WO2003079030A1 - Verfahren zur charakterisierung hochparallelisierter liquidhandlingstechnik mittels mikroplatten sowie testkit zur durchführung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur charakterisierung hochparallelisierter liquidhandlingstechnik mittels mikroplatten sowie testkit zur durchführung des verfahrens Download PDF

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WO2003079030A1
WO2003079030A1 PCT/DE2003/000834 DE0300834W WO03079030A1 WO 2003079030 A1 WO2003079030 A1 WO 2003079030A1 DE 0300834 W DE0300834 W DE 0300834W WO 03079030 A1 WO03079030 A1 WO 03079030A1
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sample
reagent
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microplate
optical measurement
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PCT/DE2003/000834
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Heidrun Rhode
Anton Horn
Margarete Schulze
Gerhard Cumme
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Cybio Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Definitions

  • the invention relates to a method for characterizing highly parallelized liquid handling technology using microplates and to a test kit for carrying out the method. It is used wherever highly paralized liquid handling technology is to be characterized with regard to correctness and precision, especially when the volumes handled are in the ⁇ l or sub- ⁇ l range and the characterization is to take place under conditions that correspond to the real conditions of use of liquid handling technology correspond.
  • Liquid handling technology with a large number of channels for sample handling such as multipipettes with 96 or 384 channels or more, provides a large number of sample volumes in individual cavities of a microplate arranged as a grid for multi-channel sample preparation and evaluation or storage or transport etc.
  • the correctness and accuracy of the sample handling is of crucial importance for the quality and usability of the analysis results. For this reason, for the provider and also for the user of such liquid handling technology, a test criterion is increasingly in the foreground, which may also serve as a quality standard, certification basis and the like. would be helpful.
  • gravimetric methods and methods are used for this characterization, which measure the dilution of an analytical signal of a sample, which is easy to follow per se, by means of a diluent.
  • signals are, for example, optical signals or radioactivity of a sample.
  • the parallelized dosing technology should be characterized with this technology, especially since the large number of characterizing individual channels would otherwise be very difficult to calibrate.
  • the reader technology for microplates is based on the principle of vertical photometry, i.e. it does not have a defined layer thickness of the individual cavity.
  • the layer thickness is determined by the volume used and by the meniscus that forms and, depending on the surface properties of the analyte and the mechanical conditions of handling the microplate, is subject to not inconsiderable variability.
  • the absorbance of the water in the infrared range is used in US Pat. No.
  • an absorbance-measuring reader is used to measure the sample volume of a channel in liquid handling technology with n channels, a diluent volume VD is placed in the individual cavities of the microplate, a sample volume Vp which contains a dye Fj in the concentration CPFI and which is to be determined , added and mixed.
  • the multiplicative errors are mainly the variable layer thickness due to the formation of a meniscus and the temperature-dependent changes in ⁇ ; Additive-acting errors are caused, for example, by air bubbles forming more frequently and sometimes precipitates, scratches and lint. A large part of these errors, which ultimately influence the analytical result of the volume determination, can be eliminated by multi-wavelength photometry. Such a procedure is described, for example, for determining the temperature in microplates with thermochromic indicators by absorbance measurement (DE 199 28 056).
  • test kit for the practical implementation of the method is also to be provided.
  • sample volumes are dispensed into the cavities of at least one microplate using the liquid handling technique to be characterized, with regard to the selection, nature and amount of sample or reagent liquid
  • Individual channels under conditions of greatly reduced evaporation determine an average sample or reagent volume based on the number of channels in liquid handling technology by gravimetry, - each sample or reagent volume, which for optical measurements each have a first indicator with specific optical properties and at least a second indicator with contains the first indicator of different optical properties, each mixed with a diluent which contains the same at least second indicator in an identical concentration as the sample or reagent volume, but not the first indicator,
  • Intensity deviation of the corresponding standardized optical measurement signal to the optical mean intensity value is determined.
  • an average value of all sample or reagent volumes simultaneously delivered to the microplate by the liquid handling technique to be characterized is determined.
  • This mean sample or reagent volume is preferably determined by highly precise and repeated weighing, the sample or reagent volumes being dispensed by the liquid handling technique into empty cavities of the microplate as well as to a microplate in the cavities of which the diluent has already been placed , Said optical measurement signals and the relative evaluation of the channel-specific intensity deviations from a normalized optical intensity mean value can also be determined for a precise evaluation with high accuracy.
  • each cavity of the microplate at least two individual optical measurement signals at different wavelengths are determined in terms of their intensities, the at least second optical measurement signal being used in the normalization of the first optical measurement signal to eliminate the cavity-related interference factors mentioned.
  • buffers are preferably used, the pH values of which do not change or change very little when the temperature changes.
  • the mean sample or reagent volume is proportional to the mean intensity value of the standardized optical measurement signals, so that from the respective channel-related intensity deviation of the corresponding standardized optical measurement signal from the intensity mean value of all standardized optical measurement signals, the volume deviation and therefore also for each cavity Characterization of the liquid handling technique determined sample volume can be calculated.
  • the said measurement signal intensity deviations can be presented as so-called false color representations in a matrix corresponding to the channel geometry of the liquid handling technique.
  • the representation of the aforementioned cavity-specific sample or reagent volumes determined to characterize the liquid handling technique in such a matrix corresponding to the channel geometry of the liquid handling technique is also expedient for the evaluation. It is advantageous that the characterization of liquid handling technology can take place under conditions ⁇ coming a proper use of liquid handling technology and the microplate in terms of sample handling and analysis very close. These conditions are realized in particular by suitable selection, nature and volumes of sample liquid and diluent as well as by adequate sample delivery, treatment and analysis per se. The results obtained with the method according to the invention are therefore highly relevant not only for liquid handling device manufacturers
  • the kit consists of a set of instructions and at least five provided solutions (Lj a , L a , Ljf, L 2 f, L), from which the sample or reagent volumes and the diluent can be produced, depending on the application.
  • Two solutions (L ⁇ a , L 2a ) are provided for photometric measurements and two solutions (Lj f , L 2f ) are provided for fluorescence measurements.
  • the solutions L ia and Li f are stock solutions for the respective first optical indicator, the solutions L 2a and L 2f are stock solutions for the respective second optical indicator.
  • Solution L 3 is a stock solution of a quasi temperature-insensitive buffer (0.5 to 1 M phosphate buffer, pH 11.0).
  • the solution L ! A consists of 30 mM to 300 mM p-nitrophenol in 96% (vol / vol) ethanol and the solution L 2a consists of 30 mM to 300 mM phenolphthalein in 96% (vol / vol) ethanol.
  • the solution Li f consists of 30 mM to 300 mM methylumbelliferone in dimethyl sulfoxide and the solution L 2f consists of 0.3 mM to 30 mM fluorescein in 0.1 M phosphate buffer, pH 11.0.
  • Fig. 1 Temperature dependence of the p-nitrophenol absorbance in the diethanolamine buffer (application example 4)
  • Fig. 2 Temperature dependence of the phenolphthalein absorbance in the diethanolamine buffer (application example 4)
  • Fig. 3 Temperature dependence of the p-nitrophenol absorbance in the phosphate buffer
  • FIG. 5 Standard deviations of different individual masses each consisting of 15 individual weighings in microplates (application example 9).
  • FIG. 6 Matrix-shaped representation of the quotient values A1 / A2 for each cavity of the microplate (application example 10).
  • FIG. 7 Matrix-shaped representation of the from gravimetry determined average sample or reagent volume and the relative photometric deviations calculated sample or reagent volumes ( ⁇ l) for each cavity of the microplate (application example 10)
  • a 384-channel dosing device is to be characterized as an example of a liquid handling technique under application-related conditions for its intended use by means of absorbance measurements.
  • 384 x 48 ⁇ l of a diluent (solution D, 0.1 M phosphate buffer, pH 11.0, with 0.04 mM phenolphthalein), which was prepared from solutions L 2a and L 3 of a kit in accordance with the procedure, are pipetted into the cavities of two 384-well microplates, which are sealed with a tightly closed lid be covered.
  • the first microplate is used to evaluate the dosage; the second microplate is used to determine the loss of evaporation during the handling period.
  • Both microplates are then weighed to detect an "empty weight" m ⁇ of the first microplate and an initial weight m a of the second microplate.
  • 2 ⁇ l of a sample solution P are pipetted into the cavities with the respectively presented solution D of the first microplate using the 384-channel dosing device to be characterized.
  • the solution P consists of 0.1 M phosphate buffer, pH 11.0, with 0.04 mM phenolphthalein and 0.06 mM p-nitrophenol and was prepared from solutions L ⁇ a , L 2a and L 3 of the kit mentioned according to the instructions.
  • All handling processes for the aforementioned pipetting of the solution P are also carried out with the second microplate for reference, but without actually pipetting the solution P into the cavities with the respectively presented solution D of the second microplate. Then both microplates with lids are weighed again.
  • the new weight of the first microplate m corresponds to the sum of the empty weight (mi) and the weight ( ⁇ m) by the pipetting process minus the evaporation (m v ) .
  • the new weight (final weight) of the second microplate m e results from the initial weight m a minus the weight loss due to the evaporation weight m v .
  • density Pip of the pipetting solution (solution P) is determined by weighing, known per se, using a pycnometer, and a calculation is made of the mean volume Vp delivered to the cavities of the first microplate with pipetting with respect to all channels of the 384-channel dosing device Solution P.
  • the first microplate is placed in a shaker known per se for approx. 60 min.
  • the assigned optical mean values are formed from all 384 quotients and difference quotients of the first microplate and the deviation of the quotient or difference quotient value from the respective optical mean value is recorded for each cavity.
  • the relative deviations of the channel-specific values from the mean values of the quotients and difference quotients formed are thus determined. These deviations are proportional to the relative channel-specific deviations of the pipetted channel-specific sample volumes from the mean sample volume of the first microplate determined by gravimetry.
  • False color representations of the said relative deviation from the respective mean value are helpful as a visual evaluation aid for quick and clear assessment.
  • Solutions of different p-nitrophenol concentrations are prepared by adding a p-nitrophenol stock solution in 0.1 M phosphate buffer (pH 11.0) with 0.04 mM phenolphthalein using 0.1 M phosphate buffer (pH 11.0) with 0 , 04 mM phenolphthalein is gradually diluted.
  • 50 ⁇ l of the differently concentrated p-nitrophenol working solutions are simultaneously introduced into eight different cavities of a 384-well microplate with a multi-channel dosing device and in a reader (SpektraFluor Plus, from Tecan) at wavelengths of 405 nm (AI), 540 nm ( A2) and 620 nm (A3) measured, the bandwidth of the filter is ⁇ 10 nm.
  • the intra-assay precision of the 8 identical solutions are listed in Table 1 below.
  • the absorbance at 540 nm (A2) is in the range from 0.44 to 0.46. It can be seen that the precision strongly depends on the absolute absorbance, with a sales minimum in the absorbance range of 0.35 to 0.53. The quotient formation significantly improves the precision in this area. Due to the difference quotient formation, a precision improvement can only be achieved with high absorbances.
  • the precision found in the optimal absorbance range denotes the maximum statement that can be achieved with the method for precision of the individual channels with the specified color system and the specified reader.
  • Solutions of different p-nitrophenol concentrations are prepared by adding a p-nitrophenol stock solution in 0.1 M phosphate buffer (pH 11.0) with 0.04 mM phenolphthalein using 0.1 M phosphate buffer (pH 11.0) with 0 , 04 mM phenolphthalein is gradually diluted.
  • 150 ⁇ l of the differently concentrated p-nitrophenol working solutions are introduced into individual cavities of a 96-well microplate with a multi-channel dosing device on three different days at a time and in the reader at wavelengths of 405 nm (AI), 540 nm (A2) and 620 nm ( A3) measured, the bandwidth of the filter is ⁇ 10 nm.
  • the inter-assay precisions of the three determinations are shown in Table 2 below.
  • the absorbance at 540 nm (A2) is in the range from 0.398 to 0.42.
  • the measurement precision is significantly improved by forming quotients.
  • the results but also show that optical means alone cannot be used to determine the correctness (with a deviation of ⁇ 0.5%) for multichannel dispensers in the entire volume range.
  • Both dyes were dissolved both in 0.1 M diethanolamine buffer (pH 10) and in 0.1 M phosphate buffer (pH 11.0) in such a way that an absorbance of approx. 0.5 was achieved with a layer thickness of 1 cm. These solutions were measured repeatedly in a thermostated photometer (Contron) at different temperatures. The temperature was set ascending and descending by a rinsing water bath and measured by means of a thermal sensor in the measuring cell.
  • FIGS. 1 and 2 show the temperature dependence of the p-nitrophenol absorbance
  • FIG. 2 shows that of the phenolphthalein absorbance.
  • a small temperature-dependent change in the p-nitrophenol absorbance (AI) was found compared to phenolphthalein.
  • the phenolphthalein absorbance (A2) shows a clear linear drop of on average 0.0073 / K in the range from 28 ° C to 37 ° C. This leads to a linear increase in the absorbance quotient A1 / A2 of 0.025 / K.
  • Phosphate buffer In comparison to the diethanolamine buffer, there was a slight temperature-dependent linear increase in the p-nitrophenol absorbance of only 0.0003 / K (FIG. 3) and one linear decrease in phenolphthalein absorbance of 0.0001 / K (Fig. 4) found in the range from 25 ° C to 39 ° C. This is less than a seventieth of the decrease in the absorbance of phenolphthalein in diethanolamine buffer. This leads to a very slight linear increase in the absorbance quotient of 0.0008 / K. With a quotient of, for example, 0.6, this last value corresponds to a deviation of 0.13% / customer is thus smaller than the measurement precision found by known readers.
  • Multi-channel dispenser dispensed into the cavities of 384-well microplates. To do this, each. such volumes of a solution D of 0.04 mM phenolphthalein in 0.1 M phosphate buffer (pH 11.0) were distributed into the individual cavities with another precise multi-channel metering device that the total volume in each cavity was 50 ⁇ l. The microplates were sealed with adhesive films and shaken for 60 minutes, then the absorbances were measured in the reader at wavelengths of 405 nm (AI) and 540 nm (A2).
  • AI 405 nm
  • A2 540 nm
  • Sample solutions consisting of methylumbelliferone and 2 ⁇ M fluorescein in 0.1 M diethanolamine buffer (pH 9.8) were dispensed into the cavities of 384-well microplates using a multi-channel dosing device to be characterized.
  • the methylumbelliferon concentration is variable and given in column 1 of table 6, the volume in column 2.
  • different volumes of a solution of 2 ⁇ M fluorescein in 0.1 M diethanolamine buffer (pH 9.8) were mixed in with another precise multichannel dosing device pipetted the cavities of the microplates. These volumes were chosen so that a final volume of 50 ⁇ l resulted.
  • the microplates were shaken for 60 min and then measured in a reader at wavelengths of 460 nm (Flul, excitation 365 nm) and 535 nm (Flu2, excitation 485 nm).
  • Example 9 Precision of weighing: Different dry individual masses were determined 15 times with a precision balance in such a way that microplates with 384 or 1536 cavities were used as supports. 5 shows the standard deviations from 15 individual weighings for different individual masses. For weighings with the microplate empty weight, for 384-well microplates approx. 56 g and for 1536-well microplates approx. 34 g, there is an average standard deviation of the weighing for individual masses in the range of 5-1300 mg of 0.0699 mg or 0.0618 mg (Fig. 5).
  • the standard deviation is relatively constant when weighing in microplates and is independent of the individual mass (Fig. 5). For different pipetted individual volumes, this means very small but also different relative errors (see Tab. 7). In the extreme case (384 x 0.05 ⁇ l sample volume in 384-well microplates) less than 0.4% errors are on average, and for all other volumes significantly smaller errors for the accuracy of the weighing are to be expected. Therefore, the weighing error due to the imprecision of the scales in the volume or Neglect mass ranges. Weighing is therefore the method of choice for determining the correct dose.
  • Pipetting variant a Pipetting solution P into a dry microplate. In doing so
  • Pipetting variant b Pipetting solution P into a solution filled with 49 ⁇ l of solution D.
  • Solution P consists of 0.04 mM phenolphthalein and 3 mM p-nitrophenol in
  • FIGS. 6 and 7 each show a false color representation of the relative deviation from the photometric plate means and the actual metering volumes derived therefrom for each cavity of the microplate 1 and thus for each assigned channel of the metering device.
  • FIG. 6 represents the quotient A1 / A2 for each cavity and FIG. 7 shows the dosing volumes calculated from the mean sample volume determined by gravimetry and the channel-specific relative photometric deviations.
  • mean field color cavity whose value deviation in the area of the plate means ⁇ 1%

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Charakterisierung einer mehr- oder vielkanaligen Handlingtechnik angegeben, dass speziell für höherparallelisierte Vorrichtungen und für sehr kleine Probenvolumina vorteilhaft einsetzbar ist. Erfindungsgemäss werden aus der Gesamtheit der Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit aller Einzelkanäle der Liquidhandlingtechnik ein mittleres Proben- bzw. Reagenzvolumen durch Gravimetrie bestimmt, aus optischen Mess-Signalen aller jeweils mit einem Diluent vermischter Proben- bzw. Reagenzvolumina ein normierter optischern Intensitätsmittelwert gebildet und die Volumengenauigkeit jedes Einzelkanals der Liquidhandlingtechnik unter Bezug auf das mittlere Proben- bzw. Reagenzvolumen aus der Intensitätsabweichung des normierten optischen Mess-Signals des Einzelkanals zum normierten optischen Intensitätsmittelwert bestimmt. Ausserdem wird ein Testkit zur vorteilhaften Durchführung des Verfahrens angegeben. Die Erfindung findet überall dort Verwendung wo hochparallelisierte Liquidhandlingtechnik hinsichtlich Richtigkeit und Präzision charakterisiert werden soll, insbesondere dann, wenn die hantierten Volumina im ~tl- oder sub-pl-Bereich liegen und eine Charakterisierung unter realitätsnahen Einsatzbedingungen erfolgen soll.

Description

Beschreibung der Erfindung
Verfahren zur Charakterisierung hochparallelisierter Liquidhandlingtechnik mittels Mikroplatten sowie Testkit zur Durchführung des Verfahrens
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung hochparallelisierter Liquidhandlingtechnik mittels Mikroplatten sowie einen Testkit zur Durchführung des Verfahrens. Sie findet überall dort Verwendung, wo hochparalleiisierte Liquidhand- lingtechnik hinsichtlich Richtigkeit und Präzision charakterisiert werden soll, insbesondere dann, wenn die hantierten Volumina im μl- oder sub-μl-Bereich liegen und die Charakterisierung unter Bedingungen erfolgen soll, welche den realen Einsatzbedingungen der Liquidhandlingtechnik entsprechen. Die Liquidhandlingtechnik mit einer Vielzahl von Kanälen für das Probenhandling, wie beispielsweise Multipipetten mit 96 oder 384 Kanälen oder mehr, stellt eine Vielzahl von Probenvolumina in als Raster angeordneten Einzelkavitäten einer Mikroplatte zur vielkanaligen Probenvorbereitung und -auswertung oder Lagerung bzw. Transport etc. bereit. Die Richtigkeit und Genauigkeit des Probenhandlings ist von entscheidender Bedeutung für die Qualität und Verwendbarkeit der Analysenergebnisse. Aus diesem Grunde steht für den Anbieter und auch für den Nutzer solcher Liquidhandlingtechnik mehr und mehr ein Prüfkriterium im Vordergrund, welches möglicherweise auch als Qualitätsmaßstab, Zertifizierungsgrundlage u. ä. hilfreich wäre.
In den letzten Jahren haben hochparalleiisierte, extrem miniaturisierte Analyseverfahren, die auf der Mikroplattentechnologie beruhen, zur Entwicklung einer großen Zahl von neuen und effektiven Applikationen geführt, insbesondere für die targetorientierte
Wirkstoffsuche, für die Genom- und Proteomanalytik und für zahlreiche andere Gebiete der Biotechnologie, Medizin und Umweltforschung. Für das vielkanalige Handling der Proben wurden eine entsprechend hochparalleiisierte Technik zur Vielkanaldosierung, Readertechnologie und andere dazu passfähige technologische Entwicklungen geschaffen, die aus den beschriebenen Gründen möglichst anwendungsnah zu charakterisieren wäre.
Außerdem sollte die Charakterisierung der Vielzahl der Einzelkanäle praktikabel sein, darf keinen inadäquat hohen analytischen Aufwand erfordern und sollte hinreichend präzise sein.
Wie für viele Pipetten seit langem bekannt, werden für diese Charakterisierung gravimetri- sche Verfahren und solche Verfahren eingesetzt, welche die Verdünnung eines an sich leicht zu verfolgenden analytischen Signals einer Probe durch einen vorgelegten Diluenten messen. Solche Signale sind beispielsweise optische Signale oder Radioaktivität einer Probe.
Die gravimetrischen Verfahren sind sehr präzise, werden aber für den μl- und sub-μl- Bereich kaum nutzbar, sofern die Aussagen zur Präzision und Richtigkeit in einem Bereich von besser als 0,5 % gefordert werden. Außerdem wird ihr Einsatz erstens durch die besonders in diesem Volumenbereich stark hinderliche Verdunstung und zweitens durch Praktikabilitätsprobleme (es müssen statt bisher lediglich 1 bis maximal 12 Kanäle nunmehr sehr viele Einzelkanäle charakterisiert werden) nahezu unmöglich gemacht. Bisher beschränkten sich solche Untersuchungen auf relativ große Einzel Volumina (z. B. GIT Laborzeitschrift 11/2001, 1185-86). Probleme bereitet zur Charakterisierung dabei auch die Realisierung anwendungsnaher Bedingungen.
Photometrische Verfahren zur Kalibrierung von Pipetten wurden schon in den 80er Jahren beschrieben. So wird beispielsweise in der US 4,354,376 ein Kit zur Kalibrierung von Pipetten beschrieben, welcher auf dem Prinzip einer Messung der Verdünnung von Farblösungen beruht. In der US 5,492,673 wird ein Reagenzsystem zur colorimetrischen Kalibrierung von Pipetten beschrieben, welches zur Schichtdickenkorrektur der verwendeten runden Küvetten, zur Vermeidung von Nichtlinearitäten der gemessen Absorbanzen als Funktion der Farbstoffkonzentration, hervorgerufen durch Agglomerisation, und sowie zur Stabilitätsverbesserung des vorgeschlagenen Reagentienkits eine besondere Mischung von Substanzen verwendet. Die Mischung besteht aus einem 2-Puffersystem mit jeweils einem Farbindikator, wobei sich die Farbindikatoren stark in der Lage der Wellenlängen der Maxima der Lichtabsorbtion unterscheiden. Außerdem enthält die Mischung agglomeri- sationshemmende und stabilitätsverbessernde Substanzen. Es ist allerdings ein erheblicher Korrekturaufwand zum Ausschluss von gerätespezifischen Beeinflussungen durch das verwendete Photometer und durch die Küvetten sowie von Einflüssen insbesondere der Umgebungstemperatur erforderlich.
Die Verfügbarkeit von paralleler Readertechnologie legt es nahe, die parallelisierte Dosiertechnik mit dieser Technologie zu charakterisieren, zumal die große Zahl der zu charakterisierenden Einzelkanäle ansonsten nur sehr schwer zu kalibrieren wäre. Dabei ist aber zu bedenken, dass die Readertechnologie für Mikroplatten auf dem Prinzip der Vertikalphotometrie basiert, also keine festgelegte Schichtdicke der Einzelkavität aufweist. Die Schichtdicke wird durch das eingesetzte Volumen und durch den sich ausbildenden Meniskus bestimmt und unterliegt, abhängig von den Oberflächeneigenschaften des Analysegutes und den mechanischen Bedingungen der Hantierung der Mikroplatte, nicht unerheblichen Variabilitäten. Zur Kompensation der Schichtdickenunsicherheit wird in der US 6,188,476 die Absorbanz des Wassers im Infrarotbereich ausgenutzt, um die gemessenen Absorbanzen des Analysegutes auf eine Einheitsschichtdicke zu normieren. Die praktische Erfahrung zeigt aber, dass sich durch diese Korrektur zwar die mittlere Schichtdicke bestimmen lässt eine Kompensation des Einflusses der individuellen Menisci aber nur unbefriedigend gelingt.
Wird im einfachsten Fall zur Messung des Probenvolumens eines Kanals der Liquidhandlingtechnik mit n Kanälen ein absorbanzmessender Reader verwendet, so wird in die Einzelkavitäten der Mikroplatte ein Diluentvolumen VD vorgelegt, ein Probenvolumen Vp, welches einen Farbstoff Fj in der Konzentration CPFI enthält und welches zu bestimmen ist, dazugegeben und gemischt. Die gemessenen n Absorbanzen der Probelösung Ap und der n Mischungen AM sind nach dem Lambert-Beerschen Gesetz Funktionen der jeweiligen Konzentrationen der Lösungen und der Schichtdicke d:
Figure imgf000004_0001
AM= εF] *C Fi * M, wobei C FI die Konzentration des Farbstoffs Fi in der Mischung und ε den Extinktionskoeffizienten des Indikators bezeichnen. Der Dilutionsfaktor DF
DF = CMF,/CPF1 = Vp/(VP+VD) kann zur Bestimmung von Vp verwendet werden.
Vp=ND* DF/(1-DF) = VD*CMFI/CPF1/ (1 - CMFI/CPFI ) (1)
Aus der Gleichung (1) ist zu erkennen, dass die Präzision der Bestimmung von Vp von der Präzision der Bestimmung von zwei Absorbanzen im Reader und von der Genauigkeit des vorgelegten Volumens VD abhängig ist.
Die Genauigkeit der in Readern gemessenen Absorbanzen A hängt von multiplikativ wirkenden (f) und additiv wirkenden (a) Fehlern ab: A,=A* f+ a .
Multiplikativ wirkende Fehler sind hauptsächlich die durch Meniskusbildung variabel gestaltete Schichtdicke und die temperaturabhängige Änderungen von ε; additiv wirkende Fehler werden beispielsweise durch häufiger zu beobachtende Luftbläschenbildung und manchmal zu beobachtende Präzipitate, Kratzer und Fussel hervorgerufen. Ein großer Teil dieser Fehler, die letztlich das analytische Resultat der Volumenbestimmimg beeinflussen, lässt sich durch Mehrwellenlängenphotometrie eliminieren. Ein solches Vorgehen wird beispielsweise zur Bestimmung der Temperatur in Mikroplatten mit thermochromen Indikatoren durch Absorbanzmessung beschrieben (DE 199 28 056). Praktische Unter- suchungen zur Variabilität der in Readern gemessenen Absorbanzen zeigen, dass man unter Nutzung der Mehrwellenlängenphotometrie zwar eine gute Präzision der Relativwerte der Absorbanzen in den Einzelwells einer Mikroplatte bezogen auf das Mittel aller gemessenen Wells (intra-assay-Präzision) erhält, dass die für verschiedene Platten gemessenen bzw. erhaltenen Einzel- und Mittelwerte der Absorbanzen aber inakzeptabel hohe Abweichungen aufweisen.
Wenn es um den Einsatz der Readertechnologie zur Charakterisierung von Multipipetten geht, gilt es außerdem zu berücksichtigen, dass es für Mikroplatten mit höherer Kavitätendichte als 384 pro Mikroplatte (insbesondere 1536 Kavitäten und mehr) gegenwärtig keine Reader gibt, die Lichtabsorbanzen hinreichend genau messen können.
Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren vorzustellen, mit dem hochparalleiisierte Liquidhandlingtechnik vorzugsweise für Volumina im μl- und sub-μl-Bereich unter Bedingungen, welche der bestimmungsgemäßen Verwendung dieser Liquidhandlingtechmk sehr nahe kommen, aufwandgering sowie mit hoher Genauigkeit hinsichtlich Richtigkeit und Präzision charakterisiert werden kann.
Es soll ferner ein Testkit zur praktikablen Durchführung des Verfahrens angegeben werden.
Zur Lösung dieser Aufgabe werden mit der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik in die Kavitäten mindestens einer Mikroplatte jeweils Probenvolumina abgegeben, wobei hinsichtlich Auswahl, Beschaffenheit und Menge von Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit
(Pipettierlösung) und Diluent sowie bezüglich Probenabgabe, -behandlung und -analyse Bedingungen gewählt werden, die einer bestimmungsgemäßen Verwendung der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik und der Mikroplatte möglichst nahe kommen. Erfindungsgemäß werden
- aus allen durch die zu charakterisierende Liquidhandlingtechnik jeweils gleichzeitig in die Kavitäten der Mikroplatte abgegebenen Proben- bzw. Reagenzvolumina der
Einzelkanäle unter Bedingungen stark reduzierter Verdunstung ein auf die Kanalzahl der Liquidhandlingtechnik bezogenes mittleres Proben- bzw. Reagenzvolumen durch Gravimetrie ermittelt, - jedes Proben- bzw. Reagenzvolumen, welches für optische Messungen jeweils einen ersten Indikator mit spezifischen optischen Eigenschaften und zumindest einen zweiten Indikator mit zum ersten Indikator unterschiedlichen optischen Eigenschaften enthält, jeweils mit einem Diluent vermischt, der denselben zumindest zweiten Indikator in identischer Konzentration wie das Proben- bzw. Reagenzvolumen, nicht aber den ersten Indikator enthält,
- für jede mit Mischung aus Proben- bzw. Reagenzvolumen und Diluent gefüllte Kavität der Mikroplatte zumindest jeweils ein durch den ersten Indikator hervorgerufenes erstes optisches Mess-Signal sowie in gleicher Weise jeweils ein durch den zweiten Indikator hervorgerufenes zweites optisches Mess-Signal erzeugt,
- jedes erste optische Mess-Signal jeweils durch das zumindest zweite optische Mess- Signal der zugehörigen Kavität der Mikroplatte zum Zweck einer Fehlerkompensation insbesondere zur Eliminierung von Einflüssen der Kavitätsgeometrie, der Form der Flüssigkeitsoberfläche in der Kavität, der Blindabsorbanzen durch Kratzer, Bläschen und Fussel etc., bezüglich seiner Intensität normiert,
- aus allen normierten optischen Mess-Signalen ein auf die Kanalanzahl der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechmk bezogener normierter optischer Intensitäts- mittelwert gebildet und für jede Kavität der Mikroplatte jeweils die Intensitätsabweichung des korrespondierenden normierten optischen Mess-Signals vom normierten optischen Intensitätsmittelwert erfasst und
- das Volumen jedes Kanals der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik unter Bezug auf das durch Gravimetrie bestimmte mittlere Proben- bzw. Reagenzvolumen aus der
Intensitätsabweichung des korrespondierenden normierten optischen Mess-Signals zum optischen Intensitätsmittelwert bestimmt. Mit dem vorgeschlagenen Verfahren wird zunächst ein Mittelwert aller von der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik an die Mikroplatte gleichzeitig abgegebenen Proben- bzw. Reagenzvolumina bestimmt. Dieses mittlere Proben- bzw. Reagenzvolumen wird vorzugsweise über hochgenaue und wiederholte Wägung ermittelt, wobei die Abgabe der Proben- bzw. Reagenzvolumina von der Liquidhandlingtechnik sowohl in leere Kavitäten der Mikroplatte als auch an eine Mikroplatte erfolgen kann, in deren Kavitäten bereits der Diluent vorgelegt ist. Auch die besagten optischen Mess-Signale und die Relativauswertung der kanalspezifischen Intensitätsabweichungen zu einem normierten optischen Intensitätsmittelwert können für eine präzise Auswertung mit hoher Genauigkeit bestimmt werden. Es werden für jede Kavität der Mikroplatte jeweils zumindest zwei einzelne optische Mess-Signale bei unterschiedlichen Wellenlängen in ihren Intensitäten ermittelt, wobei das zumindest zweite optische Mess-Signal bei der Normierung des ersten optischen Mess-Signals zur Eliminierung der genannten kavitätsbezogenen Störfaktoren dient. Für eine Reduktion des möglichen Einflusses unterschiedlicher Temperaturen in den Einzelkavitäten der Mikroplatte über die Temperaturabhängigkeit des Extinktionskoeffizienten ε der Indikatoren, werden vorzugsweise Puffer verwendet, deren pH-Werte sich bei geänderter Temperatur nicht oder sehr gering verändern. Unter Bezug auf das sehr exakt bestimmbare mittlere Proben- bzw. Reagenzvolumen aller durch die Liquidhandlingtechnik an die Mikroplatte abgegebenen Proben- bzw. Reagenzvolumina kann die Volumengenauigkeit jedes Kanals der Liquidhandlingtechnik mit hoher Präzision jeweils aus der Intensitätsabweichung des normierten kavitätsspezifischen optischen Mess-Signals vom normierten optischen Intensitätsmittelwert bestimmt werden. Das mittlere Proben- bzw. Reagenzvolumen ist proportional zum Intensitätsmittelwert der normierten optischen Mess-Signale, so dass aus der jeweiligen kanalbezogenen Intensitätsabweichung des korrespondierenden normierten optischen Mess-Signals vom Intensitätsmittelwert aller normierten optischen Mess-Signale die Volumenabweichung und damit auch für jede Kavität das zur Charakterisierung der Liquidhandlingtechnik ermittelte Probenvolumen errechnet werden kann.
Zur übersichtlichen visuellen Charakterisierung der Liquidhandlingtechnik können die besagten Mess-Signal-Intensitätsabweichungen als sog. Falschfarbendarstellungen in einer der Kanalgeometrie der Liquidhandlingtechnik entsprechenden Matrix präsentiert werden. Auch die Darstellung der vorgenannten zur Charakterisierung der Liquidhandlingtechnik ermittelten kavitätsspezifischen Proben- bzw. Reagenzvolumina in einer solchen der Kanalgeometrie der Liquidhandlingtechnik entsprechenden Matrix ist für die Bewertung zweckmäßig. Vorteilhaft ist, dass die Charakterisierung der Liquidhandlingtechnik unter Bedingungen¬ erfolgen kann, die einer bestimmungsgemäßen Verwendung der Liquidhandlingtechnik und der Mikroplatte in Hinsicht auf Probenhandling und -analyse sehr nahe kommen. Diese Bedingungen werden insbesondere durch geeignete Auswahl, Beschaffenheit und Volumina von Probenflüssigkeit und Diluent sowie durch adäquate Probenabgabe, -behandlung und -analyse an sich realisiert. Damit haben die mit dem erfmdungsgemäßen Verfahren ermittelten Ergebnisse eine hohe Relevanz nicht nur für Liquidhandling-Gerätehersteller
(hier wären nunmehr Grundlagen für entsprechende Standards gegeben), sondern auch durch ihren praxisnahen Bezug für Anwender dieser Liquidhandlingtechnik und dadurch auch für die Interpretation von Analysenergebnissen.
In den Unteransprüchen 2 bis 29 sind weitere Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen
Verfahrens angeführt.
Darüber hinaus wird ein spezieller Testkit zur vorteilhaften Durchführung des Verfahrens angegeben. Der Kit besteht aus einer Handlungsanweisung und zumindest fünf bereitgestellten Lösungen (Lja, L a, Ljf, L2f, L ), aus denen anwendungsspezifisch jeweils die Proben- bzw. Reagenzvolumina und der Diluent hergestellt werden können. Zwei Lösungen (Lιa, L2a) sind dabei für photometrische Messungen und zwei Lösungen (Ljf, L2f) sind für Fluoreszenzmessungen vorgesehen. Die Lösungen Lia und Lif sind Stammlösungen für den jeweiligen ersten optischen Indikator, die Lösungen L2a und L2f sind Stammlösung für den jeweiligen zweiten optischen Indikator. Die Lösung L3 ist eine Stammlösung eines quasi temperaturunempfindlichen Puffers (0,5 bis 1 M Phosphatpuffer, pH 11,0).
Alle Kit-Lösungen werden im Vergleich zur Arbeitskonzentration hochkonzentriert bereitgestellt. Für die Photometrie bestehen die Lösung L!a aus 30 mM bis 300 mM p-Nitrophenol in 96 % (vol/vol) Äthanol und die Lösung L2a aus 30 mM bis 300 mM Phenolphthalein in 96 % (vol/vol) Äthanol. Für die Fluorimetrie bestehen die Lösung Lif aus 30 mM bis 300 mM Methylumbelliferon in Dimefhylsulfoxid und die Lösung L2f aus 0,3 mM bis 30 mM Fluoreszein in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 11,0.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Anwendungsbeispielen näher erläutert werden. Es zeigen:
Fig. 1 : Temperaturabhängigkeit der p-Nitrophenol-Absorbanz im Diäthanolamin- Puffer (Anwendungsbeispiel 4) Fig. 2: Temperaturabhängigkeit der Phenolphthalein-Absorbanz im Diäthanolamin- Puffer (Anwendungsbeispiel 4) Fig. 3: Temperaturabhängigkeit der p-Nitrophenol-Absorbanz im Phosphat-Puffer
(Anwendungsbeispiel 4) Fig. 4: Temperaturabhängigkeit der Phenolphthalein-Absorbanz im Phosphat-Puffer (Anwendungsbeispiel 4)
Fig. 5: Standardabweichungen verschiedener Einzelmassen aus jeweils 15 Einzel- wägungen in Mikroplatten (Anwendungsbeispiel 9) Fig. 6: Matrixförmige Darstellung der Quotientenwerte A1/A2 für jede Kavität der Mikroplatte (Anwendungsbeispiel 10) Fig. 7: Matrixförmige Darstellung der aus dem durch Gravimetrie ermittelten mittleren Proben- bzw. Reagenzvolumen und den relativen photometrischen Abweichungen errechneten Proben- bzw. Reagenzvolumina (μl) für jede Kavität der Mikroplatte (Anwendungsbeispiel 10)
Anwendungsbeispiel 1 :
Es soll ein 384-Kanal-Dosierer als Beispiel für eine Liquidhandlingtechnik unter a wendungsnahen Bedingungen für dessen bestimmungsgemäße Verwendung mittels Absor- banzmessungen charakterisiert werden. Zunächst werden mit einem präzisen Dosierer 384 x 48 μl eines Diluenten (Lösung D, 0,1 M Phosphatpuffer, pH 11,0, mit 0,04 mM Phenolphthalein) der aus Lösungen L2a und L3 eines Kits entsprechend der Handlungsvorschrift hergestellt wurde, in die Kavitäten von zwei 384-well-Mikroplatten pipettiert, welche durch einen dicht schließenden Deckel abgedeckt werden. Die erste Mikroplatte dient der Evaluation der Dosierung; durch die zweite Mikroplatte soll der Verdunstungsverlust im Hantierungszeitraum ermittelt werden. Beide Mikroplatten werden danach gewogen, um ein "Leergewicht" m\ der ersten Mikroplatte und ein Anfangsgewicht ma der zweiten Mikroplatte zu erfassen. Nach den Wägungen werden mit dem zu charakterisierenden 384-Kanal-Dosierer je 2 μl einer Probenlösung P in die Kavitäten mit der jeweils vorgelegten Lösung D der ersten Mikroplatte pipettiert. Die Lösung P besteht aus 0,1 M Phosphatpuffer, pH 11,0, mit 0,04 mM Phenolphthalein und 0,06 mM p-Nitrophenol und wurde aus Lösungen Lιa, L2a und L3 des erwähnten Kits nach Handlungsvorschrift hergestellt. Alle Hantierungsvorgänge für die vorgenannte Pipettierung der Lösung P werden zur Referenz auch mit der zweiten Mikroplatte durchgeführt, ohne jedoch die Lösung P tatsächlich in die Kavitäten mit der jeweils vorgelegten Lösung D der zweiten Mikroplatte zu pipettieren. Im Anschluss daran werden beide Mikroplatten mit Deckel erneut gewogen. Das neue Gewicht der ersten Mikroplatte m entspricht der Summe aus Leergewicht (mi) und der Zuwaage (Δm) durch den Pipettiervorgang abzüglich der Verdunstung (mv). das neue Gewicht (Endgewicht) der zweiten Mikroplatte me resultiert aus dem Anfangsgewicht ma abzüglich des Gewichtsverlustes durch das Verdunstungsgewicht mv. Es ergeben sich folgende Beziehungen: Δm = m2 - mi + mv und mv = ma - n e. Des Weiteren erfolgen eine Bestimmung der Dichte ξ der Pipettierlösung (Lösung P) durch an sich bekannte Wägung mittels eines Pyknometers sowie eine Berechnung des mit Pipettierung in Bezug auf alle Kanäle des 384-Kanal-Dosierers an die Kavitäten der ersten Mikroplatte abgegebenen mittleren Volumens Vp der Lösung P. Vp=Δm/(ξ*384) =(m2-mι+ma-me)/(ξ*384) Die erste Mikroplatte wird in einem an sich bekannten Schüttler für ca. 60 min. geschüttelt, so dass sich die in den Kavitäten befindlichen Lösungen D und P gut durchmischen, und im Anschluss daran erfolgt die Ermittlung der Absorbanzen von p-Nitrophenol, Phenolphthalein und der Blindabsorbanz durch photometrische Messungen bei den Wellenlängen von 405 n , 540 nm und 620 nm. Aus den für jede Kavität der ersten Mikroplatte bei den genannten Wellenlängen gemessenen Absorbanzwerten erfolgt zur Normierung der Absorbanz des ersten Indikators p-Nitrophenol mit kavitätsspezifischen Zusatzsignalen für jede Kavität jeweils die Bildung des Quotienten A 05/A540 sowie des Differenzenquotienten (A4o5-A62o)/(A540-A62o). Zur Berechnung und Weiterbehandlung dieser Werte findet vorzugsweise eine an sich bekannte rechentechnische Tabellenkalkulation Anwendung.
Aus allen 384 Quotienten und Differenzenquotienten der ersten Mikroplatte werden jeweils die zugeordneten optischen Mittelwerte gebildet und für jede Kavität die Abweichung des Quotienten- bzw. Differenzenquoti entenwertes vom jeweiligen optischen Mittelwert erfasst. Somit werden die relativen Abweichungen der kanalspezifischen Werte von den Mittelwerten der gebildeten Quotienten und Differenzenquotienten ermittelt. Diese Abweichungen sind proportional zu den relativen kanalspezifϊschen Abweichungen der pipettierten kanalspezifischen Probenvolumina zum aus dem durch Gravimetrie bestimmten mittleren Probenvolumen der ersten Mikroplatte.
Das Verhältnis f= Ik/Im der photometrischen Intensitätsabweichung einer Kavität (Ik) zum photometrischen Intensitätsmittelwert (Im) lässt sich auf Grund dieser Proportionalität auf das Verhältnis f= Vk/Vm der Volumen- Abweichimg (Vk) desselben Kanals vom Volumen-Mittel (Vm) beziehen. Das pipettierte Volumen jedes Kanals entspricht dann Vk = f * Vm.
Als visuelle Bewertungshilfe zur schnellen und übersichtlichen Beurteilung sind Falschfarben-Darstellungen der besagten relativen Abweichung zum jeweiligen Mittelwert hilfreich.
Anwendungsbeispiel 2:
Intra-assay-Präzision der photometrischen Messung in 384-well-Mikroplatten für unterschiedliche Farbstoffkonzentrationen:
Es werden Lösungen unterschiedlicher p-Nitrophenol-Konzentrationen hergestellt, indem eine p-Nitrophenol-Stammlösung in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 11 ,0) mit 0,04 mM Phenolphthalein mittels 0,1 M Phosphatpuffer (pH 11,0) mit 0,04 mM Phenolphthalein schrittweise verdünnt wird. 50 μl der unterschiedlich konzentrierten p-Nitrophenol- Arbeitslösungen werden in acht verschiedene Kavitäten einer 384-well-Mikroplatte mit einem Mehrkanaldosierer gleichzeitig eingebracht und in einem Reader (SpektraFluor Plus, Fa. Tecan) bei Wellenlängen von 405 nm (AI), 540 nm (A2) und 620 nm (A3) gemessen, wobei die Bandbreite der Filter ±10 nm beträgt.
Die Intra-assay-Präzisionen der jeweils 8 gleichen Lösungen sind in nachfolgender Tabelle 1 aufgelistet. Die Absorbanz bei 540 nm (A2) liegt im Bereich von 0,44 bis 0,46. Man erkennt, dass die Präzision stark von der absoluten Absorbanz abhängt, mit einem VK-Minimum im Absorbanz-Bereich von 0,35 bis 0,53. Durch die Quotienten-Bildung wird die Präzision in diesem Bereich deutlich verbessert. Durch die Differenzen- quotientenbildung kann nur bei hohen Absorbanzen noch eine Präzisionsverbesserung erreicht werden. Die gefundenen Präzisionen im optimalen Absorbanzbereich bezeichnen die mit dem Verfahren maximal erreichbare Aussage zu Präzisionen der Einzelkanäle mit dem angegebenen Farbsystem und dem angegebenen Reader.
Tabelle 1:
Figure imgf000012_0001
Anwendungsbeispiel 3:
Inter-assay-Präzision der photometrischen Messung in 96-Well-Mikroplatten für unterschiedliche Farbstoffkonzentrationen:
Es werden Lösungen verschiedener p-Nitrophenol-Konzentrationen hergestellt, indem eine p-Nitrophenol-Stammlösung in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 11,0) mit 0,04 mM Phenolphthalein mittels 0,1 M Phosphatpuffer (pH 11,0) mit 0,04 mM Phenolphthalein schrittweise verdünnt wird. 150 μl der verschieden konzentrierten p-Nitrophenol- Arbeitslösungen werden jeweils an drei verschiedenen Tagen in einzelne Kavitäten einer 96- Well Mikroplatte mit einem Mehrkanaldosierer gleichzeitig eingebracht und im Reader bei Wellenlängen von 405 nm (AI), 540 nm (A2) und 620 nm (A3) gemessen, wobei die Bandbreite der Filter ±10 nm beträgt.
Die Inter-assay-Präzisionen der drei Bestimmungen sind in nachstehender Tabelle 2 dargestellt. Die Absorbanz bei 540 nm (A2) ist im Bereich von 0,398 bis 0,42. Die Inter-assay-Präzisionen zeigen eine deutliche Abhängigkeit von der Absorbanzhöhe mit einem minimalen VK um A = 0,5. Im Absorbanz-Bereich von 0,4 bis 0,52 erfolgt eine deutliche Verbesserung der Messpräzision durch Quotientenbildung. Die Ergebnisse zeigen aber auch, dass mit optischen Mitteln allein keine exakte Bestimmung der Richtigkeit (mit < 0,5% Abweichung) für Mehrkanaldosierer im gesamten Volumenbereich erreicht werden kann.
Tabelle 2:
Figure imgf000013_0001
Anwendungsbeispiel 4:
Temperaturabhängigkeit der photometrischen Mess-Signale von p-Nitrophenol (Fl) und Phenolphthalein (F2) in verschiedenen Puffersystemen:
Es wurden beide Farbstoffe sowohl in 0,1 M Diäthanolamin-Puffer (pH 10) als auch in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 11,0) so gelöst, dass eine Absorbanz von ca. 0,5 bei 1 cm Schichtdicke erreicht wird. Diese Lösungen wurden in einem thermostatierten Photometer (Contron) wiederholt bei unterschiedlichen Temperaturen gemessen. Die Temperatur wurde durch ein umspülendes Wasserbad aufsteigend und absteigend eingestellt und mittels Thermosensor in der Messküvette gemessen.
Diäthanolamin-Puffer:
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt. Fig. 1 zeigt die Temperaturabhängigkeit der p-Nitrophenol-Absorbanz, Fig. 2 die der Phenolphthalein-Absorbanz. Es wurde eine im Vergleich zu Phenolphthalein geringe temperaturabhängige Veränderung der p- Nitrophenol-Absorbanz (AI) gefunden. Die Phenolphthalein-Absorbanz (A2) zeigt einen deutlichen linearen Abfall von im Mittel 0,0073/K im Bereich von 28 °C bis 37 °C. Daraus leitet sich ein linearer Anstieg des Absorbanz-Quotienten A1/A2 von 0,025/K ab.
Phosphatpuffer: Es wurde ein im Vergleich zum Diäthanolaminpuffer geringer temperaturabhängiger linearer Anstieg der p-Nitrophenol-Absorbanz von lediglich 0,0003/K (Fig. 3) und ein linearer Abfall der Phenolphthalein-Absorbanz von 0,0001/K (Fig. 4) im Bereich von 25 °C bis 39 °C gefunden. Das ist weniger als ein Siebzigstel des Abfalls der Absorbanz von Phenolphthalein in Diäthanolamin-Puffer. Daraus leitet sich ein sehr geringer linearer Anstieg des Absorbanz-Quotienten von 0,0008/K ab. Dieser letzte Wert entspricht bei einem Quotienten von beispielsweise 0,6 einer Abweichung von 0,13 %/Kund ist damit kleiner als die gefundene Messpräzision bekannter Reader.
Anwendungsbeispiel 5:
Intra-assay-Präzision der photometrischen Messung in allen Kavitäten von 384-well- Mikroplatten im Absorbanz-Bereich der höchsten Präzision unter Verwendung von AI, des Quotienten A1/A2 und des Differenzenquotienten (A1-A3)/(A2-A3):
Es wurden 50 μl einer homogenen Mischung, bestehend aus 0,06 mM p-Nitrophenol und 0,09 mM Phenolphthalein, mit einem Mehrkanaldosierer in die Kavitäten einer 384-well- Mikroplatte pipettiert, die Platte wurde kurz geschüttelt und anschließend im Reader bei 405 nm (AI), 540 nm (A2) und 620 nm (A3) gemessen. Die Mittelwerte, relative Abweichungen, ausgedrückt als Variationskoeffizienten, wurden für die Absorbanzwerte AI aller Kavitäten und für deren normierte Größen aus A1/A2 und aus (A1-A3)/(A2-A3) errechnet bzw. für jede einzelne Kavität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Man erkennt die deutliche Präzisionsverbesserung durch Normierung mittels Quotienten. Die Differenzenquotientenbildung führt hier zu keiner weiteren Präzisionsteigerung.
Tabelle 3:
Figure imgf000015_0001
Anwendungsbeispiel 6:
Intra-assay-Präzision der fluorimetrischen Messung unter Verwendung von Flul und des Quotienten Flul Flu2:
Es wurden 50 μl einer homogenen Mischung bestehend aus 0,06 mM Methylumbelliferon und 1,3 μM Fluorescein mit einem Mehrkanaldosierer in die Kavitäten einer 1536-well- Mikroplatte pipettiert, die Platte wurde kurz geschüttelt und anschließend in einem Reader bei 460 nm (Flul, Anregung 365 nm) und 535 nm (Flu2, Anregung 485 nm) gemessen. Die Mittelwerte, Standardabweichungen sowie Variationskoeffizienten wurden für die Fluoreszenzwerte Flul und Flu2 aller Kavitäten und für deren normierten Größen aus Flul/Flu2 berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Auch hier ist die erhebliche Verbesserung der Präzision durch Quotientenbildung sichtbar. Die Präzision der Quotienten stellt die mit dem jeweiligen Reader maximal erreichbare Präzision und dadurch Auflösung des Verfahrens dar.
Tabelle 4:
Figure imgf000015_0002
Anwendungsbeispiel 7:
Intra-assay-Präzision der Pipettierung von 384 Probenvolumina unter Verwendung der
Mess-Signale AI und des Quotienten A1/A2:
Es wurden verschiedene in nachfolgender Tabelle 5 in Spalte 2 angegebene Volumina der
Probelösungen P, bestehend aus p-Nitrophenol in den in Tabelle 5 in Spalte 1 angegebenen
Konzentrationen und zusätzlich 0,04 mM Phenolphthalein mit einem zu prüfenden
Mehrkanaldosierer in die Kavitäten von 384-well-Mikroplatten abgegeben. Dazu wurden jeweils . solche Volumina einer Lösung D aus 0,04 mM Phenolphthalein in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 11,0) mit einem anderen präzisen Mehrkanaldosierer in die einzelnen Kavitäten verteilt, dass das Gesamtvolumen in jeder Kavität 50 μl betrug. Die Mikroplatten wurden mit Klebefolien dicht verschlossen und 60 min geschüttelt, anschließend wurden die Absorbanzen im Reader bei Wellenlängen von 405 nm (AI) und 540 nm (A2) gemessen.
Die Mittelwerte, Standard-Abweichungen und Variationskoeffizienten (VK), wurden für die Absorbanzwerte AI und A2 aller Kavitäten und für deren normierten Größen aus A1/A2 berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Die mittels Quotientenbildung normierten Präzisionen sind in allen Fällen besser als die durch die alleinige Verwendung von AI erreclineten Präzisionen und repräsentieren daher , die Dosierergenauigkeit besser als die Messung von AI allein.
Tabelle 5:
Figure imgf000017_0001
Anwendungsbeispiel 8:
Intra-assay-Präzision der Pipettierung von 384 Probenvolumina unter Verwendung von Flul und des Quotienten Flul/Flu2:
Es wurden Probelösungen, bestehend aus Methylumbelliferon und 2 μM Fluoreszein in 0,1 M Diäthanolaminpuffer (pH 9,8) mit einem zu charakterisierenden Mehrkanaldosierer in die Kavitäten von 384-well-Mikroplatten abgegeben. Die Methylumbelliferonkonzen- tration ist variabel und in Spalte 1 von Tabelle 6 angegeben, das Volumen in Spalte 2. Dazu wurden jeweils verschiedene Volumina einer Lösung aus 2 μM Fluoreszein in 0,1 M Diäthanolaminpuffer (pH 9,8) mit einem anderen präzisen Mehrkanaldosierer in die Kavitäten der Mikroplatten pipettiert. Diese Volumina wurden so gewählt, dass ein 50 μl Endvolumen resultiert. Die Mikroplatten wurden für 60 min geschüttelt und anschließend in einem Reader bei Wellenlängen von 460 nm (Flul, Anregung 365 nm) und 535 nm (Flu2, Anregung 485 nm) gemessen.
Die Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten wurden für die Fluoreszenzwerte Flul aller Wells und für deren normierten Größe aus Flul/Flu2 errechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt. Man erkennt die zumeist verbesserte Präzision nach Quotientenbildung. Tabelle 6:
Figure imgf000018_0001
Anwendungsbeispiel 9: Präzision der Wägung: Es wurden verschiedene trockene Einzelmassen 15 mal mit einer Präzisionswaage in der Weise bestimmt, dass als Träger Mikroplatten mit 384 bzw. 1536 Kavitäten benutzt wurden. In Fig. 5 sind die Standardabweichungen aus jeweils 15 Einzelwägungen für verschiedene Einzelmassen zusammengestellt. Für Wägungen mit dem Mikroplatten- Leergewicht, für 384-Well-Mikroplatten ca. 56 g und für 1536-well-Mikroplatten ca. 34 g, ergibt sich eine mittlere Standardabweichung der Wägung für Einzelmassen im Bereich von 5-1300 mg von 0,0699 mg bzw. 0,0618 mg (Fig. 5).
Die Standardabweichung ist bei Wägung in Mikroplatten relativ konstant und unabhängig von der Einzelmasse (Fig. 5). Das bedeutet für verschiedene pipettierte Einzelvolumina zwar sehr geringe aber auch unterschiedliche relative Fehler (vgl. Tab. 7). Im Extremfall (384 mal 0,05 μl Probenvolu- men in 384-well-Mikroplatten) sind im Mittel weniger als 0,4 % Fehler, für alle anderen Volumina deutlich noch geringere Fehler für die Wägerichtigkeit zu erwarten. Daher ist der Wägefehler durch Waagen-Unpräzision in den zu untersuchenden Volumen- bzw. Massebereichen zu vernachlässigen. Die Wägung stellt daher die Methode der Wahl für die Bestimmung der Dosierrichtigkeit dar.
Tabelle 7: Rechnerische Fehler der Wägung von Differenzgewichten in Mikroplatten (MP)
Figure imgf000019_0001
Anwendungsbeispiel 10:
Evaluation der Richtigkeit und Präzision eines 384-Kanal Dosierers:
Es wird nach dem prinzipiellen Verfahren in Anwendungsbeispiel 1 vorgegangen.
Dabei werden zwei anwendernahe Pipettier-Varianten a und b parallel am Beispiel der
Dosierung von 1 μl evaluiert.
Pipettier- Variante a: Pipettieren der Lösung P in eine trockene Mikroplatte. Dabei werden
49 μl der Lösung D nachträglich in alle Kavitäten gegeben.
Pipettier- Variante b: Pipettieren der Lösung P in eine mit 49 μl der Lösung D gefüllte
Mikroplatte.
Die Lösung P besteht aus 0,04 mM Phenolphthalein und 3 mM p-Nitrophenol in
Dimethylsulfoxid, die Lösung D aus 0,04 mM Phenolphthalein und 0,1 M Phosphatpuffer
(pH 1 1,0).
Das Vorgehen und die Ergebnisse der Teilschritte sind in Tabelle 8 sowie in Fig. 6 und
Fig. 7 dargestellt. Tabelle 8:
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Die Figuren 6 und 7 zeigen jeweils eine Falschfarben-Darstellung der relativen Abwei- chung von dem photometrischen Plattenmittel und die daraus abgeleiteten tatsächlichen Dosiervolumina für jede Kavität der Mikroplatte 1 und damit für jeden zugeordneten Kanal des Dosierers.
Fig. 6 repräsentiert dabei den Quotienten A1/A2 für jede Kavität und Fig. 7 die aus dem durch Gravimetrie bestimmten mittleren Probenvolumen und den kanalspezifischen relativen photometrischen Abweichungen errechneten Dosiervolumina. In den Figuren 6 und 7 bedeuten: mittlere Feldfarbe: Kavität, deren Wertabweichung im Bereich des Plattemittels ± 1 der
Standardabweichung liegen, helle Feldfarbe: Kavität, deren Wertabweichung um mehr als 1 SD vom Plattenmittel nach unten abweichen, dunkle Feldfarbe: Kavitätswerte, die Werte zeigen, die um mehr als 1 SD vom Plattenmittel nach oben abweichen

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Charakterisierung hochparallelisierter Liquidhandlingtechnik, vorzugsweise für Volumina im μl- und sub-μl-Bereich, mittels Mikroplatten, wobei die Liquidhandlingtechnik eine Vielzahl von Elementen für das Probenhandling, wie beispielsweise Multipipetten, aufweist, durch welche eine Vielzahl von Probenvolumina einer Probenflüssigkeit bzw. Reagenzflüssigkeit in als Raster angeordneten Kavitäten einer Mikroplatte zur vielkanaligen Probenvorbereitung und -analyse oder Lagerung bzw. Transport etc. bereitgestellt wird, mit gravimetrischer Volumenbestimmung und optischer Messung in Anwesenheit eines Diluenten, dadurch gekennzeichnet,
- dass aus allen durch die zu charakterisierende Liquidhandlingtechnik jeweils gleichzeitig in die Kavitäten der Mikroplatte abgegebenen Proben- bzw. Reagenzvolumina unter Bedingungen stark reduzierter Verdunstung ein auf die Kanalzahl der Liquidhandlingtechnik bezogenes mittleres Proben- bzw. Reagenzvolumen durch
Gravimetrie ermittelt wird,
- dass jedes Proben- bzw. Reagenzvolumen, welches für optische Messungen jeweils einen ersten Indikator mit spezifischen optischen Eigenschaften und zumindest einen zweiten Indikator mit zum ersten Indikator unterschiedlichen optischen Eigenschaften enthält, jeweils mit einem Diluent vermischt wird, der denselben zumindest zweiten Indikator in identischer Konzentration wie das Proben- bzw. Reagenzvolumen, nicht aber den ersten Indikator enthält, - dass für jede mit Mischung aus Proben- bzw. Reagenzvolumen und Diluent gefüllte Kavität der Mikroplatte zumindest jeweils ein durch den ersten Indikator hervorgerufenes erstes optisches Mess-Signal sowie in gleicher Weise jeweils ein durch den zweiten Indikator hervorgerufenes zweites optisches Mess-Signal erzeugt werden, - dass jedes erste optische Mess-Signal jeweils durch das zumindest zweite optische Mess-Signal der zugehörigen Kavität der Mikroplatte zum Zweck einer Fehlerkompensation, insbesondere zur Eliminierung von Einflüssen der Kavitätsgeometrie, der Form der Flüssigkeitsoberfläche in der Kavität, der Blindabsorbanzen etc., bezüglich seiner Intensität normiert wird,
- dass aus allen normierten optischen Mess-Signalen ein auf die Kanalanzahl der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik bezogener optischer Intensitätsmittelwert gebildet und für jede Kavität der Mikroplatte jeweils die Intensitätsabweichung des korrespondierenden normierten optischen Mess-Signals vom normierten optischen Intensitätsmittelwert erfasst wird und - dass das Volumen jedes Kanals der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik unter Bezug auf das durch Gravimetrie bestimmte mittlere Proben- bzw. Reagenzvolumen aus der Intensitätsabweichung des korrespondierenden normierten optischen Mess-Signals zum optischen Intensitätsmittelwert bestimmt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mittlere Proben- bzw. Reagenzvolumen durch mehrfache Wägung bei bekannter Dichte der Proben- bzw. Reagenzvolumina bestimmt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Wägung vor der jeweiligen Vermischung der Proben- bzw. Reagenzvolumina mit dem Diluent erfolgt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Wägung nach der jeweiligen Vermischung der Proben- bzw. Reagenzvolumina mit dem Diluent erfolgt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abgabe der Probenbzw. Reagenzvolumina von der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik in die Kavitäten der Mikroplatte zwecks Schaffung der Bedingungen stark reduzierter Verdunstung in einer dampfgesättigten Kammer erfolgt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1 bzw. 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroplatte nach der Abgabe der Probenvolumina in deren Kavitäten verdunstungsgeschützt verschlossen wird, beispielsweise durch einen Deckel oder durch eine Folie.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1 bzw. 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Abgabe der Proben- bzw. Reagenzvolumina von der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik in die Kavitäten einer perforierbar verschlossenen Mikroplatte erfolgt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein durch Verdunstung auftretender Masseverlust kontinuierlich durch Wägung ermittelt wird und dass, vorzugsweise auf rechentechnische Weise, aus dem Masseverlust und dem Zeitablauf der
5 Verdunstung durch Extrapolation auf das Ausgangsvolumen zurück geschlossen wird.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abgabe der Probenbzw. Reagenzvolumina von der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik in leere Kavitäten der Mikroplatte erfolgt und dass die Volumina des Diluenten nachträglich dazu
10 pipettiert werden.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abgabe der Probenbzw. Reagenzvolumina von der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik in Kavitäten der Mikroplatte erfolgt, in welche jeweils die Volumina des Diluenten bereits vorgelegt
15 wurden.
11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit jeweils eine wässrige Lösung verwendet wird.
10 12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit jeweils eine Lösung organischer Lösungsmittel verwendet wird.
13. Verfahren gemäß Ansprüchen 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Probenbzw. Reagenzflüssigkeit jeweils eine Mischung aus organischen Lösungsmitteln und
!5 wäßrigen Lösungen verwendet wird.
14. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Diluent jeweils eine wässrige Lösung verwendet wird.
0 15. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Diluent jeweils eine Lösung organischer Lösungsmittel verwendet wird.
16. Verfahren gemäß Ansprüchen 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Diluent jeweils eine Mischung aus organischen Lösungsmitteln und wäßrigen Lösungen verwendet wird.
17. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit und/oder dem Diluent jeweils noch weitere Reagenzien, wie Puffer, Salzlösungen, proteinhaltige Lösungen, Zellsuspensionen, Partikellösungen sowie unterschiedliche Lösungsmittelanteile etc., zugesetzt werden.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Puffer ein in seinem pH- Wert nahezu temperturunabhängiger Phosphatpuffer mit pH 9,0-12,5 zugesetzt wird.
19. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Indikatoren in der Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit bzw. im Diluent jeweils Farbstoffe verwendet werden.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass als Farbstoffe p- Nitrophenol und Phenolphtalein eingesetzt werden.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass p-Nitrophenol als erster Indikator jeweils nur der Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit zugegeben wird und dass
Phenolphtalein als zweiter Indikator jeweils in identischer Konzentration der Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit und dem Diluenten zugegeben wird.
22. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das normierte optische Mess-Signal auf Grund der Bildung des Quotienten aus dem ersten optischen Mess-Signal
Absorbanz AI und dem zweiten optischen Mess-Signal Absorbanz A2 (A1/A2) jeweils im Wellenlängenbereich 390-420 nm (AI) sowie im Wellenlängenbereich 530-560 nm (A2) erzeugt wird .
23. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das normierte optische Mess-Signal auf Grund der Bildung des Differenzenquotienten aus dem ersten optischen Mess-Signal Absorbanz AI und dem zweiten optischen Mess-Signal Absorbanz A2 und dem dritten optischen Mess-Signal Absorbanz A3 ((AI -A3)/(A2- A3)) jeweils im Wellen- längenbereich 390-420 nm (AI), im Wellenlängenbereich 530-560 nm (A2) sowie im Wellenlängenbereich 620-890 nm (A3) erzeugt wird.
24. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass als Farbstoffe für die Indikatoren Fluoreszensfarbstoffe eingesetzt werden.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass Methylumbelliferon als erster Indikator jeweils nur der Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit zugegeben wird und dass Fluoreszein als zweiter Indikator jeweils in identischer Konzentration der Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit und dem Diluenten zugegeben wird.
26. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das normierte optische Mess-Signal auf Grund der Bildung des Quotienten (Flul/Flu2) aus dem ersten optischen Mess-Signal (Fluoreszenz Flul) und dem zweiten optischen Mess-Signal (Fluoreszenz Flu2) zur Normierung der Fluoreszenzintensitäten bei 440-470 nm (Anregung bei 340- 370 nm, Flul) sowie der Fluoreszenzintensitäten bei 520-550 nm (Anregung bei 470- 500 nm, Flu 2) erzeugt wird.
27. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur übersichtlichen visuellen Auswertung die Intensitätsabweichungen der normierten ersten optischen Mess- Signale jeder Kavität der Mikroplatte vom optischen Intensitätsmittel wert als Falschfarbendarstellung in einer der Kanalgeometrie der Liquidhandlingtechnik entsprechenden Matrix präsentiert wird.
28. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Bestimmung der Volumengenauigkeit für die Charakterisierung der Liquidhandlingtechnik ermittelten Pipettierungsvolumina jeder Kavität der Mikroplatte in einer der Kanalgeometrie der Liquidhandlingtechnik entsprechenden Matrix dargestellt wird.
29. Verfahren nach einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass hinsichtlich Art, Volumen und zugesetzten Reagentien von Proben- bzw. Reagenzflüssigkeit und Diluent, bezüglich der Probenabgabe in trockene Kavitäten bzw. in vorgelegte Flüssigkeiten sowie in Hinsicht auf die Probenbehandlung in den Mikroplatten an sich Bedingungen realisiert werden, die einer bestimmungsgemäßen Verwendung der zu charakterisierenden Liquidhandlingtechnik und der Mikroplatte möglichst nahe kommen.
30. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung jeweils anwendungsbezogener Proben- bzw. Reagenzflüssigkeiten sowie Diluenten zumindest fünf mit Handlungsanweisung versehene unterschiedliche Lösungen zusammengestellt werden, wobei zwei den ersten bzw. zweiten optischen Indikator repräsentierende Lösungen (Lιa, L a) für photometrische Messungen, zwei den ersten bzw. zweiten optischen Indikator repräsentierende Lösungen (Lif, L2f) für Fluoreszenzmessung sowie eine Lösung L als für beide Messverfahren verwendbarer temperaturunempfindlicher Puffer vorgesehen sind.
31. Testkit gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest fünf Lösungen (Lιa, L2a, Lif, L2f, L3) jeweils in wesentlich höherer Konzentration als die Konzentration für deren bestimmungsgemäße Verwendung vorliegt, wobei die Konzentration für die jeweilige Verwendung durch entsprechende Dosierung durch den Anwender selbst geschaffen wird.
32. Testkit gemäß Ansprach 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung L3 aus 0,5 bis 1 M Phosphatpuffer, pH 11 ,0, besteht.
33. Testkit nach einem oder mehreren der Ansprüche 30-32, dadurch gekennzeichnet, dass für photometrische Messungen die Lösung Lja aus 30 mM bis 300 mM, vorzugsweise 150 mM, p-Nitrophenol in 96 % (vol/vol) Äthanol und die Lösung L2a aus 30 M bis 300 mM, vorzugsweise 150 mM, Phenolphthalein in 96 % (vol/vol) Äthanol bestehen.
34. Testkit nach einem oder mehreren der Ansprüche 30-32, dadurch gekennzeichnet, dass für Fluoreszenzmessungen die Lösung Lif aus 30 mM bis 300 mM, vorzugsweise 150 mM, Methylumbelliferon in Dimethylsulfoxid und die Lösung L f aus 0,3 mM bis 30 mM, vorzugsweise 15 mM, Fluoreszein in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 11,0 bestehen.
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