DE4420572C2

DE4420572C2 - Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration von fluoreszierenden Stoffen

Info

Publication number: DE4420572C2
Application number: DE19944420572
Authority: DE
Inventors: Hartmut Dr Rer Nat Lucht; Franz Dipl Ing Koenig
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1994-06-03
Publication date: 1999-02-04
Anticipated expiration: 2014-06-04
Also published as: DE4420572A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration von fluoreszierenden Stoffen, insbesondere von fluoreszierenden Stoffen in Lösung oder in festen, bevorzugt körnigen, Medien, gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs, wie aus US 4 600 306 bekannt.

Impulslaseranordnungen mit Wellenlängen bis in den UV-Bereich finden zunehmend als Anregungslichtquelle für die Fluoreszenzspektroskopie Anwendung. In dem Buch "Topics in Fluorescence Spectroscopy" Volume 1, 1991, Plenum Press, New York von J. R. Lakowicz findet sich dazu eine zusammenfassende Darstellung.

Zur Bestimmung von fluoreszierenden Proben ergibt die Strukturierung der Fluoreszenzspektren keine ausreichende Selektivität. Das Abklingverhalten der Fluoreszenz impulsartig angeregter Proben zeigt für die unterschiedlichen Spezies deutliche Unterschiede. Die zeitaufgelöste Erfassung der Fluoreszenz kann folglich eine Verbesserung der Selektivität ergeben.

Bei der Messung von fluoreszierenden Proben wird die Nachweisempfindlichkeit wesentlich durch das Streulicht bestimmt, das sich der Fluoreszenz überlagert. Da das Streulicht synchron zum anregenden Lichtimpuls auftritt, wird durch Auswertung der Meßwerte zu verzögerten Zeitpunkten das Streulicht unterdrückt und das Signal/Rauschverhältnis erheblich verbessert.

Die zeitaufgelöste Messung der Fluoreszenz erfolgt durch ultraschnelle Impulsoszillographen, Samplingoszillographen oder Boxcarintegratoren.

Sollen Proben noch bei Konzentrationen unter einem ppb nachgewiesen werden, so muß die Empfindlichkeit der Photodetektoren bis zur Möglichkeit der Registrierung einzelner Photonen gesteigert werden. Zur zeitaufgelösten Registrierung der Fluoreszenz werden dann statistische Meßverfahren notwendig. Für Blitzlampen als Anregungslichtquellen wird seit Jahren die zeitlich korrelierte Photonenzähltechnik erfolgreich eingesetzt.

Dabei wird synchron zum anregenden Lichtimpuls eine Spannungsrampe gestartet, die durch das erste gemessene Photon der Fluoreszenz gestoppt wird. Das erfolgt mit einem Zeit-Amplituden-Converter (TAC). Die erzielte Rampenamplitude wird digitatlisiert und einem Speicherkanal bzw. Zeitbereich als "count" zugeordnet. Die nach vielen Lichtimpulsen erhaltene Häufigkeitsverteilung der "counts" in den Speicherkanälen ergibt ein Abbild des zeitlichen Abklingens der Fluoreszenz. Das beschriebene Meßverfahren über die zeitlich korreliere Photonenzähltechnik gehört zum Stand der Technik und ist ausführlich in der eingangs genannten US 4 600 306 beschrieben worden. Hierbei wurden zur Verkürzung der Meßzeit mehrere TACs verwendet. Zur Vermeidung von Verfälschungen der Abklingkurven gilt die Voraussetzung, daß die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines gemessenen Photons pro Laserimpuls sehr viel kleiner als eins ist. Für vertretbare Meßzeiten ergibt sich die Forderung nach einer hohen Repetitonsrate der Lichtimpulse mit nur einem Zeit-Amplituden-Converter.

Im Vergleich zu den Blitzlampen haben Laser eine bessere Strahlcharakteristik und eine um viele Größenordnungen höhere spektrale Energiedichte. Ihr Einsatz erschließt den Einsatz der Fibertechnik und ermöglicht eine erhebliche Steigerung der Nachweisempfindlichkeit. Die Anregung der Proben zur Fluoreszenz erfolgt überwiegend im ultravioletten Spektralbereich. Als Laserlichtquellen werden N₂-Laser, Excimer-Laser oder 3. und 4. Harmonische der Nd:YAG-Laser eingesetzt, wobei die verwendeten Repetitionsraten unter 100 Hz liegen. Bei der Verwendung der zeitlich korrelierten Photonenzähltechnik entstehen folglich Meßzeiten von vielen Minuten, die unvertretbar sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei geringen Repetitionsraten der Lichtquellen und geringer Meßzeit der fluoreszierenden Stoffe eine höhere Nachweisempfindlichkeit zu erhalten, als es bisher möglich war, sowie über einen Konzentrationsbereich über viele Größenordnungen mit der kürzesten Meßzeit ein maximales Signal/Rauschverhältnis zu erzielen. Der Kern der Erfindung liegt in der Ausbildung der Auswerteelektronik und in der Ansteuerung des Photomultipliers

Erfindungsgemäß wird das durch die Merkmale des Patentanspruches erreicht.

Die Erfindung soll in einem Ausführungsbespiel anhand von einer Zeichnung näher erläuterte werden.

Die Figur zeigt eine schematische Darstellung der Vorrichtung zur Messung der Konzentration von fluoreszierenden Stoffen.

Der N₂-Impulslaser 1 richtet Laserimpulse über die Strahlteiler 2 und 3, den Umlenkspiegel 4 und der Fokussieroptik 24 auf die Eintrittsöffnung des Lichtleitkabels 25. Der Laser hat eine Impulsleistung von 50 kW, eine Repedtionsrate von 20 Hz und eine Halbwertsbreite des Impulses von 0,5 ns.

Das Lichtleitkabel 25 endet an der Probe 5, in der die Moleküle zur Fluoreszenz angeregt werden.

Der Strahlteiler 2 lenkt einen kleinen Lichtanteil der Laserimpulse auf die Triggereinheit mit einem Photodetektor 6 (PIN-Photodiode), mit der ein Referenzpunkt erzeugt und damit die Meßelektronik synchronisiert wird. Der Strahlteiler 3 spiegelt einen kleinen Lichtanteil auf den Meßkopf 13, der die Laserimpulsenergie für eine Kompensation der Energieschwankungen der Laserimpulse mißt. Die Fluoreszenz von der Probe gelangt über das Lichtleitkabel 26 und einem Spektralfilter in einer Filterwechseleinheit 23 auf den Meßkopf mit Photomultiplier 9 mit dem nachgeschalteten HF-Verstärker 10. Der Photomultiplier hat eine hohe Verstärkung, so daß einzelne Photoelektronen an der Photokathode als Stromimpulse am HF-Verstärkereingang registriert werden.

Das Fluoreszenzlicht am Photomultiplier hat aufgrund der Lichtlaufzeit in den Kabeln zum Licht an der Triggereinheit eine erhebliche Verzögerung. Der an dem Photodetektor 6 erzeugte elektrische Impuls wird in einer Schaltung 7 um die entsprechende Zeit verzögert und erzeugt in der Schaltung 8 einen Torimpuls von 20 ns für den Integrator 11, der den Signalstrom vom HF-Verstärker 10 für den Zeitraum der Torung integriert. Durch Veränderung der Verzögerungszeit mit Schaltung 7 kann die Torung an einem geeigneten Zeitpunkt der Fluoreszenzabklingkurve erfolgen. Das Ausgangssignal N_S des Integrators 11 wird über einen im Mikrocontroller 16 befindlichen 8 Bit-Analog- Digitalwandler, kurz ADU geschrieben, digitalisiert und als Datenwort über das serielle Interface 20 dem Personalcomputer 27 übermittelt. Zur gleichen Zeit wird über den Meßkopf 13 und einer Sample- and Hold-Schaltung 14 in dem Mikrocontroller 16 ein Referenzsignal N_R digitalisiert.

Die in der Auswerteelektronik enthaltene Steuerelektronik 12 erzeugt die notwendigen Impulse für den beschriebenen zeitlichen Meßablauf. Die Baugruppen Quarzgenerator 17, RESET-Generator 18, Referenzquelle 19, serielles Interface 20 und Speicherinterface 21 sind periphere Einheiten, die zum Betrieb des Mikrocontrollers erforderlich sind.

Über die Ansteuerung 22 kann eine Umschaltung von Spektralfiltern in einer Filterwechseleinheit 23 erfolgen. Es sind folgende Baugruppen zur Auswerteelektronik zusammengefaßt: Steuerelektronik 12, Meßkopf 13, Sample- and Hold-Schaltung 14, Trigger 15 (Erzeugung eines elektrischen Startsignals für den N₂-Impulslaser), Mikrocontroller 16, Quarz 17, Reset-Elektronik 18, Referenzquelle 19, serielles Interface 20, Speicherinterface 21 und die Ansteurung 22. Ein Photoelektron an der Photokathode erzeugt am Eingang des ADU ein Signal

N_S = ΔU_ADU = eMRV t_INT/t_H τ_INT. (1)

Dabei bedeuten e die Elementarladung, M die Verstärkung des Photomultipliers, t_H die Halbwertsbreite eines durch ein Photoelektron erzeugten Anodenimpulses, R den Lastwiderstand am Photomultiplier, V die Signalverstärkung im HF-Verstärker, τ_INT Integrationszeitkonstante im Integrator 11 und t_INT die Torbreite.

Durch eine geeignete Dimensionierung des HF- Verstärkers und Integrators wird dafür gesorgt, daß die durch den Vervielfachungsprozeß hervorgerufene statistische Schwankung der Ausgangsamplitude des Photomultipliers so reduziert wird, daß die obige Gleichung (1) immer erfüllt wird.

Bei der Messung von Proben im Spurenbereich, deren Fluoreszenz pro Laserimpuls wenige Photoelektronen oder nur hin und wieder ein Photoelektron erzeugt, wird die Beschleunigungsspannung und folglich die Verstärkung des Photomultipliers solange erhöht bis ΔU_ADU im Mittel am ADU wenigstens ein Bit ergibt. Impulse, erzeugt durch thermisch emittierte Elektronen an den Photomultiplierdynoden, müssen noch deutlich unter der ADU-Schwelle liegen. Beim Auftreten von n Photoelektronen pro Laserschuß erhöht sich die Signalgröße am Eingang des ADU zu

N_S= n ΔU_ADU(2)

Die Bit-Zahl am Ausgang des ADU erhöht sich proportional zu n.

Um Energieschwankungen der Laserimpulse zu kompensieren, wird das Signal N_S mit N_R dividiert.

Die Messung der Probe erfolgt durch Akkumulation vieler Lichtimpulse, die mit dem Personalcomputer festgelegt werden können. Proben geringster Konzentrationen können selbst wenn sie nur bei jedem 10. Laserschuß ein Photoelektron erzeugen durch die Akkumulation von 1000 Lichtimpulsen sicher erkannt werden. Bei einer Repetitionsrate von 20 Hz entspricht das einer Meßzeit von 50 s.

Zur Bestimmung von Stoffen hoher Konzentration werden pro Laserschuß sehr viele Photoelektronen im Photomultiplier erzeugt. Die sich aus diesen Photoelektronen ableitenden Signale N_S überschreiten den Dynamikbereich des ADU. Im Mikrocontroller 16 werden diese Überschreitungen registriert und ein Steuersignal für den Photomultiplier 9 bereitgestellt. Sie bewirken eine Reduzierung der Beschleunigungsspannung an dem Photomultiplier. Die Verstärkung des Photomultipliers und folglich die Signale N_S werden verkleinert, bis der Dynamikbereich der Probensignale im ADU-Bereich liegt. Das Photonenrauschen der Meßergebnisse wird proportional zur sinkenden Verstärkung des Photomultipliers reduziert. Proben mit Konzentrationen über viele Größenordnungen lassen sich ohne optische Veränderungen mit kurzer Meßzeit bestimmen.

Claims

Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration von fluoreszierenden Stoffen mit
- 1. einem N₂-Impulslaser zur Erzeugung von Lichtimpulsen einer festgelegten Wellen länge zur Anregung einer Fluoreszenzstrahlung,
- 2. Strahlteiler,
- 3. Umlenkspiegel,
- 4. einer Fokussieroptik,
- 5. einer Filterwechseleinheit,
- 6. einer Triggereinheit mit einem optischen Detektor,
- 7. einer Probenaufnahme,
- 8. einem Photomultiplier,
- 9. einem HF-Verstärker,
- 10. einem Integrator,
- 11. einem Analog/Digitalwandler,
- 12. einer Verzögerungs- und Torschaltung zur Erzeugung zeitlich definierter Bereiche für die Erfassung aus der Fluoreszenzstrahlung abgeleiteter elektrischer Signale, und mit
- 13. einer Auswerteelektronik,
dadurch gekennzeichnet, daß zur Übertragung von Anregungs- und Fluoreszenzstrahlung Lichtleiter vorgesehen sind dem Photomultiplier HF- Verstärker und Integrator nachgeschaltet sind, die Schwelle des Analog/Digitalwandlers so gelegt ist, daß Signalimpulse die durch thermisch emittierte Elektronen an den Dynoden des Photomultipliers erzeugt und in dem nachfolgenden Integrator aufbereitet werden, mit hoher statistischer Wahr scheinlichkeit am Ausgang des Analog/Digitalwandlers kein Ausgangs-Bit ergeben, daß elektrische Signale, die von einem Photoelektron an der Photokathode erzeugt und in dem nachfolgenden Integrator aufbereitet werden, am Ausgang des Analog/Digital wandlers wenigstens ein Ausgangs-Bit ergeben und das Steuermittel vorgesehen sind, die bei Überschreitung des Digitalisierungsbereiches des Analog/Digitalwandlers ein Steuersignal zur Reduzierung der Beschleunigungsspannung des Photomultipliers er zeugen.