DE60128086T2

DE60128086T2 - Biomolekularer toxizitätstest

Info

Publication number: DE60128086T2
Application number: DE60128086T
Authority: DE
Inventors: Cristobal Guillermo Paddington Dos Remedios; Murat Stanmore Kekic; Arthur Roger San Francisco Cooke
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-02-07
Filing date: 2001-02-06
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2021-02-07
Also published as: AU2007200433B2; EP1292703A1; DE60128086D1; EP1292703B1; ATE360707T1; WO2001059150A1; AU2007200433B8; CA2399376A1; AU2007200433A1; US20020018997A1; AU2001229883A1; AR030050A1; EP1292703A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein einen Assay zur Detektion von Giftstoffen. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung einen Assay für Giftstoffe wie beispielsweise jene des Typs, welche Schwermetalle, zweiwertige Schwermetallkationen und organische Moleküle sowie Organohalogenide umfassen, vor. Derartige Giftstoffe sind häufig als verunreinigende Substanzen in aquatischen und terrestrischen Umgebungen zugegen. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Assayvorrichtung zur Detektion von Giftstoffen bereit. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Empfindlichkeit der Affinität eines Bindungspartners gegenüber den Giftstoffen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bibliographische Einzelheiten der Publikationen, auf welche vom Autor in dieser Patentschrift Bezug genommen werden, sind am Ende der Beschreibung kollektiv angeführt.
Eine Reihe einfacher und komplexer chemischer Einheiten verunreinigen aquatische und terrestrische Umgebungen. Viele dieser Moleküle entstehen durch lang anhaltende Verwendung dieser oder damit in Beziehung stehender Moleküle oder von Vorläufermolekülen in unzähligen industriellen Prozessen. Derartige chemische Einheiten oder Giftstoffe umfassen Schwermetallionen, Organohalogenide und organische Moleküle. Die Anwesenheit von Giftstoffen kann für Menschen und Tiere ernsthafte Gesundheitsrisiken mit sich bringen, und kann darüber hinaus Auswirkungen auf die Vegetation und andere Beteiligte in der Biosphäre haben. Einige Giftstoffe können darüber hinaus ernsthafte Auswirkungen auf die Ozonschicht haben. Demzufolge ist eine verlässliche Analyse von Giftsoffen im Rahmen einer Überwachung der Umwelt von Bedeutung. Sie stellt darüber hinaus eine bedeutende Komponente im Rahmen einer Bestimmung des Ausmaßes der Kontamination industrieller und städtischer Gebiete dar, was Auswirkungen auf soziale, städtische und industrielle Planungen hat.
Es wurde eine Reihe von Assays für bestimmte Giftstoffe entwickelt. Einige dieser Assays erfordern die Verwendung komplexer und teurer Apparaturen und/oder von Apparaturen, welche nicht transportabel oder zumindest nicht leicht transportabel sind. Darüber hinaus sind einige Assays bezüglich des Bereichs oder der Art der Giftstoffe beschränkt, welche detektiert werden können. Daher besteht ein Bedarf hinsichtlich der Entwicklung weiterer Assays für Giftstoffe, welche empfindlich und kostengünstig sind.
Eine Art von Assay, welcher entwickelt wurde, ist der Bioassay. Bioassays können in drei Kategorien unterteilt werden: (i) auf gesamten mehrzelligen Tieren basierende Assays, wie beispielsweise Assays auf Basis von Nagern, Frischwassercopepoden (Krustentiere) oder Assays auf Basis mariner Echinodermen (Nipper et al., 1997), oder auf Pflanzen basierende Assays; (ii) auf einzelnen Zellen basierende Assays, wie beispielsweise jene, welche auf dem vom lumineszenten marinen Bakterium Photobacterium phospherum emittierten Licht basieren und allgemein als Mikrotoxtest bekannt sind (Ruiz et al., 1997), sowie andere auf einzelnen Zellen basierende Assays, wie beispielsweise der Lymphozytenassay (Markovic et al., 1977); (iii) subzelluläre Assays unter Verwendung von entweder vollständigen Mitochondrien oder submitochondrialen Partikeln aus Rinderherzen, in welchen membranbasierte Enzymsysteme zur Untersuchung der Toxizität von Proben verwendet werden (Read et al., 1997).
Die Reihe an Tests, welche derzeit von der Umweltschutzbehörde (EPA) in den Vereinigten Staaten zugelassen sind, ist ausschließlich auf die erste dieser Kategorien beschränkt. So hat das EPA beispielsweise lediglich acht Taxa für Frischwassertoxizitätstests und eine ähnliche Anzahl für die Testung mariner Giftstoffe benannt.
Folglich besteht ein Bedarf hinsichtlich der Entwicklung eines Assays, welcher die analytische Grundlage für eine Überwachung der Umweltverschmutzung ausdehnen kann. So hat das EPA beispielsweise im Falle von Schwermetallionen Standards festgelegt, welche die Gesamtmenge an Metallionen in einer Probe vorschreiben. Allerdings trennen biologische Zellsysteme ihre biologischen Arbeitsmoleküle (Zytoplasma) aus der Umwelt unter Verwendung einer semipermeablen Zellmembran (Plasmalemma) ab. Hieraus folgt, dass diese selektive permeable Zellmembran es einem potentiell verunreinigenden Molekül oder Atom ermöglichen oder auch nicht ermöglichen kann, durch sie hindurchzutreten, in dessen Folge potentiell toxische Schadstoffe toxisch oder untoxisch sein können.
Darüber hinaus können Schadstoffe, welche in einigen biologischen Systemen toxisch sind, in anderen Systemen untoxisch sein. Häufig hängt die Biotoxizität eines Schadstoffes davon ab, ob der Schadstoff in Kombination mit anderen Chemikalien in der Probe vorliegt. So können beispielsweise organische Lösungsmittel die Toxizität bestimmter Schadstoffe erhöhen. Lipide können die Fähigkeit eines gelösten Stoffes, toxisch zu wirken, ebenfalls beeinflussen (Pollak, 1998).
Im Rahmen der Arbeiten, welche zur vorliegenden Erfindung geführt haben, war das Ziel der Erfindung die Entwicklung eines Assays, welcher einen schnellen, verlässlichen und einen „ja/nein" Ansatz hinsichtlich der Bestimmung, ob eine bestimmte Probe einen Giftstoff enthält oder mutmaßlich einen Giftstoff enthält, bereitstellen kann. Der von den Erfindern entwickelte Assay stellt eine neue Art oder Klasse von Assay dar, nämlich einen molekularen Bioassay, in welchem die Bildung eines Komplexes zwischen zwei Makromolekülen (natürlich vorkommend und/oder synthetisch) die Grundlage für eine Messung der Anwesenheit toxischer Liganden bildet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Über diese Patentschrift hinweg, sofern der Zusammenhang nichts anderes erfordert, ist unter dem Wort „umfassen" oder Variationen wie beispielsweise „umfasst" oder „umfassend" zu verstehen, dass es die Einbeziehung eines festgelegten Elementes oder einer festgelegten ganzen Zahl oder einer festgelegten Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen, jedoch nicht den Ausschluss eines beliebigen anderen Elementes oder einer beliebigen anderen ganzen Zahl oder einer beliebigen anderen Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen, beinhaltet.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion eines Inhibitors der Wechselwirkung zwischen zwei oder mehreren Bindungspartnern bereit, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Bindungspartner vor, während oder nach dem Zeitpunkt, an welchem die Partner eine Bindungspartnerschaft mit einer den Inhibitor mutmaßlich enthaltenden Probe gebildet haben, und Durchmustern hinsichtlich entweder Dissoziation der Bindung zwischen den Bindungspartnern oder Hemmung der Bindung zwischen den Bindungspartnern umfasst, wobei Dissoziation oder Hemmung der Bindung für die Anwesenheit eines Inhibitors indikativ ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein Verfahren zur Detektion eines Inhibitors der Wechselwirkung zwischen zwei oder mehreren Bindungspartnern vor, wobei das Verfahren das Immobilisieren eines Bindungspartners auf einem festen Träger, Inkontaktbringen mit einer den Inhibitor mutmaßlich enthaltenden Probe vor, während oder nach dem Zeitpunkt, an welchem ein Bindungspartner des mit einem Reportermolekül markierten ersten Bindungspartners unter Bildung einer Bindungspartnerschaft an den immobilisierten Partner bindet, und Durchmustern hinsichtlich entweder Dissoziation der Bindung zwischen den Bindungspartnern oder Hemmung der Bindung zwischen den Bindungspartnern umfasst, wobei Dissoziation oder Hemmung der Bindung für die Anwesenheit eines Inhibitors indikativ ist.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf eine Assayvorrichtung zur Detektion eines Inhibitors der Wechselwirkung zwischen den Mitgliedern einer Bindungspartnerschaft, umfassend zwei oder mehrere Bindungspartner, gerichtet, wobei der Assay einen festen Träger, umfassend einen hieran immobilisierten Bindungspartner, sowie einen mit einem Reportermolekül markierten Bindungspartner des immobilisierten Partners umfasst.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Assayvorrichtung zur Detektion eines Inhibitors der Wechselwirkung zwischen den Mitgliedern einer Bindungspartnerschaft, umfassend zwei oder mehrere Bindungspartner, bereit, wobei der Assay einen festen Träger, umfassend einen hieran immobilisierten Bindungspartner, sowie einen Behälter umfasst, welcher dahingehend angepasst ist, dass er einen Bindungspartner des immobilisierten Partners enthält, der mit einem Reportermolekül markiert ist oder mit einem Reportermolekül markiert werden kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung der Bindungspartner einer Bindungspartnerschaft zur Herstellung eines Assays zur Detektion eines Inhibitors der Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern vor. Der Assay kann für eine quantitative oder quantitative Deformulierung des Inhibitors angepasst sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine photographische Darstellung, welche die von EtBr und/oder DNA entwickelten Farbmuster zeigt, nachdem sie auf eine Nylonmembran aufgebracht und mittels UV (oberes Feld) oder mittels einer Glühlampe (unteres Feld) bestrahlt wurden. Alle Chemikalien wurden in 5 μl Volumen aufgebracht. Die Zusätze sind: (1) 10 mg/ml EtBr; (2) 0.25 mg/ml EtBr; (3) 1 mg/ml DNA; (4) DNA + 10 EtBr; (5) DNA + 0.25 EtBr bei hoher Empfindlichkeit.
2 ist eine graphische Darstellung, welche Veränderungen im Emissionsspektrum des DNA/EtBr-Komplexes nach Zusatz von HgCl₂ zeigt. Anregung – 520 nm.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Verwendung makromolekularer Bindungspartner einer Bindungspartnerschaft in einem Assay zur Bestimmung der Anwesenheit eines Inhibitors der Bindungspartnerschaft.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren wie in Anspruch 1 beschrieben bereit. Ferner wird ein Verfahren zur Detektion eines Inhibitors der Wechselwirkung zwischen zwei oder mehreren Bindungspartnern beschrieben, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Bindungspartner vor, während oder nach dem Zeitpunkt, an welchem die Partner eine Bindungspartnerschaft mit einer den Inhibitor mutmaßlich enthaltenden Probe gebildet haben, und Durchmustern hinsichtlich entweder Dissoziation der Bindung zwischen den Bindungspartnern oder Hemmung der Bindung zwischen den Bindungspartnern umfasst, wobei Dissoziation oder Hemmung der Bindung für die Anwesenheit eines Inhibitors indikativ ist.
Eine Bezugnahme hierin auf einen „Inhibitor" meint ein Molekül oder eine chemische Einheit, welche(s) die Bindung zwischen Bindungspartnern reduzieren oder verhindern kann, oder welche(s) in der Lage ist, eine vollständige oder partielle Dissoziation der Bindungspartner nach einer Wechselwirkung zu bewirken. Ein Inhibitor liegt bevorzugt in Form eines Giftstoffes vor. Der Begriff „Giftstoff" wird in seiner breitesten Bedeutung verwendet und umfasst einen beliebigen Inhibitor der Bindung zwischen Bindungspartnern oder ein Molekül, welches in der Lage ist, eine vollständige oder partielle Dissoziation von Bindungspartnern, die im Rahmen einer Bindungspartnerschaft aneinander gebunden haben, zu fördern. Giftstoffe können, müssen jedoch nicht notwendigerweise „toxisch" in dem Sinne sein, dass sie in der Lage sind, den Tod eines lebenden Organismus zu induzieren oder eine oder mehrere Mutationen im Genom eines Organismus zu induzieren, oder physiologische Prozesse eines Organismus zu beeinträchtigen. Giftstoffe können auch in Abhängigkeit von der Konzentration oder der Expositionszeit in ihrer Toxizität variieren. Bevorzugte Inhibitoren in Form von Giftstoffen umfassen Schwermetalle, Schwermetallionen, sowie einfache und komplexe organische Moleküle und Organohalogenide (2,4-Dioxin oder Picloram).
Die zu untersuchende Probe kann eine aus einem Labor stammende Testprobe, eine aus der Umwelt wie beispielsweise aus einer aquatischen oder terrestrischen Umgebung stammende Probe, oder eine industrielle Probe aus beispielsweise einem Gebiet in oder rund um einen industriellen Prozess sein. Eine „terrestrische" Probe umfasst gasförmige Proben wie beispielsweise Luft, umfassend Ozon.
Der Assay der vorliegenden Erfindung kann auf vielfältige Art und Weise durchgeführt werden. In einer besonders nützlichen Ausführungsform ist ein Mitglied der Bindungspartnerschaft auf einem festen Träger immobilisiert. Ein anderes Mitglied der Bindungspartnerschaft wird anschließend mit einem Reportermolekül markiert. Anschließend wird es den Bindungspartnern ermöglicht, aneinander zu binden. Eine einen Inhibitor mutmaßlich enthaltende Probe wird anschließend mit dem Komplex aus immobilisiertem Bindungspartner und markiertem Bindungspartner in Kontakt gebracht. Ein Verlust des Reportermoleküls zeigt anschließend an, dass der Inhibitor eine vollständige oder partielle Dissoziation der Bindungspartnerschaft induziert hat.
In einer weiteren nützlichen Ausführungsform wird die den mutmaßlichen Inhibitor enthaltende Probe mit den immobilisierten Mitgliedern der Bindungspartnerschaft und dem markierten Mitglied der Bindungspartnerschaft vor Ausbildung der Partnerschaft in Kontakt gebracht. Die Abwesenheit des Reportermoleküls zeigt an, dass der Inhibitor die Bildung der Bindungspartnerschaft verhindert oder reduziert.
Im Allgemeinen stellen die Bindungspartner Molekülpaare dar. Allerdings erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf eine Bindungspartnerschaft, welche drei oder mehrere Mitglieder umfasst.
Bei den im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Bindungspartnern handelt es sich um ein Nukleinsäuremolekül und einen Farbstoff. Alternative Verfahren verwenden Makromoleküle wie beispielsweise Proteine. Eine Bezugnahme hierin auf ein „Protein" umfasst eine Bezugnahme auf ein Peptid oder Polypeptid. Ein Protein umfasst darüber hinaus ein Enzym sowie Moleküle mit Proteinkomponenten, wie beispielsweise Glykoproteine, Fusionsproteine und Lipoproteine. In Bezug auf Enzyme können die Bindungspartner die Enzyme und ein Enzymsubstrat umfassen. Demzufolge kann ein Bindungspartner auch ein nicht-proteinöses Molekül, wie beispielsweise ein Substrat, sein. Die Makromoleküle können darüber hinaus Nukleinsäuremoleküle, umfassend RNA oder DNA oder Hybridformen hiervon, sein. Eine Bezugnahme auf „RNA" und „DNA" umfasst eine Bezugnahme auf Antisense- und Sense-Moleküle und Oligonukleotide sowie große Nukleinsäuremoleküle. Eine Bindungspartnerschaft kann darüber hinaus Nukleinsäuremoleküle und an Nukleinsäuren bindende Proteine umfassen.
Die Bindungspartner können alternativ Aktin und Aktin-bindende Proteine, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Cofilin und DNase I, umfassen.
Wie vorstehend dargelegt, ist ein Mitglied der Bindungspartnerschaft in einer bevorzugten Ausführungsform auf einem festen Träger immobilisiert.
Gemäß diesem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion eines Inhibitors der Wechselwirkung zwischen zwei oder mehreren Bindungspartnern bereitgestellt, wobei das Verfahren das Immobilisieren eines Bindungspartners auf einem festen Träger, Inkontaktbringen mit einer den Inhibitor mutmaßlich enthaltenden Probe vor, während oder nach dem Zeitpunkt, an welchem ein Bindungspartner des mit einem Reportermolekül markierten ersten Bindungspartners unter Ausbildung einer Bindungspartnerschaft an den immobilisierten Partner bindet, und Durchmustern hinsichtlich entweder Dissoziation der Bindung zwischen den Bindungspartnern oder Hemmung der Bindung zwischen den Bindungspartnern umfasst, wobei Dissoziation oder Hemmung der Bindung für die Anwesenheit des Inhibitors indikativ ist.
Im Allgemeinen ist der Bindungspartner auf einem festen Träger, umfassend Glas oder ein Polymer, wie beispielsweise Polystyrol, Polymethacrylat, Zellulose, Polyacrylamid, Nylon, Polyvinylchlorid oder Polypropylen, immobilisiert. Der feste Träger kann in Form von Röhrchen, Kügelchen, Scheiben von Mikroplatten, oder einer beliebigen anderen Oberfläche, welche für die Durchführung eines Immunoassays geeignet ist, vorliegen. Als fester Träger kann darüber hinaus eine feste Matrix, wie beispielsweise eine feuchte oder hydratisierte feste Matrix, in Betracht gezogen werden. Die Bindungsprozesse sind im Fachbereich wohlbekannt, wobei eine kovalente oder passive Bindung angewendet werden kann.
Unter „Reportermolekül", wie es im Rahmen der vorliegenden Patentschrift verwendet wird, wird ein Molekül verstanden, welches aufgrund seiner chemischen Natur ein identifizierbares Signal bereitstellt, das die Detektion einer Bindung zwischen den Bindungspartnern oder einer Dissoziation der Bindung ermöglicht. Die am häufigsten verwendeten Reportermoleküle in dieser Art von Assay sind entweder Enzyme, Fluorophore, oder Radionuklide enthaltende Moleküle (d. h. Radioisotope) sowie chemilumineszierende Moleküle.
Ebenfalls beschrieben ist ein Assay, in welchem die Bindungspartner Aktin und ein Aktin-bindendes Molekül, wie beispielsweise Cofilin oder DNase I, sind. Globuläres oder monomeres Aktin ist auf einem festen Träger, wie beispielsweise in Form eines Teststreifens, immobilisiert. In diesem Zusammenhang sind Polymethacrylat oder Polystyrol besonders bevorzugt.
In der Praxis werden Avidin oder eine ähnliche Verbindung, wie beispielsweise Streptavidin, kovalent auf dem festen Träger fixiert. Aktin wird mit Biotin umgesetzt, wobei sich biotinyliertes Aktin bildet. Letzteres lässt man anschließend mit dem mit Avidin/Streptavidin beschichteten festen Träger Wechselwirken, wobei ein fester Träger gebildet wird, welcher Avidin/Streptavidin-biotinyliertes Aktin umfasst. Ein Bindungspartner des Aktins, wie beispielsweise Cofilin oder DNase I, wird anschließend mit einem sichtbaren Farbstoff, wie beispielsweise Texasrot (Molecular Probes, Inc.), markiert. Anschließend lässt man das markierte Aktin-bindende Protein an das immobilisierte Aktin und den Teststreifen, welcher mit einer beispielsweise einen Giftstoff wie etwa eines oder mehrere Schwermetallionen (z. B. Cd, Cu, Hg oder Zn) enthaltenden Testprobe in Kontakt gebracht wurde, binden. Eine Dissoziation des gefärbten Bindungspartners wird dann beobachtet, wenn ein Giftstoff die Bindungspartnerschaft hemmt. Alternativ kann eine Visualisierung im Anschluss an eine Elektrophorese erfolgen, wie beispielsweise von Kekic und dos Remedios (1999) beschrieben.
Wie vorstehend dargelegt, kann der Assay in vielfältiger Art und Weise variiert werden. So kann ein fester Träger beispielsweise eine feuchte oder hydratisierte feste Matrix umfassen, wobei der feste Träger einen Bindungspartner zurückhält, welcher an einen mit einem gefärbten oder fluoreszierenden Ligandenfarbstoff markierten zweiten Bindungspartner bindet. In einer weiteren Alternative umfasst der Assay die Detektion eines sichtbaren Reaktionsproduktes. In dieser Ausführungsform verändert der Giftstoff die enzymatische Aktivität, wie beispielsweise in vollständigen oder fragmentierten Mitochondrien. Die enzymatische Aktivität wird anschließend beispielsweise spektrophotometrisch gemessen, um Veränderungen der Extinktion bei bestimmten Wellenlängen zu überwachen.
Ebenfalls beschrieben ist ein Assay, welcher auf der hohen Affinität von Giftstoffen wie beispielsweise Cadmium und Quecksilber für Sulfhydrylgruppen basiert, die beispielsweise in einer Vielzahl von Proteinen zugegen sind. Die Bindung an oder die Reaktion von Schwermetallen mit Sulfhydrylseitenketten von Proteinen hat einen Effekt auf deren Reaktivität.
Im Rahmen der Konzipierung des Assayverfahrens ist es von besonderem Nutzen, natürlich vorkommende biologische Moleküle, wie beispielsweise Proteine und Nukleotide, auszuwählen. Allerdings können rekombinante oder synthetische sowie derivatisierte Formen dieser Moleküle ebenfalls verwendet werden. Bevorzugt erfolgt die Wechselwirkung der Bindungspartner mit hoher Affinität, kann jedoch durch eine Reihe von Giftstoffen, wie beispielsweise toxische Schadstoffe, beeinträchtigt werden. Der Begriff „Beeinträchtigung" bedeutet, dass die Wechselwirkung in signifikanter Art und Weise verändert wird, wie beispielsweise in Form einer Verringerung der Bindungsaffinität zwischen den Bindungspartnern. Eine Bezugnahme auf „Bindung" wie in einer Bindungspartnerschaft ist breit auszulegen und umfasst kovalente Bindung, umfassend Disulfidverknüpfungen, ionische Bindung, Wasserstoffbrückenbindung sowie Bindung oder Assoziation über van der Waals'sche Kräfte und/oder elektrostatische Anziehung.
Die Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern kann unter Verwendung beliebiger Mittel, umfassend makroskopische und mikroskopische Visualisierung, detektiert oder überwacht werden. Makroskopische Visualisierung umfasst visualisierende Lichtemissionen und Farbstoffe sowie eine Beobachtung der Wechselwirkung zwischen beweglichen festen Trägern, wie beispielsweise Kügelchen.
Ebenfalls beschrieben ist eine Assayvorrichtung zur Detektion eines Inhibitors der Wechselwirkung zwischen Mitgliedern einer Bindungspartnerschaft, umfassend zwei oder mehrere Bindungspartner, wobei der Assay einen festen Träger, umfassend einen hieran immobilisierten Bindungspartner, sowie einen mit einem Reportermolekül markierten Bindungspartner des immobilisierten Bindungspartners umfasst.
Ebenfalls beschrieben ist eine Assayvorrichtung zur Detektion eines Inhibitors der Wechselwirkung zwischen Mitgliedern einer Bindungspartnerschaft, umfassend zwei oder mehrere Bindungspartner, wobei der Assay einen festen Träger, umfassend einen hieran immobilisierten Bindungspartner, sowie einen Behälter umfasst, welcher dahingehend angepasst ist, dass er einen Bindungspartner des immobilisierten Bindungspartners enthält, der mit einem Reportermolekül markiert ist oder mit einem Reportermolekül markiert werden kann.
Die Assayvorrichtung kann alternativ Behälter umfassen, welche dahingehend angepasst sind, dass sie Mittel enthalten, die zur Durchführung des Assays von Nutzen sind, wie beispielsweise Reportermoleküle und Verdünnungsmittel. Ein Behälter, welcher dahingehend angepasst ist, dass er eine Probe, wie beispielsweise eine aus der Umwelt stammende Probe, enthält, kann ebenfalls umfasst sein. Die Assayvorrichtung kann einzeln oder in ihrer Gesamtheit verpackt sein und kann darüber hinaus Mittel zur Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Reportermoleküls umfassen. Die Assayvorrichtung kann darüber hinaus Gebrauchsanweisungen enthalten.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung von Bindungspartnern einer Bindungspartnerschaft zur Herstellung eines Assays zur Detektion eines Inhibitors der Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern vor. Der Assay kann für eine quantitative oder qualitative Bestimmung des Inhibitors angepasst sein.
Der Begriff „Assay" kann synonym mit „Verfahren" gelesen werden. Aspekte dieser Erfindung, welche sich auf Elektrophorese beziehen, sind von der Beschreibung in Kekic und dos Remedios (1999) umfasst.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin anhand der nachfolgenden nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben, wobei die Beispiele 1–4, 6–8, 10–11 und 14 als Veranschaulichung für alternative Assays dienen und die Beispiele 5, 9, 12 und 13 die Erfindung veranschaulichen.
BEISPIEL 1
Materialien und Verfahren
Die Herstellung von Aktin, die Herstellung von Cofilin und DNase I, native Gelelektrophorese, die Herstellung von Schwermetallionen und organischen Verbindungen, sowie andere Verfahren sind wie in Kekic und dos Remedios (1999) beschrieben.
BEISPIEL 2
Hemmung der Wechselwirkungen zwischen Makromolekülen
Die Hemmung der Wechselwirkung von beispielsweise Aktin und Cofilin oder Aktin und DNase I kann durch Immobilisieren eines Makromoleküls (beispielsweise Aktin) auf einem festen Trägerstreifen, welcher in einem kleinen Behälter (1–2 ml) suspendiert ist, sichtbar gemacht werden. Die Probe wird in einer Spritze aufgenommen, was zwei Zwecken dient: (1) um das Volumen der potentiell verunreinigten Wasserprobe zu messen; und (2) die Spritze enthält eine Pufferverbindung, welche den pH der wässrigen Probe stabilisiert. Anschließend wird ein kleiner Filter auf dem Abfluss der Spritze platziert und die Probe in ein die Makromoleküle enthaltendes Gefäß injiziert. Die Dissoziation eines gefärbten makromolekularen Farbstoffes (beispielsweise Texasrot (Molecular Probes Inc.)), welcher an Cofilin (oder an DNase I oder an ein anderes Aktin-bindendes Protein) gebunden ist, kann visuell unter Ablösung von dem das ungefärbte Aktin enthaltenden Streifen beobachtet werden.
Die experimentelle Grundlage dieses Assays ist nachstehend beschrieben.
Vier Schwermetallionen (Cd, Cu, Hg und Zn) wurden über den Konzentrationsbereich 1–1000 μg L^–1 untersucht. Der Komplex ist gegenüber einem fortschreitenden Zusatz von 1–20 μg L^–1 Hg (zugesetzt als Acetat) am empfindlichsten. Die Volumendichten der Aktin-Cofilin-Banden, welche aus den nativen Polyacrylamidgelen aufgezeichnet wurden, sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die Zugabe von 1 und 5 μg L^–1 führt zu einer fortschreitenden Erhöhung der Dichte des Aktin-Cofilin-Komplexes, während 10 μg L^–1 die Dichte dieser Bande auf ein mit der Kontrolle vergleichbares Niveau verringern, wobei gleichzeitig eine Reihe schwächerer Banden auftreten. Bei 20 μg L^–1 wird dieser Trend durch den nahezu vollständigen Verlust der nativen Aktin-Cofilin-Bande hervorgehoben. Die Abwesenheit von ungebundenem Cofilin in der Nähe des oberen Endes des Gels lässt darauf schließen, dass natives Cofilin nicht dissoziiert ist. Aus dieser und anderen Bestimmungen schätzen die Erfinder, dass unter Verwendung eines 25 μM Aktin-Cofilin-Komplexes der E₅₀ für Hg für das Verschwinden der Aktin-Cofilin-Bande etwa 20–40 μg L^–1 beträgt. Dieses Bindungsverhältnis lässt darauf schließen, dass ein Hg²⁺ an einen hochreaktiven Cysteinylrest in dem Aktin-Cofilin-Komplex bindet.
Cu²⁺ beeinflusst den Aktin-Cofilin-Komplex nicht erkennbar, bis es eine Konzentration von etwa 200 μg L^–1 erreicht. Bei höheren Cu²⁺-Konzentrationen wird die Bildung des Aktin-Cofilin-Komplexes fortschreitend gehemmt, wobei sich die Proteine gleichmäßig entlang der Bahn des Gels zu verteilen scheinen. Die 50% effektive Dosis (E₅₀) für Cu²⁺ beträgt etwa 400–600 μg L^–1. Cu²⁺ kann an eine Reihe von Aminosäureseitenketten binden. So ist beispielsweise bekannt, dass es an Phe-375 der Aktin-Sequenz bindet. Beurteilt man die E₅₀-Werte, so ist die Spaltung des Aktin-Cofilin-Komplexes gegenüber Hg²⁺ um etwa eine Größenordnung empfindlicher als gegenüber Cu²⁺.

Die Erfinder untersuchten die Effekte des Zusatzes von ZnCl₂ unter Verwendung einer Konzentration im Bereich von 250–2500 μg L^–1. Bei diesen relativ hohen Konzentrationen verringerte es die Dichte des Aktin-Cofilin-Komplexes. Der E₅₀-Wert (900–1000 μg L^–1) war sowohl gegenüber Hg als auch gegenüber Cu signifikant erhöht. Folglich wurde ein steigende Empfindlichkeit der Aktin-Cofilin-Bande gegenüber diesen Übergangsmetallionen in der Reihenfolge Hg»Cu>Cd Zn erreicht. TABELLE 1¹

Metallkation	Aktin-Cofilin μg L^–1	SMP μg L^–1	BHM μg L^–1	Fisch μg L^–1 (nach 96 h)	Mikrotox μg L^–1
Hg²⁺	20–40	130	126	170	59
Cu²⁺	400–600	300	93	530	9300
Cd²⁺	800–1200	520	158	630	41400
Zn²⁺	900–1000	1700	80	2990	33000

¹ Die effektiven (E₅₀) Konzentrationen für vier Schwermetallkationen wurden bestimmt mittels: (1) Analyse nativer PAGE-Gele von Aktin-Cofilin; (2) eines auf submitochondrialen Partikeln (SMP) basierenden Assays; (3) eines auf Rinderherzmitochondrien (BHM) basierenden Assays; (4) eines auf einem Gesamtorganismus (Fisch) basierenden Assays; sowie (5) der mittleren letalen Konzentrationen (@ 96 h) für Photobacterium phosphoreum, bekannt als Mikrotoxassay. Die Mengen an zugesetzten Metallionen (g L^–1) umfassten nicht die Masse der Gegenionen (Chloride oder Acetat). Die Daten in den rechten vier Spalten wurden aus Read et al. (1997) zitiert.

BEISPIEL 3
Detektion der Wechselwirkung
Die Aktin-Cofilin-Wechselwirkung kann unter Verwendung eines auf Fluoreszenz basierenden Detektorsystems überwacht werden, in welchem eine als Donor fungierende Fluoreszenzsonde durch Licht einer geeigneten Wellenlänge (unter Verwendung eines geeigneten selektiven Filters) angeregt wird. In diesem Beispiel kann ein Alexa(Handelsname)-Fluoreszenzfarbstoff (hierin als Donorsonde verwendet) auf ein Molekül (beispielsweise monomeres Aktin) platziert werden, welches in diesem Fall nicht auf einem festen Träger fixiert werden muss. Eine zweite, unterschiedliche Markierung (die Akzeptorsonde) wird mittels eines zweiten Makromoleküls (beispielsweise Cofilin) reaktiviert, wobei das Absorptionsspektrum des Akzeptors derart gewählt wird, dass es mit dem Emissionsspektrum der Donorsonde überlappt. Dort, wo eine enge physikalische Assoziation zwischen dem Aktin und dem Cofilin eines Aktin-Cofilin-Komplexes auftritt, wird die Emission der Donorsonde durch die Akzeptorsonde gequencht, in dessen Folge eine geringe oder keine Fluoreszenzemission auftritt. Sind die zwei Proteine physikalisch dissoziiert (beispielsweise ein verunreinigender Giftstoff), so wird die Emission des Donors nicht länger gequencht und die Fluoreszenzemission der Donorsonde mittels eines Photonendetektors detektiert. Folglich wird in dieser Form der Vorrichtung die Wechselwirkung zwischen makromolekularen Liganden (beispielsweise Aktin und Cofilin) unter Verwendung von Fluoreszenzresonanzenergietransfer überwacht, wobei der Giftstoff, welcher eine Dissoziation der Bindung dieser Makromoleküle bewirkt, anhand der Erhöhung der Lichtemission der Donorsonde infolge des Entzugs der Akzeptorsonde detektiert wird.
BEISPIEL 4
Verwendung von magnetischen Kügelchen
Eine andere Form der Vorrichtung stützt sich auf magnetische Kügelchen, um die gebundenen von den ungebundenen Proteinen zu trennen. Dynabeads (Handelsname) stellen einen Mechanismus zur Messung der Bindung zwischen Aktin und Cofilin bereit. In dieser Form der Vorrichtung wird Aktin mit den magnetischen Kügelchen umgesetzt und eine Bindung von Cofilin (wie vorstehend mit Texasrot markiert) ermöglicht. Daher binden die Kügelchen Aktin und binden über Aktin das Cofilin. Die Proteine können in diesem Zustand entweder in gefriergetrocknetem oder in einem halbtrockenen Zustand gelagert werden. Diese Vorrichtung funktioniert dadurch, dass die wässrige Probe einem kleinen Behälter, welcher einen biologischen Puffer enthält, hinzugefügt wird. Der Behälter wird mit einem ringförmigen Magneten ausgestattet, welcher über das Äußere des Behälters gleitet und die magnetischen Kügelchen an ein Ende des Röhrchens zieht.
Eine Wasserprobe, welche keine Dissoziation des gefärbten Cofilins aus ungefärbtem Aktin bewirkte, wird als sicher oder untoxisch angesehen. Eine Probe, welche eine Dissoziation der zwei Proteine bewirkte, wird als potentiell toxisch angesehen.
BEISPIEL 5
Nukleinsäuremesssystem
In diesem Assay wird ein gefärbter Indikatorfarbstoff (z. B. Acridinorange) in die DNA interkaliert oder an eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie beispielsweise RNA, gebunden. Die Toxizität wird durch den Verlust des Farbstoffes aus einer immobilisierten Nukleinsäure angezeigt.
BEISPIEL 6
Elektrophorese von Komplexen von Aktin-Cofilin oder Aktin-DNase I in nativen Gelen
Kombinationen von Aktin, Cofilin und DNase I wurden in äquimolaren Konzentrationen (~ 20–25 μm) in einem Eppendorf-Röhrchen vermischt und für 15 min bei 22°C inkubiert. Anschließend wurden Aktin, Cofilin, DNase I und ihre Komplexe auf einem 10% w/v nativen Gel getrennt. Da die Trennungen in diesem Gel unter nicht-denaturierenden Bedingungen erzielt wurden, wandern die Proteine nicht entsprechend ihren scheinbaren Molekulargewichten, wie dies in SDS-PAGE-Gelen der Fall ist. Anstelle dessen wird die Migrationsrate anhand des Verhältnisses von Ladung zu Volumen bestimmt. Aktin (M_r 43 kDa) besitzt eine negative Nettoladung. Unter Bedingungen einer niedrigen Ionenstärke wird monomeres Aktin als Hauptmonomerbande beobachtet, welche geringeren Mengen an Dimer und höheren Oligomeren bis zur Grenzfläche zwischen den Sammelgelen (5%) und Laufgelen (10%) vorauswandert. Cofilin besitzt etwa die Hälfte der Molekülmasse (18.7 kDa) von Aktin, verbleibt jedoch aufgrund seiner positiven Nettoladung bei den pH-Bedingungen im nativen Laufgel (pH 8.6) im Sammelgel. DNase I (M_r 43 kDa) wandert als verschwommene Bande, welche sich vor den Aktin-Monomeren bewegt. Werden Cofilin und DNase I in äquimolaren Mengen gemischt, so ergibt sich keinerlei Beweis dafür, dass die beiden einen Komplex bilden.
Ein äquimolarer Komplex von Aktin mit entweder DNase I oder Cofilin erzeugt zwei Banden, welche schärfer definiert sind als jede der reinen Proteine. Ein Gemisch von Aktin mit DNase I führt zu zwei scharfen Banden; einer unteren Bande, welche in der Nähe des Aktin-Monomers wandert und frei von DNase-Banden ist (jedoch mit keiner hiervon identisch ist), und einer oberen Bande mit geringfügig niedrigerer Dichte. Ein ähnliches, jedoch nicht identisches Bandenpaar wird beobachtet, wenn Aktin mit Cofilin komplexiert wird. Bemerkenswert ist die Verringerung der Dichte der Banden von ungebundener DNase I und Cofilin. Diese Aktin-ABP-Komplexe stellen den Schwerpunkt elektrophoretischer Formen der Assays dar, welche in Kekic und dos Remedios (1999) beschrieben sind.
BEISPIEL 7
Verunreinigungstest, welcher auf einer Protein-Protein-Wechselwirkung basiert, wobei eines der Proteine auf einer festen Matrix immobilisiert ist
In diesem Beispiel wird eine gegenüber Verunreinigungen empfindliche Vorrichtung beschrieben, welche unter Verwendung eines festen Trägers konstruiert ist, der aus einer feuchten oder hydratisierten festen Matrix besteht, wobei der feste Träger ein Protein zurückhält, welches an ein mit einem gefärbten (und/oder fluoreszierenden) Ligandenfarbstoff markiertes zweites Protein bindet, und wobei der Schadstoff oder der Giftstoff die Wechselwirkung der beiden Proteine hemmt.
Es wurde gezeigt, dass die Wechselwirkung von Proteinen wie beispielsweise Aktin und Cofilin eine Empfindlichkeit gegenüber einer Reihe herkömmlicher Umweltschadstoffe aufweist (Kekic und dos Remedios, 1995). Dieses Beispiel beschreibt eine Farbreaktion, welche auf Aktin und Cofilin basiert, welche leicht an eine Verwendung in freier Umgebung angepasst werden kann, und welche eine Empfindlichkeit gegenüber den Schadstoffen aufweist. Im Rahmen des Beispiels kann neben Cofilin auch ein anderes Aktin-bindendes Protein, wie beispielsweise DNase I, verwendet werden.
Cofilin wird als Fusionsprotein mit einem Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag exprimiert. Dieses Tag ermöglicht es Cofilin, sehr fest an eine Matrix wie beispielsweise Glutathion-Agarose, welche in einer durchsichtige Säule platziert ist, zu binden. Aktin wird mit einem in hohem Maße sichtbaren, fluoreszierenden Farbstoff wie beispielsweise Texasrot markiert und durch diese Säule hindurchgeführt. Eine Reihe dieser fluoreszenzmarkierten Aktinmoleküle verbleiben infolge Bindung an das Cofilin auf der Säule. Hierbei bleibt eine leuchtend rötliche Färbung zurück, welche auch bei Bestrahlung mit ultravioletten Licht leicht zu erkennen ist. Diese Färbung verbleibt auf der Säule, nachdem gereinigter Puffer mit niedrigem Salzgehalt durch diese hindurchgeführt wurde. Allerdings zeigte sich, dass die Fäbung verschwindet, nachdem eine mit Quecksilber verunreinigte Lösung durch sie hindurchgeführt wird. Die Entfärbung ist mit großer Sicherheit auf die Quecksilberionen zurückzuführen, welche die Wechselwirkung zwischen dem Aktin und dem Cofilin stören. Daher wird das „gefärbte" Aktin von der Säule eluiert, wobei die ungefärbte Cofilin-Agarose zurückbleibt.
In der Praxis konnte eine verunreinigte Wasserprobe entweder durch den Verlust der Färbung während der Freisetzung eines gefärbten (markierten) zweiten Proteins aus der Matrix oder durch die Anwesenheit einer Färbung im Eluenten (oder beides) detektiert werden.
BEISPIEL 8
Verunreinigungstest, welcher auf Proteinaktivität basiert und ein sichtbares Reaktionsprodukt erzeugt
Ein etablierter Bioassay für verunreinigte Wasserproben ist jener, welcher auf einer veränderten enzymatischen Aktivität von entweder vollständigen oder fragmentierten Mitochondrien basiert. Giftstoffe, wie beispielsweise Schwermetallionen, verursachen eine quantitative Veränderung der Aktivität von Enzymen, welche in diesen Mitochondrien oder mitochondrialen Fragmenten (sogenannte submitochondriale Partikel) enthalten sind. Diese Enzyme werden üblicherweise in einem Spektrophotometer durch Überwachen von Veränderungen der Extinktion bei bestimmten Wellenlängen untersucht. Eines von mehreren dieser mitochondrialen Enzyme stellt eine geeignete Zielstruktur für einen enzymbasierten Assay dar, in welchem die Aktivität durch Entwicklung eines sichtbaren, kolorimetrischen Reaktionsproduktes detektiert wird.
BEISPIEL 9
Verunreinigungstest, welcher auf DNA-Farbstoff-Wechselwirkung basiert
Es wird eine ähnliche Vorrichtung konstruiert, in welcher das Makromolekül eine Nukleinsäure-ähnliche DNA ist, die an einen in einem durchsichtigen Röhrchen gelagerten festen Träger (beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, behandelte oder unbehandelte Glaskügelchen) gebunden ist, und in welchem der Bindungspartner ein Farbstoff, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Fluoreszenzmarkierungen wie beispielsweise Acridinorange, Ethidiumbromid oder ein auf Fluorescein basierender Farbstoff, ist. Die Detektion einer verunreinigten Wasserprobe kann entweder durch Verlust der Färbung aus der Säule oder durch Detektion der Markierung im Eluenten der Säule abgeleitet werden.
Daher wird eine gegenüber Verunreinigungen empfindliche Vorrichtung unter Verwendung eines festen Trägers konstruiert, welcher aus einer feuchten oder hydratisierten festen Matrix besteht, wobei der feste Träger ein Nukleinsäurepolymer, wie beispielsweise DNA oder eine stabilisierte RNA, zurückhält, welche an einen zweiten, gefärbten (und/oder fluoreszierenden) Ligandenfarbstoff bindet, und wobei der Schadstoff oder Giftstoff die Bindung des Farbstoffes an die Nukleinsäure hemmt.
BEISPIEL 10
Test, welcher auf der Reaktivität von Sulfhydrylen basiert
Schwermetalle, wie beispielsweise Cadmium und Quecksilber, besitzen eine hohe Affinität für Sulfhydrylgruppen wie beispielsweise jene, welche in einer Vielzahl von Proteinen vorgefunden werden. Die Bindung an oder die Reaktion von Schwermetallen mit Sulfhydrylseitenketten von Proteinen hat einen Effekt auf deren Reaktivität. Es sind eine Reihe etablierter Protokolle zur Messung der Reaktivität von Sulfhydrylen bekannt. Eines umfasst Ellmans-Reagenz, und ein anderes Verfahren umfasst die Verwendung von NBD-Cl (ein Fluoreszenzfarbstoff) (Akinyele et al., 1999). Ein weiteres Verfahren umfasst die Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffes NBD-F. Es wird berichtet, dass dieser Farbstoff eine höhere Fluoreszenzausbeute (vermutlich besser sichtbar) und eine höhere Reaktivität aufweist (Watanabe und Imai, 1981).
Liganden können mit einer beliebigen Anzahl an Sulfhydrylen (Cysteinresten) oder einer Cysteinlösung zur Anwendung gelangen, um die Anwesenheit von Schadstoffen (wie beispielsweise Schwermetallen) durch Messung des Effektes auf die Wechselwirkung zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Sulfhydryl zu detektieren. Die Farbe der Testlösung nimmt in Abhängigkeit von der Größenordnung des Effektes zwischen dem Schadstoff und dem Sulfhydryl sichtbar ab. Dies stellt einen in freier Umgebung durchführbaren Test dar, welcher eine „ja/nein"-Antwort liefert, oder für welchen unter Verwendung einer Detektionsvorrichtung (z. B. Lichttransmission oder Extinktion) ein Messwert erhalten wird, welcher einen hohen oder niedrigen Wert des Schadstoffes anzeigt.
Daher wird eine gegenüber Verunreinigungen empfindliche Vorrichtung unter Verwendung eines festen Trägers konstruiert, welcher aus einer feuchten oder hydratisierten festen Matrix besteht, wobei der feste Träger ein Protein mit mehreren Cysteinylseitenketten zurückhält, und wobei die Reaktivität dieser Cysteinyle durch Schadstoffe oder Giftstoffe (beispielsweise Schwermetallionen) reduziert wird.
BEISPIEL 11
Test, welcher auf Protein-Protein-Wechselwirkungen basiert und einen auf Polyacrylamidgel basierenden Assay unter Verwendung komplexer Gemische nutzt
Schwermetalle und andere Xenobiotika (d. h. Chemikalien, welche lebensfremd sind) oder Giftstoffe sind häufig untoxisch oder nur minimal toxisch, wenn sie getrennt und einzeln einem Biotoxizitätsassay zugeführt werden, können jedoch eine unerwartet hohe Toxizität aufweisen, wenn sie in Kombination zugeführt werden (Pollak, J. K. 1998).
Um die unterschiedliche Toxizität in Wasserproben, von welchen bekannt ist, dass sie eine Reihe von Schadstoffen enthalten, zu demonstrieren, wird ein elektrophoretisches Verfahren verwendet.
Die Toxizität von Kombinationen von Chemikalien (chemische Gemische) wird über Protein-Protein (Aktin-Cofilin)-Wechselwirkungen detektiert, welche unter Verwendung nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder unter Verwendung eines anderen Lösungszustandes eines Festzustand-Assays überwacht werden.
BEISPIEL 12
Immobilisierte DNA, welche einen Farbstoff/Liganden enthält, wird zur Detektion von Schwermetallionen verwendet
DNA wird auf einem festen Träger, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, einer Membran, immobilisiert. Ein Beispiel für diese Membran ist ein kommerziell erhältliches Nylonmembranprodukt, welches Immobilon-Ny⁺-Transfermembran (erworben von Millipore Pty Ltd) genannt wird. DNA ist in der Lage, an eine Reihe von Fluoreszenzfarbstoffen, wie beispielsweise Acridinorange und Ethidiumbromid, zu binden, wobei die Farbstoffe an sich jedoch nicht binden. Unter Verwendung dieser Membran können im Subpicogrammbereich liegende Mengen an DNA detektiert werden. Die Bindung eines Farbstoffes wie beispielsweise Ethidiumbromid (EtBr) kann mittels einer einfachen visuellen Überprüfung unter Verwendung von gewöhnlichem Tageslicht oder einer künstlichen Glühlampe detektiert werden. Die Bindung eines Farbstoffes an die DNA wird auch durch Bestrahlen der DNA mit ultraviolettem Licht oder Licht aus dem nahen Ultraviolett detektiert, wobei die Fluoreszenz visuell beobachtet wird (siehe 1).
Daher wird die Toxizität von Schwermetallionen durch Hemmung der DNA-Ethidiumbromid-Wechselwirkung detektiert, wobei die DNA auf einem festen Membranträger immobilisiert ist.
BEISPIEL 13
Schwermetallionen bewirken sowohl eine Hemmung als auch Veränderung des Emissionsmaximums der Fluoreszenz von DNA-Ligandenfarbstoffen
Die Fluoreszenzemission von DNA-Farbstoffliganden wie beispielsweise Ethidiumbromid (EtBr) wird spektroskopisch in Lösung untersucht.
Es werden 5 μg/ml DNA und 2 μg/ml EtBr bei einem gleichen Volumen von 10 μl bereitgestellt und die Emissionsspektren aufgenommen, wie in 2 dargestellt.
Ein Zusatz von HgCl₂ führte zu einem konzentrationsabhängigen Quenching des Fluoreszenzsignals im Bereich von 1–100 μM. Veränderungen der Fluoreszenzintensität waren bei 2 μM erkennbar.
Daher wird die Toxizität von Schwermetallionen durch Hemmung der DNA-Ethidiumbromid-Fluoreszenz detektiert, wobei eine signifikante Abnahme der Fluoreszenzintensität bei Verwendung niedriger Konzentrationen an Schwermetallionen von 2 μM leicht erkennbar ist.
BEISPIEL 14
Schwermetallionen und/oder andere Schadstoffe verändern die Konformation von Proteinen, und verändern somit die spektralen Eigenschaften eines gebundenen Fluoreszenzfarbstoffes
Wird die Mikroumgebung, welche einen an ein Protein (wie beispielsweise Aktin) gebundenen Fluoreszenzfarbstoff umgibt, verändert, so führt dies zu einer Veränderung der spektralen Eigenschaften dieses Farbstoffes. Diese Eigenschaften sind entweder mit dem bloßen Auge oder spektrophotometrisch erkennbar.
Ein Beispiel hierfür ist die Cadmium-vermittelte Depolymerisation von Pyrenmarkierten Aktinfilamenten (Wang und Templeton, 1996). Diese ist nicht notwendigerweise auf polymere Proteine beschränkt und ist auf monomere Proteine (umfassend Aktin) anwendbar, welche mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Ein derartiges Beispiel ist die Verringerung der Fluoreszenzintensität von mit 1-Anilinonaphthalin-8-sulfonsäure (ANS) markiertem alpha-Chymotrypsinogen A, wenn dieses organischen Verbindungen wie beispielsweise Alkohol ausgesetzt wird (Kahn et al., 2000).
Die Anwesenheit von Schwermetallen, organischen Lösungsmitteln und/oder anderen Schadstoffen wird daher anhand spektraler Veränderungen von mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten Proteinen (oder anderen Liganden) detektiert, welche in Reaktion auf Konformationsänderungen und/oder strukturelle Änderungen am Protein oder Liganden auftreten.
Der Fachmann ist sich dessen bewusst, dass die hierin beschriebene Erfindung anderen Variationen und Modifikationen als jenen, welche spezifisch beschrieben sind, zugänglich ist. Es versteht sich, dass die Erfindung alle derartigen Variationen und Modifikationen umfasst. Die Erfindung umfasst ferner alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, auf welche im Rahmen dieser Patentschrift einzeln oder kollektiv Bezug genommen oder hingewiesen wird, sowie beliebige und alle Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Schritte oder Merkmale.
LITERATURVERZEICHNIS

Akinyele et al., 1999, J. Agric. Food Chem. 47: 2303–2307
Kekic und dos Remedios, 1999, Electrophoresis 20: 2053–2058
Khan et al., 2000, Biochim. Biophys. Acta 1481(2): 229–236
Markovic et al., 1997, Immunol. Cell Biol. 71 Supplement S3
Nipper et al., 1997, Ecotoxicol. 3: 109–115
Pollak et al., 1998, Int. J. Environm. Health Res. 8: 157–163
Read et al., 1997, Environmental Applications with Submitochrondrial Particles, CRC Press, Boca Raton, S. 1–35
Ruiz et al., 1997, Bull. Environ. Contam. Toxicol. 59: 619–625
Wang und Templeton, 1996, Toxicol. Appl. Pharmacol. 139(1): 115–121
Watanabe und Imai, 1981, Anal. Chem. 55: 1786–1791

Claims

Verfahren zur Detektion eines Giftstoffs umfassend ein Schwermetall oder ein Schwermetallion in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst, Inkontaktbringen der Probe, welche mutmaßlich den Giftstoff enthält mit einem an einen Fluoreszenzfarbstoff gebundenem Nukleinsäuremolekül und Durchmustern hinsichtlich entweder Dissoziation der Bindung zwischen dem Nukleinsäuremolekül und dem Farbstoff oder Hemmung der Bindung zwischen dem Nukleinsäuremolekül und dem Farbstoff, wobei Dissoziation oder Hemmung der Bindung für das Vorliegen des Giftstoffs indikativ ist.
Verfahren gemäß Anpruch 1, wobei der Farbstoff ausgewählt ist, aus der Gruppe, welche aus Acridinorange und Ethidiumbromid besteht.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Nukleinsäuremolekül auf einem festen Träger immobilisiert ist, welcher Glas, Polystyrol, Polymethacrylat, Zellulose, Nylon, Polyvinylchlorid oder Polypropylen umfasst.
Verfahren nach Anpruch 3, wobei der feste Träger Polystyrol oder Polymethacrylat ist.