DE69926398T2

DE69926398T2 - System mit zwei weglängen zum nachweis der lichtabsorption

Info

Publication number: DE69926398T2
Application number: DE69926398T
Authority: DE
Inventors: C. Anthony GILBY
Original assignee: Waters Investments Ltd
Current assignee: Waters Technologies Corp
Priority date: 1998-11-20
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2019-11-20
Also published as: EP1141675A1; US6342948B1; JP4995289B2; JP2010112961A; EP1564541A2; EP1564541A3; JP4480275B2; AU1916300A; EP1141675B1; WO2000031512A1; EP1564541B1; DE69942466D1; EP1141675A4; DE69926398D1; JP2002530667A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Instrumente für die Flüssigkeitschromatographie und insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung für Absorptionsdetektoren, die Flusszellen mit zwei Weglängen ermöglichen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Absorptionsdetektoren sind in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography; HPLC) nützlich. Licht mit einer breiten Spektralverteilung oder Bandbreiten-limitiertes Licht wird durch eine Probe geführt und sodann mittels eines Detektors, wie beispielsweise einem Photodetektor, bei der gewählten analytischen Wellenlänge gemessen. Bei einem herkömmlichen Instrument durchquert das Licht eine feststehende Strecke (Weglänge) durch die Probe. Das Photodetektorsignal des Instruments wird gemessen, wenn die Analytenprobenkonzentration Null ist (I₀) und wenn der Analyt vorhanden ist (I). Die Absorption (A), eine dimensionslose Zahl, die in Absorptionseinheiten (absorbance units; a.u.) ausgedrückt wird, wird mittels log(I₀/I) berechnet und an dem Ausgang des Instruments angezeigt. Die Absorption ist proportional zum Produkt der Weglänge (b) und der Konzentration (c) – das Beersche Gesetz. Die Proportionalitätskonstante kann mittels eines Kalibrierungsexperiments unter Verwendung bekannter Analytenkonzentrationen bestimmt werden, womit es ermöglicht wird, unbekannte Konzentrationen zu messen.
Wenn die Weglänge in cm gemessen wird und die Konzentration in mol/l gemessen wird, dann wird die Proportionalitätskonstante molares Absorptionsvermögen (ε) mit Einheiten cm^–1 (mol/l)^–1 genannt.
Da ε für jeden Analyten von der Wellenlänge abhängt, umfasst das Instrument einen Monochromator, Filter, einen Dioden-Array-Spektrograph oder im Fall von Infrarotlicht ein Fouriertransformation-Interferometer, so dass die Absorption bei bestimmten Wellenlängen gemessen wird.
Der Bereich von Konzentrationen eines Analyten, der in einem solchen Instrument gemessen werden kann, ist beschränkt. Am unteren Ende wird die minimal detektierbare Veränderung der Absorption durch das Grundrauschen des Absorptionsausgangs bestimmt, wobei es sich um einen Wert handelt, der sich von Wellenlänge zu Wellenlänge und von Instrument zu Instrument ändert. Ein gut konstruierter UV-Absorptionsdetektor für die HPLC kann eine Absorptionsänderung im Bereich von 10 bis 20 μ a.u. detektieren. Eine obere Schranke der Konzentrationsmessung wird erreicht, wenn die Beziehung zwischen der Absorption und der Konzentration bedeutend nicht-linear wird. Dies erfolgt typischerweise dann, wenn die Absorption 1 bis 2 a.u. übersteigt. Die obere Absorptionsschranke ist üblicherweise die Folge von Streulicht oder einer ungenügenden spektralen Auflösung. Die obere Absorptionsschranke ist von der Wellenlänge und vom Instrument abhängig und wird vermindert, wenn das Lösungsmittel oder die bei der HPLC verwendete mobile Phase absorbiert.
Hier wird der Konzentrationsbereich des Analyten als das Verhältnis der maximalen Konzentration zu der minimalen Konzentration definiert. Aufgrund des vorstehend Ausgeführten ist dieser auf ungefähr fünf Größenordnungen beschränkt. Wenn es das Ziel ist, quantitative Messungen mit einer Genauigkeit von 1% durchzuführen, dann kann der Analytenkonzentrationsbereich (unter der Annahme von vergleichbaren molaren Absorptionsvermögen der Komponenten) nicht drei Dekaden übersteigen. Dies kann dazu führen, dass mehr als ein HPLC-Lauf mit unterschiedlichen Probeninjektionen erforderlich ist, um Hauptkomponenten und Spurenverunreinigungen in einem Probengemisch zu quantifizieren.
Das Beersche Gesetz zeigt, dass niedrigere Konzentrationen detektiert werden können, wenn die Zellenweglänge vergrößert wird, und höhere Konzentrationen fallen in den linearen Absorptionsbereich, wenn die Weglänge vermindert wird. Ein Ändern der Weglänge an sich wird jedoch den Konzentrationsbereich weder erhöhen noch vermindern.
Ferner sind der Konstruktion von Zellendetektoren Grenzen gesetzt, die durch die physikalischen Eigenschaften von erhältlichen Komponenten (Lichtquellen, Photodetektoren usw.), die Beschränkungen hinsichtlich des Zellenvolumens, das erforderlich ist, um eine chromatographische Auflösung beizubehalten, und die kommerziellen Erfordernisse hinsichtlich des spektralen Bereichs und der spektralen Auflösung auferlegt werden. Es ist bereits eine Aufgabe, Detektoren und chromatographische Systeme zu bauen, die keine störende Rauschquelle aufweisen, die über den durch die physikalischen Gesetze bestimmten Mindestwert hinausgeht. Sogar wenn das theoretische Rauschen durch eine verbesserte Konstruktion vermindert werden könnte, kann ein solch bedeutend niedrigeres Rauschen in der Praxis nicht realisiert werden.
Lichtleitende Flusszellen mit langer Weglänge bieten eine Möglichkeit, um die Konzentrationsempfindlichkeit bei einem gegebenen Grundrauschen zu steigern. Unglücklicherweise wird die Schranke bei hohen Konzentrationen, die durch den linearen Absorptionsbereich des Detektors bestimmt wird, um denselben Wert vermindert, so dass sich der Konzentrationsbereich nicht ändert. Wenn die mobile Phase absorbiert, dann wird, wie vorstehend bemerkt, der Konzentrationsbereich bei einer längeren Zelle tatsächlich kleiner sein.
Ein großer Konzentrationsbereich ist eine sehr wichtige Eigenschaft eines Detektors. Er ermöglicht, Hauptkomponenten und Spurenverunreinigungen (wie beispielsweise in einer Medikamentzusammensetzung) im Rahmen einer einzelnen Injektion zu quantifizieren. Bei dieser Anwendung einer Trennung auf analytischen Skalen ist ein großer Konzentrationsbereich unter Verwendung größerer Probeninjektionen nützlicher als die besten Detektionsschranken bei niedrigen Konzentrationen.
Es hat unterschiedlich erfolgreiche Ansätze bzw. Versuche gegeben, zwei Weglängen bereitzustellen, um einen größeren Bereich von Konzentrationen zu messen. In der US-PS Nr. 5,214,593 (Magnussen) wird ein Verfahren beschrieben, bei dem Flusszellen mit mehreren Weglängen verwendet werden, wobei wenigstens zwei Lichtstrahlen und wenigstens zwei Photodetektoren verwendet werden. Licht, das durch eine Probenzelle mit Standardlänge durchtritt, trifft auf einen Probenphotodiode und Licht, das durch eine (kürzere) Referenzzelle durchtritt, trifft auf eine Referenzphotodiode. Bei niedrigen Probenkonzentrationen verhält sich der Detektor wie ein herkömmliches Instrument mit zwei Strahlen mit einer sehr geringen Proben-indu zierten Veränderung des Referenzphotodiodensignals. Bei hohen Konzentrationen fällt das Probenphotodiodensignal auf Null ab und der Referenzstrahl des Instruments verhält sich wie ein Detektor mit einem einzelnen Strahl. Die Signalverarbeitungselektronik wählt das für den Konzentrationsbereich geeignete Photodiodenausgangssignal aus. Jede Weglänge weist einen eigenen Lichtstrahl und einen eigenen Detektor auf. Die zwei Detektoren erzeugen Signale, die separat verarbeitet werden und sodann kombiniert werden. Dies erfordert eine kostspielige Redundanz der Ausstattung und wäre insbesondere kostspielig bei der Implementierung unter Verwendung von Photodioden-Array-Detektoren.
Wie sich dies den 1, 2 und 3 von Magnussen entnehmen lässt, wird tatsächlich die Verwendung von drei Detektoren bevorzugt, wobei der dritte Detektor als eine Referenz dient. Dies kann die Kosten der Vorrichtung bedeutend steigern.
Ferner ist es bei Magnussen erforderlich, dass die Vorrichtung besonders ausgestaltet ist, um eine Analyse mit einer Flusszelle mit mehreren Weglängen durchzuführen. Das Instrument muss mit mehreren Lichtstrahlen, mehreren Lichtdetektoren und mehreren Kanälen für die Verarbeitung des Detektorsignals gebaut werden.
Die in Magnussen beschriebene Ausgestaltung kann nicht bei bestehenden Systemen mit einer einzelnen Weglänge verwendet werden.
US-PS Nr. 4,120,592 (Flemming) beschreibt eine optische Multiplex-Analyse-Vorrichtung. Die Vorrichtung verwendet mehrere Weglängen mit einer einzelnen Lichtquelle und einem Detektor. Der Lichtstrahl tritt lediglich durch eine Zelle mit einer Weglänge zu einer Zeit durch, und zwar aufgrund der Wirkung eines Lichtspektrumfilterrads und von spektral empfindlichen Strahlteilern bzw. Strahlsplittern, wie dies in 1 von Flemming dargestellt ist. Somit wird nach Flemming lediglich eine Weglänge zu einem gegebenen Zeitpunkt gemessen, was zusätzliche Zeit für das Analysieren von Proben erfordert. Ferner ist nach Flemming, ähnlich wie nach Magnussen, ein speziell konstruiertes System erforderlich, um eine Analyse mit Flusszellen mit mehreren Weglängen durchzuführen.
US-PS 5,602,647 beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren zum optischen Messen von Konzentrationen von Komponenten, die eine Steigerung der Messgenauigkeit von Konzentrationen ermöglichen. Die Vorrichtung umfasst eine Zelle, eine Lichtquelle, einen Photodetektor und eine arithmetische Einheit. Die Zelle weist unterschiedliche optische Weglängen bei unterschiedlichen Stellen auf und enthält eine Probe darin.
WO 98/45575 beschreibt ein Bohrlochwerkzeug, das einen optischen Fluidanalysator und ein Gasanalysemodul umfasst. Das Gasanalysemodul umfasst eine Lichtquelle im nahen Infrarotlicht, einen Photodetektor bzw. Photodetektoren, eine Gasprobenzelle bzw. Gasprobenzellen mit Abschnitten mit optischen Fenstern und unterschiedlichen Weglängen, sowie Faseroptik, die Licht zu der Probenzelle führt und von der Probenzelle zu dem Photodetektor bzw. den Photodetektoren führt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Flusszelle mit zwei Weglängen in einer Absorptionsdetektionsvorrichtung gemäß Anspruch 1 bereit, wobei Licht von den unterschiedlichen Probenweglängen kombiniert wird und auf denselben Photodetektor trifft. Diese Ausgestaltung kann mit Photodioden-Array-Detektoren (PDA), die herkömmlicherweise lediglich eine einzelne Zelle aufweisen, und einem einzelnen Photodioden-Array verwendet werden.
Eine Flusszelle mit zwei Weglängen wird bereitgestellt, in der ein Teil des Lichts eine lange Weglänge durchläuft und der andere Teil des Lichts eine sehr viel kürzere Weglänge durchläuft. Licht, das in die Flusszelle eintritt, wird zwischen den zwei Wegen aufgeteilt und sodann wieder kombiniert, um zu dem Photodetektor geführt zu werden. Die Flusszelle mit zwei Weglängen kann im Prinzip die Zelle mit einem einzelnen Weg in einem Spektrometer oder einem Detektor ersetzen. Bei niedrigen Analytenkonzentrationen sind Veränderungen der Lichtübertragung in dem Abschnitt mit dem langen Weg der Zelle empfindlich hinsichtlich kleiner Konzentrationsänderungen. Die Neigung bzw. Steigung der Kalibrierungskurve, A gegenüber c, ist in diesem Bereich groß. Bei hohen Konzentrationen wird der lange Weg undurchsichtig und die Detektorantwort hängt von dem Licht in dem kurzen Weg ab. Die Neigung A gegenüber c ist proportional zur Weglänge und ist bedeutend kleiner, wenn die kurze Weglänge dominiert. Bei mittleren Konzentrationen vollführt die Neigung einen Übergang zwischen diesen zwei Bereichen.
Da die Gesamtkurve von A gegenüber c nicht-linear ist, fällt ein sehr viel größerer Bereich von Konzentrationen in den beschränkten Absorptionsbereich des Detektors. Sobald die Instrumentenantwort gegenüber der Konzentration eines bestimm ten Analyten charakterisiert ist, kann das Instrument für eine quantitative Analyse verwendet werden. Das Längenverhältnis der zwei Wege kann recht groß sein, und zwar von der Größenordnung 100:1. Bis auf die Form des Algorithmus, um die Probenkonzentration zu berechnen, der detailliert nachstehend beschrieben wird, gibt es keine Änderung beim Betrieb des Detektors oder des Spektrometers unter Verwendung der Flusszelle mit zwei Weglängen gemäß der Erfindung. Die Konzepte gemäß der Erfindung werden hierin in Bezug auf Absorptionsdetektoren für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography; HPLC) beschrieben, sind jedoch ebenso bei Arbeitsplatz-Spektrophotometern anwendbar.
Merkmale der Erfindung umfassen die Bereitstellung einer Flusszelle mit zwei Weglängen, die den Bereich der Analytenkonzentration vergrößert, der in einem Absorptionsdetektor gemessen werden kann, indem Licht kombiniert wird, das zwei unterschiedliche Probenweglängen durchlaufen hat. Die Menge und die Kosten der benötigten Ausstattung werden gemäß der Erfindung auf ein Mindestmaß beschränkt, insofern als ein einzelner Detektor verwendet wird, um Licht zu empfangen, das durch jede unterschiedliche Weglänge durchtritt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Flusszellen mit zwei Weglängen in einem herkömmlichen System mit einer einzelnen Weglänge zu verwenden, um somit bestehenden Instrumenten verbesserte Fähigkeiten bereitzustellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorstehenden und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich eingehender anhand der nachstehenden detaillierten Beschreibung von beispielhaften Ausführungsformen, wenn diese im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
1 zeigt einen schematischen Überblick über ein Messsystem mit zwei Weglängen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die 2A und 2B zeigen Flusszellen für die Verwendung in einer beispielhaften Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die 3A und 3B zeigen Details der Flusszelle von 2.
4 zeigt eine alternative Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung.
5 zeigt einen Graph, der eine verallgemeinerte Kalibrierungskurve von A gegenüber c darstellt.
6 zeigt einen Graph, der A gegenüber c für eine Flusszelle mit einer einzelnen Weglänge darstellt.
7 zeigt einen Graph, der Δc/c gegenüber c für eine Flusszelle mit einer einzelnen Weglänge mit einer Länge von 50 mm darstellt.
Die 8A, 8B und 8C zeigen Graphen, die A gegenüber c mit Streulicht für eine Flusszelle mit zwei Weglängen gemäß der vorliegenden Erfindung darstellen.
9 zeigt einen Graph, der Δc/c gegenüber c für Flusszellen mit zwei Weglängen mit X = 0,5 und k = 0,1% darstellt.
10 zeigt einen Graph, der Δc/c gegenüber c für Flusszellen mit zwei Weglängen mit X = 0,8 und k = 0,1% darstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Ein schematischer Überblick über ein Messsystem 10 mit zwei Weglängen gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 1 dargestellt. Eine Lichtquelle 12 stellt Lichtstrahlen 14 bereit, die in eine Flusszelle 16 eintreten und durch diese durchtreten. Bei der Lichtquelle 12 kann es sich um eine beliebige Lichtquelle handeln, die Licht in dem gewünschten Wellenlängenbereich und mit der gewünschten Bandbreite liefert, einschließlich einer Deuteriumlampe. Die Lichtquelle 12 kann außerdem Fokussierungslinsen und Reflektoren (nicht gezeigt) umfassen.
Wenn die Lichtstrahlen 14 in die Flusszelle 16 eintreten, dann treten diese durch die Probe in der Kammer 26 hindurch. Die Probe fließt durch den Einlass 22 in die Flusszelle hinein und durch den Auslass 24 aus dieser heraus. Nachdem die Lichtstrahlen 18 durch die Flusszelle 16 durchgetreten sind, werden diese von einem Detektor 20 detektiert und gemessen, wobei es sich um verschiedene Typen von Lichtdetektoren handeln kann, wie beispielsweise eine Siliziumphotodiode oder ein Photodioden-Array. Im Fall eines Photodioden-Array-Detektors wird das kombinierte Licht 18 hinsichtlich der Wellenlänge dispergiert bzw. gestreut, bevor dieses das Photodioden-Array erreicht. Ein beispielhafter Detektor ist der "996 Photodiode Array Detector", der von der Firma Waters Corp. aus Milford, Massachusetts hergestellt wird. Alle Lichtstrahlen 18, die durch die Flusszelle 16 durchgetreten sind, werden von demselben Detektor 20 detektiert, der ein Ausgangssignal erzeugt, das kennzeichnend für das Licht ist, wie dieses durch die Probe in der Kammer 26 beeinflusst wird.
Die Flusszelle 16 wird durch einen Abschnitt 28 geteilt, der keine Probe in sich hineinlässt, jedoch ermöglicht, dass Licht durch diesen durchtritt. Dies erzeugt zwei Weglängen für das Licht, um durch die Flusszelle durchzutreten, und zwar eine wie bei 32 dargestellte kurze Weglänge und eine wie bei 30 dargestellte lange Weglänge. Bei dem Abschnitt 28 kann es sich um ein festes transparentes Material handeln oder dieser Abschnitt 28 kann ein Gas oder sogar ein Vakuum enthalten.
Die Breite 34 des langen Wegs 30 ist ausgewählt, um zu bestimmen, welcher Prozentsatz des Lichtes durch die Probe in der Kammer 26 entlang des langen Wegs 30 gegenüber dem kurzen Weg 32 durchtritt. Die Wahl dieses Verhältnisses wird nachstehend beschrieben.
Eine beispielhafte Ausführungsform einer Flusszelle 16 gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 2A dargestellt. Diese Flusszelle 16 kann in ein Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem (high performance liquid chromatography system; HPLC-System), in dem üblicherweise eine herkömmliche Flusszelle mit einer einzelnen Weglänge verwendet wird, eingebaut werden, um somit zu erlauben, dass mit bestehender HPLC-Ausstattung eine Analyse mit zwei Weglängen durchgeführt wird. In der Tat kann es sich bei dieser Flusszelle 16 um eine reguläre Flusszelle mit einer einzelnen Weglänge handeln, die gemäß der Erfindung umgestaltet worden ist.
Die Flusszelle 16 ist zylinderförmig mit einer Außenwand 17 und zwei transparenten Endbereichen 38 und 40. Die Außenwand weist eine Dicke auf, die die Probenkammer 26 definiert. Die Innenseite der Außenwand 17 der Flusszelle ist mit Teflon AF beschichtet oder mit einer Röhre aus Teflon AF ausgekleidet, um eine lichtleitende Weglänge zu erzeugen. Die Probenkammer 26 weist eine darin angeordnete Röhre 28 auf, die den Durchgang von Licht ermöglicht, ohne dass dieses durch die Pro be in der Probenkammer durchtritt, die innerhalb der Röhre angeordnet ist. Die Röhre 28, die innerhalb der Außenwand 17 eingebracht ist, ist detaillierter in den 3A und B dargestellt. Vorzugsweise handelt es sich bei der Röhre 28 um ein Stück einer Quarzglaskapillarröhre, obgleich jedwedes für Licht transparente, feste Material verwendet werden kann.
Die Innenseite 19 der Röhre 28 ist mit Teflon AF beschichtet, das für seine guten lichtleitenden Eigenschaften bekannt ist, so dass Licht, das in die Probenkammer (Bohrung) 26 eintritt, wirksam auf die Bohrung begrenzt wird. Somit werden zwei Lichtwege ausgebildet, und zwar einer durch die Bohrung 26 und ein zweiter durch die Wand der Röhre 28. Das Licht ist während des Durchgangs durch die Flusszelle getrennt, und zwar, wie in 2 dargestellt, in den ersten und den zweiten Flussweg.
Alternativ kann die Röhre 28 unbeschichtet sein. Das Licht folgt dann einem komplizierteren Weg oder einer Vielzahl von Wegen durch die Probe. Licht, das in das Ende der Röhre 28 eintritt, durchläuft den kurzen Weg und wird innerhalb der Röhre 28 zu dem Ende geführt, und zwar aufgrund des größeren Brechungsindexes der Röhre 28 gegenüber der Probe in der Kammer 26. Ein Teil des Lichts, der wahrscheinlich sehr klein ist, wird durch die Probe durch eine gedämpfte Totalreflektion an dem inneren Punkt der Reflektion absorbiert, wo die Röhre 28 die Probe berührt. Dies führt zu einer geringen Vergrößerung der effektiven Weglänge des kurzen Wegs. Auf der anderen Seite können einige der Strahlen, die zunächst in den langen Weg eingetreten sind, auf die innere Bohrung der Röhre 28 treffen. Ein Teil dieser Strahlen wird in die Quarzglaswand der Röhre 28 gebeugt und hält sich länger oder kürzer in dem Quarzglas auf, bevor dieser wiederum in die Flüssigkeit des langen Wegs eintritt. Diese Strahlen bewegen sich somit entlang von Wegen durch die Flüssigkeit, die zwischen dem langen und dem kurzen Weg liegen. Die Antwort einer solchen Zelle auf Veränderungen der Probenkonzentration kann unter Verwendung einer Reihe von Kalibrierungsproben bestimmt werden.
In einer Ausführungsform mit mehreren Weglängen, die jedoch nicht Teil der Erfindung ist, die mehr als zwei Weglängen aufweist, ist beispielsweise eine Struktur, wie diese in 2B dargestellt ist (im Wesentlich ähnlich zu der in 2A dargestellten Ausführungsform) ohne Innenbeschichtungen hergestellt, um das Licht zu führen und die zwei unterschiedlichen Flusswege unterschiedlicher Länge, wie vorstehend im Detail beschrieben, auszubilden. Bei diesem Beispiel tritt ein oberer Lichtstrahl in lange Weglängen ein und durchläuft diese, während ein unterer Strahl einen kurzen Weg durchläuft. In einer derartigen Ausführungsform verbinden sich bzw. verschmelzen die mehreren Lichtwege bei deren Durchgang durch die Zelle, wodurch eine geometrische Progression von verzweigenden Strahlen ausgebildet wird, die die Zelle entlang von Wegen unterschiedlicher Längen durchlaufen.
Eine Beschichtung mit niedrigem Brechungsindex, wie beispielsweise Teflon AF, auf der Innenseite der Röhre 28 verhindert im Wesentlichen, dass Lichtstrahlen, die in die Röhre 28 eintreten, in die lange Weglänge eintreten. Licht in der kurzen Weglänge, das in die Wand der Röhre 28 eingetreten ist, wird in der Röhrenwand geführt, und zwar unabhängig davon, ob irgendeine Beschichtung auf der Innenseite der Außenwand 17 des Flusszellenkörper vorhanden ist oder nicht. Somit können mehrere Weglängen durch ein lichtleitendes Material beeinflusst werden, das auf der Innenseite der Röhre angeordnet ist, ohne ein lichtleitendes Material auf der Innenseite der Außenwand der Flusszelle bereitzustellen.
Wenn die Röhre 28 unbeschichtet ist, dann besteht eine weitere Möglichkeit darin, Verjüngungsstrahltechniken oder umgekehrte Verjüngungsstrahltechniken (taper beam bzw. reversed taper beam techniques; wie diese beispielsweise in der US-PS Nr. 5,153,679 beschrieben werden) zu verwenden, um Licht in dem langen Weg der mit Fluid gefüllten Bohrung zu beschränken. Optische Einrichtungen, um einen Verjüngungsstrahl zu erzeugen, sind in dem Waters "2487 dual wavelength tunable UV-visible absorbance detector" enthalten und optische Einrichtungen, um einen umgedrehten Verjüngungsstrahl zu erzeugen, sind in dem Waters "996 Photodioden-Array-Detektor" enthalten. Die Flusszelle von HPLC-Detektoren wie diesen kann zu einer Zelle mit zwei Weglängen gemäß der vorliegenden Erfindung umgebaut werden, und zwar unter Verwendung einer einfachen unbeschichteten lichtleitenden Röhre, die in die Zellenbohrung eingebracht wird. Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung mit längeren Weglängen und einem kleineren Volumen als herkömmliche HPLC-Zellen auf analytischen Skalen werden besser unter Verwendung einer Flusszellenkammer hergestellt, deren Innenwand mit Teflon AF ausgekleidet ist (wie dies in der US-PS Nr. 5,184,192 beschrieben wird). Dies ermöglicht es, dass ein größerer Lichtdurchsatz beibehalten wird.
Um die Herstellung zu erleichtern, sollte sich die Röhre 28 (die in den Ansichten in den 3A und 3B dargestellt ist) nicht ganz bis zum Zellenendenfenster 40 erstrecken (wie dies am besten in 2A dargestellt ist). Dies verhindert, dass der Ausflussanschluss 24 blockiert wird. Somit kann es sich bei der Röhre 28 um eine feste Röhre handeln, während der Einfluss- und der Ausflussanschluss 22 und 24 richtig funktionieren. Der Flusszellenkörper und der Einlass- und der Auslassanschluss können aus Materialien hergestellt werden, wie beispielsweise 316 Edelstahl oder PEEK (Polyetheretherketon). Die Endfenster, die flach oder gekrümmt sein können, sind in der beispielhaften Ausführungsform aus Quarzglas hergestellt. Die Abmessungen der Röhre 28 in der beispielhaften Ausführungsform umfassen einen Innendurchmesser (inner diameter; ID) von ungefähr 1 mm und einen Außendurchmesser (outer diameter; OD) von ungefähr 2 mm. Die beispielhafte Röhre 28 ist bemaßt, um einen langen Weg 30 mit einer Länge von ungefähr 10 bis 20 mm und einen kurzen Weg 32 mit einer Länge von ungefähr 0,2 mm bereitzustellen. Aus praktischen Gründen kann ein Bereich von Verhältnissen des langen Wegs zum kurzen Weg von 50:1 bis 100:1 oder möglicherweise sogar ein extremerer Bereich von 2:1 bis 1000:1 implementiert werden. Zellen mit sehr unterschiedlichen Abmessungen können ausgestaltet werden, um zu der Applikation zu passen, um beispielsweise den Bereich von der präparativen Chromatographie zu der Mikrobohrungschromatographie abzudecken.
Eine alternative Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 4 dargestellt. Hier wird Licht entlang der zwei Wege 40a und 40b mittels eines faseroptischen Leiters (Fiber Optic cable bzw. FO cable) in zwei getrennten Flusszellen 16 und 16' geführt, nach denen das Licht in einen einzelnen Weg 42 zu dem Detektor 20 wieder kombiniert wird. Die zwei Flusszellen 16 und 16' umfassen eine Verrohrung, um die Probenkonzentration beiden Flusszellen (nicht gezeigt) bereitzustellen. Andere Techniken können verwendet werden, um das Licht entlang der Wege 40 zu trennen, zu führen und wieder zusammenzubringen, einschließlich Spiegel, halbversilberte Spiegel, Prismen, Strahlaufspalter oder dergleichen.
Die Absorptionseigenschaften einer Zelle mit zwei Weglängen gemäß der vorliegenden Erfindung werden nachstehend unter Bezugnahme auf 5 beschrieben. Zunächst wird der Fall einer Flusszelle mit einem einzelnen Weg beschrieben, um zu der Erklärung mit zwei Wegen überzuführen.
Bei einer Zelle mit einem einzelnen Pfad ist die Absorption definiert als A = log(I0/I) = log(eαbc) – α·b·c·log(e) (Gl. 1) und A = ε·b·c so dass log(e)·α = 0.434α = ε (Gl. 2)wobei α der Absorptionskoeffizient, b die Weglänge, c die Konzentration des Analyten in Mol/Liter (M/L) und ε das molare Absorptionsvermögen in cm^–1(M/L)^–1 ist.
Wenn die mobile Phase transparent ist, dann ist das Photodetektorsignal I₀, wenn kein Analyt vorhanden ist. Wenn die mobile Phase absorbiert, dann ist das Signal I_m. In einer Zelle mit einem einzelnen Weg der Länge b sind die Absorption und die Transmission der mobilen Phase: Am = log(I0/Im) und Im/I0 = 10–Am (Gl. 3)
Es ist die herkömmliche Praxis, das Detektorabsorptionsausgangssignal bei purer mobiler Phase in der Zelle auf Null zu normieren. Die Transmission der Analytenkonzentration c beträgt sodann I/I_m. Sowohl I als auch I_m werden durch die Absorption der mobilen Phase reduziert, so dass: I = I0·10–Am·e–αbc und Im = I0·10–Am (Gl. 4)
Diese werden kombiniert, um die Probentransmission und die Probenabsorption zu liefern: I/Im = (I0·10–Am·e–αbc)/(I0·10–Am) (Gl. 5) A = log(Im/I) = log[(I0·10–Am)/(I0·10–Am·e–αbc)] = log[eαbc] = α·b·c·log(e) = ε·b·c (Gl. 6)als ob A_m gleich Null wäre.
Die Absorption der mobilen Phase beeinflusst nicht die Neigung der Kalibrierungskurve A gegenüber c. Ein Wert von A_m ungleich Null verkleinert jedoch die Signale, was dazu führt, dass das Absorptionsrauschen zunimmt, und dies vermindert die Empfindlichkeit bei niedrigen Konzentrationen.
Nun wird ein Streulichtterm hinzugefügt. Streulicht wird dem Photodetektorsignal hinzugefügt, und zwar unabhängig davon, ob eine absorbierende mobile Phase oder eine absorbierende Probe in der Zelle vorhanden ist. Mit anderen Worten: es wird angenommen, dass das Streulicht bei einer Wellenlänge vorliegt, die nicht absorbiert wird. Der Beitrag des Streulichts, der als ein Bruchteil des Lichts genommen wird, das bei einer gegebenen analytischen Wellenlänge für die Messung zur Verfügung steht, beträgt k·I₀. Der Wert von k hängt von der analytischen Wellenlänge ab. Die Analytentransmission und die Analytenabsorption lauten: I/Im = (I0·10–Am·e–αbc + k·I0)/(I0·10–Am + k·I0) (Gl. 7) A = log(Im/I) = log[(1 + k·10Am)/(e–αbc + k·10Am))] (Gl. 8)
Bei Konzentrationen unterhalb der Streulichtdämpfung (stray light roll-off) (k = 0 in Gleichung 8]: A = log[1/e–αbc] = log(e)·α·b·c = ε·b·c. (Gl. 9)
Und wiederum wird die Neigung der Kurve nicht durch die Absorption der mobilen Phase beeinflusst.
Bei hohen Konzentrationen und mit k·10^Am viel kleiner als 1, liefert Gleichung 8: Aroll-off = log(1/k·10Am) = log(1/k) – Am (Gl. 10)
Gleichung 10 zeigt, dass der Einfluss, den eine absorbierende mobile Phase auf die Dämpfung (roll-off) bei hohen Konzentrationen hat, auf zwei Arten betrachtet werden kann. Die Dämpfungsabsorption wird durch A_m vermindert, oder das Streulicht wird um den Faktor 10^Am verstärkt.
Zusammenfassend, die Absorption der mobilen Phase in einer Flusszelle mit einer einzelnen Weglänge vermindert die Empfindlichkeit bei niedrigeren Konzentrationen, indem das Rauschen verstärkt wird, und bei hohen Konzentrationen wird der Einfluss des Streulichts verstärkt, um den linearen Bereich zu reduzieren. Beide Effekte vermindern den Konzentrationsbereich eines Absorptionsdetektors.
Die Kalibrierungskurve, wie diese in 6 dargestellt ist, A gegenüber c, weist eine Neigung b·ε vor der Streulichtdämpfung und eine Nullüberschneidung auf (das Detektorabsorptionsausgangssignal wird normalerweise auf Null gesetzt, wenn c = 0).
Bei Zellen mit zwei Weglängen folgt die Entwicklung des Ausdrucks von A gegenüber c denselben Schritten wie bei der vorstehend beschriebenen Zelle mit einer einzelnen Weglänge.
Bei einem transparenten Lösungsmittel (mobile Phase) in der Zelle beträgt das Photodetektorsignal I₀. Ein Bruchteil X des Lichts tritt aus dem langen Weg b aus und ein Bruchteil (1 – X) tritt aus dem kurzen Weg j·b aus.
Das Photodetektorsignal mit Analytenkonzentration c ist die Summe der Beiträge der zwei Weglängen: I = X·I0·e–αbc + (1 – X)·I0·e–αjbc (Gl. 11) A = log(I0/I) = log·[1/(X·e–αbc + (I – X)·e–αjbc)] (Gl. 12)
Nun wird der Effekt der Absorption der mobilen Phase berücksichtigt. Das Signal mit purer mobiler Phase in der Zelle lautet: Im = X·I0·10–Am + (1 – X)·I0·10–jAm (Gl. 13)
Die Transmission des Analyten in der mobilen Phase relativ zu der mobilen Phase allein lautet: I/Im = (X·I0·10–Am·e–αbc + (1 – X)·I0·10–jAm·e–αjbc)/(X·I0·10–Am + (1 – X)·I0·10–jAm) (Gl. 14)
Das Hinzufügen eines Streulichtterms vervollständigt die Gleichung: I/Im = (X·I0·10–Am·e–αbc + (1 – X)·I0·10–jAm·e–αjbc + k·I0)/(X·I0·10–Am + (1 – X)·I0·10–jAm + k·I0) = (X·10–Am·e–αbc + (1 – X)·10–jAm·e–αjbc + k)/(X·10–Am + (1 – X)·10–jAm + k) (Gl. 15)
Die Gleichung für die Kalibrierungskurve für eine Zelle mit zwei Weglängen kann nunmehr für die Absorption A in Abhängigkeit der Analytenkonzentration c angegeben werden (5). A = log(Im/I) = log[(X·10–Am + (1 – X)·10–jAm + k)/(X·10–Am·e–αbc + (1 – X)·10–jAm·e–αjbc + k)] (Gl. 16)
Die Differenzierung von Gleichung 16 liefert die Neigung der Kalibrierungskurve: dA/dc = α·log(e)·b·(X·10–Am·e–αbc + j·(1 – X)·10–jAm·e–αjbc)/(X·10–Am·e–αbc + (1 – X)·10–jAm·e–αjbc + k) (Gl. 17)
8 zeigt Schaubilder der Absorption gegenüber der Konzentration für verschiedene Niveaus der Absorption der mobilen Phase. Bei dem Beispiel beträgt die lange Wellenlänge 50 mm, die kurze Wellenlänge 0,5 mm (j = 0,01) und das Licht wird zu gleichen Teilen unter den Weglängen aufgeteilt, wenn keine Absorption der mobilen Phase vorhanden ist (X = 0,5). Dies ist mit 6 für die Zelle mit einer einzelnen Weglänge zu vergleichen.
Es gibt drei Bereiche in den Schaubildern A gegenüber c bei Zellen mit zwei Weglängen. Bei niedrigen Konzentrationen dominiert der lange Pfad und liefert eine hohe Empfindlichkeit. Der kurze Pfad verhält sich wie eine Extraquelle von Streulicht. Bei mittleren Konzentrationen wird der lange Pfad bei der analytischen Wellenlänge undurchsichtig und von hier bis zu hohen Konzentrationen wird das Licht, das aus der Zelle austritt, durch die Absorption in dem kurzen Pfad bestimmt. Bei sehr hohen Konzentrationen dominiert letztendlich das Streulicht, wodurch bewirkt wird, dass sich die Kurve abflacht. Diese Bereiche sind in 5 dargestellt.
Bei einer nicht-absorbierenden mobilen Phase führt Gleichung 16 zu: Aintercept = log[1/1 + X],undAroll-off = log[1/k]was es ermöglicht, X und k anhand der Kalibrierungskurve zu bestimmen. Tabelle I zeigt ein Beispiel für die Abhängigkeit von A_intercept von der Absorption der mobilen Phase. Das Weglängenverhältnis beträgt j = 0,01. Bei A_m = 1,0 handelt es sich in der Praxis um einen hohen Wert, der jedoch beispielsweise mit Methanol bei einem TFA-Gradienten bei kurzen Wellenlängen erreicht werden kann.
Tabelle I
Übliche Mengen von Streulicht haben einen vernachlässigbaren Effekt auf die Extrapolation, um A_intercept aufzufinden.
Gleichung 17 zeigt, dass die Neigung bei hohen Konzentrationen ε·j·b beträgt, was der Neigung bei einer Zelle mit einer einzelnen Weglänge bei der kurzen Weglänge entspricht. Dies ändert sich nicht, wenn typische Niveaus der Absorption der mobilen Phase zugegen sind, da der Weg so kurz ist. Die ursprüngliche bzw. anfänglich Neigung wird aus Gleichung 17 mit c = 0 gewonnen. Dies kann folgendermaßen geschrieben werden (dA/dc)_init = ε·b·(ursprünglicher Neigungsfaktor). Tabelle II zeigt ein Beispiel für den Effekt der Absorption der mobilen Phase auf die ursprüngliche Neigung. Die lange Weglänge beträgt b = 50 mm, j = 0,01 und ε. = 10⁴ cm^–1(M/L)^–1. Wenn A_m = 0, (dA/dc)_init = ε·b·X
Tabelle II
Ein Ziel der Flusszelle mit zwei Weglängen besteht darin, den Bereich von Konzentrationen von Analyten zu erweitern, die akkurat gemessen werden können. 5 zeigt eine verallgemeinerte Kalibrierungskurve, A gegenüber c. Die folgende Analyse macht keine Einschränkungen bezüglich der Form der Kurve mit der Ausnahme, dass deren Neigung immer positiv sein muss. Die Analyse kann auf Zellen mit einer einzelnen Weglänge, zwei Weglängen oder mehreren Weglängen angewendet werden.
Die folgenden Größen können unter Bezugnahme auf 5 definiert werden:

ΔA:: Die kleinste detektierbare Veränderung der Absorption, die dem Rauschen am Detektorausgang entspricht, wenn der Ausgang A entspricht.
ΔA₀:: Das Grundlinienabsorptionsrauschen – die kleinste detektierbare Veränderung der Absorption, wenn die Zelle mit reiner mobiler Phase gefüllt ist, A = 0.
Δc:: Die kleinste detektierbare Veränderung der Konzentration, die ΔA entspricht.
dA/dc:: Die Neigung der Kalibrierungskurve bei der Konzentration c.

Die analytische Genauigkeit des Detektors Δc/c kann mittels der Neigung der Kalibrierungskurve (dA/dc) und dem Absorptionsrauschen ΔA bei der Absorption A berechnet werden, wenn die Analytenkonzentration c beträgt. Die Beziehung wird bequemerweise folgendermaßen geschrieben: Δc/c = (dc/dA)·ΔA/c (Gl. 18)
Die analytischen Genauigkeitsschaubilder, 7, 9 und 10, zeigen den Bereich von Konzentrationen, die akkurat gemessen werden können. Wenn Δc/c = 1, dann ist die Absorption eines Analyten gleich dem Grundlinienrauschen und c ist die Konzentrationsschranke der Detektion (concentration limit of detection; concentration LOD). Wenn Δc/c kleiner als 0,01 ist, dann kann die Konzentration mit einer Genauigkeit von besser als 1% gemessen werden.
Das Absorptionsrauschen variiert mit der Probenabsorption, und zwar nimmt dieses zu, wenn Licht durch die Probe absorbiert wird. Es ist möglich, die Rauschquellen in dem Detektor zu charakterisieren und ΔA bei jedem Signallevel I vorauszusagen. Alternativ deckt in einem üblichen Absorptionsdetektor das Grundliniensignalniveau I₀ einen großen Bereich von Werten über das gemessene Spektrum ab. Eine Aufzeichnung des Grundliniensignals während einer kurzen Zeitdauer bei unterschiedlichen Wellenlängen stellt dieselben Informationen von ΔA gegenüber I bereit. Dieser letzte Ansatz weist den Vorteil auf, mit dem System in Beziehung stehende Effekte zu umfassen, wie beispielsweise das Rauschen der Pumpe und ein von der mobilen Phase abhängiges fluidisches Rauschen. Es ist insbesondere einfach, diese Daten für einen PDA-Detektor zu erhalten, da das Rauschen gleichzeitig bei allen Wellenlängen gemessen werden kann.
Ergebnisse, die unter Verwendung von Rauschdaten mittels eines Waters Corporation "996 PDA-Detektor" gewonnen worden sind, sind in 7 (für eine Zelle mit einer einzelnen Weglänge) und den 9 und 10 (für eine Zelle mit zwei Weglängen) dargestellt. Die Verbesserung des Konzentrationsbereichs (Verhältnis der höchsten Konzentration zu der niedrigsten Konzentration, wobei die Konzentration mit einer Genauigkeit von 1% oder besser gemessen werden kann) bei Verwendung der Zelle mit zwei Weglängen ist offensichtlich. Der Nachteil besteht in einem Verlust an sehr hoher analytischer Genauigkeit, was durch das Minimum in 7 angezeigt wird, was jedoch tatsächlich niemals in einer praktischen analytischen Umgebung erreicht werden kann. Es ist wiederum anzumerken, dass die Leistung bei hohen Konzentrationen nicht durch die Absorption der mobilen Phase beeinflusst wird.
Tabelle III zeigt Konzentrationsbereiche von Zellen mit einer einzelnen Weglänge und von Zellen mit zwei Weglängen. Die Konzentration kann zwischen den nachstehend aufgeführten Schranken mit einer Genauigkeit von 1% oder besser gemessen werden.
Tabelle III
Tabelle III weist einige interessante Ergebnisse auf. Zunächst macht ein Streulicht von 0,1% bei den vorstehenden Zahlen keinen großen Unterschied aus. Bei einem Streulicht von 0,1% muss die Schranke bei einer Zelle mit einer einzelnen Weglänge und bei hohen Konzentrationen um 30% bis 40% vermindert werden, wenn die Anforderung besteht, innerhalb des linearen Bereichs des Beerschen Gesetzes zu verbleiben. Schließlich ist der dramatische Effekt der Absorption der mobilen Phase tatsächlich schlechter für die lange Zelle mit einer einzelnen Weglänge als für die Zelle mit zwei Weglängen (A_m ist die Absorption der mobilen Phase bei einem Weg mit einer Länge von 50 mm).
Kalibrierungsstrategien für eine Zelle mit zwei Weglängen gemäß der vorliegenden Erfindung werden nachstehend mit denen für eine Zelle mit einer einzelnen Weglänge verglichen. Eine Zelle mit einer einzelnen Weglänge liefert eine Kalibrierungskurve A = ε·b·c, die durch den Ursprung verläuft und eine Neigung ε·b aufweist. Die momentane Kalibrierungspraxis besteht aus den folgenden Schritten: Messungen werden über einen spektralen Bereich (PDA) oder bei einer ausgewählten analytischen Wellenlänge (einstellbarer Detektor) vorgenommen:

1. Abscannen der Grundlinie mit reiner mobiler Phase in der Zelle, um die Nullabsorption zu bestimmen.
2. Messen der Absorption einer Reihe von Analyten bekannter Konzentrationen in der mobilen Phase und Aufzeichnen einer Kalibrierungskurve. Es ist zu notieren, wo die Kurve von einer akzeptablen Linearität abweicht, und die Quantifizierung ist auf Absorptionen unterhalb dieses Punkts zu beschränken.

Schritt 2 nimmt sowohl die Absorption der mobilen Phase als auch das Streulicht hinsichtlich der Detektorlinearität in Berücksichtigung.
Eine Zelle mit zwei Wegen wird durch zwei Weglängen, b und j·b, und den Bruchteil X des Lichts in dem langen Weg charakterisiert, wenn nichts in der Zelle absorbiert. Bei niedrigen Konzentrationen wird die Form der Kalibrierungskurve durch die Absorption der mobilen Phase beeinflusst, wobei es sich um einen eindeutigen Unterschied zu der Zelle mit einer einzelnen Weglänge handelt. Die Kalibrierung einer Zelle mit zwei Weglängen charakterisiert die Nichtlinearität der Kalibrierungskurve, um den vergrößerten Konzentrationsbereich auszunutzen. Eine Strategie erfordert die folgenden Schritte, wobei jedoch erkannt werden sollte, dass andere Strategien ebenso möglich sind:
Schritt 1: Bestimmen des Weglängenverhältnisses j anhand der Konstruktion der Zelle.
Schritt 2: Abscannen der Grundlinie zunächst mit purem Wasser in der Zelle (I₀), sodann mit purer mobiler Phase (I_m). Das Verhältnis (I_m/I₀) ist die Transmission der mobilen Phase.
Schritt 3: Messen der Transmission eines Bereichs von Konzentrationen des untersuchten Analyten (I/I_m) und Anpassen der Daten bei jeder Wellenlänge zu der nachstehenden Gleichung (Gleichung 19), wobei X ein einstellbarer Parameter ist. Die Dämpfung (roll-off) der Transmission I_roll-off/I₀ bei hohen Konzentrationen liefert k.
Das Kombinieren von Gleichungen 13 und 15 unter der Annahme 10^–jAm = 1 und der Annahme, dass k einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Messung der Absorption der mobilen Phase hat, liefert: (Im/I0 – (1 – X))·e–αbc + (1 – X)·e–αjbc = (I/Im)·(Im/I0) – k (Gl. 19)
Pures Wasser ist das transparenteste Lösungsmittel im UV-Bereich. Nichtsdestotrotz nimmt dessen Absorption unterhalb 200 nm rasch zu und erreicht ungefähr 0,13 a.u. bei 190 nm bei einem Weg mit einer Länge von 10 mm. Eine geeignete Korrektur der I₀-Daten sollte bei Wellenlängen unterhalb von 200 nm vorgenommen werden.
Obgleich die hierin beschriebene Ausführungsform der Flusszelle mit zwei Weglängen Teflon AF umfasst, das auf zahlreiche Oberflächen beschichtet ist, um ein Führen des Lichts zu bewirken, erkennt man, dass andere Materialien verwendet werden können, um das Führen des Lichts zu bewirken, und zwar in Abhängigkeit der Applikation, wie beispielsweise andere amorphe Fluorpolymere.
Während das lichtleitende Material aus Teflon AF in den vorstehenden Ausführungsformen als Beschichtung beschrieben worden ist, die auf wenigstens eine der Innenseiten der Außenwand der Flusszelle und die Innenseite der Quarzglasröhre aufgebracht worden ist, sollte man erkennen, dass die amorphen Fluorpolymerbeschichtungen auf die Innen- und die Außenseite der Quarzglasröhre mit einem gleichen Effekt aufgebracht werden können und die lichtleitenden Materialien können in einer anderen Form als einer Beschichtung bereitgestellt werden, wie beispielsweise, indem Folien angrenzend auf die betreffende Oberfläche bzw. die betreffenden Oberflächen aufgebracht werden.
Obgleich die Erfindung unter Bezugnahme auf beispielhafte Ausführungsformen von dieser veranschaulicht und beschrieben worden ist, können zahlreiche weitere Änderungen, Weglassungen und Hinzufügungen hinsichtlich der Form und hinsichtlich des Details von dieser gemacht werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen, wie dieser durch die Ansprüche definiert wird.

Claims

Absorptionsdetektionsvorrichtung, umfassend: eine Flusszelle (16) mit zwei Weglängen, die eine Kammer (26) aufweist, die eine Probe aufnimmt, die eine mobile Phase und einen Analyten umfasst, wobei die Kammer ausgestaltet ist, einen ersten Lichtweg (30) durch die Probe mit einer Länge b und einen zweiten Lichtweg (32) durch die Probe mit einer Länge jb bereitzustellen, wobei der erste Lichtweg (30) länger als der zweite Lichtweg (32) ist; eine Lichtquelle (12), die Licht in die Flusszelle (16) und in den ersten Lichtweg (30) durch die Probe und den zweiten Lichtweg (32) durch die Probe lenkt, wobei im Fall keiner Absorption durch die mobile Phase und den Analyten ein Bruchteil x des Lichts durch den ersten Lichtweg (30) hindurchläuft und ein Bruchteil (1 – x) des Lichts durch den zweiten Lichtweg (32) hindurchläuft; eine einzelne Detektionsvorrichtung (20), die ein einzelnes Ausgangssignal erfasst, das kennzeichnend für Licht ist, das aus dem ersten Lichtweg (30) durch die Probe und dem zweiten Lichtweg (32) durch die Probe austritt; und Berechnungsmittel, die ausgestaltet sind, die Konzentration c des Probenanalyten mit der gemessen Absorption mittels der nachstehenden Gleichung in Beziehung zu setzen: A = log(Im/I) = log[(x·10–Am + (1 – x)·10–jAm + k)/(x·10–Am·e–αbc + (1 – x)·10–jAm·e–αjbc + k)],wobei: I_m das Detektionsvorrichtungssignal darstellt, das mit dem durch die mobile Phase übertragenen Licht im Zusammenhang steht, I das Detektionsvorrichtungssignal darstellt, das mit dem übertragenen Licht beim Vorhandensein eines Analyten im Zusammenhang steht, j das Weglängenverhältnis darstellt, Am die Absorption der mobilen Phase darstellt, k eine Konstante darstellt, die mit Streulicht im Zusammenhang steht, und α den Absorptionskoeffizienten des Analyten darstellt.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Flusszelle (16) ein für Licht transparentes Material umfasst, das kürzer als der erste Lichtweg (30) ist, um den zweiten Lichtweg (32) auszubilden, wobei der Brechungsindex des transparenten Materials größer als der Brechungsindex der Probe ist.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 2, wobei das für Licht transparente Material eine Röhre (28) ist.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Flusszelle (16) umfasst: eine für Licht transparente Röhre (28), die im Innern der Kammer (26) angeordnet ist, und wenigstens ein erstes lichtleitendes Material, das angrenzend an eine Innenseite der Kammer (26) angeordnet ist, und J oder ein zweites lichtleitendes Material, das angrenzend an eine Innenseite (19) der für Licht transparenten Röhre (28) angeordnet ist, wobei die für Licht transparente Röhre (28) hinsichtlich der Kammer (26) derart dimensioniert ist, dass der erste Lichtweg (30) durch die Probe und der zweite Lichtweg (32) durch die Probe ausgebildet wird.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Kammer (26) zylinderförmig ist.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 4, wobei das erste lichtleitende Material Teflon AF ist, das auf die Innenseite der Kammer (26) beschichtet ist.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 4, wobei das erste lichtleitende Material eine Röhre aus Teflon AF ist, die angrenzend an die Innenseite der Kammer (26) angeordnet ist.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Kammer (26) ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist und einen Einlassanschluss (22) in der Nähe des ersten Endes und einen Auslassanschluss (24) in der Nähe des zweiten Endes einschließt und wobei die Flusszelle (16) ferner für Licht transparente Endfenster (38, 40) umfasst, die jeweils an dem ersten und dem zweiten Ende angeordnet sind.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Flusszelle (16) eine für Licht transparente Röhre (28) umfasst, die kürzer als der erste Lichtweg (30) ist, um den zweiten Lichtweg (32) auszubilden, wobei der Brechungsindex der für Licht transparenten Röhre größer als der Brechungsindex der Probe ist und wobei wenigstens eines der für Licht transparenten Endfenster (38, 40) eine Eingangslinse ist, die mit der Lichtquelle (12) zusammenwirkt, um Lichtstrahlen in dem ersten Lichtweg im Wesentlichen daran zu hindern, auf eine Innenseite (19) der für Licht transparenten Röhre (28) einzufallen.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Flusszelle (16) eine für Licht transparente Röhre (28) umfasst, die kürzer als der erste Lichtweg (30) ist, um den zweiten Lichtweg (32) auszubilden, wobei der Brechungsindex der für Licht transparenten Röhre größer als der Brechungsindex der Probe ist und wobei wenigstens eines der für Licht transparenten Endfenster (38, 40) eine Ausgangslinse ist, die ausgestaltet ist, Lichtstrahlen, die auf eine innere Bohrung der Röhre (28) einfallen, im Wesentlichen daran zu hindern, den einzelnen Photodetektor (20) zu erreichen.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, wobei die für Licht transparente Röhre (28) eine Röhre aus Quarzglas umfasst.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach Anspruch 4, wobei das zweite lichtleitende Material aus Teflon AF ausgebildet ist.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Detektionsvorrichtung (20) einen Photodetektor umfasst.
Absorptionsdetektionsvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Detektionsvorrichtung (20) ein Photodetektorarray umfasst.