DE19822452A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Konzentrationsbestimmung, Bestimmung von Adsorptions- und Bindungskinetiken und Gleichgewichts- und Bindungskonstanten von Molekülen durch Lumineszenzmessungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung, die durch Abrastern einer Oberfläche mit einem fokussierten Laser und der Detektion von Lumineszenzphotonen die Bestimmung der Konzentration, der Bindungskinetik bzw. Adsorptionskinetik sowie der Gleichgewichts- bzw. Bindungskonstante von lumineszenzmarkierten Molekülen an Oberflächen erlaubt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Lumineszenz-Analyse. Insbesondere betrifft die Erfindung ein schnelles Verfahren zur Lumineszenz-Analyse mit einem hohen dynamischen Meßbereich, die Bestimmung von Adsorptions- und Bindungskinetiken und Gleichgewichts- bzw. Bindungskonstanten sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Die Lumineszenzanalyse, insbesondere die Fluoreszenzanalyse, hat sich sowohl zur Visualisierung wie auch zur Konzentrationsbestimmung verschiedenster Analyte in der Umwelt-, chemischen und biochemischen Analytik, Lebensmittelchemie und medizinischen Diagnostik etabliert. Der Anwendungsbereich der Lumineszenzanalyse war jedoch lange auf einen relativ hohen Konzentrationsbereich beschränkt, d. h. der dynamische Meßbereich war klein.

Andererseits ist in den letzten Jahren versucht worden, die Empfindlichkeit der Lumineszenzanalyse durch eine Verringerung des Detektionsvolumens zu erhöhen. Hierbei stand die Verwendung konfokaler Techniken im Vordergrund, mit der sich das Detektionsvolumen bis hinab auf Femtoliter verringern ließ (siehe z. B. R. Rigler, Ü. Mets, J Widengren, P. Kask, Eur. Biophys. J. 22, 169 (1993)). Sogar der Nachweis einzelner Moleküle wurde so möglich. Jedoch tritt bei geringer Konzentration nur selten ein Molekül in das Detektionsvolumen ein, so daß die Meßdauer bei kleinen Konzentrationen so groß ist, daß das Verfahren für praktische Fragestellungen nicht anwendbar ist.

Macklin et al. (Science, Vol. 272, 255, 1996) beschreiben ein Spektroskopie-Verfahren an einzelnen Molekülen, bei dem eine Oberfläche abgerastert wird, um so die Moleküle schnell zur weiteren spektroskopischen Analyse lokalisieren zu können. Ein solches Verfahren könnte zwar bei geringen Analyt-Konzen­ trationen, bei denen pro Meßpunkt maximal nur einige wenige Moleküle detektiert werden, auch zur Konzentrationsbestimmung dienen, wäre jedoch bei hohen Analyt-Konzentrationen im Vergleich zu klassischen Ein-Punkt-Meß­ verfahren, d. h. Verfahren ohne Abrastern vieler Meßpunkte, langsam und damit insbesondere für Screening-Verfahren bei der Suche nach pharmazeutischen Wirkstoffen mit u. U. Tausenden von Proben nicht geeignet.

Daher ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereit zustellen, um Analyt-Konzentrationen in einem weiten Konzentrationsbereich schnell nachzuweisen.

Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, Adsorptions- und Bindungskinetiken und Gleichgewichts- bzw. Bindungskonstanten zu bestimmen.

Die erste Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung der Dichte lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche gelöst, bei dem eine Oberfläche mit einem Laserstrahl abgerastert wird (Abb. 1). In der Abb. 1 ist 1 = Laserstrahl, 2 = für das gewählte Licht transparente Oberfläche, 3 = fokussierende Optik, 4 = adsorbierte oder gebundene Moleküle. Die Anregungslichtquelle, der Detektor und weitere optische Elemente sind nicht dargestellt. Die von mit dem Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen werden mit einem Detektor aufgenommen (Abb. 2, 3). Abb. 2 zeigt die Signale, die beim Abrastern detektiert werden, wobei an einem Meßpunkt 1 Sekunde gemessen wurde. Die Zeit während der Bewegung zum nächsten Meßpunkt ist auf der Zeitachse nicht dargestellt. An jedem Meßpunkt findet man Signal. Abb. 3 stellt eine Messung bei wesentlich geringerer Moleküldichte auf der Oberfläche dar. Die Zahl der Moleküle in einem Meßpunkt ist geringer (geringere Signalhöhe), außerdem treten die Signale weniger häufig auf. Die Aufnahme der Photonen wird nach der Detektion von N Photonen abgebrochen, wobei N=1/(S²+2), wobei S der relative Fehler der Konzentrationsbestimmung ist. N kann hierbei die Zahl aller detektierten Photonen oder aller detektierten Photonen abzüglich der Untergrundphotonen sein; ist die Dichte der lumineszierenden Moleküle auf der Oberfläche so klein, daß Flächenbereiche auftreten, in denen sich kein Molekül befindet, so muß das Untergrundsignal abgezogen werden.

Bei gewöhnlichen Substanzmengenbestimmungen wird die Zahl der detektierten Fluoreszenzphotonen N innerhalb einer gegebenen Meßzeit t bestimmt, und auf der Grundlage von N dann eine Abschätzung der Substanzmenge Q gemacht. Erfindungsgemäß soll im Gegensatz dazu die Zeit t bestimmt werden, in welcher eine gegebene Zahl von Fluoreszenzphotonen N gemessen wird, das heißt nach Messung von N Photonen wird die Messung abgebrochen und über die Meßzeit dann die Substanzmenge abgeschätzt. Die Zahl der Fluoreszenzphotonen N soll hierbei durch den relativen Fehler der Messung, der vorbestimmt ist, gegeben sein. Die Abhängigkeit der jeweiligen Zahl der Fluoreszenzphotonen N von dem relativen Fehler der Messung ergibt sich wie folgt.

Es sei angenommen, daß die Wahrscheinlichkeit, für eine tatsächliche Substanzmenge q in einer Zeiteinheit ein Photon zu detektieren, gleich κq ist, wobei κ ein Konstante ist, in welche die Laserintensität der Absorptionsquerschnitt, die Fluoreszenzquanteneffizienz und die Detektionseffizienz eingehen. Es soll nun abgeschätzt werden, mit welcher Genauigkeit eine solche Substanzmengenbestimmung durchgeführt werden kann.

Die Wahrscheinlichkeit P_N-1(t), für eine Substanzmenge q in einer gegebenen Zeit t genau N-1 Photonen detektiert zu haben, ist durch die folgende Poissonverteilung gegeben:

Somit ist die Wahrscheinlichkeitsdichte π_N(t), im Zeitintervall {t,t+dt} das N-te Photon zu detektieren, durch π_N(t)=κqP_N-1(t) gegeben.

Wenn man für eine gemessene Zeit t die Substanzmenge über die Beziehung Q=(N-1)/(κt) bestimmt, so ist die entsprechende Wahrscheinlichkeitsverteilung P(Q) gegeben durch [D.T. Gillespie "A theorem for physicists in the theory of random variables" Am. j. Phys. 51(6), (1983), 520]

Das k-te Moment dieser Verteilung ist (k<N-1):

Mittelwert und Standardabweichung sind damit begeben durch:

Der relative Fehler der Konzentrationsbestimmung ist S=σ_Q/q. Folglich gilt für die zum Erreichen einer bestimmten Genauigkeit der Konzentrationsbestimmung erforderliche Zahl Photonen N=1/(S²+2). Somit läßt sich die Genauigkeit der Messung durch die Festlegung der Zahl der zu messenden Photonen festlegen. Für einen relativen Meßfehler von 1% genügt z. B. die Messung von ca. N=10⁴ Fluoreszenzphotonen.

Der Vorteil dieses Verfahrens ist, daß nicht immer die gesamte Oberfläche abgerastert werden muß, sondern, daß die Meßzeit von der Dichte der lumineszierenden Moleküle abhängt; ein hohen Konzentrationen ist die erforderliche Zahl an detektierten Photonen schon sehr schnell erreicht, während nur bei sehr geringen Dichten die gesamte Oberfläche abgerastert werden muß. Als Meßzeit wird nur die Zeit verstanden, während der der Detektor Photonen detektieren kann. Die Meßzeit soll vorzugsweise an einem Meßpunkt nicht größer sein, als Photonen von dem Molekül bzw. den Molekülen erwartet werden können. Ist die Meßzeit größer als diese Zeit (z. B. aufgrund der Photozerstörung), verschlechtert sich das Signal-zu-Rausch-Verhältnis.

Da die Zahl der detektierten Lumineszenzphotonen, die von einem Molekül emittiert werden, von der Dauer der Detektion abhängt, ist eine Kalibrierung für die Bestimmung der Dichte erforderlich.

Erfindungsgemäß können die lumineszierenden Moleküle selbst den Analyten darstellen, oder die lumineszierenden Moleküle binden an den Analyten und dienen so als Marker für den indirekten Nachweis. Beispiel für einen solchen indirekten Nachweis des Analyten ist beispielsweise das Binden eines Farbstoff-markierten Antikörpers an ein Antigen. Die Konzentration der lumineszierenden Moleküle in Lösung läßt sich über Eichmessungen zur Dichte der lumineszierenden Moleküle an der Oberfläche in Beziehung setzen.

Erfindungsgemäß werden bevorzugt Fluorophore als Lumineszenz­ marker verwendet. Diese Fluorophore können erfindungsgemäß sowohl über ihre Farbe (d. h. der Wellenlänge der emittierten Photonen) wie auch über ihre Fluoreszenzlebensdauer detektiert werden (z. B. S. Seeger et al. Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 97, 1542 (1993). Beispielsweise kann der Farbstoff Cy5 erfindungsgemäß verwendet werden. Die Wahl der jeweils erfindungsgemäß verwendeten lumineszierenden Moleküle hängt jedoch in erster Linie von dem verwendeten Laserlicht wie auch von dem verwendeten Einzelmoleküldetektor ab.

Der erfindungsgemäß verwendbare Einzelmoleküldetektor ist nicht beschränkt, sofern er bei gegebenem Detektionsvolumen, gegebener Wellenlänge und Leistung des Laserstrahles und gegebenem lumineszierenden Molekül die Detektion eines einzelnen lumineszierenden Moleküls erlaubt. Die Anforderungen an die Empfindlichkeit des Einzelmoleküldetektors steigen hierbei mit zunehmendem Detektionsvolumen und sinkender Leistung des Laserstrahles. Es ist daher insbesondere bevorzugt, das Detektionsvolumen zu minimieren, indem man den Laserstrahl beugungsbegrenzt fokussiert.

Der Einzelmoleküldetektor umfaßt eine Abbildungsoptik, eine Einheit, die bei Auftreffen von Photonen ein elektrisches Signal erzeugt sowie einen Computer samt Software zur Auswertung der elektrischen Signale. Hierfür wird eine kommerziell erhältliche Computer-Einsteckkarte verwendet, die die Zahl der detektierten Fluoreszenzphotonen pro Zeiteinheit zählt. Für eine zeitaufgelöste Messung im Nanosekundenbereich wird eine schnelle elektronische Korrelatorkarte verwendet (z. B. Digital Time 70, SL Microtest, Jena oder SPC-300, Picoquant). Die Abbildungsoptik ermöglicht vorzugsweise eine zu dem Fokus des Laserstrahles konfokale Abbildung der emittierten Photonen auf die Einheit zur Erzeugung eines elektrischen Signals. Diese Einheit ist vorzugsweise eine Photodiode, insbesondere bevorzugt eine Einzelphotonen­ zähl-Avalanche-Photodiode. Alternativ kann auch ein Photomultiplier oder eine verstärkte CCD-Kamera verwendet werden. Insbesondere wird bevorzugt, den erfindungsgemäß verwendbaren Einzelmoleküldetektor derart einzurichten, daß die Detektion erst nach einer bestimmten Zeit nach der Anregung durch den Laser beginnt ("Gating").

Weiterhin ist es möglich, zeitaufgelöste Messungen im Nanosekundenbereich durchzuführen. Hierbei ist neben einer schnellen Elektronik eine gepulste oder modulierte Lichtquelle und ein schneller Detektor erforderlich.

Durch die zeitabhängige Detektion der Fluoreszenzphotonen ist eine Unterscheidung zwischen an der Oberfläche gebundenen Molekülen und farbstoffmarkierten Molekülen, die sich frei in der überstehenden Lösung befinden bewegen, möglich. Dabei wird berücksichtigt, daß freie Farbstoffe bzw. farbstoffmarkierte Moleküle gewöhnlicherweise Diffusionskonstanten im Bereich von 10^-5 bis 10^-6 cm²/s aufweisen, was bei freier Diffusion zu Durchgangszeiten durch das konfokale Volumen von etwa 100 ms, beim Durchtritt durch das Detektionsvolumen nicht durch das Zentrum, sondern in Randbereichen, noch kürzer, führt, wogegen die an der Oberfläche fixierten Moleküle beliebig lange (praktisch bis zur Photozerstörung) im Detektionsvolumen verweilen. Somit werden Bindungsereignisse zwischen immobilisierten Rezeptormolekülen und Liganden bzw. immobilisierten Liganden und Rezeptormolekülen nachgewiesen, ohne das nichtgebundene farbstoffmarkierte Moleküle aus der überstehenden Lösung entfernt werden müssen. Signale, die kurz auftreten, werden dabei frei beweglichen Molekülen zugeordnet, während Signale, die lange auftreten, z. B. länger als 100 ms, an der Oberfläche gebundenen Molekülen zugeordnet werden.

Zur Anregung des Lumineszenzmarkers wird Laserlicht mit einer Wellenlänge von 600 nm und mehr bevorzugt, um das Auftreten von Streulicht und Autofluoreszenz zu minimieren. Insbesondere sind Halbleiterlaser und Helium-Neon-Laser in diesem Wellenlängenbereich aus Kostengründen für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt. Der Strahl dieses Laserlichtes wird über die Oberfläche gerastert.

Die Rastervorrichtung ist erfindungsgemäß nicht beschränkt, sofern sie in Zeitabständen die Position des Laserstrahles um einen definierten Abstand verändert. Rastervorrichtungen, wie sie in herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskopen verwendet werden, sowie kommerziell erhältliche x,y-Verschiebetische sind auch im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Die Meßzeit pro Meßpunkt beträgt vorzugsweise 1 ms bis 1 s. Die Meßkarte gibt die Zahl der detektierten Fluoreszenzphotonen je Zeitintervall, vorzugsweise 1 ms, an das Steuerprogramm weiter, welches bei Erreichen der vorbestimmten Photonenzahl den Meßvorgang abbricht, die bis dahin verflossene Meßzeit und die Meßdaten abspeichert.

Hierbei lassen sich prinzipiell drei unterschiedliche Meßbereiche unterscheiden.

Bei hohen Analytkonzentrationen kann die erwünschte Photonenzahl schon bei einem einzelnen Meßpunkt erreicht werden. Über die Signalintensität, d. h. die Anzahl der detektierten Photonen läßt sich so direkt die Konzentration des Analyten bestimmen. Die Signalintensität ist in diesem Bereich der Analytkonzentration proportional. Bei einer Rastereinrichtung, die 100 mal 100 Meßpunkte anfährt, führt das Abstoppen der Messung schon nach dem ersten Meßpunkt bei ausreichender Meßgenauigkeit zu einer 10 000fachen Beschleunigung des Meßverfahrens.

Bei mittleren Analytkonzentrationen sind zunehmend mehr Meßpunkte zum Erreichen der gewünschten Meßgenauigkeit erforderlich. Pro Meßpunkt wird die Anzahl der detektierten Photonen integriert und ein Durchschnittswert über alle Meßpunkte gebildet, um so die Konzentration in der gewünschten Genauigkeit zu bestimmen. Die erwünschte Meßgenauigkeit wäre in diesem Bereich nicht ohne Messungen an verschiedenen Meßpunkten möglich. Würden Messungen lediglich an demselben. . Meßpunkt mehrfach wiederholt werden, so verschlechterte sich das Signal-Rausch-Verhältnis u. a. aufgrund der Photozerstörung der lumineszierenden Moleküle.

Wird die Konzentration des Analyten weiter erniedrigt, so wird schließlich ein dritter Meßbereich erreicht, bei dem nicht mehr an jedem Meßpunkt Moleküle detektiert werden. Hier kann dann die durchschnittliche Anzahl der detektierten Moleküle pro Meßpunkt weniger als 1 betragen. Die Signalhöhe an den Meßpunkten mit Signal ist im Rahmen statistischer Schwankungen konstant. Die Konzentration der Moleküle an der Oberfläche ist in diesem Bereich dem Verhältnis aus der Anzahl der Meßpunkte mit Signal zu der Gesamtanzahl der Meßpunkte annähernd proportional. Meßpunkte mit Signal werden durch das Setzen einer Signalschwelle für die Fluoreszenzintensität von Meßpunkten ohne Signal, d. h. ausschließlich Untergrundsignal unterschieden.

Die drei Meßbereiche können mehr als 8 Größenordnungen umfassen.

Eine weitere Steigerung der Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich dadurch erreichen, daß die Oberfläche des Trägers, die abgerastert wird, derart ausgewählt wird, daß an ihr der Analyt bzw. das lumineszierende Molekül leicht gebunden wird. Dies kann durch Ausnutzung ionischer oder hydrophober Wechselwirkungen zwischen der Oberfläche und dem Analyten bzw. dem lumineszierenden Molekül erreicht werden. Insbesondere ist es jedoch bevorzugt, daß die lumineszierenden Moleküle durch eine Affinitätsreaktion selektiv an der Oberfläche gebunden werden. Bei einer solchen Affinitätsreaktion wird das lumineszierende Molekül bzw. der Analyt über ein Fangmolekül an der Oberfläche immobilisiert.

Erfindungsgemäß bevorzugte Fangmoleküle sind an der Oberfläche immobilisierte Proteine oder Nukleinsäuren, die das lumineszierende Molekül bzw. den Analyten selektiv zu binden vermögen. Bevorzugte Proteine sind Antikörper, die entsprechende Antigene binden. Ein weiteres erfindungsgemäß bevorzugt verwendetes Protein ist (Strept-)Avidin, welches das mit Biotin derivatisierte lumineszierende Molekül bzw. den so derivatisierten Analyten sehr selektiv zu binden vermag. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendete Nukleinsäuren sind insbesondere DNS-Oligomere, die spezifisch bestimmte DNS-Abschnitte binden.

Insbesondere wird es erfindungsgemäß bevorzugt, die Fangmoleküle kovalent an die Oberfläche zu binden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Fangmoleküle über einen Langmuir-Blodgett-Film, vorzugsweise einem Langmuir-Blodgett-Film eines Cellulosederivates, auf der Oberfläche immobilisiert. Insbesondere bevorzugt ist es, die Oberfläche zunächst mit 1 bis 8 Monolagen Aminoalkyltrimethyl­ silylethercellulose (ATMSC) und anschließend 1 bis 8 Monolagen Trimethylsilylethercellulosecinnammoat (TMSCC) zu beschichten. Für die kovalente Ankopplung der Fangmoleküle werden dann die Cinnamoyl-Gruppen des TMSCC zu Aldehyd-Gruppen oxidiert.

Die zweite erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem die Oberfläche mit einem Laserstrahl abgerastert wird, die von mit dem Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen mit einem Einzelmoleküldetektor aufgenommen werden und die Aufnahme der Photonen abgebrochen wird. Das Gleichgewicht der Adsorption bzw. der Bindung an die Oberfläche ist dann erreicht, wenn an mindestens zwei aufeinanderfolgenden Meßpunkten die im Rahmen statistischer Schwankungen gleiche Zahl Photonen detektiert werden. Dazu wird die zu bindende bzw. adsorbierende Substanz in Lösung über eine entsprechend präparierte Oberfläche gegeben und das Abrastern der Oberfläche mit dem Fluoreszenzdetektor eingeleitet. Die Zeit, zu welcher ein jeweiliger Spot beim Abrastern vermessen wurde, wir dann gegen die im Spot detektierte Fluoreszenz abgetragen. Dies gilt für Konzentrationen der Substanz in der Lösung, die zu einer Dichte an der Oberfläche nach der Adsorption bzw. Bindung führt, bei der mehrere Moleküle in einem Meßpunkt gebunden bzw. adsorbiert sind. Hierbei können auch die Signale mehrerer Meßpunkte zusammengefaßt werden und einem Zeitintervall zugeordnet werden, z. B. 5 Sekunden. Es werden dann 5 Sekunden lang mehrere Meßpunkte abgerastert, die Zahl der detektierten Photonen ggf. nach der Subtraktion von Untergrundsignal zusammengefaßt und in einem Signal-Zeit-Diagramm aufgetragen. Dies wird nun in 5 Sekunden dauernden Intervallen fortgesetzt und die mit der Zeit ansteigende Photonenzahl aufgetragen. Eine weitere Möglichkeit ist die Messung der Zeit zwischen der Detektion von Lumineszenzphotonen, die mit zunehmender Adsorption bzw. Bindung an der Oberfläche kleiner wird, da die Moleküldichte mit der Zeit zunimmt.

Es sei zum Beispiel die Vermessung einer einfachen Bindungskinetik der Art

angenommen, wobei x(t) die mittlere Konzentration der zur Zeit t gebundenen Moleküle, c die als konstant angenommene Konzentration der freien Moleküle in Lösung, s₀- die Gesamtzahl der freien Bindungsstellen auf der Oberfläche, und k₊, k₋ die zu bestimmenden Bindungs- bzw. Ablösungskonstanten sind. Durch Vermessung des zeitlichen Verlaufs (über die Zuordnung Zeit-Spot) der zu x(t) proportional angenommenen Fluoreszenzintensität der Spots kann damit direkt die Größe k₊c+k₋ bestimmt werden, ohne Kenntnis von s₀ haben zu müssen. Nimmt man darüber hinaus dieselbe Messung bei verschiedenen Werten von c vor, so lassen sich außerdem die Konstanten k₊ und k₋ getrennt bestimmen.

Durch die Kenntnis von k₊ und k₋ kann die Gleichgewichtskonstante bzw. Bindungskonstante des beobachteten Vorgangs errechnet werden.

Die Erfindung stellt zudem eine Vorrichtung zur Bestimmung der Dichte lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche bereit, umfassend einen Laser, einen Einzelmoleküldetektor, eine Rastereinrichtung und ein Mittel zum Abbrechen der Messung nach Detektion einer vorherbestimmten Anzahl Photonen. Der in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendete Laser, die verwendete Einzelmolekülvorrichtung, die verwendete Rastereinrichtung und das verwendete Mittel zum Abbrechen der Messung nach Detektion einer vorherbestimmten Anzahl Photonen entsprechen den oben für das erfindungsgemäße Verfahren angegebenen.

Ausführungsbeispiel 1

Es werden gemäß dem bei F. Löscher et al. (Proc. SPIE beschriebenen Verfahren Huhn-anti-c-Aktin-Immunglobulin G auf einem Objektträger immobilisiert. Nach Waschen mit Phosphat-Puffer PBS wird mit einer c-Aktin-haltigen Lösung etwa 15 Minuten inkubiert und nach einem weiteren Waschschritt mit PBS eine Lösung eines polyklonalen Huhn-anti-c-Aktin-IgY-Anti­ körpers, der zuvor nach Standardverfahren mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 markiert wurde, zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten wird die Oberfläche mit einem konfokalen Detektor abgerastert, wobei Aregung und Detektion durch das Deckglas hindurch geschieht.

Die Zeit, die benötigt wird, bis ausreichend Photonen (z. B. 10000) detektiert werden, wird gemessen. Ach geeigneter Kalibrierung, also der Messung dieser Zeit als Funktion der Konzentration läßt sich die Konzentration an c-Aktin bestimmen.

Ausführungsbeispiel 2

Auf eine Glasplatte, auf der wie im Ausführungsbeispiel 1 Ziege-anti-Maus-Antikörper immobilisiert wurden, wird eine Lösung von 10^-12 mol/l Maus-anti-Hase-Antikörper, die zuvor mit Cy5-Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden, zugegeben und sofort begonnen, die Oberfläche mit einem konfokalen Laserraster-Detektor abgerastert. Die Zahl der detektierten Photonen wird gegen die Zeit aufgetragen. Aufgrund der zunehmenden Dichte der fluoreszierenden Moleküle auf der Oberfläche nimmt die registrierte Zahl der Fluoreszenzphotonen mit der Zeit zu (Abb. 4).

Claims (10)

1. Verfahren zur Bestimmung der Dichte lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche, bei dem die Oberfläche mit einem Laserstrahl abgerastert wird, die von mit dem Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen mit einem Einzelmoleküldetektor aufgenommen werden und die Aufnahme der Photonen nach Detektion von N Photonen abgebrochen wird, wobei N=1/(S²+2), wobei S der Fehler bei der Bestimmung der Dichte ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lumineszierenden Moleküle fluoreszierende Marker für einen Analyten darstellen.

3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Einzelmoleküldetektor eine Avalanche-Photodiode ist.

4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß an der Oberfläche gebundene Moleküle aufgrund der längeren Detektionszeit der Lumineszenzphotonen von denen die frei in Lösung diffundieren unterschieden werden.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die lumineszierenden Moleküle durch eine Affinitätsreaktion selektiv an der Oberfläche gebunden werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die lumineszierenden Moleküle durch an der Oberfläche immobilisierte Proteine, organische Moleküle oder Nukleinsäuren selektiv gebunden werden.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine, organischen Moleküle oder Nukleinsäuren kovalent an der Oberfläche immobilisiert sind.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine oder Nukleinsäuren kovalent über einen Langmuir-Blodgett-Film an der Oberfläche immobilisiert sind.

9. Verfahren zur Bestimmung der Adsorptionskinetik oder Bindungskinetik lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche, bei dem die Oberfläche mit einem Laserstrahl während dem Ablauf der Reaktion abgerastert wird, und die von mit dem Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen mit einem Detektor aufgenommen werden.

10. Vorrichtung zur Bestimmung der Dichte lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche umfassend einen Laser, einen Detektor, eine Rastereinrichtung und ein Mittel zum Abbrechen der Messung nach Detektion einer vorherbestimmten Anzahl Photonen.