DE102013021097A1 - Kalibriernormal für eine Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Kalibriernormal (7) für eine Vorrichtung (1) zur bildlichen Darstellung biologischen Materials (6), das während der Untersuchung zumindest bereichsweise zur Lumineszenz angeregt wird. Die Vorrichtung (1) verfügt über eine Beleuchtungseinheit (2) mit einer Strahlungsquelle, durch die eine elektromagnetische Anregungsstrahlung (15) emittierbar ist. Ferner ist eine Aufnahme (3) vorgesehen, die sicherstellt, dass das auf einem Träger (5) angeordnete biologische Material (6) innerhalb eines Strahlengangs der Anregungsstrahlung (15) positioniert ist. Im Übrigen verfügt die Vorrichtung über zumindest eine Bilderzeugungseinheit (4), die vom biologischen Material (6) aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung (15) emittierte Lumineszenzstrahlung (16) empfängt und ein Bild zumindest der zur Lumineszenz angeregten Bereiche des biologischen Materials (6) erzeugt. Zur Kalibrierung verfügt die Vorrichtung über ein Kalibriernormal (7), das aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung (15) eine Kalibrationsstrahlung emittiert, die von der Bilderzeugungseinheit (4) aufgenommen und in einer Steuerung (18) unter Berücksichtigung der aufgenommenen Kalibrierstrahlung ein Kalibrationssignal generierbar ist. Die beschriebene technische Lösung zeichnet sich dadurch aus, dass das Kalibriernormal (7) ein Gehäuse (9) mit einem darin eingeschlossenen zur Lumineszenz anregbaren Stoff (12) aufweist und mit Hilfe eines Befestigungsmittels (19) fest mit der Beleuchtungseinheit (2) oder der Aufnahme (3) verbunden ist.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Kalibriernormal sowie eine Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials, in die ein entsprechendes Kalibriernormal integriert ist. Zu den wesentlichen Bauteilen einer gattungsgemäßen Vorrichtung gehören eine Beleuchtungseinheit mit einer Strahlungsquelle, durch die eine elektromagnetische Anregungsstrahlung emittiert wird, sowie eine Aufnahme zur Positionierung des auf einem Träger angeordneten biologischen Materials innerhalb eines Strahlenganges der Anregungsstrahlung. Ferner ist eine Bilderzeugungseinheit vorgesehen, die vom biologischen Material aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung emittierte Lumineszenzstrahlung empfängt und ein Bild zumindest der zur Lumineszenz angeregten Bereiche des biologischen Materials erzeugt. Weiterhin ist ein Kalibriernormal vorgesehen, das aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung eine Kalibrationsstrahlung emittiert, die von der Bilderzeugungseinheit aufgenommen und in einer Steuerung unter Berücksichtigung der aufgenommenen Kalibrierstrahlung ein Kalibrationssignal generierbar ist.
  • Insbesondere auf dem Gebiet der in-vitro-Diagnostik werden bei der Untersuchung menschlicher oder tierischer Proben vielfach Fluoreszenzuntersuchungen durchgeführt. In Abhängigkeit der eingesetzten Analyseverfahren werden hierbei Fluoreszenzbilder mit unterschiedlichen Systemen aufgenommen und ausgewertet. Um die jeweiligen Ergebnisse trotzdem miteinander vergleichen zu können ist es wichtig, die gerätespezifischen Einflüsse auf das Fluoreszenzsignal ermitteln und entsprechend korrigieren zu können. Von besonderer Bedeutung ist in diesem Zusammenhang die Verwendung von Kalibrier- bzw. Fluoreszenzstandards für die Gerätekalibrierung, deren Strahlungsintensität auf zertifizierte Standards rückführbar ist.
  • Die Bedeutung derartiger Standards wird anhand eines Projekts deutlich, das gemeinsam von der Physikalisch Technischen Bundesanstalt (PTB), der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM) sowie den Firmen Gigahertz-Optik GmbH und Sigma-Aldrich GmbH durchgeführt wurde. Im Rahmen dieses Projekts wurde eine radiometrische Rückführungskette für Fluoreszenzstandards entwickelt, die aus drei wesentlichen Elementen besteht. Einerseits ist ein kompakter, homogen leuchtender Ulbrichtkugelstrahler vorgesehen, dessen spektrale Strahldichte gegenüber einer Wolframbandlampe um mehrere Größenordnungen reduziert wurde, so dass er in seinen Strahlungseigenschaften wesentlich besser an eine fluoreszierende Probe angepasst ist als herkömmliche Strahldichtnormale. Das zweite Element ist ein Referenzfluorometer mit minimalen optischen Abbildungsfehlern, das rückgeführt über das Strahldichtenormal die Zertifizierung vom Fluoreszenzspektrum mit ausreichend kleinen radiometrischen Messunsicherheiten ermöglicht. Als dritter Teil der Rückführungskette dient ein Kalibiersatz „Spektrale Fluoreszenzstandards BAM-F001 sowie BAM-F005”, dessen korrigierte Emissionsspektren im Januar 2006 von der BAM zertifiziert wurden. Diese Standards ermöglichen es einem Anwender, die relativen spektralen Empfindlichkeiten des Emissionskanals von Fluoreszenzmesssystemen unter applikationsrelevanten Bedingungen vergleichsweise einfach und rückführbar zu ermitteln und zu korrigieren.
  • Zur praktischen Durchführung von Untersuchungen sind aus dem Stand der Technik zahlreiche Vorrichtungen zur Aufnahme und Auswertung von Lumineszenzbildern, insbesondere von Fluoreszenzbildern, bekannt, mit denen Proben biologischen Materials untersucht werden. Derartige Vorrichtungen verfügen häufig über ein Mikroskop oder eine Kameraeinheit, mit denen jeweils Aufnahmen von mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten biologischen Proben erzeugt werden. Des Weiteren sind Microarray-Scanner bekannt, mit denen fluoreszenzmarkierte DNA-Proben, die auf sogenannten Biochips angeordnet sind, untersucht werden können.
  • Aus der WO 2009/127424 sind verschiedene Fluoreszenzstandards bekannt, die für die Fluoreszenzspektroskopie einsetzbar sind. Problematisch bei den bekannten Fluoreszenzstandards ist oftmals, dass diese über den anwendbaren Zeitraum nicht lichtstabil sind bzw. leicht ausbleichen, vor allem bei einer längeren Belichtung oder beim Belichten mit hohen Intensitäten. Darüber hinaus sind die verwendeten Farbstoffe in vielen Fällen nur innerhalb eines schmalen Spektralbereichs verwendbar.
  • Weitere Probleme bestehen oftmals darin, dass sie vergleichsweise teuer sind, mechanisch, thermisch und chemisch instabil sind und darüber hinaus schnell altern oder austrocknen, was wiederum zur Änderung der bestrahlungsabhängigen Fluoreszenzintensität führt.
  • Die zuvor genannte Schrift offenbart in diesem Zusammenhang unterschiedliche Fluoreszenzstandards bzw. Fluoreszenzfarbstoffe, die sich dadurch auszeichnen, dass ein fluoreszierendes Mineral oder eine Substanz verwendet wird, die ein fluoreszierendes Mineral enthält. Bei den beschriebenen Mineralien handelt es sich sowohl um natürliche als auch um synthetische Mineralien.
  • Neben mineralischen Fluoreszenzfarbstoffen kommen auch andere Farbstoffe, wie etwa Polymere, als Fluoreszenzstandards zum Einsatz. Aus der EP 1 373 870 B1 ist eine Vorrichtung zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen und/oder zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen bekannt, die auf der Verwendung spezieller Polymere beruht. Die beschriebene Vorrichtung weist im Wesentlichen einen nicht-fluoreszierenden Träger auf, auf dem in mehreren definierten Bereichen Polymerschichten mit zum Teil unterschiedlicher Dicke und/oder Zusammensetzung aufgebracht sind. Die Polymerschichten sind derart auf den Träger aufgebracht, dass sie nach entsprechender Bestrahlung fluoreszieren, so dass der beschichtete Träger als Fluoreszenzstandard verwendet werden kann.
  • Die beschriebenen Fluoreszenzstandards werden zur Standardisierung von Experimenten eingesetzt, die auf der Auswertung von Sonden-Arrays beruhen, wobei sich die Fluoreszenzstandards mit den biologisches Material enthaltenden Sonden auf einem gemeinsamen Träger befinden. Bei den Trägern handelt es sich um epoxidierte Objektträger, in die durch Ultraschallbohrung Löcher eingebracht sind, welche mit einem fluoreszierenden Polymer gefüllt und anschließend verklebt werden.
  • Zur Erstellung einer Diagnose werden auf einen Träger zunächst eine Reihe von Spots von PCR-Produkten aufgebracht, wobei an die einzelnen PCR-Spots speziell aufgereinigte und fluoreszenzfarbstoffmarkierte spezifische cDNA durch Hybridisierung immobilisiert wird. Anschließend werden diese Proben mittels eines konfokalen Laserscanners ausgelesen und die Ergebnisse analysiert, wobei die Auswertung unter Berücksichtigung eines Abgleichs mit den Intensitäten der unterschiedlichen Bereiche der Fluoreszenzstandards erfolgt.
  • Ausgehend von den bekannten Systemen zur Aufnahme von Lumineszenzbildern, insbesondere von Fluoreszenzbildern biologischen Materials, und den für die Kalibrierung derartiger Systeme verwendeten Standards, liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein einfach und reproduzierbar herstellbares Kalibriernormal anzugeben, mit dem vergleichsweise einfach und genau die Kalibrierung einer entsprechenden Untersuchungsvorrichtung erfolgen kann. Hierbei ist zum einen wesentlich, dass sich der verwendete Lumineszenzstoff durch eine besondere Langlebigkeit auszeichnet, insbesondere ein zu schnelles Ausbleichen vermieden wird, trotzdem eine vergleichsweise einfache Handhabung ermöglicht und darüber kostengünstig ist. Insbesondere sollte das Kalibriernormal derart ausgeführt sein, dass die Kalibrierung einer entsprechenden Untersuchungseinheit im normalen Labor-Arbeitsablauf, bei dem eine große Anzahl unterschiedlicher Proben in kurzer Zeit abgearbeitet werden muss, ohne großen Aufwand und in kurzer Zeit vorgenommen werden kann. Des Weiteren soll das Kalibriernormal eine möglichst automatisierte und trotzdem hochgenaue Kalibrierung einer Untersuchungseinheit ermöglichen. Weiterhin soll auf bevorzugte Weise sichergestellt sein, dass auch bei der Herstellung einer Vielzahl von Untersuchungseinheiten, Kalibriernormale für die jeweilige Einheit verwendet werden, die untereinander vergleichbar sind. Die Rückführbarkeit des anzugebenden Kalibriernormals auf einen normierten Standard ist daher ein weiteres wesentliches Merkmal. Das Kalibriernormal soll zudem spektral möglichst in Übereinstimmung mit dem in der Fluoreszenzanwendung eingesetzten Fluorochrom stehen.
  • Die vorgenannte Aufgabe wird mit einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 sowie einem Kalibriernormal nach Anspruch 15 gelöst. Eine erfindungsgemäße Verwendung des Kalibriernormals ist ferner in Anspruch 17 angegeben. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der anhängigen Ansprüche und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.
  • Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials, mit einer Beleuchtungseinheit, die über eine Strahlungsquelle verfügt, durch die eine elektromagnetische Anregungsstrahlung emittierbar ist. Ferner ist eine Aufnahme vorgesehen, die sicherstellt, dass das auf einem Träger angeordnete biologische Material innerhalb eines Strahlengangs der Anregungsstrahlung positioniert ist. Im Übrigen verfügt die Vorrichtung über zumindest eine Bilderzeugungseinheit, die vom biologischen Material aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung emittierte Lumineszenzstrahlung empfängt und ein Bild zumindest der zur Lumineszenz angeregten Bereiche des biologischen Materials erzeugt. Zur Kalibrierung verfügt die Vorrichtung über ein Kalibriernormal, das aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung eine Kalibrationsstrahlung emittiert, die von der Bilderzeugungseinheit aufgenommen und in einer Steuerung unter Berücksichtigung der aufgenommenen Kalibrierstrahlung ein Kalibrationssignal generierbar ist. Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass das Kalibriernormal ein Gehäuse mit einem darin eingeschlossenen zur Lumineszenz anregbaren Stoff aufweist und mit Hilfe eines Befestigungsmittels fest mit der Beleuchtungseinheit oder der Aufnahme verbunden ist.
  • Das erfindungsgemäße Kalibriernormal ist somit ein Bauteil, das eine wesentliche Komponente der Vorrichtung zur optischen Untersuchung biologischen Materials darstellt. Insbesondere ist das Kalibriernormal integraler Bestandteil der Vorrichtung, an der dieses auch bei wechselnden Probenträgern verbleibt und so für lange Zeit bzw. eine Vielzahl von Untersuchungen einsetzbar ist.
  • In einer ersten speziellen Ausführungsform der Erfindung verfügt das Gehäuse über ein Fenster, das für die Anregungs- sowie die Lumineszenzstrahlung wenigstens teiltransparent ist. Bevorzugt ist das Gehäuse des Kalibriernormals als Stahlfassung ausgeführt, auf deren Oberseite, also der der Strahlungsquelle zugewandten Seite des Kalibriernormals, ein Fenster eingebracht ist. Auf der dem Fenster gegenüber liegenden Seite des Gehäuses ist auf vorteilhafte Weise eine Öffnung vorgesehen, durch die während der Herstellung des Kalibriernormals der lumineszierende Stoff, insbesondere ein Pulver, in das Gehäuse eingebracht wird und die nach Einbringen des lumineszierenden Stoffes mit einem Stopfen, vorzugsweise auch aus Stahl, verschlossen und verklebt wird.
  • Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass das Fenster eine Markierung zur Ermittlung eines definierten Abstands zwischen der Aufnahmeeinheit und der Markierung aufweist. Vorzugsweise ist die Markierung in Form eines Fadenkreuzes ausgeführt, das der exakten und reproduzierbaren Fokussierung mit einem Objektiv der Aufnahmeeinheit dient, wobei in diesem Fall eine punktgenaue Fokussierung in alle drei Bewegungsrichtungen (X-, Y-, Z-Richtung) möglich ist. Objektive mit einer 20-fachen oder einer 40-fachen Vergrößerung sind besonders geeignet für die Verwendung in der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
  • Alternativ oder in Ergänzung sind auf der Oberfläche des Fensters andere Strukturen vorgesehen. Diese anderen oder weiteren Strukturen sind bevorzugt derart ausgeführt, dass sie weitere Funktionen, wie beispielsweise die Definition und Kalibrierung der XY-Position und/oder der Ursprungsposition und/oder die Bestimmung des Abbildungsmaßstabes, gewährleisten.
  • Gemäß einer speziellen Weiterbildung der Erfindung handelt es sich bei dem zur Lumineszenz anregbaren Stoff um einen zur Fluoreszenz anregbaren Farbstoff, also einen sogenannten Fluoreszenzfarbstoff. Auf vorteilhafte Weise ist der lumineszierende bzw. fluoreszierende Farbstoff pulverförmig. Die Verwendung einer Mischung aus einem Fluorochrom und einem Siliziumdioxid (SiO2) bzw. Quarz ist besonders geeignet. Das Fluorochrom wird mit einem weiteren Stoff gemischt, insbesondere mit dem zuvor erwähnten Siliziumdioxid, um die Strahlungsintensität der vom Kalibriernormal ausgehenden Lumineszenz- bzw. Fluoreszenzstrahlung gegenüber reinem Fluorochrom auf geeignete Weise zu reduzieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass, alternativ oder in Ergänzung zur Verdünnung des Fluorochroms mit Siliziumdioxid (SiO2), weitere Dämpfungsmittel vorgesehen sind. Insbesondere ist es in diesem Zusammenhang denkbar, das Fenster des Gehäuses des Kalibriernormals mit wenigstens einem Dämpfungsmittel, durch das eine Intensität der vom lumineszierenden Stoff emittierten Lumineszenzstrahlung beim Durchtritt durch das Fenster verringert wird, vorzusehen. Vorzugsweise ist das Dämpfungsmittel auf einer dem lumineszierenden Stoff zugewandten Oberfläche des Fensters angeordnet und weist einen teiltransparenten Graufilter und/oder eine Lochrasterstruktur auf. Ebenso ist es denkbar, das Fenster in Bezug auf ein Spektrum der emittierten Lumineszenzstrahlung teiltransparent auszuführen, um die gewünschte Dämpfung der Strahlungsintensität der Lumineszenzstrahlung zu erreichen.
  • Alternativ zur Verwendung eines Kalibriernormals mit einem pulverförmigen Fluorochrom ist es denkbar, sogenannte Nanodots als lumineszierenden Stoff im Bereich der Beleuchtungseinheit oder an der Aufnahme, auf der sich der für den Träger mit dem zu untersuchenden biologischen Material befindet, vorzusehen. Auf vorteilhafte Weise ist es hierbei denkbar, optisch reines Epoxidharz zu erzeugen und eine Küvette zu füllen, die in diesem Fall das Gehäuse des Kalibriernormals bildet. Bevorzugt wird eine derartige Küvette in eine geeignete Halterung der Aufnahmeeinheit eines Mikroskops oder eines Microarray-Scanners eingesetzt. Auch in diesem Fall stellt die Küvette ein integrales Bauteil der Untersuchungseinheit dar und ist fest mit dieser verbunden. Gemäß einer besonders speziellen Weiterbildung der Erfindung wird diese Küvette im Kalibrierfalle von außen zugeführt bzw. eingesetzt.
  • Ein wesentlicher Gedanke der Erfindung besteht darin, ein Kalibriernormal für eine Vorrichtung zur optischen Untersuchung biologischen Materials bereit zu stellen, der ein Bauteil der Vorrichtung darstellt und somit langzeitstabil ist und vor allem fest mit der Untersuchungsvorrichtung verbunden ist. Auf bevorzugte Weise verfügt das Gehäuse des Kalibriernormals über ein Außengewinde, mit dem das Kalibriernormal in die zur Positionierung des Trägers mit dem biologischen Material vorgesehene Aufnahme, beispielsweise ein Kreuztisch eines Mikroskops oder einer Kameraeinheit oder das Aufnahmefach eines Microarray-Scanners, einschraubbar ist. Ebenso ist es denkbar, eine dauerhafte, lösbare-feste Verbindung zwischen dem Kalibriernormal und der Aufnahme- oder Beleuchtungseinheit der Untersuchungsvorrichtung mittels einer Rastverbindung oder einer Übermaßpassung herzustellen.
  • Gemäß einer besonderen Weiterbildung der Erfindung ist das Kalibriernormal rückführbar ausgeführt, so dass Messergebnisse, die mit Hilfe des Kalibriernormals erzeugt werden, auf eine zertifizierte Strahlungsquelle oder ein durch die zertifizierte Strahlungsquelle kalibriertes Normal rückführbar sind. Dies kann erreicht werden, indem das Kalibriernormal mittels einer zertifizierten Strahlungsquelle oder mittels eines durch eine zertifizierte Strahlungsquelle kalibrierten Normals kalibriert worden ist. Gemäß einer speziellen Weiterbildung ist hierfür bei der Herstellung des Kalibriernormals ein spezieller mechanischer Aufbau mit einer Aufnahme für das Kalibriernormal vorgesehen. Ferner ist eine Laserdiode vorgesehen, die alternativ durch eine andere geeignete, schmalbandige Strahlungsquelle, insbesondere eine LED, ersetzt werden kann. Gemäß einer speziellen Ausführungsform ist es sogar denkbar, eine breitbandige Strahlungsquelle einzusetzen und mit Hilfe optischer Hilfsmittel ein geeignetes Spektrum zu erzeugen.
  • Die Strahlungsleistung der zuvor beschriebenen Belichtungsquelle wird bevorzugt mit einem kalibrierten Detektor gemessen und eingestellt. Sofern eine Laserdiode als Beleuchtungsquelle verwendet wird, wird deren Temperatur und Strahlungsleistung stabilisiert geregelt betrieben. Vorteilhaft an der schmalbandigen Anregung ist, dass sich das Anregungs-(Excitations-) und das Emissionsspektrum nicht signifikant überlappen und sich somit das Emissionsspektrum des Kalibriernormals nahezu vollständig spektral vermessen lässt.
  • Zur Vermessung des Emissionsspektrums wird auf vorteilhafte Weise ein Spektrometersystem verwendet, das zuvor mit einer zertifizierten Strahlungsquelle rückführbar kalibriert worden ist. Während der Prüfung des Kalibriernormals wird dieser mit der bevorzugt verwendeten Laserdiode zur Strahlung angeregt. Daraufhin wird das Emissionsspektrum mit dem kalibrierten Spektrometer erfasst, so dass eine rückführbare Bestrahlungsstärkemessung zur zertifizierten Strahlungsquelle gewährleistet ist. Zur effizienten Streulichtunterdrückung wird das Spektrometer mit einem geeigneten Langpassfilter ausgestattet, das die Anregungsstrahlung blockt und die Emissionsstrahlung transmittiert. Aufgrund einer derart durchgeführten Vermessung kann das geprüfte Kalibriernormal, auch beim Anwender, als Prüfmittel eingesetzt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Kalibriernormal zur Kalibrierung einer Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials. Das Kalibriernormal verfügt über ein Gehäuse, das zumindest bereichsweise einen zur Lumineszenz, insbesondere zur Fluoreszenz, anregbaren Stoff umgibt. Dieses Gehäuse des Kalibriernormals ist zumindest teilweise aus einem für eine Anregungs- sowie für eine von dem angeregten Stoff emittierte Lumineszenzstrahlung transparenten Material ausgeführt. Ferner ist an einer Außenseite des Gehäuses wenigstens ein Befestigungsmittel vorgesehen, mittels dem das Kalibriernormal in oder an der Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials befestigbar ist. Das Kalibriernormal ist somit derart gestaltet, dass dieser zu einem integralen Bauteil einer Untersuchungsvorrichtung werden kann. Erfindungsgemäß zeichnet sich das Kalibriernormal dadurch aus, dass das Befestigungsmittel ein Gewinde, einen Stecker oder ein Rastelement aufweist, das jeweils geeignet ist, wiederholt an einem eine Gegenkontur aufweisenden Gegenstück der Vorrichtung befestigt zu werden.
  • Bei dem zum Einsatz kommenden Lumineszenzfarbstoff handelt es sich vorzugsweise um einen Fluoreszenzfarbstoff, der im Inneren des Gehäuses angeordnet ist und entweder pulverförmig ist und wenigstens ein Fluorochrom sowie ein Quarz (SiO2) aufweist, oder über ein zur Lumineszenz anregbares Epoxidharz oder vergleichbares Polymer verfügt.
  • Gemäß einer speziellen Weiterbildung lässt sich ein erfindungsgemäß ausgeführtes Kalibriernormal mit einem Mikroskop, einer Kameraeinheit oder im Bereich einer Probenaufnahme eines Microarray-Scanners verwenden, indem das Kalibriernormal dauerhaft, und zwar lösbar-fest, am Kreuztisch eines Mikroskops oder der Kameraeinheit oder im Bereich der Probenaufnahme des Microarray-Scanners befestigt wird.
  • Im Folgenden wird die Erfindung ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Dabei zeigen:
  • 1: Automatisches Fluoreszenzmikroskop mit einem Kalibriernormal sowie
  • 2: Erfindungsgemäß ausgeführtes Kalibriernormal.
  • 1 zeigt schematisch eine Vorrichtung 1 zur optischen Untersuchung biologischen Materials 6, die ein erfindungsgemäß ausgeführtes Kalibriernormal 7 aufweist. Bei dem zu untersuchenden biologischen Material 6 handelt es sich in diesem Fall um mit einem Patientenserum sowie wenigstens einem fluoreszenzmarkierten Marker inkubierte Gewebeschnitte. Die Gewebeschnitte 6 sind auf einem Objektträger 5 angeordnet, der wiederum auf der Aufnahme 3 der Untersuchungseinheit 1, hier einem Kreuztisch, positioniert ist. Als Vorrichtung 1 zur optischen Untersuchung biologischen Materials 6 kommt ein Fluoreszenzmikroskop zum Einsatz, das eine Steuerung 17 aufweist, die gewährleistet, dass die Untersuchung der Proben 6 wahlweise manuell oder zumindest teilautomatisiert erfolgen kann. Zur Aufnahme der Bilder des zu untersuchenden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten biologischen Materials 6 ist eine Kameraeinheit 4 zur Bilderzeugung vorgesehen, die in einem automatisierten Prozess zunächst die jeweils aufzunehmende Probe 6 fokussiert und im Anschluss daran wenigstens ein Fluoreszenzbild der Probe 6 erzeugt und in einem Datenspeicher 18 ablegt.
  • Vor Beginn der ersten Untersuchung wird das automatische Fluoreszenzmikroskop 1 im Rahmen des üblichen Laborarbeitsablaufes zunächst kalibriert. Hierfür ist am Kreuztisch 3 des Mikroskops ein Kalibriernormal 7 vorgesehen, das ein in einem Gehäuse 9 eingeschlossenes fluoreszierendes Pulver 12 aufweist. Bei dem bevorzugt verwendeten fluoreszierenden Pulver 12 handelt es sich um eine Mischung aus einem Fluorochrom und einem Siliziumdioxid (SiO2), wobei auf ein Teil Fluorochrom wenigstens 300 Teile des Siliziumdioxids (SiO2 = Quarz) kommen. Das Gehäuse 9 des Kalibriernormals 7 verfügt auf seiner der Strahlungsquelle 2 des Fluoreszenzmikroskops 1, hier eine blaue LED, zugeordneten Oberseite über ein Fenster 8, das zum einen für die Anregungsstrahlung 16 transparent und zum anderen für die vom Fluoreszenzfarbstoff 12 im angeregten Zustand emittierte Fluoreszenzstrahlung 16 teiltransparent ist. Darüber hinaus ist auf dem Fenster 8 des Gehäuses 9 eine Markierung 13 in Form eines Fadenkreuzes vorgesehen, das vor der Durchführung des Kalibriervorgangs mit Hilfe der Bildaufnahmeeinheit 4 fokussiert wird. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, dass auch bei der Kalibration des Fluoreszenzmikroskops 1 stets der richtige Abstand (Z-Richtung) zwischen der Bildaufnahmeeinheit 4 und dem Kalibriernormal 7 eingestellt ist und somit zuverlässige Messergebnisse erhalten werden. Darüber hinaus verfügt das Fenster 8 über eine weitere Markierung 14, die die Ermittlung der Ausgangsposition sowie einer Position des Kalibriernormals 7 in einer zum Kreuztisch 3 parallelen Ebene (XY-Position) ermöglicht.
  • Nachdem das Kalibriernormal 7 fokussiert und seine Position relativ zur Bildaufnahmeeinheit 4 festgelegt wurde, indem der Kreuztisch 3 des Fluoreszenzmikroskops 1 entsprechend verfahren worden ist, ermittelt die Bildaufnahmeeinheit 4 die Strahlungsintensität der vom Kalibriernormal 7 emittierten Fluoreszenzstrahlung 16. Durch die Kalibration wird sichergestellt, dass die im Anschluss an die Kalibration durchgeführten Fluoreszenzmessungen der verschiedenen biologischen Proben 6 stets zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Mit Hilfe des verwendeten Kalibriernormals 7 wird insbesondere ein Standard implementiert, der die Langzeitstabilität des Fluoreszenzmikroskops 1 gewährleistet und überprüft. Der verwendete Fluoreszenzfarbstoff 12, hier eine Mischung aus Fluorochrom und Siliziumdioxid, zeichnet sich einerseits durch seine Langzeitstabilität und andererseits durch die Ähnlichkeit seines Spektrums mit dem Spektrum des üblicherweise für die Fluoreszenzmarkierung von biologischem Material 6 verwendeten IFT-Farbstoffs, dem sogenannten FITC, aus.
  • Da es sich bei dem erfindungsgemäß verwendeten Kalibriernormal 7 um ein rückführbares Normal handelt, das spektrometrisch gegenüber einem zertifizierten Bestrahlungsstärkenormal überprüft wurde, kann das Kalibriernormal 7 als Prüfmittel eingesetzt werden. Neben der Stabilität, also der Vergleichbarkeit unterschiedlicher Fluoreszenzmikroskope 1, kann damit auch der Abgleich der Systeme untereinander geprüft werden.
  • Die Beleuchtungseinheit 2 des Fluoreszenzmikroskops 1 verfügt über eine LED als Strahlungsquelle. Die Anregung mit Hilfe einer LED hat den großen Vorteil, dass über die Filterung und Abbildung bis zur Detektion mit der Kamera 4 die komplette Abbildungskette zusammenhängend mit Hilfe des verwendeten Kalibriernormals 7 geprüft bzw. gesteuert oder sogar geregelt werden kann.
  • 2 zeigt in einer Detailansicht das für die Kalibration verwendete Kalibriernormal 7. Das Kalibriernormal 7 verfügt über ein Stahlgehäuse 9, in das auf seiner Oberseite ein Fenster 8 eingelassen ist. Der verwendete pulverförmige Fluoreszenzstandard 12 wird während der Herstellung des Kalibriernormals 7 durch eine Öffnung 10 auf der Unterseite des Kalibriernormals 7 in diesen eingebracht und die Öffnung 10 im Anschluss daran mit Hilfe eines Stopfen 11 verschlossen und verklebt. Im unteren Bereich verfügt das Kalibriernormal 7 darüber hinaus über ein Außengewinde als Befestigungsmittel 19, mittels dem das Kalibriernormal 7 in ein entsprechend hierfür vorgesehenes Innengewinde im Kreuztisch 3 einer Untersuchungseinheit 1 zur Erzeugung von Fluoreszenzbildern einschraubbar ist. Das Kalibriernormal 1 wird somit fest mit der Untersuchungseinheit 1, insbesondere einem automatisiert betreibbaren Fluoreszenzmikroskop mit Kameraeinheit 4, verbunden und so zu einem integralen Bauteil der Untersuchungseinheit 1. Das Kalibriernormal 7 muss somit nicht bei jeder Messung bzw. bei jedem Start einer neuen Messserie im Strahlengang der Anregungsstrahlung 15 erneut positioniert werden.
  • Auf der Oberseite des Fensters 8 ist ferner ein Fadenkreuz 13 als Kennzeichnung vorgesehen. Unterhalb des Fensters 8 befindet sich der pulverförmige Lumineszenzfarbstoff 12, hier ein Fluoreszenzfarbstoff, der als eine Mischung aus Fluorochrom, insbesondere auf Basis einer dotierten Orthosilikat-Siliziumdioxid-Mischung, ausgeführt ist.
  • Das auf die Oberseite des Fensters 8 aufgebrachte Fadenkreuz 13 dient der exakten und reproduzierbaren Fokussierung des Kalibriernormals 7 mit Hilfe des Objektivs, das in diesem Fall ein Teil der Bilderzeugungseinheit 4 eines automatisiert betreibbaren Fluoreszenzmikroskops ist. Bevorzugt werden Objektive mit einer 20-fachen oder 40-fachen Vergrößerung verwendet und die Fokussierung in X-, Y-, sowie Z-Richtung ausgeführt. Durch eine derart vorgenommene Fokussierung des Kalibriernormals 7 wird stets ein definierter Abstand zwischen der Bilderzeugungs- bzw. Bildaufnahmeeinheit 4, insbesondere dem jeweiligen Objektiv, und dem Kalibriernormal 7 eingestellt, so dass eine wiederholgenaue und homogene Ausleuchtung im Gesichtsfeld der Bildaufnahmeeinheit 4, bspw. einer Kamera, sichergestellt ist. Die Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung 16, die von dem Kalibriernormal 7 emittiert wird, ist dadurch reproduzierbar.
  • Sofern weitere Messungen mit Hilfe des Kalibriernormals 7 durchgeführt werden sollen, wie etwa die Bestimmung des Abbildungsmaßstabes oder die Definition und Kalibrierung der XY-Position sowie der Ursprungsposition, werden auf die Oberfläche des Fensters weitere hierfür geeignete Kennzeichnungen 14 aufgebracht.
  • Da der verwendete Fluoreszenzfarbstoff 12 über eine hohe Leuchtdichte verfügt, wird die Strahlungsintensität durch geeignete Maßnahmen am Kalibriernormal 7 gedämpft. Auf diese Weise wird die Fluoreszenzstrahlung 12 des Kalibriernormals 7 an die Leuchtdichte des für die Markierung des biologischen Materials 6 üblicherweise verwendeten Fluoreszenzfarbstoffs (FITC) angeglichen.
  • Den größten Einfluss auf die Dämpfung der Strahlungsintensität hat die Mischung des pulverförmigen Fluorochroms mit Siliziumdioxid. Üblicherweise werden hierbei Mischungen verwendet, bei denen ein Teil des Fluorochroms mit wenigstens 300 Teilen des Siliziumdioxids gemischt wird. Im Gehäuse 9 des Kalibriernormals 7 können sich zwischen 180 und 220 mg der pulverförmigen Mischung 12 aus Fluorochrom und Siliziumdioxid befinden.
  • In Ergänzung zur Verdünnung des Fluorochroms mit Siliziumdioxid können weitere Dämpfungsmaßnahmen am Kalibriernormal 7 vorgenommen werden. Einerseits kann das Fenster 8 auf der Rückseite mit einem teiltransparenten Graufilter belegt sein, der die Anregung und die Emission reduziert, so dass die Strahlungsintensität der vom Kalibriernormal 7 emittierten Fluoreszenzstrahlung 16 deutlich reduziert wird. Die emittierte Fluoreszenzstrahlung 16 wird derart gedämpft, dass die Strahlungsintensität der Fluoreszenzstrahlung 16 des Kalibriernormals 7, im Wesentlichen an die Strahlungsintensität der während der Untersuchung vom biologischen Material 7 emittierten Fluoreszenzstrahlung angepasst ist.
  • Alternativ oder in Ergänzung zur Verwendung eines Graufilters ist es denkbar, dass das Fenster 8 auf der Rückseite eine Lochrasterstruktur aufweist, deren Aspektverhältnis die Transmission definiert. Auch hier wird wiederum eine Reduzierung der Strahlungsintensität der emittierten Fluoreszenzstrahlung 16 des Kalibriernormals 7 erreicht. Eine weitere Variante sieht vor, dass das Fenster 8 spektral teiltransparent für die vom Fluoreszenzstandard 7 ausgehende Fluoreszenzstrahlung 16 und ggf. auch für die Anregungsstrahlung 15 ist. Auf diese Weise kann in Kombination mit dem Emissionsspektrum des Fluorochroms das emittierte Spektrum angepasst werden.
  • Durch Verwendung geeigneter Langpassfilter ist hierbei auch die Anpassung des Emissionspektrums des Kalibriernormals 7 an die jeweiligen Spektren anderer Fluoreszenzfarbstoffe, die bspw. rotes Licht emittieren, möglich.
  • Durch eine sehr enge Toleranz der Fensterdicke reduziert sich weiterhin die Fertigungsstreuung der Normale untereinander. Eine gleichbleibende Fensterdicke wird in der Herstellung dadurch sichergestellt, dass das Fenster 8 vor dem Einbau in das Gehäuse 9 auf das gewünschte Endmaß poliert wird.
  • Das in 2 dargestellte und zuvor erläuterte Kalibriernormal 7 zeichnet sich vor allem dadurch aus, dass es auf einen Standard bzw. eine Referenzlichtquelle rückführbar ist. Um dies sicher zu stellen, wird jedes Kalibriernormal 7 nach seiner Herstellung in einem mechanischen Aufbau kalibriert. Der mechanische Aufbau verfügt hierbei über eine Aufnahme für das Kalibriernormal 7, das mit Hilfe einer Laserdiode zur Fluoreszenzstrahlung angeregt wird. Hierbei ist es denkbar, dass die Laserdiode durch eine andere geeignete schmalbandige Strahlungsquelle ersetzt wird. Die Strahlungsleistung des zur Fluoreszenzstrahlung angeregten Kalibriernormals 7 wird mit Hilfe eines kalibrierten Detektors gemessen und eingestellt. Hierbei wird die Laserdiode in Temperatur und Strahlungsleistung stabilisiert geregelt betrieben. Aufgrund des Einsatzes einer schmalbandigen Anregung wird eine Überlappung des Anregungs- und des Emissionsspektrums zuverlässig verhindert, so dass sich das Emissionsspektrum des Kalibriernormals 7 vollständig spektral vermessen lässt.
  • Das zur Vermessung verwendete Spektrometersystem ist ebenfalls zunächst mit einer zertifizierten Strahlungsquelle rückführbar kalibriert worden. Das Kalibriernormal 7 wird mit der Laserdiode zur Strahlung angeregt, das Emissionsspektrum mit dem kalibrierten Spektrometer erfasst, so dass eine rückführbare Leuchtdichtemessung zur zertifizierten Strahlungsquelle gewährleistet ist. Daher kann das beschriebene Kalibriernormal 7 als Prüfmittel eingesetzt werden. Auf bevorzugte Weise wird in der Fertigung ein zertifiziertes Leuchtdichtenormal eingesetzt, das sogenannte „Masternormal”. Dieses dient in der Fertigung von Untersuchungseinheiten 1, wie etwa automatisiert betreibbaren Fluoreszenzmikroskopen, zum Abgleich der Untersuchungseinheiten 1 untereinander mit den darin eingebauten, vom Master abgeleiteten Kalibriernormals 7. Mit Hilfe des erfindungsgemäß ausgeführten Kalibriernormals 7 können somit Fluoreszenzmikroskope bereitgestellt werden, die einerseits leicht zu kalibrieren und andererseits sowohl langzeitstabil als auch untereinander vergleichbar sind. Dieser Vorteil wird dadurch erreicht, dass in der Fertigung des Kalibriernormals 7 von der Anregung durch die LED über Filterung und Abbildung bis zur Detektion mit der Kameraeinheit 4 die komplette Abbildungskette zusammenhängend geprüft bzw. gesteuert oder sogar geregelt werden kann. Zum anderen ist das erfindungsgemäß ausgeführte Kalibriernormal 7 integraler Bestandteil der Untersuchungseinheit 1 und bleibt bevorzugt über die gesamte Lebensdauer am Gerät.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    Untersuchungsvorrichtung
    2
    Beleuchtungseinheit
    3
    Aufnahme
    4
    Bilderzeugungseinheit
    5
    Träger
    6
    biologisches Material
    7
    Kalibrierstandard
    8
    Fenster
    9
    Gehäuse
    10
    Öffnung
    11
    Stopfen
    12
    Lumineszenzfarbstoff
    13
    Markierung zur Fokussierung
    14
    weitere Markierung
    15
    Anregungsstrahlung
    16
    Lumineszenzstrahlung
    17
    Steuerung
    18
    Datenspeicher
    19
    Befestigungsmittel
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 2009/127424 [0005]
    • EP 1373870 B1 [0008]

Claims (17)

  1. Vorrichtung (1) zur bildlichen Darstellung biologischen Materials (6), – mit einer Beleuchtungseinheit (2), die über eine Strahlungsquelle verfügt, durch die eine elektromagnetische Anregungsstrahlung (15) emittierbar ist, – mit einer Aufnahme (3) zur Positionierung des auf einem Träger (5) angeordneten biologischen Materials (6) innerhalb eines Strahlengangs der Anregungsstrahlung (15), – mit zumindest einer Bilderzeugungseinheit (4), die vom biologischen Material (6) aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung (15) emittierte Lumineszenzstrahlung (16) empfängt und ein Bild zumindest der zur Lumineszenz angeregten Bereiche des biologischen Materials (6) erzeugt, und – mit einem Kalibriernormal, das aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung (15) eine Kalibrationsstrahlung emittiert, die von der Bilderzeugungseinheit aufgenommen und in einer Steuerung (17) unter Berücksichtigung der aufgenommenen Kalibrierstrahlung ein Kalibrationssignal generierbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Kalibriernormal ein zumindest teilweise mit einem zur Lumineszenz anregbaren Stoff (12) gefülltes Gehäuse (9) aufweist, das über wenigstens ein Befestigungsmittel (19) an der Beleuchtungseinheit (2) oder der Aufnahme (3) angebracht ist.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der lumineszierende Stoff (12) im Gehäuse (9) des Kalibriernormals (7) gegenüber einer Umgebung abgeschlossenen ist.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (9) ein Fenster (8) aufweist.
  4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fenster (8) eine Markierung (13) zur Ermittlung eines definierten Abstands zwischen einer Optik der Bilderzeugungseinheit (4) und dem Kalibriernormal (7) aufweist.
  5. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fenster (8) wenigstens ein Dämpfungsmittel aufweist, durch das eine Intensität der vom lumineszierenden Stoff emittierten Kalibrierstrahlung beim Durchtritt durch das Fenster (8) verringert wird.
  6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Dämpfungsmittel auf einer dem lumineszierenden Stoff (12) zugewandten Oberfläche des Fensters (8) angeordnet ist und einen teiltransparenten Graufilter und/oder eine Lochrasterstruktur aufweist und/oder in Bezug auf ein Spektrum der Anregungsstrahlung (15) und/oder der emittierten Lumineszenzstrahlung (16) teiltransparent ausgeführt ist.
  7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der lumineszierende Stoff (12) pulverförmig ausgeführt ist.
  8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der lumineszierende Stoff (12) von der Anregungsstrahlung (15) zur Fluoreszenz anregbar ist.
  9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der lumineszierende Stoff (12) wenigstens Fluorochrom und pulverisierten Quarz (SiO2) enthält.
  10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der lumineszierende Stoff (12) ein Epoxidharz oder ein vergleichbares Polymer aufweist.
  11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Befestigungsmittel (19) als am Gehäuse (9) angeordnetes Außengewinde ausgeführt ist.
  12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahme (3) ein Kreuztisch eines Mikroskops oder eine Probenaufnahme eines Microarray-Scanners ist.
  13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Kalibriernormal (7) mittels einer zertifizierten Strahlungsquelle oder mittels eines durch eine zertifizierte Strahlungsquelle kalibrierten Normals kalibriert worden ist.
  14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungsquelle der Beleuchtungseinheit (2) eine gegen einen Standard kalibrierte LED ist.
  15. Kalibriernormal (7) zur Kalibrierung einer Vorrichtung (1) zur bildlichen Darstellung biologischen Materials (6), das ein Gehäuse (9) aufweist, das zumindest bereichsweise einen zur Lumineszenz, insbesondere zur Fluoreszenz, anregbaren Stoff (12) umgibt, zumindest teilweise aus einem für eine Anregungs- (15) sowie eine Lumineszenzstrahlung (16) transparentem Material besteht und an dem auf einer dem zur Lumineszenz anregbaren Stoff (12) abgewandten Seite ein Befestigungsmittel (19) vorgesehen ist, das in oder an der Vorrichtung (1) zur bildlichen Darstellung biologischen Materials (6) befestigbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Befestigungsmittel (19) ein Gewinde, einen Stecker oder ein Rastelement aufweist, das geeignet ist, wiederholt an einem eine Gegenkontur aufweisenden Gegenstück der Vorrichtung (1) befestigt zu werden.
  16. Kalibriernormal nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der im Inneren des Gehäuses (9) angeordnete Stoff (12) entweder pulverförmig ist und wenigstens ein Fluorochrom sowie ein Quarz (SiO2) aufweist, oder über ein zur Lumineszenz anregbares Epoxidharz oder ein vergleichbares Polymer verfügt.
  17. Verwendung eines Kalibriernormals nach wenigstens einem der vorangehenden Ansprüche, bei der das Kalibriernormal dauerhaft am Kreuztisch eines Mikroskops, einer Kameraeinheit oder im Bereich einer Probenaufnahme eines Microarray-Scanners befestigt wird.
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