DE102012108620B4

DE102012108620B4 - Verfahren zum Bestimmen der Weglänge einer Probe und Validierung der damit erhaltenen Messung

Info

Publication number: DE102012108620B4
Application number: DE102012108620.6A
Authority: DE
Inventors: Keith Hulme; John Hammond; Nathan Hulme
Original assignee: Starna Scient Ltd Hainault Industrial Estate Hainault; Starna Scientific Ltd
Current assignee: Starna Scient Ltd Hainault Industrial Estate Hainault; Starna Scientific Ltd
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2024-05-08
Anticipated expiration: 2032-09-15
Also published as: US8947668B2; GB2494693A; DE102012108620A1; US20130070236A1; GB2494693B; GB201116080D0

Abstract

Ein Verfahren zum zurückverfolgbaren Bestimmen einer unbekannten optischen Weglänge einer Probe in einem optischen Messgerät, wobei das optische Messgerät mithilfe einer Zelle eines zertifizierten Referenzmaterials validiert ist, das eine spezifizierte nominale Extinktion aufweist, die Probe gelöst oder in einem Lösungsmittel suspendiert ist, wobei das zertifizierten Referenzmaterials auch im gleichen Lösungsmittel gelöst oder suspendiert ist, wobei das gelöste oder suspendierte zertifizierte Referenzmaterial in einer ersten und zweiten geschlossenen Kuvette enthalten ist, wobei die Küvetten eine erste und zweite spezifizierte Weglänge und eine spezifizierte Genauigkeit aufweisen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: - Messen der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials, um eine erste Extinktionsmessung für die erste spezifische Weglänge zu erhalten;- Messen der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials für eine zweite Weglänge, um eine zweite Extinktionmessung zu erhalten; gekennzeichnet durch- Verwenden eines Tropfers, um einen Tropfen eines spezifizierten Volumens an Lösungsmittel allein auf das optische Messgerät zu tropfen, so dass die Weglänge des spezifizierten Volumens durch Referenz zu der ersten und zweiten Extinktionmessung bestimmt wird;- Verwenden des Tropfers, um die Probe auf das optische Messgerät zu tropfen, wobei die Probe das gleiche Volumen wie das spezifizierte Volumen aufweist, so dass eine zurückverfolgbare Extinktionmessung der Probe ermöglicht wird.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen einer unbekannten optischen Weglänge und zum Validieren der damit erhaltenen Messungen, insbesondere einem zurückverfolgbaren Verfahren zum Bestimmen der Weglänge eines Volumens beispielsweise eines Tropfens.
Die Metrologie ist eine Wissenschaft, die sich mit Messungen beschäftigt; insbesondere beinhaltet sie experimentelle und theoretische Bestimmungen in jedem Gebiet der Technik. Das internationale Fachvokabular der Metrologie wird von der Internationalen Organisation zur Standardisierung (ISO) gepflegt und befindet sich gegenwärtig in seiner dritten Überarbeitung.
Eine der Kerngrundlagen der Metrologie ist die metrologische Rückverfolgbarkeit, welche als die Eigenschaft eines Resultats einer Messung oder eines Wertes eines Standards, wobei dieser auf Referenzen, gewöhnlicherweise nationale oder internationale Standards, durch eine ununterbrochene Kette von Vergleichen, welche alle bestimmte Unsicherheiten aufweisen, definiert ist. In vielen Ländern werden nationale Standards für Gewichte und Maße durch ein Nationales Metrologisches Institut (NMI) gepflegt, welches den höchsten Grad an Standards zur Kalibrierung oder zur Mess-Rückverfolgbarkeitsinfrastruktur in dem jeweiligen Land bereitstellt. In Großbritannien zum Beispiel ist die NMI das National Physical Laboratory, in den USA ist die NMI das National Institute of Standards and Technology (NIST), in Deutschland ist die NMI die Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB) und in Kanada ist die NMI das Institute for National Measurement Standards (NRC).
Typischerweise wird die Zurückverfolgbarkeit durch eine Kalibrierung erreicht, welche die Beziehung zwischen dem Resultat, das in einem Messinstrument angezeigt wird, und dem Wert eines gemessenen Standards ergibt. Demzufolge kann die Kalibrierung zu einem zurückverfolgbaren Standard dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Instrument präzise und akkurat ist, und es kann auch dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Instrument einen systematischen Fehler aufweist.
Die Zurückverfolgbarkeit kann auch von einer Einheit erhalten werden, die von einer der Fundamentaleinheiten des International System of Units (SI) abgeleitet ist. In der vorliegenden Erfindung ist eine abgeleitete Einheit, insbesondere die Extinktion, zum Meter zurückverfolgbar.
Das Gesetz von Lambert-Beer sagt aus, dass eine logarithmische Abhängigkeit zwischen der Transmission oder Transmissivität (T) des Lichts durch eine Substanz und dem Produkt des Extinktionskoeffizienten (α) der gleichen Substanz und der Distanz, die das Licht durch das Material zurücklegt, welches allgemein als Weglänge (1) bezeichnet wird. Demzufolge kann der Extinktionskoeffizient (α) als ein Produkt von:

entweder (a), dem Extinktionskoeffizienten oder des molaren Extinktionsvermögens (ε) und der Konzentration (c) der absorbierenden Spezies in dem Material, oder (b), eines Extinktionsquerschnitts (σ) und der Dichte (N) der Absorber ausgedrückt werden.

Für Flüssigkeiten werden diese Beziehungen gewöhnlicherweise gefasst als: T = I I₀ = 10<-α1> = 10<-εlc> wobei I0 die Intensität oder die Leistung des einfallenden Lichtes und I die Intensität des transmittierten Lichtes ist.
Die Transmission (T) wird in Termen der Extinktion ausgedrückt. Für Flüssigkeiten ist die Extinktion definiert als: A = -log10(I I₀)
Aus der obigen Gleichung kann abgeleitet werden, dass die Extinktion mit der Konzentration (oder der Dichtezahl der Absorber) linear in Beziehung steht, was durch die folgende Gleichung ausgedrückt wird: A = εlc = αl
Falls die Weglänge und das molare Extinktionsvermögen oder der Extinktionsquerschnitt bekannt sind, kann nach der obigen Gleichung bei einer Flüssigkeit die Konzentration einer Substanz oder die Dichtezahl der Absorber durch Messen der Extinktion berechnet werden.
Typischerweise wird bei einer analytischen Spektroskopie eine Kuvette mit einer Weglänge von 1 cm in einem Standardsystem verwendet, um die obige Berechnung zu vereinfachen. Dies gestattet es, dass die Konzentration einer unbekannten Zusammensetzung durch Messen ihrer Extinktion und durch Vergleichen mit einer Reihe von Extinktionswerten von Standardlösungen, die in einer Standardkurve veranschaulicht sind, abgeleitet werden kann.
In einer vertikalen Spektroskopie allerdings variiert die Weglänge von Probe zu Probe. Darüber hinaus kann dasselbe Problem bei sehr kleinen Probenvolumina in einem horizontalen System entstehen.
Die vorliegende Erfindung sucht demnach nach einer Möglichkeit, dass eine unbekannte Weglänge durch das Verwenden einer hochgenauen Referenzweglänge und zertifizierter Referenzlösungen oder Referenzmaterialien bestimmt wird, um vollständig zurückverfolgbare Messungen zu erzielen.
Die US 5 959 738 A und die Continuation zur US 5 959 738 A offenbaren ein photometrisches Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen optischer Weglängen von flüssigen Proben, die in einem Lösungsmittel gelöste oder suspendierte Analysebestandteile beinhalten, mittels vertikaler Spektrophotometrie. Dieses Dokument beschreibt auch ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen einer optischen Weglänge und einer Probenkonzentration, welches genaue Resultate gewährleistet. In diesem Dokument wird die Weglänge durch Messung der Extinktion der gleichen Probe mit zwei verschiedenen Wellenlängen und dem Berechnen der mathematischen Differenz zwischen der Extinktionsmessung bei der höheren Wellenlänge und der Extinktionsmessung bei der niedrigeren Wellenlänge und dem darauf folgenden Dividieren der erhaltenen Zahl durch die mathematische Differenz zwischen dem Extinktionsmesswert bei der höheren Wellenlänge und dem Extinktionsmesswert bei der niedrigeren Wellenlänge einer Standardlösung.
Obgleich die Verfahren und Vorrichtungen, die in diesen Dokumenten offenbart sind, eine Verbesserung gegenüber anderen vorbekannten Systemen darstellen, sind die Messungen nur vergleichend und nicht dazu geeignet, mit sehr kleinen Volumina zu arbeiten, welche in der Biotechnologie und in der pharmazeutischen Forschung erforderlich sind.
Die WO 2007/ 131 945 A2 offenbart eine Vorrichtung mit einer elektromagnetischen Strahlungsquelle, einem Detektor und einem Fallkopf, der dazu geeignet ist, einen Tropfen Flüssigkeit aufzunehmen, und des Weiteren dazu geeignet ist, um beim Gebrauch mit der Quelle und dem Detektor ausgerichtet zu werden, um die Analyse einer Probe, die den Tropfen enthält, zu gestatten. In dieser Vorrichtung ist der Fallkopf dazu ausgebildet, die Konfiguration des Tropfens so zu beschränken, dass die Oberflächenspannungen signifikanter als die Schwerkraft sind. Diese Vorrichtung stellt auch eine Verbesserung gegenüber anderem Stand der Technik dar. Die Vorrichtung gewährleistet jedoch keine vollkommen zurückverfolgbaren Ergebnisse, da jede Messung nicht mit einem genauen Standard validiert werden kann. Demzufolge kann die erhaltene Weglängenmessung weder als ein Teil von ISO-konformen Protokollen verwendet werden noch kann sie dazu verwendet werden, um ISOkonforme Resultate zu erzielen.
US 2002 / 0 149 772 A1 bezieht sich auf ein Verfahren zur Kalibrierung von Pipetten. Bei dem Verfahren wird eine bestimmte Konzentration eines chromophoren Indikators in einer Flüssigkeit bereitgestellt, eine Probe aus der Flüssigkeit abgetrennt, die optische Absorption der abgetrennten Probe gemessen und das Volumen der abgetrennten Probe durch Korrelation der gemessenen optischen Werte mit der Konzentration des Indikators in dieser Flüssigkeit bestimmt.
US 2005 / 0 168 737 A1 bezieht sich auf ein anderes Verfahren zur Kalibrierung sowie auf ein entsprechendes Gerät. Bei dem Gerät handelt es sich um eine Kalibrierplatte mit einer oder mehreren Küvetten, die mit den gewünschten Lösungen gefüllt sind. Die Küvetten sind versiegelt, um eine Verdunstung zu verhindern. Die Küvetten verfügen außerdem über eine komprimierbare Komponente, um die Expansion der Lösung zu ermöglichen, und über eine Blasenkontrollvorrichtung, um sicherzustellen, dass die komprimierbare Komponente den Strahlengang nicht schneidet.
Die vorliegende Erfindung sucht demnach ein zurückverfolgbares Verfahren zum Bestimmen einer unbekannten optischen Weglänge bereitzustellen.
Nach der vorliegenden Erfindung wird demnach ein Verfahren zum zurückverfolgbaren Bestimmen einer unbekannten optischen Weglänge einer Probe in einem optischen Messgerät bereitgestellt, mit den Merkmalen von Anspruch 1.
Vorzugsweise umfasst der Schritt des Messens der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials in der hochgenauen Kuvette das Messen der Extinktion bei drei vorbestimmten Wellenlängen. Besonders bevorzugt wird die Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials in der hochgenauen Kuvette bei zumindest zwei vorbestimmten Wellenlängen gemessen. Noch bevorzugter wird die Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials in der hochgenauen Kuvette bei drei verschiedenen vorbestimmten Wellenlängen gemessen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorbestimmten Wellenlängen ungefähr 258 nm, 416 nm und 630 nm.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die hochgenaue Kuvette eine Weglänge hauptsächlich in dem Bereich von 1 mm zu 10 mm mit einer Abweichung von bis zu 0,001 mm auf.
Vorzugsweise werden die Schritte des Messens der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials, des Lösungsmittels und der Probe innerhalb weitgehend vernachlässigbarer Zeitintervalle ausgeführt. Besonders bevorzugt werden die Schritte des Messens der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials, des Lösungsmittels und der Probe gleichzeitig ausgeführt. Ganz besonders bevorzugt wird der Schritt des Messens der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials und der Probe mit Hilfe der gleichen optischen Weglänge ausgeführt.
Vorzugsweise wird die Probe mit einer Standardpipette dargereicht. Besonders bevorzugt wird die Genauigkeit der Pipette durch Verwendung der Pipette mittels Darreichen eines vorbestimmten Betrags von zertifizierten Referenzmaterial, Messen der Extinktion des vorbestimmten Betrags und Vergleichen der Extinktion des vorbestimmten Betrags mit einem vorbestimmten Extinktionswert gemessen.
Die obigen Merkmale gestatten es der vorliegenden Methode zwei bis drei Größenordnungen genauer als der Stand der Technik zu sein. Des Weiteren ermöglicht die vorliegende Erfindung, die Ergebnisse zu ISO-Standards zurückzuverfolgen. Dies ist insbesondere in Gebieten wie der Biotechnologie nützlich, bei denen ein Probenvolumen sehr klein sein kann, was es sehr schwierig macht, zurückverfolgbare Messungen und Resultate zu erzielen. Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung sauberer und die Resultate können in dieser Weise weniger anfällig für Kontaminationen und Hintergrundrauschen im Vergleich zum Stand der Technik erzielt werden. Des Weiteren gestattet die Erfindung eine Verbesserung in der Geschwindigkeit gegenüber dem Stand der Technik.
Eine beispielhafte Ausführungsform wird nun in größerem Detail unter Bezugnahme zu der 1, die ein Mikrovolumen-Spektrophotometer zeigt, beschrieben.
Die 1 zeigt ein Mikrovolumen-Spektrophotometer umfassend ein Hauptgehäuse 1 mit einem Sockel 2 mit einer optischen Oberfläche 3, die zur Aufnahme eines Tropfens 4 geeignet ist. Bei Gebrauch kann das Gehäuse gedreht werden, so dass der Tropfen zu einer optischen Faserlichtquelle ausgerichtet ist, welche es gestattet, dass Licht durch den Tropfen zu einem Detektor gelangt.
Das System zum Bestimmen der Weglängen hat zwei Hauptkomponenten. Erstens eine Reihe von geschlossenen hochgenauen Küvetten oder Zellen mit 1, 2, 5 und 10 mm Weglängen und mit einer Toleranz von bis zu 0,001 mm. Zweitens ein stabiles zertifiziertes Referenzmaterial (CRM) mit einer nominalen Extinktion von 1,000 Extinktionseinheiten mit spektralen Charakteristiken, die es gestatten, Messwerte bei drei geeigneten Wellenlängen zu bestimmen.
Beispielsweise ist eine gemeinhin verwendete Referenz Starna Green<TM> Material, in welchem die Wellenlängen nominal 258, 416 und 630 nm sind.
Moderne Spektrophotometer können dazu verwendet werden, die Extinktion einer Lösung in den Weglängenbereich von 0,1000 cm (1,000 mm) bis 1,000 cm (10,000 mm) zu messen. Vorrichtungen, wie diejenige, die in der WO 2007/ 131 945 A2 beschrieben werden, können als ein Teil eines Standardspektrophotometers verwendet werden oder allein. Wenn diese Art von Vorrichtung mit einem modernen Spektrophotometer verbunden ist, ist es möglich die Extinktion einer Probe in dem Gerät und einer Probe, die in einer herkömmlichen Kuvette eingeschlossen ist, zu messen, welche in dem Spektrophotometer oder einem zusätzlichen Gerät angeordnet ist. Mit anderen Worten verlässt sich die Kalibrierung auf die Fähigkeit des Spektrophotometers, das mit dem Tropfgerät verbunden ist, welches die optische Weglänge, die bestimmt werden soll, benötigt, auch eine konventionelle Weglängen-Kuvette im Bereich von 1 bis 10 mm zu messen.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der Tropfanalysator mit einem Standardspektrophotometer verbunden. Bei Gebrauch eliminiert das vorliegende Verfahren alle Variablen, die mit dem Verlust der Zurückverfolgbarkeit verbunden sind, mit Ausnahme der Pipettengenauigkeit. Die Pipettengenauigkeit kann allerdings durch Messen eines vorbestimmten Volumens eines zertifizierten Referenzmaterials validiert werden, mit dem Messen der Extinktion davon und dem Vergleich des gemessenen Extinktionswertes mit einem bekannten vorbestimmten Extinktionsswertes für das Zielvolumen.
Das Spektrophotometer benötigt deswegen keine Messungen unter Hochgenauigkeitsbedingungen, da die Extinktionsignale, die in den hochgenauen Küvetten gemessen werden, mit dem Verhältnis zwischen der Messung und der Extinktion der unbekannten Weglängenmessung justiert werden.
Insgesamt werden jegliche fundamentalen Instrumentenfehler beseitigt, falls eine vernachlässigbare Drift angenommen wird. Wellenlängendrift ist als die Variation in der Wellenlänge aufgrund einer Temperaturvariation der Lichtquelle definiert. Demzufolge kann die Weglänge jeglicher optischen Lösung, Tropfen und Meniskus zwischen zwei parallelen Oberflächen sowohl in einer horizontalen als auch in einer vertikalen Orientierung bestimmt werden.
In dem Sockel 2 aus der 1 weist die optische Oberfläche 3 einen Durchmesser von 2 mm auf. Falls ein Tropfen eines Probenvolumens von 3 µl auf die optische Oberfläche 3 platziert wird, beträgt die optische Weglänge durch die Probe ungefähr 1 mm. Es ist dann möglich, die Resultate mit einer normalen 1 mm Referenzzelle mit einer validierten Standardlösung zu vergleichen. Das Lösungsmittel sollte in der Probe das gleiche wie in der Standardlösung sein.
In diesem Ausführungsbeispiel werden die Messungen durch denselben optischen Pfad vorgenommen. Des Weiteren werden die Messungen weitestgehend zur selben Zeit durchgeführt, um jegliche Drift in dem System zu minimieren.
Es sollte für Fachleute klar sein, dass andere Ausführungsformen der Erfindung konstruiert werden können. Beispielsweise können verschiedene Referenzmaterialien verwendet werden. Darüber hinaus kann, obwohl ein Satz von 1, 2, 5 und 10 mm Weglängen-Kuvetten beschrieben worden ist, jeglicher Satz in dem Bereich von 1 mm bis 10 mm verwendet werden, solange die Zelldimensionen keine Abweichung > 0,001 mm für jede vorbestimmte Größe aufweisen. Ferner würden kleinere 0,1 mm bis 1,00 mm Zellen theoretisch auf die gleiche Art funktionieren.
In einer alternativen Ausführungsform könnte ein System kundenspezifisch aufgebaut werden, das eine andere Form der Probendarstellung verwendet. Beispielsweise könnte ein Mikroplattenlesegerät mit einem Kuvettenleser anstelle eines Standardspektrophotometers verwendet werden. Ein NanoDrap<TM> Gerät oder ein gleichartiges Gerät könnten ebenfalls verwendet werden.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform könnte ein Tropfmessgerät separat aufgesetzt werden oder in ein Spektrophotometer bei der Herstellung inkorporiert werden. In diesem Fall könnte die Oberfläche für die Messung der Extinktion der Referenzmaterialien in der Zelle verwendet werden. Alternativ dazu kann das Gerät einen Kuvettenhalter aufweisen, der es erlaubt, das Referenzmaterial in der Zelle zu halten, das analysiert werden soll.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform könnten zwei verschiedene optische Weglängen verwendet werden, um die Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials und der unbekannten Probe zu messen. In dieser Ausführungsform könnten jedoch mehr Driftfehler auftreten. Darüber hinaus könnte die Extinktion in Intervallen zwischen den Messungen gemessen werden. Allerdings sollten diese relativ kurz gehalten werden, um jegliche relativ kleine Driftkomponente zu minimieren.
Im Gegensatz zu den bekannten Verfahren zum Bestimmen der Weglänge eines Tropfens ist die Lösung nach der Erfindung schneller, weniger anfällig für Kontamination, da keine separaten Glasplatten erforderlich sind, und erzielt um 2 bis 3 Größenordnungen genauere Resultate. Die Resultate sind darüber hinaus absolut und nicht relativ wie bei den Beispielen aus dem Stand der Technik.

Claims

Ein Verfahren zum zurückverfolgbaren Bestimmen einer unbekannten optischen Weglänge einer Probe in einem optischen Messgerät, wobei das optische Messgerät mithilfe einer Zelle eines zertifizierten Referenzmaterials validiert ist, das eine spezifizierte nominale Extinktion aufweist, die Probe gelöst oder in einem Lösungsmittel suspendiert ist, wobei das zertifizierten Referenzmaterials auch im gleichen Lösungsmittel gelöst oder suspendiert ist, wobei das gelöste oder suspendierte zertifizierte Referenzmaterial in einer ersten und zweiten geschlossenen Kuvette enthalten ist, wobei die Küvetten eine erste und zweite spezifizierte Weglänge und eine spezifizierte Genauigkeit aufweisen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: - Messen der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials, um eine erste Extinktionsmessung für die erste spezifische Weglänge zu erhalten; - Messen der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials für eine zweite Weglänge, um eine zweite Extinktionmessung zu erhalten; gekennzeichnet durch - Verwenden eines Tropfers, um einen Tropfen eines spezifizierten Volumens an Lösungsmittel allein auf das optische Messgerät zu tropfen, so dass die Weglänge des spezifizierten Volumens durch Referenz zu der ersten und zweiten Extinktionmessung bestimmt wird; - Verwenden des Tropfers, um die Probe auf das optische Messgerät zu tropfen, wobei die Probe das gleiche Volumen wie das spezifizierte Volumen aufweist, so dass eine zurückverfolgbare Extinktionmessung der Probe ermöglicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Messens der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials das Messen der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials bei zumindest zwei vorbestimmten Wellenlängen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Messens der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials aus dem Messen der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials bei drei vorbestimmten Wellenlängen besteht.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die vorbestimmten Wellenlängen 258 mm, 416 nm und 630 nm sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Kuvette eine Weglängentoleranz von 1/10000 aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zertifizierte Referenzmaterial eine nominale Extinktion von 1,000 Extinktionseinheiten aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Messen der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials und eines Messen der Extinktion der Probe weitgehend gleichzeitig ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Messen der Extinktion des zertifizierten Referenzmaterials und ein Messen der Extinktion der Probe unter Verwendung der gleichen optischen Weglänge ausgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, des Weiteren die Schritte aufweisend: - Darreichen der Probe mit einer Pipette; - Messen der Genauigkeit der Pipette durch Verwenden der Pipette zum Darreichen eines vorbestimmten Betrags des zertifizierten Referenzmaterials; - Messen der Extinktion des vorbestimmten Betrags des zertifizierten Referenzmaterials; und - Vergleichen der Extinktion des vorbestimmten Betrags des zertifizierten Referenzmaterials mit einem vorbestimmten Extinktionswertes.