DE3915692A1

DE3915692A1 - Verfahren und anordnung zur bestimmung schnell veraenderlicher fluoreszenzvorgaenge

Info

Publication number: DE3915692A1
Application number: DE19893915692
Authority: DE
Inventors: Bernhard Dr Ruth
Original assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1989-05-13
Filing date: 1989-05-13
Publication date: 1990-11-22
Also published as: DE3915692C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff der Patentansprüche 1 und 4.

Das Photonensynthesesystem (PS) von dunkel-adaptierten Pflan zen zeigt nach Beginn der Anregung mit sichtbarem Licht eine Fluoreszenz ab etwa 665 nm, die sich zeitlich verändert. In der Abb. 1 ist der Verlauf schematisch dargestellt. Mit Einschalten des Anregungslichtes Ia (Fig. 1a, 1b) steigt die Fluoreszenz F(t) mit verschiedenen Zeitkonstanten im Bereich zwischen 1 ns und etwa 500 ms stark an und durchläuft dabei einige Wendepunkte und ggf. Zwischenmaxima und -minima. Nach etwa 1 s erreicht die Fluoreszenz das Maximum Fm, sinkt dann ab und erreicht, möglicherweise über mehrere Wendepunkte oder Zwischenmaxima innerhalb weniger Minuten den Gleichgewichts wert Fs. Der ausgeprägte Kurvenverlauf wird nur bei Intensitä ten des Anregungslichts von einigen mW/cm² erreicht.

Wenn das Anregungslicht abgeschaltet wird, dann sinkt die Fluoreszenz F (t) rasch ab. Es treten auch hier Zeitkonstanten vom ns-Bereich bis in den Minutenbereich auf, die Intensitäten überstreichen daher mehrere Größenordnungen.

Die bei der Induktionskinetik und der verzögerten Fluoreszenz auftretenden Zeitkonstanten können mit verschiedenen Komponen ten des Photosynthesesystems in Verbindung gebracht werden. Der Verlauf der Fluoreszenz kann damit Aufschluß über die Ef fektivität einzelner Komponenten geben.

Die Schwierigkeit bei der Messung und der Interpretation der Ergebnisse besteht nun darin, daß sowohl Intensitäten als auch die auftretenden Zeitkonstanten über einen weiteren Bereich variieren. Außerdem ist nicht klar, welches Meßvolumen von der Fluoreszenz erfaßt wird. Die Messungen werden daher in Verbin dung mit der Bestimmung der Chlorophyll-Konzentration, CO2-Fi xierung und Sauerstoff-Erzeugung durchgeführt. Diese Verfahren sind im Vergleich zur der Messung selbst aufwendig.

Der Anwendung der Verfahren bei der Messung von intakten Blät tern sind aber auch deshalb Grenzen gesetzt, weil die Abgren zung von bestrahltem und nicht bestrahltem Blattbereich unklar ist und außerdem durch die Dichte der Chloroplasten Anre gungslicht absorbiert wird und durch Absorption und Re-Emis sion Spektrum und Intensität des Fluoreszenzlichts beeinflußt werden.

Es ist daher vorgeschlagen worden, die "Grundfluoreszenz" als Normierung zu verwenden. Darunter versteht man die Fluores zenz, die auftritt, wenn die Reaktionszentren des Photosynthe sesystems nicht besetzt sind. Die Grundfluoreszenz kann natur gemäß nur am Anfang der Anregung mit Licht bestimmt werden, das aber ist schwierig, da sich gerade hier die Fluoreszenz schnell ändert. Im allgemeinen sieht man deshalb den ersten Meßwert ungleich Null nach Einschalten als ein Maß für die Grundfluoreszenz an. Eine Normierung auf die Grundfluoreszenz führt daher zu beträchtlichen Fehlern.

In der Praxis wird daher selten die Normierung auf die Grund fluoreszenz benutzt, sondern man betrachtet das Verhältnis Fm/Fs. Auf diese Weise geht Information verloren, da in jedem der beiden Signale Informationen über die Effektivität ver schiedener Komponenten des Photosynthesesystems enthalten ist. Außerdem ist die Variation dieser Größe beträchtlich.

Es ist für diese Art der Messungen notwendig, die Probe sehr schnell mit einer Lichtquelle zu bestrahlen, deren Intensität nach Beginn der Anregung konstant sein muß. Mit Blitzlampen oder gepulsten Lasern lassen sich diese Effekte nicht untersu chen.

Von M. Voss et al., Fluorometric Detection of Photosystem II Herbicide Penetration and Detoxification in Whole Leaves, Weed Science 32 (1984) 675 wird ein Laser mit einem mechanischen Verschluß beschrieben. Damit werden Öffnungszeiten im Bereich von etwa 2 ms erreicht. Da aber die interessierende Fluores zenz mit einer Zeitkonstanten von µSekunden ansteigen kann, ändert sich die Fluoreszenz während der Öffnung schon stark und man erhält keine zuverlässige Messung der Grundfluores zenz.

Weiterhin ist aus U. Schreiber et el., Portable solid-state Fluorometer for the Measurement of chlorophyll Fluorescence induction in plants. Rev.Sci.Instrum. 46 (1975) 538, eine Meßan ordnung bekannt, bei der eine Diode zur Erzeugung des Anre gungslichts verwendet wird. Dioden kann man innerhalb einiger ns an- und abstellen. Der Nachteil ist, daß Dioden im Ver gleich zu anderen Lichtquellen eine geringe Intensität haben und außerdem ein Emmissionsspektrum aufweisen, das mit dem der Fluoreszenz überlappt. Die geringe Intensität des Anregungs lichts und die Notwendigkeit der Separation des Fluoreszenz lichts mit Filtern führt dazu, daß wenig Licht zur Detektion zur Verfügung steht. Aus diesem Grund kann die Fluoreszenz erst dann erfaßt werden, wenn sie schon eine beträchtliche In tensität erreicht hat. Die Bestimmung der Grundfluoreszenz kann daher ebenfalls nur ungenau erfolgen.

Man hilft sich daher damit, den ersten gemessenen Wert als Grundfluoreszenz anzusehen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei der Messung der Induktions-Kinetik wie auch der verzögerten Fluoreszenz des Photosynthesesystems eine Normierung zu ermöglichen. Diese Normierung kann durch die Bestimmung der Grundfluoreszenz geleistet werden. Das aber ist mit den bestehenden Verfahren nur unzureichend möglich.

Außerdem wird mit dem Anstieg der Fluoreszenz von der Grund fluoreszenz aus eine weitere Komponente ermittelt, die eben falls Aussagen über das Photosynthesesystem liefert.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den kennzeichnenden Teil der Patentansprüche 1 und 4 gelöst. Die übrigen Pa tentansprüche stellen vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfin dungen dar.

Folgende Vorteile lassen sich mit der Erfindung erzielen:
Die Kombination Laser, schneller optischer Schalter und mecha nischer Schalter zusammen mit der Intensitätsstabilisierung erlaubt

a) das Ein- und Ausschalten des Anregungslichts in weniger als 10 ns (Vorteil gegenüber mechanischen Schaltern, ms),
b) das Schalten und Aufrechterhalten einer konstanten Leistung für eine beliebig lange Zeit (Vorteil gegenüber gepulsten Lasern),
c) das Schalten einer ausreichend hohen Intensität des Anre gungslichts, die einen ausgeprägten Kurvenverlauf der In duktions-Kinetik und eine für die Detektion ausreichende Intensität des Fluoreszenzlichts erzeugt (Vorteil gegenüber der Erzeugung des Anregungslichts mit einer Diode) und
d) das Schalten des Anregungslichts mit einer hohen Frequenz schärfe, die die Separation des Fluoreszenzlichts vom Erre gerlicht erleichtert (Vorteil gegenüber einer Diode, die üblicherweise eine Bandbreite von über 20 nm hat.

Durch die der gegebenen Intensität angepaßten Detektorempfind lichkeit ergeben sich folgende Vorteile:

a) Die stark unterschiedlichen Intensitäten können mit einem Detektor erfaßt werden. Dadurch bleiben spektrale Empfind lichkeit, Raumwinkel und Meßwinkel konstant und es entfal len sonst notwendige Anpassungsmessungen:
b) Bei der digitalen Meßwerterfassung ist das Detektoraus gangssignal an den Eingangsbereich des angeschlossenen Ana log-Digital-Konverters angepaßt. Dem Auftreten von niedri gen Ausgangssignalen muß nicht dadurch Rechnung getragen werden, daß ein Analog-Digital-Konverter mit sehr hoher Auflösung eingesetzt werden muß. Die hohe Auflösung des Analog-Digital-Konverters reduziert auch die maximale Ab tastrate.

Bei den bisherigen Verfahren wird eine konstante Empfindlich keit benutzt.

Die Anpassung der Zeitkonstante an die notwendige Abtastrate verringert das Rauschen und trägt so zur Datenreduktion bei. In den bisherigen Verfahren wird nur eine Zeitkonstante ver wendet.

In der speziellen Aufgabe der Messung der Chlorophyll-Fluores zenz ist es möglich, mit dem gleichen Detektor die Grundfluo reszenz mit einer Auflösung von 10 µs zu bestimmen und die sehr viel höhere Maximalfluoreszenz. Insbesondere ist es mög lich, die verzögerte Fluoreszenz über mehrere Größenordnungen hinweg zu verfolgen.

Ein Ausführungsbeispiel für die Erfindung wird im folgenden anhand der Figuren näher beschrieben:

Es zeigen:

Fig. 1a und 1b den zeitlichen Verlauf der Intensität Ia der geschalteten Laserintensität bzw. die Intensität F(t) der Fluoreszenz.

Fig. 2 eine schematische Darstellung der Meßanordnung.

Fig. 3 ein Blockschaltbild für die Anordnung.

Fig. 4 zeigt die Steuerung für die Hochspannung 12.

Fig. 5 zeigt zwei Beispiele für den Beginn der Fluoreszenz.

Fig. 6 zeigt den Anfang einer Fluoreszenz im vergrößerten Zeitmaßstab.

Fig. 7a, b, c, zeigt die Wirkung von optischem und mechani schem Schalter auf die Intensität des Lasers 1.

Der Aufbau der Optischen Anordnung und eine Prinzipschaltung der Elektronik sind in Fig. 2 dargestellt.

Zur Anregung der Fluoreszenz wird ein Laser 1 benutzt, da er genügend Intensität liefert und aufgrund der Frequenzschärfe des Lichts die Separation des Fluoreszenzlichts wesentlich er leichtert.

Der Optische Schalter 2 dient zum Ein- und Ausschalten des Lichtes für die Anregung.

Es können mehrere Geräte benutzt werden (z.B. auch Pockels- Zellen). In dem ersten Anwendungsbeispiel wird ein akusto-op tischer Modulator verwendet, der z.B. wesentlich einfacher und preiswerter ist als ein Q-switsch im Laser. Es lassen sich Schaltzeiten von einigen 10 ns erreichen und die Leistung des eingestrahlten Lichts kann einige 10 mW betragen.

Mit einem Laser läßt sich der akusto-optische Modulator in einfacher Weise betreiben.

Für die exakte Erfassung der Induktions-Kinetik und den Ver gleich der Intensitäten bei verschieden zeitlichen Phasen ist es notwendig, daß die Intensität des Anregungslichts nach dem Einschalten zeitlich konstant bleibt. Da die Laserintensität schwanken kann und auch die optischen Eigenschaften der Schal ter nach dem Einschalten nicht sofort stabilisiert sind, wer den folgende Komponenten zur Stabilisierung eingesetzt.

Vor dem optischen Schalter 2 ist ein zusätzlicher mechanischer Schalter 31 eingesetzt, der Öffnungs- und Schließzeiten unter 10 ms hat. Der mechanische Schalter 31 ermöglicht es, den op tischen Schalter fast immer eingeschaltet zu lassen, so daß sich seine Eigenschaften stabilisieren können (thermische Ef fekte). Soll nun der Strahl eingeschaltet werden, so schließt der optische Schalter 2 (siehe Fig. 7a), der mechanische Schalter 31 öffnet (siehe Fig. 7b) und der optische Schalter 2 öffnet ebenfalls, nachdem 31 vollständig offen ist. Auf diese Weise wird der optische Schalter 2 nur während der Verschlußzeiten des mechanischen Schalters geschlossen, so daß seine Stabilität nicht beeinträchtigt wird. Beim Ausschalten des Strahls wird in umgekehrter Reihenfolge verfahren. Zuerst schließt der optische Schalter 2, dann der mechanische Schal ter 31 und anschließend öffnet sich wieder der optische Schal ter 2.

Um weitere Schwankungen der Strahlintensität zu kompensieren, wird mit einem teildurchlässigen Spiegel 28 ein Teil des Strahls auf den Detektor zur Strahlkontrolle 29 gelenkt. Des sen Signal 37 wird in einer Steuereinheit "Strahlkontrolle" 30 verarbeitet, die den optsichen Schalter 2 über das Signal 38 so moduliert, daß die Strahlintensität konstant ist (Feinregulation). Der Beginn dieser Steuerung muß gegenüber dem Signal 36 verzögert sein, da der Strahl sonst nicht seine volle Leistung erreicht.

Das Licht wird über ein Faserbündel 3 auf die Probe 4 in der Meßküvette 5 gelenkt. Durch den anderen Arm des Faserbündels wird das Licht zum optischen Filter 6, vorzugsweise ein Inter ferenzfilter, geführt, der das Fluoreszenzlicht im Bereich ab 665 nm selektiert.

Die Detektoreinheit 7 ist in ihrer Empfindlichkeit durch das Signal 32 steuerbar und erzeugt das Meßsignal 33. Die Einheit 8 erzeugt aufgrund von vorgegebenen Steuersignalen 34 und dem Meßsignal 33 das Signal 32 zur Einstellung der Empfindlichkeit des Detektors. Außerdem modifiziert Einheit 8 Signal 33 in der Weise, daß aufgrund der gegebenen Intensität und Zeitkonstante eine optimale Erfassung des resultierenden Meßsignals 35 durch die Einheit 9 (Datenerfassung und Versuchssteuerung) ermög licht wird. Einheit 9 erzeugt auch die Steuersignale 36 für Steuereinheit Strahlinensität 30 und Signal 34 für die Einheit 8.

Die Beschreibung der Komponenten im Einzelnen (Fig. 3)

Die Fluoreszenz überstreicht einen beträchtlichen Intensitäts bereich. Ein Photomultiplier 10 als Detektor-Einheit 7 hat eine wesentlich größere Empfindlichkeit als eine Diode. Auf diese Weise kann man Anregungs- und Fluoreszenzlicht wesent lich besser trennen, was aus Mangel an scharfkantigen opti schen Filtern auch zu einem beträchtlichen Verlust an Fluores zenzintensität führt. Der Photomutiplier hat aber noch als weiteren wesentlichen Vorteil, daß die Empfindlichkeit durch die Variation der PM-Spannung 32 über einen weiteren Bereich den Erfordernissen angepaßt werden kann.

Eine logische Schaltung zur Hochspannungs-Steuerung 12 erkennt aufgrund des Steuersignals 34, das eine Zusammenfassung der einzelnen Signale 39, 40 und 41 ist und des Photomultiplier- Ausgangssignals 42 das eine Realisierung des Detektorsignals 33 ist, wann die Empfindlichkeit größer oder kleiner einge stellt werden muß. In diesem Fall wird der Wert 43 geändert, der die regelbare Hochspannungsversorgung 11 steuert (Ausgang 32).

Die Änderungen von 43, bewirken Änderungen der entsprechenden Verstärkungsfaktoren im Zwischenspeicher 18 bzw. Interface 19.

Die Kombination zwischen Hochspannungssteuerung 11 und Pho tomultiplier 10 ist deshalb günstig, weil eine relativ geringe Spannungsänderung durch die Multiplier-Eigenschaft eine Ände rung der Empfindlichkeit um eine Größenordnung bewirkt. In ei nem Anwendungsbeispiel wird die Empfindlichkeit innerhalb von 2-10 µs umgestellt.

Bei niedrigen Intensitäten wird der Photomultiplier 10 mithilfe der Einheit 13 (Verstärker-Diskriminator) als Photo nenzähler geschaltet, so daß 44 eine Impulsfolge logischer Si gnale ist, deren Zählrate proportional zur Intensität des Fluoreszenzlichts ist.

Die Bestimmung sehr niedriger Intensitäten der Fluoreszenz ist gerade bei der verzögerten Fluoreszenz unbedingt notwendig, da hier die Intensität über einen Bereich von 8 Zehnerpotenzen abfällt.

Bei höheren Lichtintensitäten ist die Photonenzähltechnik nicht mehr einsetzbar, da die einzelnen Impulse nicht mehr auflösbar sind. In diesem Fall wird 42 als Analogsignal im Verstärker 14 weiterverarbeitet, dessen Verstärkung und Zeit konstante an die gegebene Intensität und die Abtastrate 51 für das Eingangssignal 46 des Analog-Digital-Konverters 17 ange paßt sind.

Die bisher auftretenden Zeitkonstanten sind so kurz, daß die Meßwertaufnahme nicht direkt mit einem Rechner erfolgen kann. Sobald dies aber der Fall ist, werden die Signale 47 aus dem Verstärker 15 direkt mit dem Interface 19 verarbeitet. Es empfiehlt sich aber für Verstärker 15 eine größere Zeitkon stante zu wählen, da die geringere Zeitkonstante von Verstär ker 14 nicht nötig ist und darüber hinaus aufgrund der größe ren Bandbreite des Rauschen unnötig groß bleibt.

In der Einheit 9 sind folgende Komponenten enthalten:
Bei sehr schnell veränderlicher Fluoreszenz ist ein Zwischen speicher und eine Steuerung notwendig (Einheit 18). Entspre chend dem Takt 50 zählt Zähler 16 die Photonenimpulse und übergibt die Zählrate in Form der Binärzahl 48 an den Zwi schenspeicher 18. In ähnlicher Weise wandelt der Analog-Di gital-Konverter 17 das Analogsignal 46 in die Binärzahl 49 um und übergibt sie entsprechend Takt 51 an Einheit 18. Die Steu ersignale 39, 40 und 41 steuern die Hochspannungssteuerung 12 und aktivieren die Verstärker 13, 14 und 15. Nach Ende des ak tuellen Versuchs werden aufgrund der Steuersignale 52 die Da ten 53 aus dem Zwischenspeicher 18 über das Interface 19 in den Rechner 20 gelesen. Interface 19 erzeugt auch das Signal 36 für die Steuereinheit Strahlintensität 30.

Die Steuereinheit Strahlintensität 30 hat folgende Aufgaben:
Aufgrund des Signals 36, das Ein- und Ausschalten der Laserin tensität anzeigt, erzeugt Einheit 30 das Signal 38 für den op tischen Schalter 2 und das Signal 54 für den mechanischen Schalter 31 in einer Reihenfolge, die die Verzögerung und Öff nungs- und Schließzeiten von mechanischem Schalter 31 berück sichtigen und in Abb. 7 dargestellt sind.

Fig. 7a zeigt das Verhalten des optischen Schalters 2, der die Steilheit der Flanken bestimmt und Fig. 7b zeigt das Ver halten des mechanischen Schalters mit Verzögerung und Öff nungs- und Schließzeiten.

Fig. 7c zeigt die resultierende Laser-Leistung, die durch die Schaltung von optischem Schalter 2 bestimmt ist.

Die Steuereinheit 30 verarbeitet auch das Signal 37, das bei ansteigender Strahlintensität das Signal 38 modifiziert, um den optischen Schalter 2 so zu steuern, daß die Intensität wieder sinkt.

Zu Beginn ist 38 auf einem voreingestellten Wert und erst nach einer Verzögerung beginnt diese Steuerung zu arbeiten. Die Dauer der Verzögerung hängt von den Zeitkonstanten aus opti schem Schalter 2 und des Detektors "Strahlkontrolle" 29 ab. Es muß darauf geachtet werden, daß der Sollwert unter der maxima len Intensität eingestellt wird.

Die Steuerung der Hochspannung 12 ist in Abb. 4 genauer dargestellt. Das Photomultipliersignal 42 wird in den beiden Komparatoren 23 und 24 mit den Schwellen 55 und 56 verglichen (55 kleiner 56). Bei Überschreiten der Schwelle werden die lo gischen Signale 57 und 58 high. Der Ausgang 59 von Einheit (25), Exklusives Oder, ist genau dann high, wenn 42 zwischen R 1 und R 2 liegt. Wenn das entsprechende Signal 39, 40, 41 an liegt, ist das Signal 60 ebenfalls high und der Schalter 27 schaltet das vorher festgelegte Signal 61 auf den Ausgang 62 zur Steuerung der regelbaren Hochspannung. Die Signale 57 und 58 können für die Erhöhung und Erniedrigung der Empfind lichkeit weiter verarbeitet werden.

Die eindeutige Bestimmung der Grundfluoreszenz F₀ ist mit die sem Verfahren möglich.

In Fig. 5 ist die Induktionskinetik der Fluoreszenz in den ersten 70 ms aufgetragen. Man erkennt anhand der unterschiedlichen Steigung, daß mehrere Zeitkonstanten zum tragen kommen. Die Abtastrate von 10 µs gesattet es, Zeitkon stanten bis zu dieser Größe festzustellen. Nach Stand der Li teratur können damit alle Zeitkonstanten im Zusammenhang mit der Elektronenstransportkette und den biochemischen Vorgängen erfaßt werden.

In Fig. 6 ist der Anfang der Fluoreszenz nocheinmal herausge zeichnet. Es ist offensichtlich, daß man durch Extrapolation aus dem Bereich zwischen 0,2 ms und 3 ms auf den Zeitpunkt 0 die Grundfluoreszenz F₀ sicher bestimmen kann.

Bezugszeichenliste

1 Laser
2 optischer Schalter
3 Faserbündel
4 Probe
5 Meßküvette
6 Optischer Filter
7 Detektoreinheit
8 Einheit zur Empfindlichkeitssteuerung
9 Einheit Datenerfassung und Versuchssteuerung
10 Photomultiplier
11 Regelbare Hochspannungsversorgung
12 Hochspannungssteuerung
13 Verstärker Diskriminator
14 Verstärker
15 Verstärker
16 Zähler
17 Analog-Digital-Wandler
18 Zwischenspeicher und Steuerung
19 Interface
20 Rechner
21 Potentiometer
22 Potentiometer
23 Komparator
24 Komparator
25 Exclusives Oder
26 Und-Stufe
27 Analog-Schalter
28 Teildurchlässiger Spiegel
29 Detektor zur Strahlkontrolle
30 Steuereinheit Strahlintensität
31 Mechanischer Schalter
32 Empfindlichkeitssteuerung von 7
33 Detektor-Ausgangssignal
34 Steuersignal für Empfindlichkeitssteuerung 8
35 Modifiziertes Meßsignal
36 Steuersignal für Laserintensität
37 Meßsignal der Laserintensität
38 Steuerung des optischen Schalters
39 Steuersignale für Einheit 12 und 13
40 Steuersignale für Einheit 12 und 14
41 Steuersignale für Einheit 12 und 15
42 Ausgangssignale des PM
43 Eingangssignal für regelbare Hochspannung
44 Photonenimpulse
45 Taktrate für ADC 17
46 Ausgang Verstärker 14
47 Ausgang Verstärker 15
48 Binärzahl aus Zähler 16
49 Binärzahl aus ADC 17
50 Takt für Zähler 16
51 Takt für ADC 17
52 Steuersignal für Zwischenspeicher 18
53 Daten aus Zwischenspeicher 18
54 Steuersignal für mechanischen Schalter
55 Unteres Referenz-Signal
56 Oberes Referenz-Signal
57 Indikator für Unterschreiten von 55
58 Indikator für Unterschreiten von 56
59 Indikator für Schwellenüberschreitung
60 Logisches Signal für Änderung der Empfindlichkeit
61 Vorgewähltes Signal für Analog-Schalter

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung schnell veränderlicher Fluores zenzvorgänge an biologischen Proben durch Anregung mit ei nem abschaltbaren Laser, wobei das Fluoreszenzlicht der Probe mit einem Detektorsystem erfaßt wird, dadurch gekenn zeichnet, daß

a) die Laserintensität in weniger als einer µsec einge schaltet und während der gesamten Bestrahlungszeit kon stant gehalten wird, dabei wird
b) die Fluoreszenzstrahlung in einem durch ein optisches Filter vorgegebenen Wellenlängenbereich mit einem Detek tor erfaßt, derart daß für geringe Intensitäten Photonen gezählt werden und daß für höhere Intensitäten die Ver stärkung des Detektorausgangssignals automatisch so ver ändert wird, daß der Dynamikbereich eines Analog-Digi tal-Wandlers voll ausgenützt wird, wobei
c) die Abtastraten und die Verstärkerzeitkonstanten an die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzintensität angepaßt werden und dann
d) nach einer Bestahlungszeit im Minutenbereich die La serintensität in weniger als einer µsec abgeschaltet wird
e) und schließlich die Fluoreszenz ohne Laseranregung für eine bestimmte Zeit erfaßt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennnzeichnet, daß das Ein- und Abschalten der Laserintensität mit einer Kombina tion aus einem mechanischen Schalter und einem optischen Schalter durchgeführt wird, derart daß der optische Schal ter nur während der Öffnungs- und Schließphase des mechani schen Schalters geschlossen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder dem folgenden, dadurch ge kennzeichnet, daß als Detektor ein Photomultiplier verwen det wird, dessen Verstärkung über die Variation der Hoch spannung verändert wird.

4. Vorrichtung zur Bestimmung schnell veränderlicher Fluores zenzvorgänge an biologischen Proben durch Anregung mit ei nem abschaltbaren Laser, wobei das Fluoreszenzlicht der Probe mit einem Detektorsystem erfaßt wird, dadurch gekenn zeichnet, daß eine steuerbare Kombination von einem opti schen und einem mechanischen Schalter zwischen dem Laser und der Probe angeordnet ist, und daß eine Empfindlichkeitssteuerung (8) zwischen Detektoreinheit (7) und der Datenerfassung und Versuchssteuerung (9) vorgesehen ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoreinheit (7) ein Photomultiplier (10) ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder dem folgenden, dadurch ge kennzeichnet, daß die Probe durch ein Faserbündel (3) an den Laser (1) und an die Detektoreinheit (7) angekoppelt ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder einem der folgenden, da durch gekennzeichnet, daß zwischen der Detektoreinheit (7) und dem benachbarten Faserbündelende (3 a) ein Interferenz filter (6) angeordnet ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder einem der folgenden, da durch gekennzeichnet, daß vor dem Faserbündelende (3 b) ein Strahlteiler angeordnet ist, in dessen reflektierten Strah lengang ein weiterer Detektor (29) liegt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder einem der folgenden, da durch gekennzeichnet, daß sie für Messungen an Photosynthesesystemen verwendet wird.