DE19928056A1 - Verfahren und Testkit zur Bestimmung der Temperatur in den Einzelgefäßen von Multiküvetten mit Fluoreszenzreadern - Google Patents

Verfahren und Testkit zur Bestimmung der Temperatur in den Einzelgefäßen von Multiküvetten mit Fluoreszenzreadern

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zur Bestimmung der Temperatur in den Einzelgefäßen von Multiküvetten mit Fluoreszenzreadern und wird für biochemische, immunologische und medizinische Analysenverfahren angewendet. DOLLAR A Aufgabe ist es, mit Fluoreszenzreadern die Temperaturen in den Einzelgefäßen von Multiküvetten sowie die Homogenität der Verteilung der einzelnen Gefäßtemperaturen über die gesamte Miltiküvette exakt zu bestimmen. Insbesondere sollen für jedes Einzelgefäß der Muliküvette Temperaturabweichungen von der Solltemperatur mit hoher Auflösung erfaßt werden. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird zur Temperaturbestimmung der Einzelgefäße in diese eine Indikatorlösung aus einem temperaturabhängigen Puffer und einem pH-abhängigen Fluoreszenzindikator gefüllt und auf die Solltemperatur erwärmt. Durch den temperaturabhängigen Puffer stellt sich in jedem Einzelgefäß je nach Temperatur ein pH-Wert ein, der die Fluoreszenz der Indikatorlösung bestimmt. Wenigstens zwei Fluoreszenzintensitäten f¶1¶ und f¶2¶ der Indikatorlösung bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen der Fluoreszenz und zumindest einer Emissionswellenlänge oder bei mindestens einer Anregungswellenlänge und zumindest zwei verschiedenen Emissionswellenlängen werden gemessen und aus diesen ein temperaturabhängiges Signal p gebildet, welches zur Temperaturbestimmung in den Einzelgefäßen mit unter sonst gleichen Bedingungen gewonnenen Kalibrierwerten verglichen wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zur Bestimmung der Temperatur in den Einzelgefäßen von Multiküvetten mit Fluoreszenzreadern und wird für biochemische, immunologische und medizinische Analysen­ verfahren angewendet.
Multiküvetten haben für ein nahezu unübersehbares Gebiet von Applikatio­ nen Verbreitung gefunden. Die Anforderungen des High-Through-Put- Screening und der Proteomforschung, aber auch die Entwicklung der Analytik für Biotechnologie, Umweltschutz und Medizin haben zur intensiven Entwicklung der Multiküvetten-Analysentechnologie beigetragen. In den letzten Jahren ist es ausgehend von der 8 × 12-Anordnung der herkömmlichen Multiküvetten zu einer Vervielfachung der Analysenplätze auf der gleichen Flächeneinheit gekommen. Durch den vermehrten Einsatz fluorimetrischer und luminometrischer Meßtechnik ist eine erhebliche Empfindlichkeitssteigerung der Assays erreicht worden. Die Miniaturisierung der Tests führte zu einer drastischen Volumenreduktion im unteren Mikroliterbereich.
Da die meisten in Multiküvetten durchgeführten Analysenverfahren tempe­ raturabhängig sind, ist die Kenntnis der Temperatur in den einzelnen Reaktionsgefäßen der Multiküvette wünschenswert, zumindest muß, wenn unter standardisierten Bedingungen gearbeitet wird, garantiert sein, daß innerhalb eines Analysenansatzes der Multiküvette eine Gleichverteilung der Temperatur vorliegt. Werden kinetische Untersuchungen durchgeführt oder Analysen, die den Anforderungen der internationalen Gesellschaft für klinische Chemie (IFCC) genügen, darf die Temperatur nur in geringen Grenzen schwanken.
Die im allgemeinen in der Analytik, in der Industrie, in der Medizin und anderswo eingesetzten Mittel zur Temperaturbestimmung über Widerstands­ änderungen von Thermistoren, Thermokopplern und Widerstandsthermo­ metern etc. können für Multiküvetten kaum genutzt werden, weil erstens eine große Anzahl von solchen miniaturisierten Meßelementen, die individuell abgeglichen werden müßten, aufwendig und kostenintensiv herzustellen wäre; zweitens würden solche Thermofühler durch ihre Wärmeleiteigenschaf­ ten das zu untersuchende System stören und zu verfälschten Resultaten führen. Darüber hinaus kann mit solchen Elementen nur eine lokale Temperatur, abhängig von der Positionierung des Fühlers, gemessen werden. In der Analysenflüssigkeit der Multiküvette können sich aber leicht Gradien­ ten ausbilden; die wirksame und gesuchte Temperatur ist die mittlere Reak­ tionstemperatur in der Analysenlösung.
Deshalb bieten sich optische Temperaturmeßverfahren für die Bestimmung der Temperatur in den Einzelgefäßen von Multiküvetten an. Der Bestimmung der Temperatur mit optischen Thermometern stehen allerdings die relativ großen Meßfehler entgegen, die durch ungenügend charakterisierte Schichtdicke sowie durch Oberflächeneigenschaften der Flüssigkeitsspiegel in den Einzelgefäßen hervorgerufen werden und zu erheblicher Verfälschung des Meßwertes führen können.
Für kolorimetrische Messungen sind aus der GB 2 191 286 A und aus der DE 31 47 146 C2 thermochrome Systeme bekannt. In der DE 41 30 584 C2 wird ein Verfahren zur Verbesserung der Empfindlichkeit der Temperatur­ bestimmung in kolorimetrischen Readern beschrieben, welches aus der Kombination von Kresolrot als pH-Indikator und einem temperaturabhän­ gigen Puffersystem besteht. Dieses Verfahren nutzt die Absorbanzmessung des Systems mit Mehrwellenlängenkolorimetrie, um die Unpräzision der Multiküvettenmessung zu kompensieren. Die oben genannten Patentschriften beruhen auf kolorimetrischen Messungen und sind deshalb für Fluoreszenz­ reader, besonders dann wenn nicht im Durchlicht gemessen werden kann, nicht geeignet.
Für Temperaturmessungen mit Fluoreszenzsensoren sind Anordnungen beschrieben, welche die direkte Temperaturabhängigkeit von Fluoreszenz­ intensitäten nutzen. Die Temperaturmessung mit optischen Fluoreszenz­ sensoren auf der Basis von Faseroptiken wird z. B. in folgenden Patent­ schriften veröffentlicht: Die US 4 986 671 beschreibt einen optischen Fasersensor mit einer lumineszierenden Schicht, Gegenstand der US 5 035 513 ist ein Fasersensor mit einer Festsubstanz, deren temperatur­ abhängige Fluoreszenzlebensdauer zur Temperaturbestimmung genutzt wird, und die US 5 352 040 verwendet ebenfalls die temperaturabhängige Zerfalls­ zeit einer Dotierung mit seltenen Erden. Sie sind aus denselben Gründen, wie für Thermistoren oben angeführt, zur Anwendung in Multiküvetten nicht geeignet.
Die US 5,788,374 beschreibt eine Methode der 2-Wellenlängenfluoreszenz­ messung unter Verwendung von Fluoreszenzindikatoren, die in Abhängigkeit von der Temperatur und der Viskosität von flüssigen Polymeren als Lösungs­ mittel Excimere mit anderen Fluoreszenzeigenschaften als die der Monomere bilden. Eine relativ geringe Änderung des Quotienten Iex/Imon im Tempera­ turbereich von 25 bis 50°C ermöglicht keine ausreichende Genauigkeit der Temperaturbestimmung. Die Kombination hydrophober Indikator mit flüssigem Polymer als Lösungsmittel entspricht nicht den Anforderungen, die an die im allgemeinen wäßrige Systeme untersuchende Multiküvetten­ technologie gestellt werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, mit Fluoreszenzreadern die Temperaturen in den Einzelgefäßen von Multiküvetten sowie die Homogenität der Verteilung der einzelnen Gefäßtemperaturen über die gesamte Multiküvette exakt zu bestimmen. Insbesondere sollen für jedes Einzelgefäß der Multiküvette Temperaturabweichungen von der Solltempera­ tur mit hoher Auflösung erfaßt werden.
Erfindungsgemäß wird zur Temperaturbestimmung der Einzelgefäße in diese eine Indikatorlösung aus einem an sich bekannten temperaturabhängigen Puffer, wie beispielsweise TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) oder AMP (2-Aminomethyl-1-propanol), und einem an sich bekannten pH-abhän­ gigen Fluoreszenzindikator, wie beispielsweise HPTS (8-Hydroxypyren- 1,3,6-trisulfonsäure), gefüllt und auf die Solltemperatur erwärmt. Durch den temperaturabhängigen Puffer stellt sich in jedem Einzelgefäß je nach Temperatur ein pH-Wert ein, der die Fluoreszenz der Indikatorlösung bestimmt. Wenigstens zwei Fluoreszenzintensitäten f1 und f2 der Indikator­ lösung bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen der Fluoreszenz und zumindest einer Emissionswellenlänge oder bei zumindest einer Anregungs­ wellenlänge und zumindest zwei verschiedenen Emissionswellenlängen werden gemessen und aus diesen ein temperaturabhängiges Signal p gebildet, welches zur Temperaturbestimmung in den Einzelgefäßen mit unter sonst gleichen Bedingungen gewonnenen Kalibrierwerten verglichen wird. Das Verfahren wird mit einem Testkit durchgeführt, das sowohl die temperaturabhängige Indikatorlösung als auch zu Eichzwecken von der Temperatur unabhängige Eichlösungen enthält.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Es zeigen:
Fig. 1 Temperaturabhängigkeit der pH-Werte der Puffer AMP (2- Amino-2-methyl-1-propanol), TRIS (Tris(hydroxymethyl)amino­ methan) und Glycin
Fig. 2 Excitationsspektren von HPTS (8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfon­ säure) in 0,1 M TRIS-Puffer bei verschiedenen Temperaturen, gemessen bei einer Emissionswellenlänge von 511 nm
Fig. 3 Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenzintensität einer 2 µM HPTS-Lösung in 0,1 M TRIS-Puffer mit einem bei 22,5°C eingestellten pH-Wert von 7,5 bei der Emissionswellenlänge 538 nm und den Anregungswellenlängen 405 nm (Gerade f1) und 450 nm (Gerade f2) und Temperaturabhängigkeit des Quotienten f1/f2 = p (Kurve). Die eingetragenen Punkte stellen Mittelwerte der Meßdaten aller Einzelgefäßpositionen dar, die Fehlerindi­ katoren die zugehörigen Standardabweichungen, und die VK- Werte die Variationskoeffizienten bei 25,9°C und 31,7°C. Der Vergleich der Variationskoeffizienten zeigt den Vorteil des Temperatursignals f1/f2 gegenüber f1 und f2.
Fig. 4 Streuung der Temperaturmeßwerte aller Positionen einer in einem Fluoreszenzreader thermisch equilibrierten Multiküvette bei unterschiedlichen Temperaturen im Bereich von 25°C bis 50°C, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Werte (), die sowohl die Restinhomogenität der Temperaturverteilung als auch die Meßfehler der Temperaturbestimmung aus den Fluoreszenzintensitäten enthalten, und theoretisch aufgrund des Variationskoeffizienten σf/f der einzelnen Fluoreszenzmessung erwarteter Verlauf (Kurve), der nur den Fluoreszenzmeßfehler enthält
Fig. 5 Zu erwartende Streuung der Temperaturmeßwerte aller Einzelgefäßpositionen einer in einem Fluoreszenzreader auf 37°C equilibrierten Multiküvette in Abhängigkeit vom Varia­ tionskoeffizienten des Quotienten f1/f2 = p der gemessenen Fluoreszenzintensitäten, bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
Fig. 6 Verteilung der Temperaturmeßwerte der Einzelgefäßpositionen einer Multiküvette in einem Fluoreszenzreader
  • A) nach Equilibrierung auf 24°C
  • B) während der Aufheizungsphase
  • C) und D) nach Erreichen der Solltemperatur 37°C
Die an den Einzelgefäßpositionen eingetragenen Symbole bezeichnen die Abweichungen der dortigen Temperaturen vom Mittel der Multiküvette (siehe auch Erläuterungen am unteren Bildrand)
Fig. 7 Eichung der Temperaturbestimmung mit temperaturunabhängig fluoreszierenden Lösungen: Die durch Vollkreise dargestellten Meßpunkte und die ihnen angepaßte Kurve wurden mit HPTS- Eichlösungen gewonnen, deren pH-Werte und damit auch Fluoreszenzen mit temperaturunabhängigen Puffern auf die pH- Werte der Indikatorlösung bei den Eichtemperaturen eingestellt wurden (zum Vergleich sind mit der Indikatorlösung erhaltene Meßpunkte durch Quadrate dargestellt)
Fig. 8 Darstellung der Emissionsspektren von Luminol (Anregungs­ wellenlänge 355 nm) und Fluorescein (Anregungswellenlänge 485 nm) in Phosphatpuffern mit unterschiedlichen pH-Werten, wobei Luminol eine Fluoreszenzintensitätsabnahme mit steigen­ dem pH-Wert und Fluorescein eine Fluoreszenzintensitäts­ zunahme mit steigendem pH-Wert aufweist
Ausführungsbeispiel 1 Optischer Thermosensor
Zur Erzeugung eines temperaturabhängigen optischen Signals wird eine Indikatorlösung benutzt, die einen Puffer mit temperaturabhängigem pH- Wert und einen pH-abhängigen Fluoreszenzindikator enthält. Beispiele für den temperaturabhängigen Puffer sind AMP (2-Amino-2-methyl-1-propanol), TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) und Glycin, siehe auch Fig. 1. Als pH-abhängig fluoreszierende Substanz dient HPTS (8-Hydroxypyren 1, 3, 6- trisulfonsäure). Sie weist in wäßriger Lösung ein Excitationsspektrum mit zwei pH-abhängigen Maxima bei Wellenlängen von 405 nm und 460 nm auf. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wurden in jeder Einzelgefäßposition einer Multiküvette 130 µl einer 2 µM HPTS-Lösung in 0,1 M TRIS-Puffer mit einem bei 22,5°C eingestellten pH-Wert von 7,5 (Indikatorlösung) verwendet. Fig. 2 zeigt Anregungsspektren bei verschiedenen Temperaturen. Die Emission wurde im verwendeten Fluoreszenzreader jeweils bei 538 nm gemessen. Die Intensitäten der Fluoreszenzsignale f1 (Anregung mit 405 nm) bzw. f2 (Anregung mit 450 nm) sind steigende bzw. fallende und nahezu lineare Funktionen der Temperatur (vgl. Fig. 3).
Verwendet man als Temperatursignal den Quotienten f1/f2 anstelle einer einzelnen Fluoreszenzintensität, sind folgende Vorteile zu erwarten: Erstens ist die Temperaturempfindlichkeit des Quotienten stärker als die Temperatur­ empfindlichkeiten der einzelnen Fluoreszenzintensitäten f1 und f2, da beide entgegengesetzt von der Temperatur abhängen (bei Erhöhung der Temperatur von 26°C auf 50°C multiplizieren sich die gemittelten Intensitäten der Fluoreszenzsignale f1 und f2 mit dem Faktor 1,3 und 1/1,9, der gemittelte Quotient f1/f2 dagegen mit 2,3). Zweitens werden positionsabhängige Unterschiede in der Geometrie des Volumens der fluoreszierenden Flüssigkeit, die multiplikativ in f1 und f2 eingehen dürften, bei der Bildung der Quotienten f1/f2 kompensiert (vgl. Ausführungsbeispiel 3).
Ausführungsbeispiel 2 Eichung
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit dem in Ausführungsbeispiel 1 angegebenen HPTS-TRIS-System geeicht, indem bei zwölf konstant gehaltenen Temperaturen im Bereich von 25°C bis 50°C in der Position E7 (nahezu Mitte der Multiküvette) jeweils die eingestellte Temperatur in der fluoreszierenden Lösung und die dazu gehörigen Fluoreszenzintensitäten f1 (Anregung mit 405 nm) und f2 (Anregung mit 450 nm) bei einer Emissions­ wellenlänge von 538 nm gemessen wurden.
Die Bestimmung der Flüssigkeitstemperatur kann z. B. erfolgen, indem mit einem in den Metallkörper der Multiküvette eingebauten elektronischen Temperaturfühler die Temperatur nahe der Position E7 gemessen und das Ergebnis auf die Temperatur der Flüssigkeit umgerechnet wird durch Addition einer Korrektur, die man für die betreffende Multiküvette aus Messungen mit Fühlern im Metallkörper und in der Flüssigkeit ermittelt.
Da die Intensitäten der Fluoreszenzsignale f1 und f2 praktisch lineare Funktionen der Temperatur mit von Null verschiedener Steigung sind, liegt für die Temperatur als Funktion des Quotienten f1/f2 = p die Form T = (a + b × p)/(1 + c × p) nahe. An die Wertepaare T, f1/f2 = p wurde daher diese Funktion durch Optimierung der Parameter a, b und c mit einem iterativen Verfahren der kleinsten Quadrate angepaßt. Die Sequenz der Vorzeichen der Abweichungen der Eichpunkte von der angepaßten Kurve ließ im Lauftest keinen systematischen Unterschied zwischen experimentellem und angepaßtem Verlauf erkennen.
Die Eichkurve T = (a + b × p)/(1 + c × p) verlief ähnlich der entsprechenden Kurve in Fig. 3. Für das vorliegende Ausführungsbeispiel ergaben sich die Werte a = - 34,584°C, b = 351,03°C, c = 4,0847.
Ausführungsbeispiel 3 Verbesserung der Präzision der optischen Temperaturmessung durch Reduktion des Fehlers des optischen Signals
Es wird davon ausgegangen, daß die Fluoreszenzintensität der Indikatorlö­ sung nahezu linear von der Temperatur abhängt, was durch Messungen bestätigt wurde (vgl. Fig. 3), und daß sie in der Multiküvette einen von Position zu Position der Einzelgefäße unterschiedlichen Faktor V enthält, der durch die Geometrie des Volumens der fluoreszierenden Indikatorlösung zustande kommt und nicht von der Anregungswellenlänge abhängt:
f1 = V(a1 + b1T) + δf1, f2 = V(a2 + b2T) + δf2.
Verwendet man als optisches Temperatursignal nur eine der beiden Fluoreszenzintensitäten f1 und f2, so wirken sich sowohl der Fluoreszenz­ meßfehler δf1 oder δf2 als auch positionsabhängige Abweichungen von V auf die Bestimmung der Temperatur aus. Für den Quotienten p = f1/f2 gilt jedoch wegen der relativ kleinen Fehler δf1 und δf2 nahezu p = (a1 + b1T)/(a2 + b2T), so daß sich die Positionsabhängigkeit von V praktisch nicht auf p und damit auch nicht auf die aus p erschlossene Temperatur auswirkt.
Zur experimentellen Verifizierung wurde eine Multiküvette mit dem in Ausführungsbeispiel 1 angegebenen HPTS-TRIS-System beschickt. Nach Erreichung der Temperaturkonstanz wurden die Fluoreszenzsintensitäten f1 (Anregung mit 405 nm) bzw. f2 (Anregung mit 450 nm) an allen Multiküvettenpositionen gemessen und aus den Quotienten f1/f2 = p mittels der Eichfunktion (Ausführungsbeispiel 2) die Temperaturen berechnet. Aus den Temperaturen ergab sich die empirische Streuung, welche durch die Restinhomogenität der Temperaturverteilung und den Fehler der Temperaturbestimmung bedingt wird. Ergebnisse für verschiedene Tempe­ raturen im Bereich von 25°C bis 50°C sind in Fig. 4 dargestellt () und zeigen im Bereich von 25°C bis 40°C eine Streuung von etwa 0,15°C.
Die Nützlichkeit des Temperatursignals f1/f2 anstelle einzelner Fluoreszen­ zen zeigt sich bereits in den Variationskoeffizienten dieser Signale (vgl. die in Fig. 3 eingetragenen Werte). Die bei Benutzung von nur einer einzelnen Fluoreszenzintensität f1 bzw. f2 zu erwartende Mindeststreuung der Tempe­ raturmeßwerte läßt sich wie folgt ermitteln: Die Fluoreszenzintensität f2 (Anregung mit 450 nm) hängt am stärksten von der Temperatur ab. Aus der Steilheit der Geraden f2 = V(a2 + b2T) und der Streuung der gemessenen f2- Werte aller Einzelgefäßpositionen ergäbe sich im Bereich von 25°C bis 40°C eine Streuung der aus f2 ermittelten Temperaturen zwischen 1°C und 1,7°C im Gegensatz zu etwa 0,15°C bei Temperaturbestimmung aus p = f1/f2.
Zur theoretischen Abschätzung der Streuung der Temperaturmeßwerte aufgrund der Fluoreszenzmeßfehler δf1 und δf2 wurde identische Temperatur auf allen Meßpositionen angenommen. Mit Hilfe des Fehlerfortpflanzungs­ gesetzes wurde aus der mittels Mehrfachmessung bestimmten Streuung von df die Streuung von p = f1/f2 = (V(a1 + b1T) + δf1)/(V(a2 + b2T) + δf2) geschätzt und aus dieser anhand der Eichfunktion die Streuung der Temperatur. Das Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt (Kurve), es entspricht im Bereich von 25°C bis 40°C etwa dem experimentellen Resultat. Oberhalb von 40°C wird die beobachtete Streuung größer als die theoretisch erwartete. Messungen zeigen in Übereinstimmung hiermit, daß die Korrelation zwischen den f1- und f2-Werten der verschiedenen Einzelgefäßpositionen bei höheren Temperaturen schwächer wird, was in f1/f2 eine schwächere Kompensation der Positionsabhängigkeit von f1 durch diejenige von f2 bewirkt.
Hat man bei der Temperatur T die Fluoreszenzintensitäten f1 und f2 auf allen Einzelgefäßpositionen gemessen, so läßt sich bei bekannter Eichfunktion die Streuung σT der Temperaturmesswerte aus dem Variationskoeffizienten σp/p des Quotienten p = f1/f2 abschätzen durch σT = σp/p × p × |dT/dp|.
Für T = 37°C und die Eichfunktion aus Ausführungsbeispiel 2 ergibt sich die Relation σT = σp/p × 29,1°C. Diese Abhängigkeit ist in Fig. 5 dargestellt.
Verwendung von Fluoreszenzintensitätsdifferenzen und ihrer Quotienten zur Temperaturbestimmung
Differenzen kompensieren positionsabhängige additive Beiträge zur Fluoreszenzintensität, z. B. die Eigenfluoreszenz des Küvettenmaterials. Durch Messungen mit einer Lösung, die bis auf das Fehlen der fluoreszierenden Substanz mit der Indikatorlösung identisch ist, könnten solche Beiträge festgestellt und danach von den mit der Indikatorlösung erhaltenen Fluoreszenzintensitäten subtrahiert werden. Die Verwendung nichtfluoreszierender Materialien erscheint jedoch einfacher.
Ausführungsbeispiel 4 Messung der Temperaturverteilung in einer Multiküvette
Unter Verwendung der in Ausführungsbeispiel 1 angegebenen Indikator­ lösung und der Eichfunktion (Ausführungsbeispiel 2) kann durch Messung der Fluoreszenzintensitäten f1 (Anregung mit 405 nm) bzw. f2 (Anregung mit 450 nm) an allen Positionen der Multiküvette die Temperaturverteilung über die gesamte Multiküvette im geeichten Temperaturbereich erfaßt werden. Fig. 6 zeigt die gemessene Temperaturverteilung bei 24°C sowie nach Erwärmung auf 37°C. Die Streuung der Temperatur beträgt im Ausgangs­ zustand 0,08°C, steigt während des Heizvorganges etwas an (0,16°C) und liegt nach Erreichen der vorgegebenen Solltemperatur bei 0,12°C.
Ausführungsbeispiel 5 Testkit zur Eichung der Temperaturbestimmung aus Fluoreszenzintensitäten und zur Ermittlung der Homogenität der Temperierung von Multiküvetten
Außer einer HPTS-Lösung in TRIS-Puffer zur Temperaturbestimmung (Indikatorlösung) enthält das Testkit einen Satz von Eichlösungen, d. h. HPTS-Lösungen in Puffern mit definierten Konzentrationen von primärem und sekundärem Phosphat mit fest eingestellten temperaturunabhängigen pH- Werten, die genau den pH-Werten der Indikatorlösung bei den Eichtem­ peraturen entsprechen.
Dieses Testkit ermöglicht die Übertragung der Temperatureichung auf beliebige Fluoreszenzreader bzw. Multiküvetten, ohne daß für jedes Gerät eine "echte" Temperatureichung durchgeführt werden muß.
Die verschiedenen Eichlösungen, deren Fluoreszenzquotienten jeweils einer Temperatur der Eichkurve der Indikatorlösung entsprechen, können gleichzeitig bei Raumtemperatur in einer Multiküvette gemessen werden, indem man sie z. B. reihenweise in eine Multiküvette pipettiert und die Fluoreszenzintensitäten bei 538 nm nach Anregung bei 405 nm und 450 nm mißt. Zur Eichung werden die Quotienten den angegebenen Temperaturen zugeordnet und die Eichfunktion wird aus den erhaltenen Wertepaaren durch nichtlineare Optimierung ermittelt.
Fig. 7 zeigt die aus vier Eichlösungen (Vollkreise) erhaltene Eichkurve im Vergleich zu den Meßpunkten (Quadrate) der Temperatureichung der Indikatorlösung.
Ausführungsbeispiel 6
Fluoreszenzen mit gegenläufiger Temperaturabhängigkeit, die zur Tempe­ raturbestimmung anhand von Intensitätsquotienen benutzt werden können, lassen sich auch mit Mischungen verschiedener pH-abhängig fluoreszieren­ der Substanzen mit einem temperaturabhängigen pH-Puffer erzeugen. Ein Beispiel zeigt Fig. 8. Hierbei handelt es sich um einen Mischindikator, bestehend aus Luminol und Fluorescein.

Claims (20)

1. Verfahren zur Bestimmung der Temperatur in den Einzelgefäßen von Multiküvetten mit Fluoreszenzreadern, mit einer Indikatorlösung aus einem temperaturabhängigen Puffer und einem pH-abhängigen Fluoreszenzindika­ tor, wobei wenigstens zwei Fluoreszenzintensitäten f1 und f2 der Indikator­ lösung bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen der Fluoreszenz und zumindest einer Emissionswellenlänge oder bei zumindest einer Anregungswellenlänge und zumindest zwei verschiedenen Emissionswellen­ längen gemessen werden und daraus ein temperaturabhängiges Signal p gebildet wird, welches zur Temperaturbestimmung in den Einzelgefäßen mit unter sonst gleichen Bedingungen gewonnenen Kalibrierwerten verglichen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als temperatur­ abhängiger Puffer TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) im Konzen­ trationsbereich von 0,05-0,5 mol/L und im pH-Bereich von 6,5-8,5 für den Temperaturbereich von 5-60°C verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als temperatur­ abhängiges Puffersystem AMP (2-Aminomethyl-1-propanol) im Konzentra­ tionsbereich von 0,05-0,5 mol/L, im pH-Bereich von 8-10 für den Tempera­ turbereich von 5-60°C verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenz­ indikator HPTS (8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure) im Konzentrations­ bereich von 0,1 bis 15 µM verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH- abhängige Fluoreszenzindikator zwei gegenläufig vom pH-Wert abhängige Fluoreszenzintensitäten liefert.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz­ signale f1 und f2 nach Anregung mit Licht einer Wellenlänge im Bereich von 390 bis 410 nm bzw. 430 bis 480 nm durch Messung des emittierten Lichts bei einer Wellenlänge im Bereich von 490 bis 540 nm gebildet werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH- abhängige Fluoreszenzindikator zumindest aus zwei fluoreszierenden Sub­ stanzen besteht, wobei zumindest eine der fluoreszierenden Substanzen pH- abhängig ihre Fluoreszenzeigenschaften ändert.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das tempera­ turabhängige Signal p durch Quotientenbildung (p = f1/f2) der beiden Fluoreszenzintensitäten f1 und f2 erzeugt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das tempera­ turabhängige Signal p durch Quotientenbildung (p = (f1-f1')/(f2-f2')) der Differenzen f1-f1' und f2-f2' erzeugt wird, wobei f1' und f2' die Fluoreszenzintensitäten sind, die unter sonst gleichen Bedingungen wie für die Bestimmung von f1 und f2, jedoch ohne pH-abhängigen Fluoreszenz­ indikator gemessen werden.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als pH- abhängiger Fluoreszenzindikator eine Mischung von Fluorescein in einem Konzentrationsbereich von 0,01 µM bis 10 µM und Luminol im Konzentrationsbereich von 0,01 µM bis 10 µM verwendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vergleich mit Kalibrierwerten anhand einer Eichkurve der Funktion p = f(T) durchgeführt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 l, dadurch gekennzeichnet, daß die Funktion p = f(T) durch Quotientenbildung aus den Geraden f1 = f1(T) und f2 = f2(T) gebildet wird, deren Parameter durch lineare Regression bestimmt werden.
13. Verfahren nach Ansprüchen 8, 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur nach der Funktion T = (a + b × p) / (1 + c × p) bestimmt wird, welche durch Optimierung der Parameter a, b und c mit einem iterativen Rechenverfahren an die Kalibrierwerte T, p = f1/f2 angepaßt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vergleich mit Kalibrierwerten anhand temperaturunabhängiger Kalibratoren erfolgt, deren Signal p durch definierte pH-Einstellung mit temperaturunabhängigen Puffern gewonnen wird.
15. Testkit zur Bestimmung der Temperatur in den Einzelgefäßen von Multi­ küvetten mit Fluoreszenzreadern, enthaltend eine temperaturabhängige Indikatorlösung, bestehend aus einem temperaturabhängigen Puffer und einem pH-abhängigen Fluoreszenzindikator, sowie mindestens drei tempe­ raturunabhängigen Lösungen, bestehend aus einem temperaturunabhängigen Puffer und einem pH-abhängigen Fluoreszenzindikator, denen jeweils eine definierte Temperatur zugeordnet ist.
16. Testkit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die temperaturabhängige Indikatorlösung einen TRIS-Puffer (Tris(hydroxy­ methyl)aminomethan) im Konzentrationsbereich von 0,05-0,5 mol/L und HPTS (8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure) im Konzentrationsbereich von 0,1 bis 15 µM enthalten.
17. Testkit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens drei temperaturunabhängigen Indikatorlösungen jeweils einen Phosphatpuffer in einer Konzentration zwischen 0,05 und 0,5 mol/L enthalten.
18. Testkit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des TRIS-Puffers bei Raumtemperatur zwischen 7,0 und 8,0 liegt.
19. Testkit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Phosphatpuffers jeweils zwischen 6,8 und 7,8 liegt.
20. Testkit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die temperatur­ abhängige Indikatorlösung und die mindestens drei temperaturunabhängigen Lösungen steril in Einwegflaschen mit Volumina im Bereich von 50 ml bis 500 ml abgefüllt sind und ein bakteriostatisches Mittel zugesetzt wird.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003079030A1 (de) * 2002-03-14 2003-09-25 Cybio Ag Verfahren zur charakterisierung hochparallelisierter liquidhandlingstechnik mittels mikroplatten sowie testkit zur durchführung des verfahrens
DE10348958B4 (de) * 2003-10-13 2008-04-17 Friedrich-Schiller-Universität Jena Verfahren zur Bestimmung der Temperatur von wässrigen Flüssigkeiten mit optischen Mitteln
DE102013021097A1 (de) * 2013-12-18 2015-06-18 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Kalibriernormal für eine Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials
CN107459487A (zh) * 2017-08-02 2017-12-12 曲阜师范大学 一种双波长pH值比色传感材料鲁米诺衍生物及其功能化比色试纸的制作及应用

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003079030A1 (de) * 2002-03-14 2003-09-25 Cybio Ag Verfahren zur charakterisierung hochparallelisierter liquidhandlingstechnik mittels mikroplatten sowie testkit zur durchführung des verfahrens
GB2403535A (en) * 2002-03-14 2005-01-05 Cybio Ag Method for characterizing a highly parallelized liquid handling technique using microplates and test kit for carrying out the method
GB2403535B (en) * 2002-03-14 2005-05-11 Cybio Ag Method for characterizing a highly parallelized liquid handling technique using microplates and test kit for carying out the method
US7504264B2 (en) 2002-03-14 2009-03-17 Cybio Ag Method for characterizing a highly parallelized liquid handling technique using microplates and test kit for carrying out the method
DE10348958B4 (de) * 2003-10-13 2008-04-17 Friedrich-Schiller-Universität Jena Verfahren zur Bestimmung der Temperatur von wässrigen Flüssigkeiten mit optischen Mitteln
DE102013021097A1 (de) * 2013-12-18 2015-06-18 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Kalibriernormal für eine Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials
CN107459487A (zh) * 2017-08-02 2017-12-12 曲阜师范大学 一种双波长pH值比色传感材料鲁米诺衍生物及其功能化比色试纸的制作及应用
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