DE3206407A1

DE3206407A1 - Einrichtung zum quantitativen nachweis biochemischer reaktionen

Info

Publication number: DE3206407A1
Application number: DE19823206407
Authority: DE
Inventors: Peter Prof. Dr. Paris Hösli; Winfried 8000 München Lührs; Herbert Dr. 8045 Ismaning Schneckenburger; Eberhard Dr. 8042 Oberschleißheim Unsöld
Original assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Current assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Priority date: 1982-02-23
Filing date: 1982-02-23
Publication date: 1983-09-01
Also published as: FR2522150A1; FR2522150B1; CH658912A5

Description

Gesellschaft für Strahlen- und Neuherberg, den 22.2.82 Umweltforschung mbH PLA 8214 Ga/he

ANR Io68083

Einrichtung zum quantitativen Nachweis biochemischer Reaktionen

Bes chreibung:

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung der im Oberbegriff des Anspruches 1 genannten Art.

Es ist eine Meßanordnung zur Bestimmung des Umsatzes fluorogener Substrate in Zellen mittels der Durchflußimpulsfluorometrie bekannt (Biotechnische Umschau 3, Heft 7,(1979^S. 214 ff), wobei die Zellen durch hydrodynamische Fokussierung vereinzelt hintereinander durch den Strahl eines Dauerstrich-Lasers geführt werden. Hierbei werden Fluorophore in den Zellen zur Fluoreszenz angeregt und geben Fluoreszenzstrahlung.ab, die beim Durchlaufen der Meßstrecke den auszuwertenden Fluoreszenzlichtimpuls bildet, der der Masse des Fluorophors proportional ist. Diese Methode erlaubt nur Einmal-Ausmessungen der Zellen und somit sind Reaktionsabläufe in der Einzelzelle nicht erfaßbar.

Eine fluorometrische Bestimmung ruhender Proben mittels der Mikrofluorometrie ist ebenfalls bekannt (Mikrochimica Acta (Wien) 1977 II, 379 - 388). Diese Bestimmung besitzt eine untere Nachweisgrenze von

-14
5 χ Io mol NADPH und ist nicht zeitauflösend. Sie ist für die Bestimmung kleinster Reaktionsumsätze auf zellulärer Basis und für die Aufnahme schneller Reaktionskinetiken nicht geeignet.

Die der Erfindung gestellte Aufgabe besteht nunmehr darin, eine Einrichtung zu bieten, mit der der fluorometrische Nachweis unter erhöhter Empfindlichkeit bzw.

Reduktion der minimal erfaßbaren Zahl von Enzymmolekülen mit Meßzeiten im Sekundenbereich möglich ist, damit einerseits schnelle Reaktionskinetiken erfaßbar sind und andererseits routinemäßige Untersuchungen mit einem großen Probendurchsatz pro Zeit durchgeführt werden können.■

Die Lösung dieser Aufgabe ist in den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruches 1 beschrieben.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den übrigen Ansprüchen wiedergegeben.

Einerseits erlaubt somit erfindungsgemäß die Anwendung des zeitauflösenden Photonenzählverfahrens sowohl die Rauschunterdrückung als auch eine Trennung des Meßsignals von Streulicht und Störlumineszenzen aufgrund des zeitlichen Abklingverhaltens. Andererseits werden für den Einsatz-des·Photonen-Zählverfahrens zum Nachweis biochemischer-Reaktionen noch'folgende zusätzliche Bedingungen in erfinderischer Weise erfüllt;

- optimale Fokussierbarkeit der Anregungs-Lichtquelle im Bereich weniger ,um.

- Lichtquelle mit großer Zahl von Anregungsimpulsen

( ζ- 10 ) innerhalb der Meßzeit von wenigen Sekunden; nur so können genügend Fluoreszenz-Photonen mit guter Einzelphotonen-Statistik (nach der Poisson-Verteilung) aufsummiert werden,

- Verwertbarer UV-Anteil der Anregungslichtquelle.

Zwar ist die zeitauflösende Einzelphotonenzählung für die Messung der Radiophotolumineszenz in Metaphosphatglas-Dosimetern bekannt (Appl.Phys. A 26, 23 - 26 (1981)), jedoch kann bei dieser Messung eine geringe Anregungsiapulsrate des verwendeten Impulslasers <und damit'eine lange Meßzeit in Kauf genommen werden,- da sich die fluoreszenzspektroskopischen Eigenschaften, innerhalb der Meßzeit nicht ändern; d.h. es gibt bei dem-vorliegenden Verwendungszweck keine Reaktionsabläufe, die verfolgt werden sollen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels mittels der Fig. 1-3 näher erläutert.

Die Fig. 1 zeigt ein Blockschaltbild der Einrichtung. Die Probe 1 mit einem Meßvolumen im sub-,ul- bis sub-nl-Bereich zur Vermeidung hoher Substratkosten für hochspezifische Proteine sowie zur Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses wird mittels eines gepulsten Laserstrahles 2 bestrahlt. Dieser Laserstrahl 2 ist über einen Umlenkspiegel 3 sowie ein Anregungsfilter 4 auf die Probe 1 gerichtet. Die · Fluoreszenzphotonen 5 gelangen über einen Emissionsfiltersatz 6 auf einen Photodetektor 7 mit zugehöriger, bekannter Meßelektronik 8 für Einzelphotonenfluoreszenz, Zeitkorrelator 9 Vielkanalanalysator Io und Computer 11 zur Steuerung und Auswertung.

Ein Teil 2¹ des Anregungslichtes 2 wird mittels des

und Strahlteilers 12 ausgeblendet /mit der Photodiode 13 aufgenommen. Deren Ausgangssignal 14 mit einer Frequenz/ die der Impulsfolge des Laserlichtes 2 entspricht, wird benutzt zur Erzeugung eines Referenzsignals in der Meßelektronik 15, welches wiederum zur sog. Synchronisation von Anregungsimpuls (Licht 2) und Einzelphotonenfluoreszenzsignal 5 im Zeitkorrelator 9 verwendet wird.

Die optische Anregung der Probe 1 kann neben dem sichtbaren Spektralbereich auch im nahen UV-Bereich (330 - 370 nm) erfolgen, so daß u.a. auch die Absorptionsbanden von Methyl-Umbelliferon, Naphthol und NADPH erfaßbar sind. Diese Pluorophore werden u.a. zum Nachweis der häufig benutzten Enzyme •S-Galaktosidase und alkalische Phosphatase verwendet.

Für die Erfüllung der.o.g. unterschiedlichen Bedingungen bzgl. einer hohen Anregungsrate wird ein CW-Laser (z.B. Argon-Ionenlaser) mit ausreichender UV-Spezifikation und aktiver Modenkopplung verwendet. Die Impulsfolgefrequenz solcher Systeme (z.B. 82 MHz) ist jedoch für die Nachweiselektronik (Zeitkorrel.ator 9) zu hoch und führt

- zu einem verfälschten Abklingverhalten der Fluoreszenz

- zu einem unnötigen Aufheizen der Probe 1 und damit möglicherweise zu einer Störung der extrem empfindlichen Enzym-Kinetiken.

Eine Reduktion der Impulsfolgefrequenz mit Hilfe eines sog. Cavity Dumpers (W.Demtröder, "Grundlagen und Techniken der Laserspektroskopie", Springer Verlag, (1977)) ist bei den z.Z. verfügbaren UV-Lasern nur unter sehr großem technischen und finanziellen Aufwand möglich. Erfindungsgemäß wurde statt dessen eine besonders kostengünstige und in der Praxis leichter verwendbare Methode entwickelt. Die Impulsselektion erfolgt mit Hilfe eines elektrooptischen Verschlusses 16 (z.B. Hochf requenz-Pockelszelle) ,_ der eine beliebig einstellbare Impuls-Folgefrequenz (z.B. 250 kHz) erlaubt. Sein praktischer Einsatz erfordert eine spezielle Synchronisation. Die Modelocker-Frequenz (=halbe Impuls-Folgefrequenz) des Modelockers 17 des Lasers 18 wird elektronisch abgegriffen und in beliebigem Teilungsverhältnis im Untersetzer 19 unterteilt. Dessen Signal 20 dient dann zur Ansteuerung des schnellen Impulsgenerators 21, dessen Ausgangssignal 22 wiederum aus TTL-Impulsen mit variabler Länge (^- 4 ns) und variabler Verzögerung besteht. Diese Anregungsimpulse 22 dienen zur Triggerung des Hochleistungsgenerators 23, der kurzfristig Spannungsänderungen an der Pockelszelle 16 von bis zu 100 V bewirkt und eine kurzzeitige Transmission des einfallenden Laserlichts 24 aus dem Laser 18 ermöglicht. Die Optimierung von Länge und Verzögerung des Trigger-Impulses 22 erlaubt ein vollständiges Ein- und Ausschalten der Pockelszellen-Spannung inner-

halb eines Zeitintervals, das kürzer als der doppelte Impulsabstand (z.B. 24 ns) ist. Dadurch wird die Selektion der einzelnen Laserimpulse 2 aus einem Impulszug hoher Folgefrequenz (z.B. 82 MHz) möglich. Ein "Nachschwingen" der Pockelszellen-Spannung wurde durch Dämpfung mittels Ferrit-Perlen und geeigneten kapazitiven Abschluß verhindert.

Die Vorteile des zeitauflösenden Photonen-Zählverfahrens können auch innerhalb der in der Biochemie erforderlichen kurzen Meßzeiten ausgenützt werden. Die nach Fig. 1 erhaltenen Fluoreszenz-Abklingkurven (Fig. 2, nur eine dargestellt) wird'mit Subnanosekunden-Zeitauflösung innerhalb weniger Sekunden aufgenommen. Die Auswertung des Meßsignals erfolgt integral innerhalb eines bestimmten Zeitbereiches der Abklingkurve (z.B. in Fig. 2, obere Kurve, zwischen 4,3 ns und 8,8 ns nach dem Maximum), innerhalb dessen der Untergrund aufgrund des Anregungslichts 2 (untere Kurve), sowie längerlebiger Störlumineszenzen stark reduziert ist. Damit kann die minimal nachweisbare Substanzmenge der

-13 -15

Probe 1 von ca. 10 mol auf 10 mol (bei /ul- bis sub- /ul-Volumina) verringert werden (s.Fig. 3; Photonenzahl als Funktion der Substanzmenge am Beispiel von Methyl-Umbelliferon).

Eine Fokussierung des Anregungslichts 2 auf kleinere Meßvolumina läßt eine Reduktion der Nachweisgrenze auf weniger als 10 mol im nl-Bereich und weniger

— 18
als 10 mol im pl-Bereich zu. Damit ist sowohl ein

Nachweis einzelner Enzymmoleküle als auch die Beobachtung schneller Enzymkinetiken mit einem Umsatz

von ca. 3 χ Io fluorogenen Molekülen pro Enzymmolekül und pro Minute möglich. Das bereits computergesteuerte Meßsystem (Fig. 1) ist weiter automatisierbar und kann daher für Routineuntersuchungen innerhalb eines weiten Anwendungsbereichs (neben der medizinischen Diagnose u.a. auch in der Lebensmittelchemie, Agrikultur, Umweltschutz) eingesetzt werden.

Claims

Gesellschaft für Strahlen-und Neuherberg, den 22.2.82 Umweltforschung mbH PLA 8214 Ga/he

ANR Io68083

Patentansprüche:

/ l.JEinrichtung zum quantitativen Nachweis biochemischer, insbesondere enzymatischer Reaktionen bei geringer Meßzeit mit einer Bestimmung natürlicher und/oder künstlicher Fluorophore als Reaktionsprodukte, wo-

Licht bei die Reaktionsprodukte mit/bestrahlt und die von ihnen abgegebene Fluoreszenzstrahlung erfaßt und ausgewertet wird, dadurch gekennzeichnet,

a) daß die optische Anregung der Reaktionsprodukte durch Lichtimpulse erfolgt,

b) daß eine zeitauflösende Photonenzählung mit Rauschunterdrückung und einer Trennung des Meßsignals von Streulicht und Störlumineszenz aufgrund des zeitlichen Abklingverhaltens vorgesehen ist und

c) daß die Anregung (2, 16-24) und die Photonenzählung (5, 7 - 11, 13, 15) synchronisiert ist.
2. Einrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ihre Verwendung in der medizinischen, insbesondere der pränatalen Diagnose von.Stoffwechselkrankheiten und/oder bei imitun-enzymatischer Reaktionen zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen.
3. Einrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Anregung (2) im sichtbaren und/oder UV-Bereich mit einem Laser (17, 18) erfolgt,dessen hohe Impulsfolge (24) durch Impuls-

Z-

selektion mit Hilfe eines einstellbaren elektro optischen Verschlusses (16) reduzierbar ist.
4. Einrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einzelphotonenzählung erfolgt.