JPH037582A - Ｄｎａ回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物学的試料中に稀薄に存在するＤＮＡの迅
速な回収方法に関する。さらに詳しくは、研究目的ある
いは診断目的で、蛋白質・多糖類・低分子量物質などの
各種生体成分を含む生物学的サンプル中に稀薄に存在す
るＤＮＡを、吸着剤を用いて迅速に単離・回収する方法
に関する。

［従来の技術］ 従来、核酸ハイブリダイゼーションの技術は分子生物学
や遺伝子工学の研究に無くてはならない技術として頻用
されてきた（ＭａｎｉａｔｉＳら、　　”ＭＯＩｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　）ｌａｎｕａｌ°’、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｔｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２）　。この
技術をさらに病気の診断に応用することは既に一部は実
用化されており、革新的な診断技術として注目されてい
る（筋原　端、ファルマシア　録、　１１４Ｂ−１１５
３，１９８７）。感染症やガンなどの従来の診断に、よ
り精緻なデータを提供するばかりでなく、遺伝病や個人
識別などこの技術でなければできない診断分野も多い。

また、愛玩動物や家畜の診断、植物病原ウィルスの検出
、食品中の病原菌の検出など、農業・水産・食品産業な
どへの広がりもみられる（高橋　豊三、“’ＤＮＡプロ
ーブ　技術と応用“シーエムシー、１９８８）。

前述したように当初は研究目的で核酸の分離・回収が行
なわれ、核酸のハイブリダイゼーションによる診、新法
に対しても多くの有用な知見が提供され、改良が加えら
れてきた。しかしながら、各種の技術の進歩にもかかわ
らず、試料から核酸を抽出する操作に限っては、依然煩
雑な作業を必要としている。例えば、核酸を蛋白質や脂
質などの他の細胞成分または生体成分から分離するため
には、原則的には次の３段階のプロセスが行われる。

（１）核酸を取り巻く構造物中の糖や蛋白質を崩壊させ
、可溶性の核酸を放出させる。

（２）放出された核酸を特に蛋白質と分離するために蛋
白質を変性させ沈殿させる。

（３）水相／有機溶媒相の二相系を利用して、沈殿の上
清に溶解している核酸と残留している蛋白質や他の生体
成分とを分離する。

この様な試料処理操作には、熟練者による数時間から１
日の多大な労力と、高速遠心分離機などの高価な設備が
必要であり、そのことが従来の臨床検査法に比べて原理
的にはより高感度で特異的な核酸のハイブリダイゼーシ
ョンによる検査診断法の普及を阻んでいる原因の一つに
なっていた。

また、上記の原則的な方法以外にも、生体由来の試料か
ら核酸を比較的迅速に分離することを目的として、ヒド
ロキシアパタイトカラムに選択的に二本鎖ＤＮＡを吸着
させる方法（Ｆ、　Ａ、　Ｂｅ１ａｎｄら、　Ｊ、　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１７４　１７７−１８６
．１９７９）や、その改良法（公開特許公報　６３−２
８１０５１）あるいはアセトンを用いてＤＮＡのみを沈
殿させる方法（公開特許公報　６３−２８００９３）な
どが報告されている。

また、生物学的試料を対象とするのではなく、あらかじ
め精製された核酸試料を核酸の分析を目的として分析用
支持体から抽出する方法が提案されている（Ｂ、　Ｖｏ
ｇｅｌｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｇ１１ｌｅｓｐ＋ｅ
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ、　７６、６１５−６１９．１９７９）。

この方法によれば、分析用支持体であるアガロースゲル
中に溶解した核酸をヨウ化ナトリウムの存在下において
ガラスに吸着させる。この方法は迅速・簡便であり、核
酸の分子景に関わりなく適用可能であり、核酸の崩壊も
伴なわずにアガロースが除去され、各種の酵素に対する
感受性も保持される。

しかしながら比較的簡便な手法として知られているこれ
らの方法は、主に、均一な試料から比較的大量の核酸を
取得する方法であり、核酸のハイブリダイゼーション技
術を適用するような、咽頭ぬぐい液、うがい水、結膜・
角膜ぬぐい液、皮膚ぬぐい液、水痘内容液、髄液、糞便
、直腸ぬぐい液、汗、唾液、血液、尿、精液、分泌液、
鼻汁、喀痰、組織破壊物、老廃物、組織の剖検・生検材
料、羊水、組織培養物、各種の標本などの成分・液量と
もに多様な生体試料に適用できるわけではなく、また診
断的に検出が必要とされる核酸量よりもはるかに多い核
酸量でなければ回収できないために、診断を目的とした
場合には適当な方法ではなかった。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、成分・液量ともに多様な生物学的試料
中に存在するＤＮＡを、短時間のうちに煩雑な操作を必
要とすることなく回収する方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 上述の目的を達成するために本発明は以下の構成を有す
る。すなわちＤＮＡを含む生体試料液をガラス粉末と接
触せしめ、ガラス粉末上にＤＮＡを濃縮せしめることを
特徴とするＤＮＡ回収方法である。

本発明は、ＤＮＡを生物学的試料またはその抽出物から
分離・回収するのに適している。ここでいうＤＮＡは、
染色体ＤＮＡまたは染色体外ＤＮＡである。染色体外Ｄ
ＮＡの例としては、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ
またはミトコンドリアＤＮＡなどが挙げられる。

本発明で用いるＤＮＡを含む試料液は生物学的試料また
はその抽出物の組織構造を、１）ホモジナイザーなどに
よる機械的な方法、２）界面活性剤や蛋白質変性剤によ
る化学的な方法、３）酵素による生物的な方法などによ
り破壊し、ＤＮＡを放出させて用いることが好ましい。

これらの方法は試料の性状に応じて適当な組み合わせで
用いられる。

本発明のＤＮＡ試料液は通常１ｐｇ以上のＤＮＡを含む
ものが用いられるが、ｌｐｇ以下のＤＮＡ含量の試料に
も適用される。

本発明は該ＤＮＡ試料液をガラス粉末に接触させガラス
粉末上にＤＮＡを濃縮させることを特徴とするＤＮＡ回
収方法である。

本発明で用いるガラス粉末は好ましくはフリントガラス
、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラスが用いられ、中
でもフリントガラスが好ましく用いられる。

また本発明のガラス粉末には、１分間当なりの水中での
沈降速度が、６ｃｍ以上の大きな粒子、１〜６ｃｍの中
程度の大きさの粒子、０．２５ｃｍ以下の小さな粒子な
どが使用できるが、好ましくは１分間当たりの水中での
沈降速度が１〜６ｃｍの中程度の大きさの粒子、０．２
５ｃｍ以下の小さな粒子が使用され、さらに好ましくは
１分間当たりの水中での沈降速度が０．２５ｃｍ以下の
小さな粒子を使用する。

使用されるガラス粉末の量は、ｌｎｎｇのガラス粉末光
たり０．０１μｇから３μｇのＤＮＡを吸着させること
ができることを考慮して、溶液中に存在する全ＤＮＡ量
を予測することにより決定できる。

ＤＮＡを含む試料はガラス粉末に接触させる必要がある
が、ＤＮＡのガラス粉末への吸着を完全とするため、室
温または他の温度で１分間から１日間撹拌することが好
ましい、さらに好ましくは簡便に効率よく行なうために
、室温で約５分間撹拌して行なう。

ＤＮＡ試料液中のＤＮＡをガラス粉末に吸着するに先だ
ってＤＮＡをガラス表面に吸着させる働きを高めるため
にカオトロピックイオンを生成する試薬を添加しておく
ことが望ましい（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ、に、　ａｎｄ　
Ｇｅ１ｄｕｓｃｈｅｋ、　Ｅ、　Ｐ、、　Ｊ、　Ａｍｅ
ｒ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、８４．１３２９頁、　１９６２　）。カオトロ
ピックイオンを生成する試薬としてはＬ　ｉ　ＣｒＬＯ
４、Ｎ　ａ　ＣａＯ、ＫＩ、ＮａＩ、ＬｉＣｆ１．Ｎａ
ＣＨＯ２等が用いられ、好ましくは入手容易なためヨウ
化ナトリウムが用いられる。カオトロピックイオンを生
成する試薬は、通常最終濃度で、０．０５−６Ｍ添加す
るが、ＤＮＡ以外の生体成分のガラス粉末への吸着を防
ぎ、効果的にＤＮＡをガラス粉末に吸着させるためには
、好ましくは最終濃度をおよそ４Ｍにする。

ＤＮＡの吸着したガラス粉末は、遠心分離機によって溶
液中から分離できる。遠心分離は室温または他の温度で
、３，０００　ｇ以上で１〜６０秒間、３．０００　ｇ
以下で３０〜１２０秒間で達成されるが、好ましくは簡
便に効率良く行なうために、室温下、約１０，０００ｇ
で５秒間あるいは約１，０００　ｇで２分間行なう。

必要ならば、このようにして分離したＤＮＡの吸着した
ガラス粉末を４℃あるいは他の温度に保温したアルコー
ル、好ましくは５０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを含む水溶
液で数回洗浄するが、さらに好ましくはＤＮＡのガラス
への吸着を維持し、効率良く洗浄するために、４°Ｃに
保温した１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジ
アミンテトラ酢酸酢酸トナトリウム塩０％（ｖ／ｖ）エ
タノールを含む１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７゜２
）を用いて３回洗浄する。

吸着したＤＮＡの脱離は熱、アルカリ処理による変性処
理によって実施することもできるが、好ましくはＤＮＡ
が吸着したガラス粉末に同容量以上の低塩濃度の水溶液
を添加して室温または他の温度で３分以上保持し吸着Ｄ
ＮＡを溶出させる。

好ましくは簡便に効率的に溶出を行なうために、５０μ
ｍの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）１ｍＭエ
チレンジアミンテトラ酢酸酢酸トナトリウム塩液中で５
０℃で５分間保温して溶出させる。よりＤＮＡの脱離を
完全にするために該溶出操作を溶出液を変えてトロ以上
繰り返す。

本発明により分離されるＤＮＡの測定は既存の核酸のド
ツトハイブリダイゼーションによる検出方法（Ｊ、　Ｂ
ｒａｎｄｓｍａ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７７、６８５１−６８
５５．１９８０　＞を利用することにより、およそ０．
５ｐｇ以上のＤＮＡを検出できる。この方法によれば、
回収されたＤＮＡを、必要に応じて熱処理あるいはアル
カリ処理により変性させた後に、ニトロセルロース膜あ
るいはナイロン膜に固定し、放射性同位元素あるいは他
の標識物で標識されたＤＮＡプローブあるいはＲＮＡプ
ローブとハイブリダイゼーションさせることにより検出
できる。

［実施例］ 以下に実施例で本発明の詳細な説明するが、これらは本
発明を限定するものではない。

実施例　１ ヒトサイトメガロウィルス（以下ＣＭＶ）の調製 ヒト胎児肺細胞ＭＲＣ−５（継代数２２代、大日本製薬
社製）を１０％の牛胎児血清（カナダ、ＢＯＣＫＮＥＫ
社製）を含むイーグルＭＥＭ培地（日永製薬社製）を用
いて、３７℃下、集密的細胞単層を形成するまで培養し
た。２５ｄの細胞単層に対して、未知の怒染力価を有す
る０、５ｍｌのＣＭＶ溶液（ＡＤ　１６９、ＡＴＣＣよ
り購入）を、８００ｇの遠心条件下で２時間接触させた
後にＣＭＶ溶液を捨て、２％の牛胎児血清を含むイーグ
ルＭＥＭ培地を用いて２週間培養しな、細胞単層全域に
わたって細胞変性効果の現れていることを確認した後に
、トリプシン処理により細胞を剥離せしめ、さらに凍結
融解を繰り返して細胞からウィルスを放出させたものを
ＣＭＶの標準液として、７０℃に保存して用いた。

このようにして調製したＣＭＶ標準液を、段階希釈して
再度ＭＲＣ−５に怒染させて細胞変性効果を観察したと
ころ、本標準液は１０”−１０７７ｍ　ｌの怒染力価を
有していた。

実施例　２ 尿中に混入させたＣＭＶ　　ＤＮＡの回収４ｍｌの健康
尿に、上記ＣＭＶ標準液をそれぞれ１０．１．０．１、
Ｏμｌ混入させた後に、１ｍｌの５％ドデシル硫酸ナト
リウム、３７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
１２５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩
と１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫ　（ＵＳ
Ａ、シグマ社製）とを添加して、３７℃で６０分間保温
しＣＭＶ　　ＤＮＡを放出させた。尿中に存在する夾雑
物の影響を検討するために尿の代わりに蒸留水を用いた
実験も同時に行なった。

上記のＤＮＡ放出液に対して、１０ｍ１の６Ｍヨウ化ナ
トリウムを添加して攪拌後、２０ｍｇのガラス粉末を添
加した。ガラス粉末は、シンチレーション類（アメリカ
ンフリントガラス社製）を粉砕したものから水中での沈
降速度が０．２５ｃｍ／ｍｉｎ以下のものを分離して用
いた。ガラス粉末を均一に拡散させるために５分間容器
の反転を、繰り返しながら溶液内のＤＮＡを吸着させた
後に、２０００ｇ、２分間の遠心分離を行なって核酸の
吸着したガラス粉末の沈殿を得た。このとき尿やプロテ
アーゼＫに由来する変性した蛋白質の沈殿物は溶液表面
に浮遊するので、本発明によって開示された方法を用い
ることにより、ＤＮＡ成分が蛋白質成分と容易に分離で
きることが判明しな。

ＤＮＡの吸着したガラス粉末の沈殿に、４℃に保温した
１ｍｌの１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジ
アミンテトラ酢酸二ナトリウム塩、５０％（ｖ／ｖ）エ
タノールを含む１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，２
＞を添加した後に、１００００ｇ、５秒間の遠心分離を
行なって沈殿を洗浄した。さらに同緩衝液で２回の洗浄
を行なった後に、５０μｍの１０ｍＭ）リス塩酸ｔＩＩ
衝液（ｐＨ７，２＞　、１ｍＭエチレンジアミンテトラ
酢酸二ナトリウム塩を添加して５０℃、５分間の熱処理
を行なってＤＮＡを溶出させた。上記条件の遠心分離に
よりＤＮＡ溶出液を得た後に、核酸の収率を上げるため
に、再度沈殿に同ｆｆｌ液を加えて核酸の溶出操作を繰
り返した。

実施例　３ 回収したＤＮＡの検出 上記の方法によって回収したＤＮＡを、ドツトハイブリ
ダイゼーション法を用いて検出した。

（ＤＮＡの固定化） まず１００μｌの上記核酸溶出液に、３０μｌの１Ｍ水
酸化ナトリウムを加えてＤＮＡを変性させた後に、市販
の濾過装置（ベセスダ・リサーチ社製、ハイブリスロッ
ト）を用いてナイロン膜（アマジャム社製、ハイボンド
−Ｎ）を通過させてＤＮＡを膜上に固定化した。この膜
を１Ｍ酢酸アンモニウムを用いて中和した後に、　５Ｘ
ＳＳＣ（７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸
ナトリウム、ｐＨ７＞で中性条件下にして４℃で保存し
た。

陽性の対照としてＣＭＶ標準液１０．１．０．１μｌを
、陰性の対照としてＭＲＣ−５破砕液１０μｍをアルカ
リ処理したものを固定化した。

（ＲＮＡプローブの作成） プローブとしては放射性同位元素で標識したＲＮＡプロ
ーブを合成して用いた。ＣＭＶ　　ＤＮＡをＨｉｎｄＩ
［Ｉ（宝酒造社製）処理して得られた１１．８キロ塩基
対のＤ　Ｎ　Ａ　（５ｐｅｃｔｏｒら、Ｊ、　Ｖｒｏｔ
、　４２．５５８−５８２．１９８２　）を市販のプラ
スミドｐＴ７１２（ベセスダ・リサーチ社製）のＨｉｎ
ｄｌ１１部位に結合してＲＮＡプローブ作成用のプラス
ミドを得た。これをＥｃｏＲＩ処理（宝酒造社製）した
ものを鋳型として、ウリジン５°−［α−３２Ｐ］三リ
ン酸（アマジャム社製）を基質の一つとしてＰａｉｒｅ
ｄ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＳＰ６／Ｔ７システム（アマジ
ャム社製）を用いてＲＮＡプローブを合成した。

合成したＲＮＡプローブは、クイックスピンカラムＧ−
５０（ＲＮＡ用）（ベーリンガー・マンハイム社製）を
用いて精製してから使用した。

（ハイブリダイゼーション） ＤＮＡを固定化した膜をハイブリダイゼーション溶液（
５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ１１％ドデシル硫酸ナ
トリウム、０．１％ツイーン２０．１００μｇ／ｍｌ酵
母ｔＲＮＡ）に浸漬して５０°Ｃで３０分間前処理した
後、５ｘｌＯ”　　ｄｐｍ／ｍ１になるようにＲＮＡプ
ローブを加えた新たな同溶液中に５０℃で一夜浸漬して
ハイブリダイゼーションを行なった。この膜を、室温下
、ｌＸ５ＳＣ（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７＞、０．１％ドデシル硫
酸ナトリウムで３０分間、２回、室温下、２ＸＳＳＣ（
０，３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７＞で５分間、３回、３７℃下、２×５ＳＣ１
１０μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡで１５分間、１回、
７０℃下、０．１ｘＳＳＣ（０，０１５Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７＞、０
．１％ドデシル硫酸ナトリウムで３０分間、２回洗浄し
た。洗浄後に乾燥させたこの膜を、増感スクリーン（デ
ュポン社製クロネックス１ライトニング−プラス）を使
用してＸ−ＯＭＡＴ　”Ａ　Ｒフィルム（コダック社製
）に対して一７０℃下、６日間感光させた。

回収されたＣＭＶのＤＮＡ１は、ハイブリダイゼーショ
ンしたＲＮＡプローブに基づく感光量から、次のとうり
表示した。

一：回収量Ｏ１５Ｐｇ以下 ＋：回収量０．５ｐｇ〜　５１）ｇ ＋＋：回収量　５１）ｇ〜５０ｐｇ ＋＋＋：回収量５０ｐｇ〜１　　ｎｇ 第１表に対照実験の結果を、第２表に蒸溜水中のＣＭＶ
　　ＤＮＡの回収結果を、第３表に尿中のＣＭＶ　　Ｄ
ＮＡの回収結果を示す。

表に示したように、本発明によって開示された方法を用
いて尿中のＣＭＶ　　ＤＮＡを回収したところ、尿中の
夾雑物の影響を受けることなく、尿中に稀薄に存在する
ＣＭＶ　　ＤＮＡを損失することなく回収できることが
明らかになった。

１月［」悟遣党 ［発明の効果］ 本発明により成分、液量とも多様な生物学的試料中に存
在するＤＮＡを簡便に回収することができることが明示
された。さらに本発明により研究あるいは診断目的で核
酸のハイブリダイゼーションによる検出方法を適用する
場合に、あらゆる生体試料に使用できる効果的なりＮＡ
の回収方法が提供された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＤＮＡを含む生体試料液をガラス粉末と接触せし
   め、ガラス粉末上にＤＮＡを濃縮せしめることを特徴と
   するＤＮＡ回収方法。