DE69821527T2 - Ionen-nachweissystem bestehend aus ziel- und indikatorionophore tragenden teilchen - Google Patents

Description

• HINTERGRUND
• Die vorliegende Erfindung betrifft Systeme zum Nachweisen von Zielionen in Körperflüssigkeiten.
• Es besteht ein klinischer Bedarf, Zielionen in Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Urin und Spinalflüssigkeit zu detektieren bzw. nachzuweisen. Unter den Ionen, die gewöhnlich detektiert werden, sind Ca⁺⁺, Na⁺ und Cl^–. Eine Vorrichtung, die zum Nachweisen von Ionen genutzt wird, ist eine Elektrode, die eine meßbare elektronische Veränderung bei Kontakt mit Zielionen enthaltenden flüssigen Proben erzeugt.
• Eine weitere Einrichtung, die zum Nachweisen von Ionen verwendet wird, ist eine ionenspezifische Dünnfilmoptode. Diese Optoden enthalten einen Zielionophor, welcher mit dem Zielion, falls vorhanden, einen Komplex bildet, und einen Indikatorionophor, der eine Anzeige einer solchen Komplexbildung, wie beispielsweise durch einen Farbwechsel, liefert (vgl. beispielsweise Seiler et al., Clin. Chem. 37(8), 1350–1355).
• Ein Problem, das diesen beiden Vorrichtungen häufig zugeordnet ist, liegt darin, daß sie mit gewöhnlich verwendeten Techniken zum Nachweisen organischer Verbindungen in Körperflüssigkeiten nicht kompatibel sind. Organische Verbindungen werden typischerweise unter Verwendung von einem photometrischen System, in welchem Reagenzien mit einer Probe der Körperflüssigkeit unter Nutzung eines Pipettenzuliefersystems kombiniert werden, detektiert, und dann werden die Reagenzien nach dem Verwenden verworfen. Im Gegensatz dazu werden Elektroden und Dünnfilmoptoden in Kontakt mit der Probe gebracht, gesäubert und dann wiederverwendet. Dementsprechend benötigt eine klinische diagnostische Ausrüstung zwei verschiedene Systeme, eine wegwerfbare, fließfähige, auf Reagenzien basierende und eine andere auf wiederverwendeten Vorrichtungen basierend. Dies erhöht die Kosten der klinischen diagnostischen Ausrüstung, weil zwei unabhängige Meßsysteme und die diesbezügliche Hardware in einem Teil der Ausrüstung kombiniert werden müssen.
• Eine andere Schwierigkeit mit herkömmlichen Ionennachweissystemen ist die Notwendigkeit, die Vorrichtung wiederholt nach jedem Gebrauch zu reinigen, was zu den Kosten des diagnostischen Verfahrens hinzukommt.
• Ein drittes Problem, das herkömmlichen Ionennachweissystemen zugeordnet ist, liegt darin, daß nur Ionophore mit niedriger Affinität verwendet werden können, und zwar aufgrund der Notwendigkeit, die Zielionen von der Elektrode oder Optode nach jedem Gebrauch auszuwaschen, damit die Elektrode oder Optode für eine neue Probe verwendet werden kann. Wenn ein Ionophor mit hoher Affinität verwendet wird, treten Schwierigkeiten beim Auswaschen des Zielions auf, mit dem Ergebnis geringerer Durchsatzraten durch ein Instrument.
• Dementsprechend besteht ein Bedarf nach einem Verfahren zum Nachweisen eines Zielions in einer Probe einer Körperflüssigkeit, das die Ausrüstung nutzen kann, die mit derjenigen kompatibel ist, die zum Analysieren in Körperflüssigkeiten vorhandener organischer Verbindungen verwendet wird, die nicht konstantes Waschen erfordert und die mit Hochaffinitätsionophoren verwendet werden kann.
• ZUSAMMENFASSUNG
• Die vorliegende Erfindung genügt diesen Bedürfnissen, indem sie ein Nachweisverfahren zum Nachweisen eines Zielions in einer Probe einer Körperflüssigkeit unter Nutzung eines neuartigen Detektors bereitstellt. Der neuartige Detektor umfaßt eine Vielzahl von Optoden suspendiert in einer wäßrigen Lösung, beispielsweise einem Latex. Jede Optode umfaßt ein Teilchen, das einen Durchmesser von etwa 10 Nanometer bis etwa 20 Mikrometer aufweist. Die Teilchen sind in der Körperflüssigkeit unlöslich und weisen darin verteilt einen Zielionophor für das Ion und einen Indikatorionophor auf. Der Zielionophor ist befähigt, einen Komplex mit dem Zielion zu bilden, und der Indikatorionophor ist befähigt, ein detektierbares Signal als Folge der Komplexbildung des Zielionophors mit dem Zielion in der Probe zu erzeugen. Der Detektor kann durch das Anwenden von Standardionophoren bei bzw. auf einem herkömmlichen Latex gebildet werden.
• Jede Optode kann eine Vielzahl von gleichmäßig in dem Teilchen verteilten Zielionophoren und Indikatorionophoren umfassen. Ferner kann jede Optode in einem Detektor den gleichen Zielionophor oder verschiedene Zielionophore zum Nachweisen verschiedener Ionen umfassen. Der Detektor kann auch verschiedene Optoden zum Nachweisen verschiedener Zielionen umfassen. Der Indikatorionophor kann ein pH-Wert anzeigender Chromoionophor oder ein pH-Wert anzeigender Fluoroionophor sein.
• Das Zielion kann aus einer Gruppe, bestehend aus Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium und Chlorid, ausgewählt werden. Der Detektor kann mit einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten, einschließlich Urin und Blut, verwendet werden.
• In dem Assay bzw. Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung wird die Probe mit dem neuartigen Detektor in einem Analysator in Kontakt gebracht. Typischerweise umfaßt die Probe eine Körperflüssigkeit, die für die Analyse, beispielsweise durch das Puffern mit einem pH-Wert-Puffer, behandelt wurde. Die Bedingungen, beispielsweise pH-Wert und Temperatur, im Analysator werden derart beibehalten, daß der Zielionophor einen Komplex mit dem Zielion bildet und der Indikatorionophor ein detektierbares Signal, wie einen Farbwechsel, erzeugt. Im Allgemeinen wird die Temperatur bei Raumtemperatur beibehalten. Das detektierbare Signal wird dann nachgewiesen, typischerweise unter Verwendung eines Spektrophotometers.
• Die vorliegende Erfindung betrifft nicht nur dieses Nachweisverfahren, sondern auch den neuartigen Detektor und die Optoden, die den Detektor aufbauen. Aufgrund der geringen Größe der Optoden sind diese pipettierbar. Daher sind sie wie jedes andere fließfähige Reagenz verwendbar, das in kommerziellen Analysatoren verwendet wird, und sind daher mit Systemen auf Reagenz-Basis, die für organische Verbindungen verwendet werden, kompatibel. Die Optoden sind preiswert und entsorgbar, so daß sie nicht gesäubert und wiederverwendet werden müssen, wie dies bei Elektroden und Dünnfilmoptoden der Fall ist. Dies vereinfacht kommerzielle klinische Nachweissysteme in einem hohen Maß.
• ZEICHNUNG
• Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung, die beigefügten Ansprüche und die begleitende Zeichnung, in der 1 die Absorptionsspektren bei zwei verschie denen pH-Werten für einen Latex zeigt, der mit 126 nm Oxazin 750 beladen wurde, besser verstanden.
• BESCHREIBUNG
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen eines Zielions in einer Probe einer Körperflüssigkeit unter Nutzung neuartiger Detektoren, die eine Vielzahl von in einer wäßrigen Lösung suspendierten Optoden umfassen. Jede Optode umfaßt ein Teilchen, das ausreichend klein ist, um pipettierbar zu sein. Jedes Teilchen weist darin verteilt einen Zielionophor für ein Ion und einen Indikatorionophor auf, um anzuzeigen, wenn ein Zielionophor mit einem Zielion einen Komplex bildet.
• Die Erfindung ist auf alle Sorten von Proben von Körperflüssigkeiten, einschließlich Vollblut, Spinalflüssigkeit, Blutserum, Urin, Speichel, Samen, Tränen usw., anwendbar. Die flüssige Probe kann unverdünnt oder nach Verdünnung oder nach der Behandlung mit einem Puffer untersucht werden.
• Die Optoden werden durch das Kombinieren der Indikatoren mit Latexteilchen gebildet. Die Latexteilchen sind normalerweise wasserunlösliche, hydrophobe organische polymere Teilchen wie Polystyrol, Polyparamethystyrol, Polymethylmethacrylat, Polyethylmethacrylat, Polyethylendimethacrylat, Polyvinylidenchlorid, Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat, Polypropylen, Methylmethacrylat-Styrol-Copolymer, Polyacrolein, Polybutadien und Polydivinylbenzol.
• Der Polymerlatex enthält üblicherweise grenzflächenaktive Mittel als Stabilisatoren. Jedoch können die Teilchen stabilisierende geladene Gruppen auf ihren Oberflächen aufweisen, in diesem Fall werden grenzflächenaktive Mittel nicht benötigt. Polymerlatexteilchen können auch von dem Einbringen von Plastifiziermitteln profitieren.
• In dieser Erfindung werden zuweilen andere Additive in den Optoden zu der Verstärkung der Extraktion des Zielions aus der wäßrigen Probe und der Migration des Zielions in die Phase der organischen Teilchen genutzt. Dies kann durch das Bereitstellen von lipophilen anionischen Stellen bewirkt werden. Beispiele solcher Additive sind:
  NaTm(CF₃)₂PB (Natriumtetrakis[3,5-bis(trifluormethyl)phenyl]borat),
  ETH500 (Tetradodecylammoniumtetrakis(p-chlor-phenyl)borat)
  und KTpClPB (Kaliumtetrakis(4-chlorphenyl)borat).
• Die Größe der Latexteilchen ist eine Funktion konkurrierender Kriterien. Ein Faktor, der die obere Teilchengröße beeinflußt, ist die Tatsache, daß die Teilchen gleichmäßig in einer Suspension einer wäßrigen Flüssigkeit verteilt bleiben müssen. Dies begrenzt die Teilchen auf eine maximale Größe von etwa 20 Mikrometer. Die Mindestteilchengröße wird durch die Notwendigkeit festgelegt, die Teilchen mit den Ionophoren zu beladen und übermäßige Lichtstreuung während des Nachweisverfahrens zu vermeiden. Die Teilchen können alternativ eines nach dem anderen beobachtet werden (beispielsweise in einem Durchflußzytometer). In diesem Fall liegt die bevorzugte Größe in dem Bereich von 1–20 Mikrometer.
• Es wurde bestimmt, daß wirksame Teilchen einen Durchmesser von etwa 10 nm bis etwa 20 Mikrometer aufweisen, vorzugsweise von etwa 50 nm bis etwa 300 nm, und am bevorzugsten von etwa 100 nm bis etwa 200 nm. Die Größe der Teilchen wird durch eine Lichtstreuungstechnik gemessen, wie sie von The Dawn Instrument, hergestellt von Wyatt Technology in Santa Barbara, Kalifornien, U.S.A., verwendet wird.
• Die vorliegende Erfindung verwendet herkömmliche Ionophore. Es können jedoch, da die Optoden in der vorgestellten Erfindung nicht wieder verwendet werden müssen, Zielionophore mit einer hohen Affinität für das Zielion verwendet werden.
• Während die vorliegende Diskussion primär Chromoionophore, wie pH-Wert-Indikatoren als der Indikatorionophor, betrifft, ist die Verwendung von Fluoroionophoren ebenso anwendbar. Das Signal ist nicht auf Farbwechsel beschränkt; eine Modifikation der Fluoreszenz oder der Chemilumineszenz ist auch verwendbar. Viele pH-Wert-Indikatoren (wie Fluoreszein und Oxazin 750) zeigen einen Wechsel bezüglich der Fluoreszenzintensität oder des Fluoreszenzspektrums in verschiedenen Protonisierungszuständen.
• Tabelle I stellt Beispiele von Analyten und verwandten Zielionophoren bereit, die in der Umsetzung der Erfindung verwendbar sind. Tabelle II zeigt repräsentative Indikatorionophore, die typischerweise ein Chromoionophor oder ein Fluoroionophor sind, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
• TABELLE I

  Analyt	Zielionophor
  Ammonium	Monactin
  Ammonium	Monactin
  Natrium	ETH2120
  Natrium	ETH4120
  Chlorid	Chlor(octaethylporphyrinato)indium
  Kalium	Valinomycin
  Calcium	ETH 1001

• TABELLE II Indikatorionophore
• ETH 5350
• ETH 2439
• ETH 5294
• ETH 2412
• Dies sind gebräuchliche Namen für diese Materialien. Die chemischen Namen sind folgende:
  

  ETH#	CHEMISCHER NAME
  ETH2120	[N,N,N',N'-Tetracyclohexyl-1,2-phenylendioxydiacetamid]
  ETH4120	[4-Octadecanoyloxymethyl-N,N,N',N'-tetracyclohexyl-1,2-phenylendioxydiacetamid]
  ETH 1001	[(-)-R,R)-N,N'-Bis-[11-(ethoxycarbonyl)undecyl]-N,N'-4,5-tetramethyl-3,6-dioxaoctan-diamid; Diethyl-N,N'-[(4R,5R)-4,5-dimethyl-1,8-dioxo-3,6-dioxaoctamethylen]bis(12-methylaminododecanoat)]
  ETH5350	[9-(Diethylamino)-5-[(2-octydecyl)imino]benzo[a]phenoxazin]
  ETH2439	[9-Dimethylamino-5-[4-16-butyl-2,14-dioxo-3,15-dioxaeicosyl)phenylimino]benzo[a]phenoxazin]
  ETH5294	[9-(Diethylamino)-5-octadecanoylimino-5H-benzo[a]phenoxazin]
  ETH2412	[5-Octadecanoyloxy-2-(4-nitrophenylazo)phenol]

• Im allgemeinen sind die beiden Ionophore verschiedene Moleküle. Jedoch ist es in der Ausübung dieser Erfindung möglich, eine Verbindung zu verwenden, in welcher der Indikatorionophor und der Zielionophor in einem Molekül verbunden sind. Zum Beispiel beschreiben Vaidya et al., Anal. Chem. 1995, 67, 4101–4111 zwei verwendbare neue Kronenether-Verbindungen, N,N'-Bis(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-4,13-diazadibenzo-18-Krone-6(CCE) und N,N'-Bis(7-hydroxy-4-methylcoumarin-8-methylen)-4,13-diazadibenzo-18-Krone-6(FCE), in welchen beide funktionellen Molekularstrukturen in der gleichen Verbindung vorhanden sind. Ebenfalls Nakamura et al., Analytica Chimica Acta, 139 (1982) 219–227, der die chromogenen Kronenether (2-Hydroxy-3,5-dinitrophenyl)oxymethyl-18-Krone-6, der Kalium detektiert, und (2-Hydroxy-3,5-dinitrophenyl)oxymethyl-15-Krone-5, der Natrium detektiert, beschreibt.
• Jede Optode kann verschiedene Zielionophore und verschiedene Indikatorionophore enthalten. Somit kann eine Suspension von Optoden zum Nachweisen von mehr als einem Zielion verwendet werden.
• Die festen Latexteilchen dieser Erfindung enthalten vorzugsweise den Indikatorionophor und den Zielionophor in einem molaren Verhältnis von etwa 0,1 zu 100 und mehr bevorzugt in einem molaren Verhältnis von etwa 0,5 zu 25.
• Die festen Latexteilchen enthalten typischerweise den Indikatorionophor und den Zielionophor in kombinierten Mengen von gleich zu etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht der beladenen Latexteilchen, und vorzugsweise von etwa 25 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-%.
• Ein zufriedenstellendes Verfahren zum Beladen der Ionophore in Latexteilchen basiert auf Verfahren, die zum Anfärben oder Färben von Latexteilchen verwendet werden. Ein typisches Verfahren (zurückzuführen auf John W. Vanderhoff von der Lehigh Universität) wird auf den Seiten 41 und 42 von „Uniform Latex Particles", veröffentlicht von Bangs Laboratories, Inc., Carmel, Indiana, beschrieben.
• Das Beladen der Latexteilchen mit dem Zielionophor und dem Signalio nophor kann auf folgende Weise durchgeführt werden. Die Teilchen werden vorübergehend mit den Ionophoren in einer Lösungsmittel-Lösung gequollen, um die Ionophore in die Teilchen zu bringen; dann wird das Lösungsmittel abdestilliert, wobei die Ionophore in den Teilchen festsitzend zurückgelassen werden. Die Teilchen kehren annähernd zu ihrer vorherigen Größe zurück (keine permanente Quellung). Die detaillierten Schritte sind wie folgt:
• a. Die zu beladenen Latexteilchen werden mit einem Feststoffanteil von <10% in Wasser hergestellt.
• b. Es werden Öl-lösliche Ziel- und Indikatorionophore mit einer ziemlich minimalen Wasserlöslichkeit ausgewählt. Die Ionophore sind vorzugsweise überwiegend Öl-löslich, müssen aber eine minimale Löslichkeit in Wasser haben, da die Diffusion von dem Emulsionströpfchen durch die wäßrige Phase zu dem Latexteilchen eine Voraussetzung dieser Vorgehensweise ist.
• c. Das Ziel („target") und die Indikatoren werden in Xylol, Methylenchlorid oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel wie Benzol, Toluol, Chloroform, Dioxandimethylformamidacetat, Methylethylketon gelöst. Das ausgewählte Lösungsmittel sollte folgende Eigenschaften aufweisen: (1) niedrige Löslichkeit in Wasser; (2) ein „gutes" Lösungsmittel für den Polymerlatex; (3) einen viel geringeren Dampfdruck als die Ionophore.
• d. Die Konzentrationen der Ziel- und Indikatorionophore werden nahe der Sättigung verwendet, um ein maximales Beladen der Teilchen zu erreichen; es können sich jedoch einige Ionophor-Kristalle in der wäßrigen Phase bilden, wenn die Grenze der Löslichkeit überschritten ist. Somit sollte die Ionophor-Konzentration zumindest leicht unterhalb der Sättigung sein.
• e. Es werden 1 bis 3 Teile der Lösungsmittel-Lösung pro Teil der Latexfeststoffe verwendet (man nehme für 0,1 Mikrometer Teilchen etwa 1 Teil Lösungsmittel pro Teil Latexfeststoff; für 1 Mikrometer Teilchen nehme man bis zu 3 Teilen Lösungsmittel pro Teil Latexfeststoff). Das Verhältnis der Ionophor-Lösung, die mit dem Latex gemischt wird, muß so sein, daß sie vollständig von den Latexteilchen absorbiert werden kann. Andernfalls bleiben einige Ionophor-Emulsionströpfchen nicht-absorbiert übrig und können ein Farbstoffpräzipitat im Wasser bilden, wenn das Lösungsmittel entfernt ist. Das Verhältnis des Lösungsmittels, das durch die Teilchen absorbiert werden kann, erhöht sich mit dem Ansteigen der Teilchengröße und der Abnahme der Polymer/Wasser-Grenzflächenspannung.
• f. Die wäßrige Latexsuspension (<10% Feststoff) wird unter dem tropfenweisen und sehr langsamen Hinzufügen der Ionophor-Lösung leicht gerührt. Man halte das Rühren regelmäßig an, um zu sehen, ob Lösungsmitteltröpfchen zu der Oberfläche schweben (Xylol) oder sich absondern (CH₂Cl₂), um eine separate Phase zu bilden. Wenn eine Phasentrennung erfolgt, fahre man mit dem Rühren fort, man verlangsame jedoch die Rate der Zugabe der Ionophor-Lösung, so daß das Lösungsmittel von den Teilchen so schnell aufgenommen wird, wie es zugefügt wird. Die passende Zugaberate kann nur ein Tropfen alle paar Sekunden sein. Dieser Zugabeschritt kann von wenigen Stunden bis zu einigen Tagen dauern. Wenn die Ionophor-Lösung zu schnell zugegeben wird, kann sie zu viel von der Lösungsmittel-in-Wasser Emulsion bilden. Dann können sich die Latexteilchen in der emulgierten Lösungsmittelphase unter dem Bilden von großen „klebrigen" Kügelchen aus Ionophor/Lösungsmittel/Polymer lösen (anstatt daß sich Lösungsmittel und Ionophore in den Polymerteilchen lösen). Das Quellen ist vollständig, wenn die Teilchen beim Anhalten des Rührens sämtliches Lösungsmittel und Ionophore aufgenommen haben und das Lösungsmittel keine separate Phase mehr bildet.
• g. Das Lösungsmittel wird durch das Verwenden eines Rotationsevaporators (wie von Rinco oder Buchi/Brinkmann hergestellt) unter reduziertem Druck abdestilliert. Die Suspension kann auf 40–50°C erwärmt werden, um den Dampfdruck zu erhöhen. Das Lösungsmittel wird mit Wasser unter Bildung eines Azeotrops abdestilliert, wodurch die Ionophore in den Teilchen zurückbleiben. Die Destillation wird fortgeführt, bis kein weiteres Lösungsmittel mit dem Wasser herüberkommt. Es kann notwendig sein, regelmäßig Wasser hinzuzugeben, um den Latex vom Austrocknen abzuhalten. Ein grenzflächenaktives Mittel kann in diesem Schritt zugegeben werden, um die Teilchenstabilität, falls notwendig, zu unterstützen.
• Eine wäßrige Suspension des Detektors, der Probe und von jeglichem vorliegenden Puffer wird üblicherweise zu einer Reaktionskammer oder zu einer Küvette in einen Analysator gegeben. Dies liefert eine im wesentlichen einheitliche Dispersion der Latexteilchen in der gepufferten Probe.
• Die Optoden werden in einem Analysator durch das Inkontaktbringen der Probe mit einer Vielzahl an Optoden, die in einer wäßrigen Lösung suspendiert sind, verwendet. Wenn ein Zielion vorhanden ist, bildet der Zielionophor, der vorzugsweise spezifisch für das Zielion ist, Komplexe mit dem Zielion und der Indikatorionophor liefert ein detektierbares Signal als ein Ergebnis der Komplexbildung des Zielionophors mit dem Zielion. Der pH-Wert und die Temperatur in dem Analysator werden beibehalten, so daß diese Komplexbildung eintreten kann und der Indikatorionophor ein detektierbares Signal erzeugen kann.
• Die wäßrige Lösung des beladenen Latex und die Probe werden gewöhnlich zu einem Reaktionsgefäß durch eine Pipette hinzugefügt. Das resultierende Gemisch ist eine im wesentlichen gleichmäßige bzw. einheitliche Dispersion der Latexteilchen in dem pH-Wert gepufferten Reaktionsgemisch.
• Ein Lichtstrahl wird dann durch die Küvette oder die Reaktionskammer geleitet und das nicht von dem Inhalt der Küvette absorbierte Licht wird gesammelt und von einem Photodetektor analysiert. Das auftreffende Licht kann sogenanntes „weißes" Licht sein und das nicht-absorbierte Licht wird zur Analyse in seine farbigen Komponenten zerlegt.
• Wenn alternativ der Indikatorionophor ein Fluoreszenzsignal entwickelt, wird anregendes Licht durch die Küvette geleitet und ein Photodetektor mißt das emittierte Fluoreszenzlicht.
• Herkömmliche Lichtquellen und Nachweissysteme können verwendet werden. Jedes Ion von Interesse verursacht, wenn es mit dem Zielionophor in Kontakt kommt, eine Veränderung des Signals, das von dem Zielionophor erzeugt wird. Somit kann die Konzentration des Zielions von Interesse in der Küvette durch die Analyse des Lichts, das den Photodetektor erreicht, bestimmt werden.
• Häufig ist es notwendig, die Konzentration der Wasserstoffionen zu kontrollieren, um die Konzentration der Zielionen zu bestimmen. Dies wird am schnell sten durch das relative Konstanthalten der Wasserstoffionenkonzentration durch pH-Wert gepufferte Reaktionsgemische erreicht. Einige Proben sind inhärent gepuffert. Blut, Serum und Plasma sind Beispiele für solche gepufferten Proben. Verschiedene Muster weisen verschiedene pH-Werte auf, so daß der pH-Wert unabhängig zur Feststellung der Zielionenkonzentration gemessen werden muß, wenn der inhärente Puffer der Probe genutzt wird.
• Jedoch ist es bevorzugt, den pH-Wert des Reaktionsgemischs mit einem Puffer zu kontrollieren. Dies reduziert Effekte, verursacht durch Abweichungen in dem Proben-pH-Wert, und erlaubt die Wahl eines optimalen pH-Werts für die Optode. Das Verhältnis der Probe in einem Reaktionsgemisch wird zum Teil von der Pufferkapazität der Probe bestimmt. Ein ausreichend kleines Verhältnis der Probe muß gewählt werden um zuzulassen, daß der Puffer den pH-Wert des Gemisches dominiert.
• Die den pH-Wert anzeigenden Ionophore der Wahl weisen hohe pK-Werte auf und die Latexsuspensionen, die diese pH-Wert-Indikatoren enthalten, werden vorzugsweise nahe dieses pK-Werts gepuffert. Somit wird die wäßrige Lösung üblicherweise so gepuffert, daß sie den pH-Wert bei oder um den pKa, bei welchem der pH-Wert-Indikatorionophor die Farbe wechselt, beibehalten. Geeignete Puffersysteme für die oben diskutierten pH-Wert-Indikatorsysteme sind bereits bekannt. Typische Puffer sind Natriumphosphat und Tris(hydroxymethyl)aminomethan. Somit ist es in dem Assay bevorzugt, daß der pH-Wert des Reaktionsgemischs bei etwa dem pH-Wert, bei dem der Indikatorionophor die Farbe wechselt, beibehalten wird.
• Es ist möglich, mehrere Ionenanalysen gleichzeitig in einer einzigen Probe durch das Verwenden eines Latexcocktails mit verschiedenen Farbindikatorionophoren, die verschiedenen Zielionophoren zugeordnet sind, durchzuführen. Alternativ können ähnliche Färbungen verwendet werden, wenn die Optoden eine nach der anderen, wie in einem Durchflußzytometer, ausgelesen werden.
• 1 ist eine Spektrophotometer-Kopie der optischen Dichte von Suspensionen von Oxazin 750 beladenem Latex bei verschiedenen pH-Werten. Spur 2 zeigt einen Verlust der Höchstwerte der dekadischen Extinktion in dem Bereich von 620 nm, nachdem der pH-Wert des Mediums auf über 10 mit Natriumhydroxid erhöht wurde. Dies wurde von einem deutlichen Farbwechsel von blau nach rosa begleitet.
• Dies demonstriert die Retention des pH-Wert-Ansprechens, wenn der Indikator in Polystyrol-Latex beladen wurde, was eine notwendige Bedingung für eine zufriedenstellende Optode ist.
• Die folgenden Beispiele sind für die Erfindung erläuternd.
• Beispiel I – Calcium-Nachweisverfahren bzw. -Assay
• Latex-Formulierung (Latex 1)
• 120 nm Polystyrol-Latex, beladen unter Verwendung von Xylol als Lösungsmittel mit
• 8 Gew.-% ETH 1001 Calciumionophor
• 2 Gew.-% ETH 5294 pH-Wert-Indikator
• 4 Gew.-% NaTm (CF₃)₂PB-Additiv mit lipophiler anionischer Stelle, verdünnt auf 1% Feststoffe im Assay-Puffer 1, der vorstehend beschriebenen „Beladen von Teilchen"-Methode folgend.
• Assay-Puffer 1
• 10^–3 M Zitronensäure, mit 0,1 N NaOH auf pH-Wert 6,5 eingestellt
• Reaktionsgemisch
• Latex, suspendiert zu 0,1% Feststoffe (30 Mikroliter Latex 1) 5 Vol.-% Serum (Probe) (15 Mikroliter)
• Puffer auf ein Gesamtvolumen von 300 Mikroliter (255 Mikroliter) ausgleichen
• Messung
• Messen der dekadischen Extinktion bei 660 nm in 5 mm Küvette
• Beispiel II – Kalium-Assay (künftiges Beispiel)
• Latex-Formulierung (Latex II)
• 120 nm Polystyrol-Latex, beladen unter Verwendung von Xylol als Lösungsmittel mit
• 1 Gew.-% Valinomycin-Kaliumionophor
• 0,5 Gew.-% ETH 5294 pH-Wert-Indikator
• 0,5 Gew.-% NaTm KTpClPB-Additiv mit lipophiler anionischer Stelle, verdünnt auf 1% Feststoffe im Assay-Puffer II, der vorstehend beschriebenen „Beladen von Teilchen"-Methode folgend.
• Assay-Puffer II
• 0,02 M Natriumacetatsäure, auf pH-Wert 5,1 mit 1 M Essigsäure eingestellt
• Reaktionsgemisch
• Latex, suspendiert zu 0,1% Feststoffe (30 Mikroliter Latex II) 5 Vol.-% Serum (Probe) (15 Mikroliter)
• Puffer auf ein Gesamtvolumen von 300 Mikroliter (255 Mikroliter) ausgleichen
• Messung
• Messen der dekadischen Extinktion bei 660 nm in 5 mm Küvette
• Obwohl die vorliegende Erfindung in beträchtlichem Maße ausführlich in Bezug auf bestimmte bevorzugte Versionen davon beschrieben worden ist, sind andere Versionen möglich. Zum Beispiel wurde die vorliegende Erfindung dahin beschrieben, daß der Detektor eine Vielzahl von Optoden umfaßt, wobei jede Optode befähigt ist, ein einziges Zielion nachzuweisen, und wobei alle Optoden für das bestimmte Zielion sind. Alternativ kann jede der Optoden mehrere Zielionen nachweisen oder ein Detektor kann eine Vielzahl von verschiedenen Optoden umfassen, um eine Vielzahl von verschiedenen Zielionen nachzuweisen. Alternativ kann der Detektor eine einzelne große Optode enthalten, in diesem Fall ist die obere Grenze der Teilchengröße nicht etwa 20 Mikrometer, sondern vielmehr etwa 200 Mikrometer. Die maximale Größe wird in diesem Fall von der Größe der Durchflußleitungen oder der Proben oder Pipetten, die zum Transport der Optode verwendet werden, bestimmt.

Claims (26)

1. Ionen-Detektor zum Nachweisen eines Zielions, das in einer Probe einer Körperflüssigkeit vorliegt, wobei der Detektor umfaßt: eine Vielzahl von Optoden, suspendiert in einer wäßrigen Flüssigkeit, wobei jede Optode umfaßt: ein Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 10 nm bis etwa 20 Mikrometer, wobei die Teilchen unlöslich in der Körperflüssigkeit sind und darin verteilt einen Zielionophor für das Zielion und einen Indikatorionophor aufweisen, wobei der Zielionophor befähigt ist, einen Komplex mit dem Zielion zu bilden, und der Indikatorionophor befähigt ist, ein detektierbares Signal als Folge der Komplexbildung des Zielionophors mit dem Zielion in der Probe zu erzeugen.
2. Verfahren zum Nachweisen eines Zielions in einer Probe einer Körperflüssigkeit, welches die Schritte umfaßt: a) das Inkontaktbringen der Probe mit einem Detektor in einem Analysator, wobei der Detektor eine Vielzahl von Optoden umfaßt, die in einer wäßrigen Suspension suspendiert sind, wobei jede Optode ein Teilchen umfaßt, das einen Durchmesser von etwa 10 nm bis etwa 20 Mikrometer aufweist, wobei die Teilchen in der Körperflüssigkeit unlöslich sind und darin verteilt einen Zielionophor für das Zielion und einen Indikatorionophor aufweisen, wobei der Zielionophor befähigt ist, einen Komplex mit dem Zielion zu bilden, und der Indikatorionophor befähigt ist, ein detektierbares Signal als Folge der Komplexbildung des Zielionophors mit dem Zielion in der Probe zu erzeugen. b) das Beibehalten der Bedingungen im Analysator, so daß der Zielionophor einen Komplex mit dem Zielion bildet und der Indikatorionophor ein detektierbares Signal erzeugt; und b) das Nachweisen des detektierbaren Signals.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Probe Körperflüssigkeit umfaßt, die mit einem Puffer gepuffert ist.
4. Optode zum Nachweisen eines Zielions in einer Körperflüssigkeit, wobei die Optode ein wasserunlösliches Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 10 nm bis etwa 200 Mikrometern umfaßt, wobei das Teilchen in der Körperflüssigkeit unlöslich ist und darin verteilt einen Zielionophor für das Zielion und einen Indikatorionophor aufweist, wobei der Zielionophor befähigt ist, einen Komplex mit dem Zielion zu bilden, und der Indikatorionophor befähigt ist, ein detektierbares Signal als Folge der Komplexbildung des Zielionophors mit dem Zielion in der Probe zu erzeugen.
5. Detektor nach Anspruch 4, wobei der Durchmesser des Teilchens etwa 10 nm bis etwa 20 Mikrometer beträgt.
6. Erfindung nach Anspruch 1, wobei die Optoden pipettierbar sind.
7. Erfindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei jede Optode eine Vielzahl von Zielionophoren und Indikatorionophoren, die gleichmäßig in dem Teilchen verteilt sind, umfaßt.
8. Erfindung nach Anspruch 4, umfassend eine Vielzahl von Zielionophoren und Indikatorionophoren, die gleichmäßig in dem Teilchen verteilt sind.
9. Erfindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Zielionophor und der Indikatorionophor in dem gleichen Molekül vorhanden sind.
10. Erfindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Durchmesser von jedem Teilchen etwa 50 nm bis etwa 300 nm beträgt.
11. Erfindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Durchmesser des Teilchens etwa 100 nm bis etwa 200 nm beträgt.
12. Erfindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei jede Optode den gleichen Zielionophor umfaßt.
13. Erfindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei zumindest einige Optoden unterschiedliche Zielionophore für unterschiedliche Zielionen umfassen.
14. Erfindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Detektor unterschiedliche Optoden zum Nachweis unterschiedlicher Zielionen umfaßt.
15. Detektor nach Anspruch 1, wobei die Teilchen wasserunlösliche, hydrophobe organische polymere Teilchen sind.
16. Detektor nach Anspruch 1, wobei der Indikatorionophor ein pH-Wert anzeigender Chromoionophor ist.
17. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Körperflüssigkeit Urin oder Blut ist.
18. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Nachweisens des Signals das Durchleiten von Licht durch die wäßrige Lösung umfaßt.
19. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Zielion aus der Gruppe bestehend aus Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium und Chlorid, ausgewählt ist.
20. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Körperflüssigkeit mehrere Ionen von Interesse enthält und mehrere Ionen detektiert werden.
21. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Detektierens unter Verwendung eines Spektrophotometers ausgeführt wird.
22. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Inkontaktbringens das Zugeben des Detektors zu der Probe durch Pipettieren umfaßt.
23. Detektor nach Anspruch 1, wobei einer der Ionophore ein Chromoionophor ist.
24. Detektor nach Anspruch 1, wobei einer der Ionophore ein Fluoroionophor ist.
25. Detektor nach Anspruch 1, wobei einer der Ionophore ein pH-Wert-Indikator ist.
26. Detektor nach Anspruch 1, wobei einer der Ionophore ein pH-Wert anzeigender Fluoroionophor ist.