WO2015090534A1 - Kalibriernormal für eine vorrichtung zur bildlichen darstellung biologischen materials - Google Patents

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calibration standard
excitation
biological material
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Helge Pannhoff
Christian Feirer
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Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag
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Definitions

  • the invention relates to a calibration standard as well as to a device for visual representation of biological material into which a corresponding calibration standard is integrated.
  • the essential components of a generic device include a lighting unit with a radiation source, through which an electromagnetic excitation radiation is emitted, and a receptacle for positioning the biological material arranged on a support within a beam path of the excitation radiation.
  • an image generation unit is provided, which receives the luminescence radiation emitted by the biological material on the basis of the excitation radiation and generates an image of at least the areas of the biological material excited for luminescence.
  • a calibration standard is provided, which emits a calibration radiation due to the excitation by the excitation radiation, which is recorded by the image generation unit and in a control, taking into account the recorded calibration radiation, a calibration signal can be generated.
  • fluorescence studies are often performed when human or animal samples are analyzed. Depending on the analytical methods used, fluorescence images are recorded and evaluated with different systems. Nevertheless, in order to be able to compare the respective results with each other, it is important to be able to determine the device-specific influences on the fluorescence signal and to be able to correct accordingly.
  • calibration or fluorescence standards for instrument calibration, the radiation intensity of which can be traced back to certified standards.
  • CONFIRMATION COPY the feedback via the beam density standard enables the certification of the fluorescence spectrum with sufficiently small radiometric measurement uncertainties.
  • the third part of the feedback chain is a calibration set "Spectral Fluorescence Standards BAM-F001 and BAM-F005" whose corrected emission spectra were certified by the BAM in January 2006.
  • the aforementioned document discloses in this connection different fluorescence standards or fluorescent dyes, which are distinguished by the fact that a fluorescent mineral or a substance containing a fluorescent mineral is used.
  • the described minerals are both natural and synthetic minerals.
  • EP 1 373 870 B1 discloses a device for referencing fluorescence signals and / or for calibrating fluorescence detection systems based on the use of special polymers based.
  • the device described essentially has a non-fluorescent carrier on which polymer layers with partly different thicknesses and / or compositions are applied in a plurality of defined regions.
  • the polymer layers are applied to the support in such a way that they fluoresce after appropriate irradiation, so that the coated support can be used as fluorescence standard.
  • the described fluorescence standards are used for the standardization of experiments based on the evaluation of probe arrays, wherein the fluorescence standards with the biological material containing probes are on a common carrier.
  • the supports are epoxidized slides in which holes are made by ultrasonic drilling, which are filled with a fluorescent polymer and then glued.
  • To prepare a diagnosis a number of spots of PCR products are first applied to a carrier, whereby specifically purified and fluorescence dye-labeled specific cDNA is immobilized on the individual PCR spots by hybridization. Subsequently, these samples are read out by means of a confocal laser scanner and the results are analyzed, whereby the evaluation takes place taking into account a comparison with the intensities of the different ranges of the fluorescence standards.
  • the invention is based on the object to provide a simple and reproducible manufacturable calibration standard, with the comparatively simple and accurate calibration a corresponding examination device can take place.
  • the luminescent substance used is distinguished by a particular longevity, in particular too fast fading is avoided, nevertheless a comparatively simple handling is possible and cost-effective.
  • the calibration standard should be such that the calibration of a corresponding examination unit in the normal laboratory workflow, in which a large number of different samples must be processed in a short time can be made without great effort and in a short time.
  • the calibration standard should allow the most automated and yet highly accurate calibration of an examination unit. Furthermore, it should be ensured in a preferred manner that, even in the production of a plurality of examination units, calibration standards for the respective Unit are used, which are comparable with each other. The traceability of the calibrating standard to a standardized standard is therefore another important feature. In addition, the calibration standard should be spectrally as close as possible to the fluorochrome used in the fluorescence application.
  • the invention relates to a device for imaging biological material, with a lighting unit having a radiation source through which an electromagnetic excitation radiation is emitted. Furthermore, a receptacle is provided which ensures that the biological material arranged on a carrier is positioned within a beam path of the excitation radiation. Moreover, the device has at least one imaging unit which receives the luminescence radiation emitted by the biological material on the basis of the excitation radiation and generates an image of at least the regions of the biological material excited for luminescence.
  • the device has a calibration standard which emits a calibration radiation due to the excitation by the excitation radiation, which is recorded by the image generation unit and a calibration signal can be generated in a control taking into account the recorded calibration radiation.
  • the invention is characterized in that the calibration standard has a housing with a luminescent substance which can be stimulated therein and is fixedly connected to the illumination unit or the receptacle with the aid of a fastening means.
  • the calibration standard according to the invention is thus a component which represents an essential component of the device for the optical examination of biological material.
  • the calibration standard is an integral part of the device, on which this remains even with changing sample carriers and so for a long time or a variety of studies can be used.
  • the housing has a window which is at least partially transparent for the excitation and the luminescence radiation.
  • the housing of the calibration standard is designed as a steel frame, on the upper side, ie the radiation source facing side of the calibration standard, a Window is introduced.
  • an opening is advantageously provided, through which during the production of the calibration standard the luminescent substance, in particular a powder, is introduced into the housing and, after insertion of the luminescent substance, with a stopper, preferably also made of steel, sealed and glued.
  • a further advantageous embodiment of the invention provides that the window has a mark for determining a defined distance between the receiving unit and the marking.
  • the marking is executed in the form of a reticle, which serves the exact and reproducible focusing with a lens of the recording unit, in which case a pinpoint focusing in all three directions of movement (X, Y, Z direction) is possible.
  • Lenses with 20x or 40x magnification are particularly suitable for use in the device of the invention.
  • other structures are provided on the surface of the window. These other or further structures are preferably designed such that they ensure further functions, such as the definition and calibration of the XY position and / or the origin position and / or the determination of the image scale.
  • the substance which can be excited to luminesce is a dye which can be excited to fluoresce, that is to say a so-called fluorescent dye.
  • the luminescent or fluorescent dye is powdery.
  • the use of a mixture of a fluorochrome and a silica (Si0 2 ) or quartz is particularly suitable.
  • the fluorochrome is mixed with another substance, in particular with the aforementioned silicon dioxide, in order to reduce in a suitable manner the radiation intensity of the luminescence or fluorescence radiation originating from the calibration standard compared to pure fluorochrome.
  • damping means are provided.
  • the window of the housing of the calibration standard with at least one damping means, by means of which an intensity of the luminescent radiation emitted by the luminescent substance as it passes through the window is reduced.
  • the damping means is on a surface of the window facing the luminescent substance and has a partially transparent gray filter and / or a hole pattern grid. It is likewise conceivable to carry out the window in a partially transparent manner with respect to a spectrum of the emitted luminescence radiation in order to achieve the desired attenuation of the radiation intensity of the luminescence radiation.
  • a calibration standard with a powdered fluorochrome
  • nanodots as a luminescent substance in the region of the illumination unit or on the receptacle on which the biological material to be examined is located for the carrier.
  • a cuvette is inserted into a suitable holder of the receiving unit of a microscope or a microarray scanner.
  • the cuvette is an integral part of the examination unit and is firmly connected to it. According to a particularly specific embodiment of the invention, this cuvette is supplied or used in the calibration case from the outside.
  • An essential idea of the invention is to provide a calibration standard for a device for the optical examination of biological material, which constitutes a component of the device and is therefore long-term stable and, above all, firmly connected to the examination device.
  • the housing of the calibration standard has an external thread with which the calibration standard can be screwed into the receptacle provided for positioning the carrier with the biological material, for example a cross table of a microscope or a camera unit or the receptacle of a microarray scanner.
  • the calibration standard is designed to be traceable, so that measurement results that are generated with the aid of the calibration standard can be traced back to a certified radiation source or a normal calibrated by the certified radiation source.
  • This can be accomplished by calibrating the calibration standard using a certified radiation source or a standard calibrated by a certified radiation source.
  • this is a special mechanical structure with a Recording for the calibration standard provided.
  • a laser diode is provided, which can alternatively be replaced by another suitable, narrow-band radiation source, in particular an LED.
  • the radiation power of the previously described exposure source is preferably measured and adjusted with a calibrated detector. If a laser diode is used as a source of illumination, its temperature and radiated power are stabilized operated operated.
  • An advantage of the narrow-band excitation is that the excitation (excitation) and the emission spectrum do not overlap significantly and thus the emission spectrum of the calibration standard can be measured almost completely spectrally.
  • a spectrometer system is used, which has been previously calibrated traceable with a certified radiation source. During the test of the calibration standard, it is excited with the laser diode which is preferably used for the radiation.
  • the emission spectrum is recorded with the calibrated spectrometer, so that a traceable irradiation strength measurement to the certified radiation source is ensured.
  • the spectrometer is equipped with a suitable long-pass filter, which blocks the excitation radiation and transmits the emission radiation. Based on such a survey, the tested calibration standard can also be used as a test device by the user.
  • the present invention also relates to a calibration standard for calibrating a biological material imaging apparatus.
  • the calibration standard has a housing which, at least in regions, surrounds a substance which can be excited to luminescence, in particular to fluorescence.
  • This housing of the calibration standard is at least partially made of a material that is transparent to an excitation light and to a luminescence radiation emitted by the excited substance.
  • at least one fastening means is provided on an outer side of the housing, by means of which the calibration standard can be fastened in or on the device for imaging biological material.
  • the calibration standard is thus designed such that it can become an integral part of an examination device.
  • the calibration standard is characterized in that the fastening means is a thread, a plug or a latching element , which is in each case suitable to be repeatedly attached to a counter-contour having counterpart of the device.
  • the next used luminescent dye it is preferably a fluorescent dye, which is arranged inside the housing and is either in powder form and at least one fluorochrome, and a quartz (Si0 2), or through a has to luminescence stimulable epoxy resin or similar polymer.
  • a calibration standard executed according to the invention can be used with a microscope, a camera unit or in the region of a sample receptacle of a microarray scanner by the calibration standard permanently, namely detachably fixed, at the cross table of a microscope or the camera unit or in the region of the sample receptacle of the microarray scanner is attached.
  • Fig. 1 Automatic fluorescence microscope with a calibration standard
  • Fig. 2 According to the invention executed calibration standard.
  • FIG. 1 schematically shows a device 1 for the optical examination of biological material 6, which has a calibration standard 7 executed according to the invention.
  • the biological material 6 to be examined in this case is tissue sections incubated with a patient serum and at least one fluorescently labeled marker.
  • the tissue sections 6 are arranged on a slide 5, which in turn is positioned on the receptacle 3 of the examination unit 1, here a cross table.
  • a device 1 for optical examination of biological material 6 is a fluorescence microscope is used, which has a controller 17, which ensures that the examination of the samples 6 can be done either manually or at least partially automated.
  • a camera unit 4 is provided for image generation, which initially focuses the respective sample 6 to be recorded in an automated process and subsequently generates at least one fluorescence image of the sample 6 and stored in a data memory 18 stores.
  • the automatic fluorescence microscope 1 is first calibrated within the scope of the usual laboratory procedure. This is the cross table 3 of the microscope, a Kalibrormormal 7 is provided which has a trapped in a housing 9 fluorescent powder 12.
  • the housing 9 of the calibration standard 7 has on its the radiation source 2 of the fluorescence microscope 1, here a blue LED, associated upper side via a window 8, the one transparent to the excitation radiation 16 and the other for the fluorescence emitted by the fluorescent dye 12 in the excited state 16th is partially transparent.
  • a mark 13 in the form of a crosshair is provided on the window 8 of the housing 9, which is focused by means of the image recording unit 4 before carrying out the calibration process. In this way it can be ensured that the correct distance (Z-direction) between the image recording unit 4 and the calibration standard 7 is always set even during the calibration of the fluorescence microscope 1, and thus reliable measurement results are obtained.
  • the window 8 has a further marking 14, which enables the determination of the starting position and a position of the calibration standard 7 in a plane parallel to the cross table 3 (XY position).
  • the image acquisition unit 4 determines the radiation intensity of the fluorescent radiation 16 emitted by the calibration standard 7.
  • the calibration ensures that the in Following calibration carried out fluorescence measurements of different biological samples 6 always lead to comparable results.
  • a standard is implemented which ensures and verifies the long-term stability of the fluorescence microscope 1.
  • the fluorescent dye 12 here a mixture of fluorochrome and silicon dioxide, is characterized on the one hand by its long-term stability and on the other hand by the similarity of its spectrum to the spectrum of the IFT dye commonly used for fluorescence labeling of biological material 6, the so-called FITC.
  • the calibration standard 7 used according to the invention is a traceable standard which has been checked spectrometrically with respect to a certified irradiance standard, the calibration standard 7 can be used as a test device. In addition to the stability, so the comparability of different Fluorescence microscopes 1, thus the balance of the systems can be checked with each other.
  • the illumination unit 2 of the fluorescence microscope 1 has an LED as the radiation source.
  • the excitation with the aid of an LED has the great advantage that the complete imaging chain can be tested, controlled or even regulated by means of the calibration standard 7, via the filtering and imaging to the detection with the camera 4.
  • FIG. 2 shows in a detailed view the calibration standard 7 used for the calibration.
  • the calibration standard 7 has a steel housing 9 into which a window 8 is embedded on its upper side.
  • the powdered fluorescence standard used 12 is introduced during the preparation of the calibration standard 7 through an opening 10 on the underside of the calibration standard 7 in this and the opening 10 thereafter closed with the aid of a plug 1 1 and glued.
  • the calibration standard 7 furthermore has an external thread as fastening means 19, by means of which the calibration standard 7 can be screwed into a correspondingly provided internal thread in the cross table 3 of an examination unit 1 for generating fluorescence images.
  • the calibration standard 1 is thus firmly connected to the examination unit 1, in particular an automatically operable fluorescence microscope with camera unit 4, and so to an integral part of the examination unit 1.
  • the calibration standard 7 therefore does not have to be at each measurement or at each start of a new series of measurements in the beam path the excitation radiation 5 are repositioned.
  • a reticle 13 is also provided as a mark.
  • the powdered luminescent dye 12 here a fluorescent dye, which is designed as a mixture of fluorochrome, in particular based on a doped orthosilicate-silica mixture.
  • the crosshair 13 applied to the upper side of the window 8 serves for exact and reproducible focusing of the calibration standard 7 with the aid of the objective, which in this case is part of the image generation unit 4 of an automatically operable fluorescence microscope. Preference is given to using lenses with a magnification of 20x or 40x and focusing in the X, Y, and Z directions. Such a focusing of the calibration standard 7 always sets a defined distance between the imaging or image acquisition unit 4, in particular the respective objective, and the calibration standard 7, so that a repeatable and homogeneous illumination in the visual field of the image acquisition unit 4, For example, a camera is ensured. The measurement of the intensity of the fluorescence radiation 16, which is emitted by the calibration standard 7, is thereby reproducible.
  • the radiation intensity is attenuated by suitable measures on the calibration standard 7.
  • the fluorescence radiation 12 of the calibration standard 7 is adjusted to the luminance of the fluorescence dye (FITC) commonly used for the marking of the biological material 6.
  • FITC fluorescence dye
  • the greatest influence on the attenuation of the radiation intensity has the mixing of the powdered fluorochrome with silicon dioxide.
  • mixtures are used in which a part of the fluorochrome is mixed with at least 300 parts of the silicon dioxide.
  • In the housing 9 of the calibration standard 7 can be between 180 and 220 mg of the powdery mixture 12 of fluorochrome and silicon dioxide.
  • the window 8 on the back can be covered with a partially transparent gray filter, which reduces the excitation and the emission, so that the radiation intensity of the fluorescence radiation 16 emitted by the calibration standard 7 is significantly reduced.
  • the emitted fluorescence radiation 16 is attenuated in such a way that the radiation intensity of the fluorescence radiation 16 of the calibration standard 7 is substantially matched to the radiation intensity of the fluorescence radiation emitted by the biological material 7 during the examination.
  • the window 8 has on the back a hole pattern grid whose aspect ratio defines the transmission. Again, a reduction of the radiation intensity of the emitted fluorescence radiation 16 of the calibration standard 7 is achieved again.
  • the window 8 spectrally partially transparent for the emanating from the fluorescence standard 7 fluorescence radiation 16 and possibly also for the Excitation radiation 15 is. In this way, in combination with the emission spectrum of the fluorochrome, the emitted spectrum can be adjusted.
  • window thickness Due to a very narrow tolerance of the window thickness, the production spread of the normals continues to be reduced. A consistent window thickness is ensured in the manufacture by the fact that the window 8 is polished to the desired final dimensions prior to installation in the housing 9.
  • each calibration standard 7 is calibrated after its manufacture in a mechanical structure.
  • the mechanical structure in this case has a receptacle for the calibration standard 7, which is excited by means of a laser diode for fluorescence radiation. It is conceivable that the laser diode is replaced by another suitable narrow-band radiation source.
  • the radiation power of the calibration standard 7 excited to fluorescence radiation is measured and adjusted with the aid of a calibrated detector.
  • the laser diode is operated stabilized regulated in temperature and radiation power. Due to the use of a narrow-band excitation, an overlap of the excitation and the emission spectrum is reliably prevented, so that the emission spectrum of the calibration standard 7 can be measured completely spectrally.
  • the spectrometer system used for the measurement has also been initially calibrated traceable with a certified radiation source.
  • the calibration standard 7 is excited by the laser diode to the radiation, the emission spectrum detected by the calibrated spectrometer, so that a traceable luminance measurement is guaranteed to certified radiation source. Therefore, the described calibration standard 7 can be used as a test device.
  • a certified luminance standard the so-called "master standard” is used in the production of examination units 1, such as automated fluorescence microscopes, for matching the examination units 1 with the calibration calibrator 7 derived from the master.
  • the calibrating standard 7 embodied according to the invention fluorescence microscopes can thus be provided which, on the one hand, are easy to calibrate and, on the other hand, both long-term stable and comparable with each other.
  • This advantage is achieved in that in the manufacture of the calibration standard 7 from the excitation by the LED via filtering and imaging to the detection with the camera unit 4, the complete imaging chain can be coherently tested or controlled or even regulated.
  • the calibrating standard 7 embodied according to the invention is an integral part of the examination unit 1 and preferably remains on the device over the entire service life.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Kalibriernormal (7) für eine Vorrichtung (1) zur bildlichen Darstellung biologischen Materials (6), das während der Untersuchung zumindest bereichsweise zur Lumineszenz angeregt wird. Die Vorrichtung (1) verfügt über eine Beleuchtungseinheit (2) mit einer Strahlungsquelle, durch die eine elektromagnetische Anregungsstrahlung (15) emittierbar ist. Ferner ist eine Aufnahme (3) vorgesehen, die sicherstellt, dass das auf einem Träger (5) angeordnete biologische Material (6) innerhalb eines Strahlengangs der Anregungsstrahlung (15) positioniert ist. Im Übrigen verfügt die Vorrichtung über zumindest eine Bilderzeugungseinheit (4), die vom biologischen Material (6) aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung (15) emittierte Lumineszenzstrahlung (16) empfängt und ein Bild zumindest der zur Lumineszenz angeregten Bereiche des biologischen Materials (6) erzeugt. Zur Kalibrierung verfügt die Vorrichtung über ein Kalibriernormal (7), das aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung (15) eine Kalibrationsstrahlung emittiert, die von der Bilderzeugungseinheit (4) aufgenommen und in einer Steuerung (18) unter Berücksichtigung der aufgenommenen Kalibrierstrahlung ein Kalibrationssignal generierbar ist. Die beschriebene technische Lösung zeichnet sich dadurch aus, dass das Kalibriernormal (7) ein Gehäuse (9) mit einem darin eingeschlossenen zur Lumineszenz anregbaren Stoff (12) aufweist und mit Hilfe eines Befestigungsmittels (19) fest mit der Beleuchtungseinheit (2) oder der Aufnahme (3) verbunden ist.

Description

Kalibriernormal für eine Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials
Die Erfindung betrifft ein Kalibriernormal sowie eine Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials, in die ein entsprechendes Kalibriernormal integriert ist. Zu den wesentlichen Bauteilen einer gattungsgemäßen Vorrichtung gehören eine Beleuchtungseinheit mit einer Strahlungsquelle, durch die eine elektromagnetische Anregungsstrahlung emittiert wird, sowie eine Aufnahme zur Positionierung des auf einem Träger angeordneten biologischen Materials innerhalb eines Strahlenganges der Anregungsstrahlung. Ferner ist eine Bilderzeugungseinheit vorgesehen, die vom biologischen Material aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung emittierte Lumineszenzstrahlung empfängt und ein Bild zumindest der zur Lumineszenz angeregten Bereiche des biologischen Materials erzeugt. Weiterhin ist ein Kalibriernormal vorgesehen, das aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung eine Kalibrationsstrahlung emittiert, die von der Bilderzeugungseinheit aufgenommen und in einer Steuerung unter Berücksichtigung der aufgenommenen Kalibrierstrahlung ein Kalibrationssignal generierbar ist.
Insbesondere auf dem Gebiet der in-vitro-Diagnostik werden bei der Untersuchung menschlicher oder tierischer Proben vielfach Fluoreszenzuntersuchungen durchgeführt. In Abhängigkeit der eingesetzten Analyseverfahren werden hierbei Fluoreszenzbilder mit unterschiedlichen Systemen aufgenommen und ausgewertet. Um die jeweiligen Ergebnisse trotzdem miteinander vergleichen zu können ist es wichtig, die gerätespezifischen Einflüsse auf das Fluoreszenzsignal ermitteln und entsprechend korrigieren zu können. Von besonderer Bedeutung ist in diesem Zusammenhang die Verwendung von Kalibrier- bzw. Fluoreszenzstandards für die Gerätekalibrierung, deren Strahlungsintensität auf zertifizierte Standards rückführbar ist.
Die Bedeutung derartiger Standards wird anhand eines Projekts deutlich, das gemeinsam von der Physikalisch Technischen Bundesanstalt (PTB), der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM) sowie den Firmen Gigahertz-Optik GmbH und Sigma- Aldrich GmbH durchgeführt wurde. Im Rahmen dieses Projekts wurde eine radiometrische Rückführungskette für Fluoreszenzstandards entwickelt, die aus drei wesentlichen Elementen besteht. Einerseits ist ein kompakter, homogen leuchtender Ulbrichtkugelstrahler vorgesehen, dessen spektrale Strahldichte gegenüber einer Wolframbandlampe um mehrere Größenordnungen reduziert wurde, so dass er in seinen Strahlungseigenschaften wesentlich besser an eine fluoreszierende Probe angepasst ist als herkömmliche Strahldichtnormale. Das zweite Element ist ein Referenzfluorometer mit minimalen optischen Abbildungsfehlern,
BESTÄTIGUNGSKOPIE das rückgeführt über das Strahldichtenormal die Zertifizierung vom Fluoreszenzspektrum mit ausreichend kleinen radiometrischen Messunsicherheiten ermöglicht. Als dritter Teil der Rückführungskette dient ein Kalibiersatz„Spektrale Fluoreszenzstandards BAM-F001 sowie BAM-F005", dessen korrigierte Emissionsspektren im Januar 2006 von der BAM zertifiziert wurden. Diese Standards ermöglichen es einem Anwender, die relativen spektralen Empfindlichkeiten des Emissionskanals von Fluoreszenzmesssystemen unter applikationsrelevanten Bedingungen vergleichsweise einfach und rückführbar zu ermitteln und zu korrigieren. Zur praktischen Durchführung von Untersuchungen sind aus dem Stand der Technik zahlreiche Vorrichtungen zur Aufnahme und Auswertung von Lumineszenzbildern, insbesondere von Fluoreszenzbildern, bekannt, mit denen Proben biologischen Materials untersucht werden. Derartige Vorrichtungen verfügen häufig über ein Mikroskop oder eine Kameraeinheit, mit denen jeweils Aufnahmen von mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten biologischen Proben erzeugt werden. Des Weiteren sind Microarray-Scanner bekannt, mit denen fluoreszenzmarkierte DNA-Proben, die auf sogenannten Biochips angeordnet sind, untersucht werden können.
Aus der WO 2009/127424 sind verschiedene Fluoreszenzstandards bekannt, die für die Fluoreszenzspektroskopie einsetzbar sind. Problematisch bei den bekannten Fluoreszenzstandards ist oftmals, dass diese über den anwendbaren Zeitraum nicht lichtstabil sind bzw. leicht ausbleichen, vor allem bei einer längeren Belichtung oder beim Belichten mit hohen Intensitäten. Darüber hinaus sind die verwendeten Farbstoffe in vielen Fällen nur innerhalb eines schmalen Spektralbereichs verwendbar.
Weitere Probleme bestehen oftmals darin, dass sie vergleichsweise teuer sind, mechanisch, thermisch und chemisch instabil sind und darüber hinaus schnell altern oder austrocknen, was wiederum zur Änderung der bestrahlungsabhängigen Fluoreszenzintensität führt.
Die zuvor genannte Schrift offenbart in diesem Zusammenhang unterschiedliche Fluoreszenzstandards bzw. Fluoreszenzfarbstoffe, die sich dadurch auszeichnen, dass ein fluoreszierendes Mineral oder eine Substanz verwendet wird, die ein fluoreszierendes Mineral enthält. Bei den beschriebenen Mineralien handelt es sich sowohl um natürliche als auch um synthetische Mineralien.
Neben mineralischen Fluoreszenzfarbstoffen kommen auch andere Farbstoffe, wie etwa Polymere, als Fluoreszenzstandards zum Einsatz. Aus der EP 1 373 870 B1 ist eine Vorrichtung zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen und / oder zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen bekannt, die auf der Verwendung spezieller Polymere beruht. Die beschriebene Vorrichtung weist im Wesentlichen einen nicht-fluoreszierenden Träger auf, auf dem in mehreren definierten Bereichen Polymerschichten mit zum Teil unterschiedlicher Dicke und / oder Zusammensetzung aufgebracht sind. Die Polymerschichten sind derart auf den Träger aufgebracht, dass sie nach entsprechender Bestrahlung fluoreszieren, so dass der beschichtete Träger als Fluoreszenzstandard verwendet werden kann.
Die beschriebenen Fluoreszenzstandards werden zur Standardisierung von Experimenten eingesetzt, die auf der Auswertung von Sonden-Arrays beruhen, wobei sich die Fluoreszenzstandards mit den biologisches Material enthaltenden Sonden auf einem gemeinsamen Träger befinden. Bei den Trägern handelt es sich um epoxidierte Objektträger, in die durch Ultraschallbohrung Löcher eingebracht sind, welche mit einem fluoreszierenden Polymer gefüllt und anschließend verklebt werden. Zur Erstellung einer Diagnose werden auf einen Träger zunächst eine Reihe von Spots von PCR-Produkten aufgebracht, wobei an die einzelnen PCR-Spots speziell aufgereinigte und fluoreszenzfarbstoffmarkierte spezifische cDNA durch Hybridisierung immobilisiert wird. Anschließend werden diese Proben mittels eines konfokalen Laserscanners ausgelesen und die Ergebnisse analysiert, wobei die Auswertung unter Berücksichtigung eines Abgleiche mit den Intensitäten der unterschiedlichen Bereiche der Fluoreszenzstandards erfolgt.
Ausgehend von den bekannten Systemen zur Aufnahme von Lumineszenzbildern, insbesondere von Fluoreszenzbildern biologischen Materials, und den für die Kalibrierung derartiger Systeme verwendeten Standards, liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein einfach und reproduzierbar herstellbares Kalibriernormal anzugeben, mit dem vergleichsweise einfach und genau die Kalibrierung einer entsprechenden Untersuchungsvorrichtung erfolgen kann. Hierbei ist zum einen wesentlich, dass sich der verwendete Lumineszenzstoff durch eine besondere Langlebigkeit auszeichnet, insbesondere ein zu schnelles Ausbleichen vermieden wird, trotzdem eine vergleichsweise einfache Handhabung ermöglicht und darüber kostengünstig ist. Insbesondere sollte das Kalibriernormal derart ausgeführt sein, dass die Kalibrierung einer entsprechenden Untersuchungseinheit im normalen Labor-Arbeitsablauf, bei dem eine große Anzahl unterschiedlicher Proben in kurzer Zeit abgearbeitet werden muss, ohne großen Aufwand und in kurzer Zeit vorgenommen werden kann. Des Weiteren soll das Kalibriernormal eine möglichst automatisierte und trotzdem hochgenaue Kalibrierung einer Untersuchungseinheit ermöglichen. Weiterhin soll auf bevorzugte Weise sichergestellt sein, dass auch bei der Herstellung einer Vielzahl von Untersuchungseinheiten, Kalibriernormale für die jeweilige Einheit verwendet werden, die untereinander vergleichbar sind. Die Rückführbarkeit des anzugebenden Kalibriernormals auf einen normierten Standard ist daher ein weiteres wesentliches Merkmal. Das Kalibriernormal soll zudem spektral möglichst in Übereinstimmung mit dem in der Fluoreszenzanwendung eingesetzten Fluorochrom stehen.
Die vorgenannte Aufgabe wird mit einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 sowie einem Kalibriernormal nach Anspruch 15 gelöst. Eine erfindungsgemäße Verwendung des Kalibriernormals ist ferner in Anspruch 17 angegeben. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der anhängigen Ansprüche und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials, mit einer Beleuchtungseinheit, die über eine Strahlungsquelle verfügt, durch die eine elektromagnetische Anregungsstrahlung emittierbar ist. Ferner ist eine Aufnahme vorgesehen, die sicherstellt, dass das auf einem Träger angeordnete biologische Material innerhalb eines Strahlengangs der Anregungsstrahlung positioniert ist. Im Übrigen verfügt die Vorrichtung über zumindest eine Bilderzeugungseinheit, die vom biologischen Material aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung emittierte Lumineszenzstrahlung empfängt und ein Bild zumindest der zur Lumineszenz angeregten Bereiche des biologischen Materials erzeugt. Zur Kalibrierung verfügt die Vorrichtung über ein Kalibriernormal, das aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung eine Kalibrationsstrahlung emittiert, die von der Bilderzeugungseinheit aufgenommen und in einer Steuerung unter Berücksichtigung der aufgenommenen Kalibrierstrahlung ein Kalibrationssignal generierbar ist. Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass das Kalibriernormal ein Gehäuse mit einem darin eingeschlossenen zur Lumineszenz anregbaren Stoff aufweist und mit Hilfe eines Befestigungsmittels fest mit der Beleuchtungseinheit oder der Aufnahme verbunden ist.
Das erfindungsgemäße Kalibriernormal ist somit ein Bauteil, das eine wesentliche Komponente der Vorrichtung zur optischen Untersuchung biologischen Materials darstellt. Insbesondere ist das Kalibriernormal integraler Bestandteil der Vorrichtung, an der dieses auch bei wechselnden Probenträgern verbleibt und so für lange Zeit bzw. eine Vielzahl von Untersuchungen einsetzbar ist.
In einer ersten speziellen Ausführungsform der Erfindung verfügt das Gehäuse über ein Fenster, das für die Anregungs- sowie die Lumineszenzstrahlung wenigstens teiltransparent ist. Bevorzugt ist das Gehäuse des Kalibriernormals als Stahlfassung ausgeführt, auf deren Oberseite, also der der Strahlungsquelle zugewandten Seite des Kalibriernormals, ein Fenster eingebracht ist. Auf der dem Fenster gegenüber liegenden Seite des Gehäuses ist auf vorteilhafte Weise eine Öffnung vorgesehen, durch die während der Herstellung des Kalibriernormals der lumineszierende Stoff, insbesondere ein Pulver, in das Gehäuse eingebracht wird und die nach Einbringen des lumineszierenden Stoffes mit einem Stopfen, vorzugsweise auch aus Stahl, verschlossen und verklebt wird.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass das Fenster eine Markierung zur Ermittlung eines definierten Abstands zwischen der Aufnahmeeinheit und der Markierung aufweist. Vorzugsweise ist die Markierung in Form eines Fadenkreuzes ausgeführt, das der exakten und reproduzierbaren Fokussierung mit einem Objektiv der Aufnahmeeinheit dient, wobei in diesem Fall eine punktgenaue Fokussierung in alle drei Bewegungsrichtungen (X-, Y-, Z-Richtung) möglich ist. Objektive mit einer 20-fachen oder einer 40-fachen Vergrößerung sind besonders geeignet für die Verwendung in der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Alternativ oder in Ergänzung sind auf der Oberfläche des Fensters andere Strukturen vorgesehen. Diese anderen oder weiteren Strukturen sind bevorzugt derart ausgeführt, dass sie weitere Funktionen, wie beispielsweise die Definition und Kalibrierung der XY-Position und / oder der Ursprungsposition und / oder die Bestimmung des Abbildungsmaßstabes, gewährleisten.
Gemäß einer speziellen Weiterbildung der Erfindung handelt es sich bei dem zur Lumineszenz anregbaren Stoff um einen zur Fluoreszenz anregbaren Farbstoff, also einen sogenannten Fluoreszenzfarbstoff. Auf vorteilhafte Weise ist der lumineszierende bzw. fluoreszierende Farbstoff pulverförmig. Die Verwendung einer Mischung aus einem Fluorochrom und einem Siliziumdioxid (Si02) bzw. Quarz ist besonders geeignet. Das Fluorochrom wird mit einem weiteren Stoff gemischt, insbesondere mit dem zuvor erwähnten Siliziumdioxid, um die Strahlungsintensität der vom Kalibriernormal ausgehenden Lumineszenz- bzw. Fluoreszenzstrahlung gegenüber reinem Fluorochrom auf geeignete Weise zu reduzieren.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass, alternativ oder in Ergänzung zur Verdünnung des Fluorochroms mit Siliziumdioxid (Si02), weitere Dämpfungsmittel vorgesehen sind. Insbesondere ist es in diesem Zusammenhang denkbar, das Fenster des Gehäuses des Kalibriernormals mit wenigstens einem Dämpfungsmittel, durch das eine Intensität der vom lumineszierenden Stoff emittierten Lumineszenzstrahlung beim Durchtritt durch das Fenster verringert wird, vorzusehen. Vorzugsweise ist das Dämpfungsmittel auf einer dem lumineszierenden Stoff zugewandten Oberfläche des Fensters angeordnet und weist einen teiltransparenten Graufilter und / oder eine Lochrasterstruktur auf. Ebenso ist es denkbar, das Fenster in Bezug auf ein Spektrum der emittierten Lumineszenzstrahlung teiltransparent auszuführen, um die gewünschte Dämpfung der Strahlungsintensität der Lumineszenzstrahlung zu erreichen.
Alternativ zur Verwendung eines Kalibriernormals mit einem pulverförmigen Fluorochrom ist es denkbar, sogenannte Nanodots als lumineszierenden Stoff im Bereich der Beleuchtungseinheit oder an der Aufnahme, auf der sich der für den Träger mit dem zu untersuchenden biologischen Material befindet, vorzusehen. Auf vorteilhafte Weise ist es hierbei denkbar, optisch reines Epoxidharz zu erzeugen und eine Küvette zu füllen, die in diesem Fall das Gehäuse des Kalibriernormals bildet. Bevorzugt wird eine derartige Küvette in eine geeignete Halterung der Aufnahmeeinheit eines Mikroskops oder eines Microarray- Scanners eingesetzt. Auch in diesem Fall stellt die Küvette ein integrales Bauteil der Untersuchungseinheit dar und ist fest mit dieser verbunden. Gemäß einer besonders speziellen Weiterbildung der Erfindung wird diese Küvette im Kalibrierfalle von außen zugeführt bzw. eingesetzt.
Ein wesentlicher Gedanke der Erfindung besteht darin, ein Kalibriernormal für eine Vorrichtung zur optischen Untersuchung biologischen Materials bereit zu stellen, der ein Bauteil der Vorrichtung darstellt und somit langzeitstabil ist und vor allem fest mit der Untersuchungsvorrichtung verbunden ist. Auf bevorzugte Weise verfügt das Gehäuse des Kalibriernormals über ein Außengewinde, mit dem das Kalibriernormal in die zur Positionierung des Trägers mit dem biologischen Material vorgesehene Aufnahme, beispielsweise ein Kreuztisch eines Mikroskops oder einer Kameraeinheit oder das Aufnahmefach eines Microarray-Scanners, einschraubbar ist. Ebenso ist es denkbar, eine dauerhafte, lösbare-feste Verbindung zwischen dem Kalibriernormal und der Aufnahmeoder Beleuchtungseinheit der Untersuchungsvorrichtung mittels einer Rastverbindung oder einer Übermaßpassung herzustellen.
Gemäß einer besonderen Weiterbildung der Erfindung ist das Kalibriernormal rückführbar ausgeführt, so dass Messergebnisse, die mit Hilfe des Kalibriernormals erzeugt werden, auf eine zertifizierte Strahlungsquelle oder ein durch die zertifizierte Strahlungsquelle kalibriertes Normal rückführbar sind. Dies kann erreicht werden, indem das Kalibriernormal mittels einer zertifizierten Strahlungsquelle oder mittels eines durch eine zertifizierte Strahlungsquelle kalibrierten Normals kalibriert worden ist. Gemäß einer speziellen Weiterbildung ist hierfür bei der Herstellung des Kalibriernormals ein spezieller mechanischer Aufbau mit einer Aufnahme für das Kalibriernormal vorgesehen. Ferner ist eine Laserdiode vorgesehen, die alternativ durch eine andere geeignete, schmalbandige Strahlungsquelle, insbesondere eine LED, ersetzt werden kann. Gemäß einer speziellen Ausführungsform ist es sogar denkbar, eine breitbandige Strahlungsquelle einzusetzen und mit Hilfe optischer Hilfsmittel ein geeignetes Spektrum zu erzeugen.
Die Strahlungsleistung der zuvor beschriebenen Belichtungsquelle wird bevorzugt mit einem kalibrierten Detektor gemessen und eingestellt. Sofern eine Laserdiode als Beleuchtungsquelle verwendet wird, wird deren Temperatur und Strahlungsleistung stabilisiert geregelt betrieben. Vorteilhaft an der schmalbandigen Anregung ist, dass sich das Anregungs- (Excitations-) und das Emissionsspektrum nicht signifikant überlappen und sich somit das Emissionsspektrum des Kalibriernormals nahezu vollständig spektral vermessen lässt. Zur Vermessung des Emissionsspektrums wird auf vorteilhafte Weise ein Spektrometersystem verwendet, das zuvor mit einer zertifizierten Strahlungsquelle rückführbar kalibriert worden ist. Während der Prüfung des Kalibriernormals wird dieser mit der bevorzugt verwendeten Laserdiode zur Strahlung angeregt. Daraufhin wird das Emissionsspektrum mit dem kalibrierten Spektrometer erfasst, so dass eine rückführbare Bestrahlungsstärkemessung zur zertifizierten Strahlungsquelle gewährleistet ist. Zur effizienten Streulichtunterdrückung wird das Spektrometer mit einem geeigneten Langpassfilter ausgestattet, das die Anregungsstrahlung blockt und die Emissionsstrahlung transmittiert. Aufgrund einer derart durchgeführten Vermessung kann das geprüfte Kalibriernormal, auch beim Anwender, als Prüfmittel eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Kalibriernormal zur Kalibrierung einer Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials. Das Kalibriernormal verfügt über ein Gehäuse, das zumindest bereichsweise einen zur Lumineszenz, insbesondere zur Fluoreszenz, anregbaren Stoff umgibt. Dieses Gehäuse des Kalibriernormals ist zumindest teilweise aus einem für eine Anregungs- sowie für eine von dem angeregten Stoff emittierte Lumineszenzstrahlung transparenten Material ausgeführt. Ferner ist an einer Außenseite des Gehäuses wenigstens ein Befestigungsmittel vorgesehen, mittels dem das Kalibriernormal in oder an der Vorrichtung zur bildlichen Darstellung biologischen Materials befestigbar ist. Das Kalibriernormal ist somit derart gestaltet, dass dieser zu einem integralen Bauteil einer Untersuchungsvorrichtung werden kann. Erfindungsgemäß zeichnet sich das Kalibriernormal dadurch aus, dass das Befestigungsmittel ein Gewinde, einen Stecker oder ein Rastelement aufweist, das jeweils geeignet ist, wiederholt an einem eine Gegenkontur aufweisenden Gegenstück der Vorrichtung befestigt zu werden.
Bei dem zum Einsatz kommenden Lumineszenzfarbstoff handelt es sich vorzugsweise um einen Fluoreszenzfarbstoff, der im Inneren des Gehäuses angeordnet ist und entweder pulverförmig ist und wenigstens ein Fluorochrom sowie ein Quarz (Si02) aufweist, oder über ein zur Lumineszenz anregbares Epoxidharz oder vergleichbares Polymer verfügt.
Gemäß einer speziellen Weiterbildung lässt sich ein erfindungsgemäß ausgeführtes Kalibriernormal mit einem Mikroskop, einer Kameraeinheit oder im Bereich einer Probenaufnahme eines Microarray-Scanners verwenden, indem das Kalibriernormal dauerhaft, und zwar lösbar-fest, am Kreuztisch eines Mikroskops oder der Kameraeinheit oder im Bereich der Probenaufnahme des Microarray-Scanners befestigt wird. Im Folgenden wird die Erfindung ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Dabei zeigen:
Fig. 1 : Automatisches Fluoreszenzmikroskop mit einem Kalibriernormal sowie
Fig. 2: Erfindungsgemäß ausgeführtes Kalibriernormal.
Figur 1 zeigt schematisch eine Vorrichtung 1 zur optischen Untersuchung biologischen Materials 6, die ein erfindungsgemäß ausgeführtes Kalibriernormal 7 aufweist. Bei dem zu untersuchenden biologischen Material 6 handelt es sich in diesem Fall um mit einem Patientenserum sowie wenigstens einem fluoreszenzmarkierten Marker inkubierte Gewebeschnitte. Die Gewebeschnitte 6 sind auf einem Objektträger 5 angeordnet, der wiederum auf der Aufnahme 3 der Untersuchungseinheit 1 , hier einem Kreuztisch, positioniert ist. Als Vorrichtung 1 zur optischen Untersuchung biologischen Materials 6 kommt ein Fluoreszenzmikroskop zum Einsatz, das eine Steuerung 17 aufweist, die gewährleistet, dass die Untersuchung der Proben 6 wahlweise manuell oder zumindest teilautomatisiert erfolgen kann. Zur Aufnahme der Bilder des zu untersuchenden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten biologischen Materials 6 ist eine Kameraeinheit 4 zur Bilderzeugung vorgesehen, die in einem automatisierten Prozess zunächst die jeweils aufzunehmende Probe 6 fokussiert und im Anschluss daran wenigstens ein Fluoreszenzbild der Probe 6 erzeugt und in einem Datenspeicher 18 ablegt.
Vor Beginn der ersten Untersuchung wird das automatische Fluoreszenzmikroskop 1 im Rahmen des üblichen Laborarbeitsablaufes zunächst kalibriert. Hierfür ist am Kreuztisch 3 des Mikroskops ein Kalibriernormal 7 vorgesehen, das ein in einem Gehäuse 9 eingeschlossenes fluoreszierendes Pulver 12 aufweist. Bei dem bevorzugt verwendeten fluoreszierenden Pulver 12 handelt es sich um eine Mischung aus einem Fluorochrom und einem Siliziumdioxid (Si02), wobei auf ein Teil Fluorochrom wenigstens 300 Teile des Siliziumdioxids (Si02 = Quarz) kommen. Das Gehäuse 9 des Kalibriernormals 7 verfügt auf seiner der Strahlungsquelle 2 des Fluoreszenzmikroskops 1 , hier eine blaue LED, zugeordneten Oberseite über ein Fenster 8, das zum einen für die Anregungsstrahlung 16 transparent und zum anderen für die vom Fluoreszenzfarbstoff 12 im angeregten Zustand emittierte Fluoreszenzstrahlung 16 teiltransparent ist. Darüber hinaus ist auf dem Fenster 8 des Gehäuses 9 eine Markierung 13 in Form eines Fadenkreuzes vorgesehen, das vor der Durchführung des Kalibriervorgangs mit Hilfe der Bildaufnahmeeinheit 4 fokussiert wird. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, dass auch bei der Kalibration des Fluoreszenzmikroskops 1 stets der richtige Abstand (Z-Richtung) zwischen der Bildaufnahmeeinheit 4 und dem Kalibriernormal 7 eingestellt ist und somit zuverlässige Messergebnisse erhalten werden. Darüber hinaus verfügt das Fenster 8 über eine weitere Markierung 14, die die Ermittlung der Ausgangsposition sowie einer Position des Kalibriernormals 7 in einer zum Kreuztisch 3 parallelen Ebene (XY-Position) ermöglicht.
Nachdem das Kalibriernormal 7 fokussiert und seine Position relativ zur Bildaufnahmeeinheit 4 festgelegt wurde, indem der Kreuztisch 3 des Fluoreszenzmikroskops 1 entsprechend verfahren worden ist, ermittelt die Bildaufnahmeeinheit 4 die Strahlungsintensität der vom Kalibriernormal 7 emittierten Fluoreszenzstrahlung 16. Durch die Kalibration wird sichergestellt, dass die im Anschluss an die Kalibration durchgeführten Fluoreszenzmessungen der verschiedenen biologischen Proben 6 stets zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Mit Hilfe des verwendeten Kalibriernormals 7 wird insbesondere ein Standard implementiert, der die Langzeitstabilität des Fluoreszenzmikroskops 1 gewährleistet und überprüft. Der verwendete Fluoreszenzfarbstoff 12, hier eine Mischung aus Fluorochrom und Siliziumdioxid, zeichnet sich einerseits durch seine Langzeitstabilität und andererseits durch die Ähnlichkeit seines Spektrums mit dem Spektrum des üblicherweise für die Fluoreszenzmarkierung von biologischem Material 6 verwendeten IFT- Farbstoffs, dem sogenannten FITC, aus.
Da es sich bei dem erfindungsgemäß verwendeten Kalibriernormal 7 um ein rückführbares Normal handelt, das spektrometrisch gegenüber einem zertifizierten Bestrahlungsstärkenormal überprüft wurde, kann das Kalibriernormal 7 als Prüfmittel eingesetzt werden. Neben der Stabilität, also der Vergleichbarkeit unterschiedlicher Fluoreszenzmikroskope 1 , kann damit auch der Abgleich der Systeme untereinander geprüft werden.
Die Beleuchtungseinheit 2 des Fluoreszenzmikroskops 1 verfügt über eine LED als Strahlungsquelle. Die Anregung mit Hilfe einer LED hat den großen Vorteil, dass über die Filterung und Abbildung bis zur Detektion mit der Kamera 4 die komplette Abbildungskette zusammenhängend mit Hilfe des verwendeten Kalibriernormals 7 geprüft bzw. gesteuert oder sogar geregelt werden kann. Figur 2 zeigt in einer Detailansicht das für die Kalibration verwendete Kalibriernormal 7. Das Kalibriernormal 7 verfügt über ein Stahlgehäuse 9, in das auf seiner Oberseite ein Fenster 8 eingelassen ist. Der verwendete pulverförmige Fluoreszenzstandard 12 wird während der Herstellung des Kalibriernormals 7 durch eine Öffnung 10 auf der Unterseite des Kalibriernormals 7 in diesen eingebracht und die Öffnung 10 im Anschluss daran mit Hilfe eines Stopfen 1 1 verschlossen und verklebt. Im unteren Bereich verfügt das Kalibriernormal 7 darüber hinaus über ein Außengewinde als Befestigungsmittel 19, mittels dem das Kalibriernormal 7 in ein entsprechend hierfür vorgesehenes Innengewinde im Kreuztisch 3 einer Untersuchungseinheit 1 zur Erzeugung von Fluoreszenzbildern einschraubbar ist. Das Kalibriernormal 1 wird somit fest mit der Untersuchungseinheit 1 , insbesondere einem automatisiert betreibbaren Fluoreszenzmikroskop mit Kameraeinheit 4, verbunden und so zu einem integralen Bauteil der Untersuchungseinheit 1. Das Kalibriernormal 7 muss somit nicht bei jeder Messung bzw. bei jedem Start einer neuen Messserie im Strahlengang der Anregungsstrahlung 5 erneut positioniert werden. Auf der Oberseite des Fensters 8 ist ferner ein Fadenkreuz 13 als Kennzeichnung vorgesehen. Unterhalb des Fensters 8 befindet sich der pulverförmige Lumineszenzfarbstoff 12, hier ein Fluoreszenzfarbstoff, der als eine Mischung aus Fluorochrom, insbesondere auf Basis einer dotierten Orthosilikat-Siliziumdioxid-Mischung, ausgeführt ist.
Das auf die Oberseite des Fensters 8 aufgebrachte Fadenkreuz 13 dient der exakten und reproduzierbaren Fokussierung des Kalibriernormals 7 mit Hilfe des Objektivs, das in diesem Fall ein Teil der Bilderzeugungseinheit 4 eines automatisiert betreibbaren Fluoreszenzmikroskops ist. Bevorzugt werden Objektive mit einer 20-fachen oder 40-fachen Vergrößerung verwendet und die Fokussierung in X-, Y-, sowie Z-Richtung ausgeführt. Durch eine derart vorgenommene Fokussierung des Kalibriernormals 7 wird stets ein definierter Abstand zwischen der Bilderzeugungs- bzw. Bildaufnahmeeinheit 4, insbesondere dem jeweiligen Objektiv, und dem Kalibriernormal 7 eingestellt, so dass eine wiederholgenaue und homogene Ausleuchtung im Gesichtsfeld der Bildaufnahmeeinheit 4, bspw. einer Kamera, sichergestellt ist. Die Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung 16, die von dem Kalibriernormal 7 emittiert wird, ist dadurch reproduzierbar.
Sofern weitere Messungen mit Hilfe des Kalibriernormals 7 durchgeführt werden sollen, wie etwa die Bestimmung des Abbildungsmaßstabes oder die Definition und Kalibrierung der XY- Position sowie der Ursprungsposition, werden auf die Oberfläche des Fensters weitere hierfür geeignete Kennzeichnungen 14 aufgebracht.
Da der verwendete Fluoreszenzfarbstoff 12 über eine hohe Leuchtdichte verfügt, wird die Strahlungsintensität durch geeignete Maßnahmen am Kalibriernormal 7 gedämpft. Auf diese Weise wird die Fluoreszenzstrahlung 12 des Kalibriernormals 7 an die Leuchtdichte des für die Markierung des biologischen Materials 6 üblicherweise verwendeten Fluoreszenzfarbstoffs (FITC) angeglichen.
Den größten Einfluss auf die Dämpfung der Strahlungsintensität hat die Mischung des pulverförmigen Fluorochroms mit Siliziumdioxid. Üblicherweise werden hierbei Mischungen verwendet, bei denen ein Teil des Fluorochroms mit wenigstens 300 Teilen des Siliziumdioxids gemischt wird. Im Gehäuse 9 des Kalibriernormals 7 können sich zwischen 180 und 220 mg der pulverförmigen Mischung 12 aus Fluorochrom und Siliziumdioxid befinden.
In Ergänzung zur Verdünnung des Fluorochroms mit Siliziumdioxid können weitere Dämpfungsmaßnahmen am Kalibriernormal 7 vorgenommen werden. Einerseits kann das Fenster 8 auf der Rückseite mit einem teiltransparenten Graufilter belegt sein, der die Anregung und die Emission reduziert, so dass die Strahlungsintensität der vom Kalibriernormal 7 emittierten Fluoreszenzstrahlung 16 deutlich reduziert wird. Die emittierte Fluoreszenzstrahlung 16 wird derart gedämpft, dass die Strahlungsintensität der Fluoreszenzstrahlung 16 des Kalibriernormals 7, im Wesentlichen an die Strahlungsintensität der während der Untersuchung vom biologischen Material 7 emittierten Fluoreszenzstrahlung angepasst ist.
Alternativ oder in Ergänzung zur Verwendung eines Graufilters ist es denkbar, dass das Fenster 8 auf der Rückseite eine Lochrasterstruktur aufweist, deren Aspektverhältnis die Transmission definiert. Auch hier wird wiederüm eine Reduzierung der Strahlungsintensität der emittierten Fluoreszenzstrahlung 16 des Kalibriernormals 7 erreicht. Eine weitere Variante sieht vor, dass das Fenster 8 spektral teiltransparent für die vom Fluoreszenzstandard 7 ausgehende Fluoreszenzstrahlung 16 und ggf. auch für die Anregungsstrahlung 15 ist. Auf diese Weise kann in Kombination mit dem Emissionsspektrum des Fluorochroms das emittierte Spektrum angepasst werden.
Durch Verwendung geeigneter Langpassfilter ist hierbei auch die Anpassung des Emissionspektrums des Kalibriernormals 7 an die jeweiligen Spektren anderer Fluoreszenzfarbstoffe, die bspw. rotes Licht emittieren, möglich.
Durch eine sehr enge Toleranz der Fensterdicke reduziert sich weiterhin die Fertigungsstreuung der Normale untereinander. Eine gleichbleibende Fensterdicke wird in der Herstellung dadurch sichergestellt, dass das Fenster 8 vor dem Einbau in das Gehäuse 9 auf das gewünschte Endmaß poliert wird.
Das in Figur 2 dargestellte und zuvor erläuterte Kalibriernormal 7 zeichnet sich vor allem ■ dadurch aus, dass es auf einen Standard bzw. eine Referenzlichtquelle rückführbar ist. Um dies sicher zu stellen, wird jedes Kalibriernormal 7 nach seiner Herstellung in einem mechanischen Aufbau kalibriert. Der mechanische Aufbau verfügt hierbei über eine Aufnahme für das Kalibriernormal 7, das mit Hilfe einer Laserdiode zur Fluoreszenzstrahlung angeregt wird. Hierbei ist es denkbar, dass die Laserdiode durch eine andere geeignete schmalbandige Strahlungsquelle ersetzt wird. Die Strahlungsleistung des zur Fluoreszenzstrahlung angeregten Kalibriernormals 7 wird mit Hilfe eines kalibrierten Detektors gemessen und eingestellt. Hierbei wird die Laserdiode in Temperatur und Strahlungsleistung stabilisiert geregelt betrieben. Aufgrund des Einsatzes einer schmalbandigen Anregung wird eine Überlappung des Anregungs- und des Emissionsspektrums zuverlässig verhindert, so dass sich das Emissionsspektrum des Kaiibriernormals 7 vollständig spektral vermessen lässt.
Das zur Vermessung verwendete Spektrometersystem ist ebenfalls zunächst mit einer zertifizierten Strahlungsquelle rückführbar kalibriert worden. Das Kalibriernormal 7 wird mit der Laserdiode zur Strahlung angeregt, das Emissionsspektrum mit dem kalibrierten Spektrometer erfasst, so dass eine rückführbare Leuchtdichtemessung zur zertifizierten Strahlungsquelle gewährleistet ist. Daher kann das beschriebene Kalibriernormal 7 als Prüfmittel eingesetzt werden. Auf bevorzugte Weise wird in der Fertigung ein zertifiziertes Leuchtdichtenormal eingesetzt, das sogenannte „Masternormal". Dieses dient in der Fertigung von Untersuchungseinheiten 1 , wie etwa automatisiert betreibbaren Fluoreszenzmikroskopen, zum Abgleich der Untersuchungseinheiten 1 untereinander mit den darin eingebauten, vom Master abgeleiteten Kaiibriernormals 7. Mit Hilfe des erfindungsgemäß ausgeführten Kaiibriernormals 7 können somit Fluoreszenzmikroskope bereitgestellt werden, die einerseits leicht zu kalibrieren und andererseits sowohl langzeitstabil als auch untereinander vergleichbar sind. Dieser Vorteil wird dadurch erreicht, dass in der Fertigung des Kalibriernormals 7 von der Anregung durch die LED über Filterung und Abbildung bis zur Detektion mit der Kameraeinheit 4 die komplette Abbildungskette zusammenhängend geprüft bzw. gesteuert oder sogar geregelt werden kann. Zum anderen ist das erfindungsgemäß ausgeführte Kalibriernormal 7 integraler Bestandteil der Untersuchungseinheit 1 und bleibt bevorzugt über die gesamte Lebensdauer am Gerät.
Bezugszeichenliste
1 Untersuchungsvorrichtung
2 Beleuchtungseinheit
3 Aufnahme
4 Bilderzeugungseinheit
5 Träger
6 biologisches Material
7 Kalibrierstandard
8 Fenster
9 Gehäuse
10 Öffnung
1 1 Stopfen
12 Lumineszenzfarbstoff
13 Markierung zur Fokussierung
14 weitere Markierung
15 Anregungsstrahlung
16 Lumineszenzstrahlung
17 Steuerung
18 Datenspeicher
19 Befestigungsmittel

Claims

Patentansprüche
Vorrichtung (1 ) zur bildlichen Darstellung biologischen Materials (6),
- mit einer Beleuchtungseinheit (2), die über eine Strahlungsquelle verfügt, durch die eine elektromagnetische Anregungsstrahlung (15) emittierbar ist,
mit einer Aufnahme (3) zur Positionierung des auf einem Träger (5) angeordneten biologischen Materials (6) innerhalb eines Strahlengangs der Anregungsstrahlung (15),
- mit zumindest einer Bilderzeugungseinheit (4), die vom biologischen Material (6) aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung (15) emittierte Lumineszenzstrahlung (16) empfängt und ein Bild zumindest der zur Lumineszenz angeregten Bereiche des biologischen Materials (6) erzeugt, und mit einem Kalibriemormal, das aufgrund der Anregung durch die Anregungsstrahlung (15) eine Kalibrationsstrahlung emittiert, die von der Bilderzeugungseinheit aufgenommen und in einer Steuerung (17) unter Berücksichtigung der aufgenommenen Kalibrierstrahlung ein Kalibrationssignal generierbar ist,
dadurch gekennzeichnet, dass das Kalibriernormal ein zumindest teilweise mit einem zur Lumineszenz anregbaren Stoff (12) gefülltes Gehäuse (9) aufweist, das über wenigstens ein Befestigungsmittel (19) an der Beleuchtungseinheit (2) oder der Aufnahme (3) angebracht ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass der lumineszierende Stoff (12) im Gehäuse (9) des Kalibriernormals (7) gegenüber einer Umgebung abgeschlossenen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (9) ein Fenster (8) aufweist. Vorrichtung nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, dass das Fenster (8) eine Markierung (13) zur Ermittlung eines definierten Abstands zwischen einer Optik der Bilderzeugungseinheit (4) und dem Kalibriernormal (7) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fenster (8) wenigstens ein Dämpfungsmittel aufweist, durch das eine Intensität der vom lumineszierenden Stoff emittierten Kalibrierstrahlung beim Durchtritt durch das Fenster (8) verringert wird. 6. Vorrichtung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass das Dämpfungsmittel auf einer dem lumineszierenden Stoff (12) zugewandten Oberfläche des Fensters (8) angeordnet ist und einen teiltransparenten Graufilter und/oder eine Lochrasterstruktur aufweist und/oder in Bezug auf ein Spektrum der Anregungsstrahlung (15) und/oder der emittierten Lumineszenzstrahlung (16) teiltransparent ausgeführt ist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, dass der lumineszierende Stoff (12) pulverförmig ausgeführt ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, dass der lumineszierende Stoff (12) von der Anregungsstrahlung (15) zur Fluoreszenz anregbar ist. 9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, dass der lumineszierende Stoff (12) wenigstens Fluorochrom und pulverisierten Quarz (Si02) enthält.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, dass der lumineszierende Stoff (12) ein Epoxidharz oder ein vergleichbares Polymer aufweist.
1 1. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, dass das Befestigungsmittel (19) als am Gehäuse (9) angeordnetes Außengewinde ausgeführt ist.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahme (3) ein Kreuztisch eines Mikroskops oder eine Probenaufnahme eines Microarray-Scanners ist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Kalibriernormal (7) mittels einer zertifizierten
Strahlungsquelle oder mittels eines durch eine zertifizierte Strahlungsquelle kalibrierten Normals kalibriert worden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungsquelle der Beleuchtungseinheit (2) eine gegen einen Standard kalibrierte LED ist.
Kalibriernormal (7) zur Kalibrierung einer Vorrichtung (1) zur bildlichen Darstellung biologischen Materials (6), das ein Gehäuse (9) aufweist, das zumindest bereichsweise einen zur Lumineszenz, insbesondere zur Fluoreszenz, anregbaren Stoff (12) umgibt, zumindest teilweise aus einem für eine Anregungs- (15) sowie eine Lumineszenzstrahlung (16) transparentem Material besteht und an dem auf einer dem zur Lumineszenz anregbaren Stoff (12) abgewandten Seite ein Befestigungsmittel (19) vorgesehen ist, das in oder an der Vorrichtung (1 ) zur bildlichen Darstellung biologischen Materials (6) befestigbar ist,
dadurch gekennzeichnet, dass das Befestigungsmittel (19) ein Gewinde, einen Stecker oder ein Rastelement aufweist, das geeignet ist, wiederholt an einem eine Gegenkontur aufweisenden Gegenstück der Vorrichtung (1 ) befestigt zu werden.
Kalibriernormal nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet, dass der im Inneren des Gehäuses (9) angeordnete Stoff (12) entweder pulverförmig ist und wenigstens ein Fluorochrom sowie ein Quarz (Si02) aufweist, oder über ein zur Lumineszenz anregbares Epoxidharz oder ein vergleichbares Polymer verfügt.
Verwendung eines Kalibriernormals nach wenigstens einem der vorangehenden Ansprüche, bei der das Kalibriernormal dauerhaft am Kreuztisch eines Mikroskops, einer Kameraeinheit oder im Bereich einer Probenaufnahme eines Microarray- Scanners befestigt wird.
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