DE3303510A1

DE3303510A1 - Rechnergesteuertes fluorometer mit auswerteeinheit zur schadstoffdetektion an intakten pflanzen und isolierten chloroplasten

Info

Publication number: DE3303510A1
Application number: DE19833303510
Authority: DE
Inventors: Peter Dr.-Ing. Gräber; Gernot Prof. Dr.Rer.Nat. Renger; Manfred Dr. rer.nat. 1000 Berlin Voß
Original assignee: RENGER GERNOT
Current assignee: RENGER GERNOT
Priority date: 1983-01-31
Filing date: 1983-01-31
Publication date: 1983-07-14
Also published as: DE3303510C2

Description

Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine kompakte Apparatur zur rechnergesteuerten fluorometrischen Auswertung der Schadstoffdetektion an intakten Pflanzen und Chloroplasten mit einer Lichtquelle zur Anregung der Fluoreszenz, optischen Elementen zur Fokussierung des Anregungslichtes auf die zu untersuchenden Proben, einem variablen Blatthalter für 'in vivo'-Untersuchungen und einem Küvettenhalter für 'in vitro'-Messungen sowie einer speziellen Meßküvette für toxische Gase, wobei die Steuerung und Auswertung der Messungen durch ein modular aufgebautes Mikrocomputersystem vorgenommen wird.
Die heute gebräuchlichsten Methoden zum Nachweis von Schadstoffwirkungen auf die Photosynthesetätigkeit benutzen z.T. aufwendige chemische bzw. physikalisch-chemische Verfahren. Zu nennen ist hier die Messung der Sauerstoffproduktion bzw. des Kohlendioxidverbrauches, die Hill-Reaktion und speziell bei Herbiziden die Extraktion mit nachfolgender gas- oder flüssigchromatischer Auftrennung der Bestandteile. Eine andere Methode ist in der Patentschrift PS 2626915 beschrieben.
Bei den meisten bekannten fluorometrischen Meßverfahren erfolgt die Messung des Fluoreszenzlichtes im Winkel von 1800 oder 90" zum Anregungslicht. Zur Messung an intakten Blättern kommt (wegen der hohen optischen Dichte) praktisch nur eine Messung des Fluoreszenzlichtes in "ReEExion" in Frage, d.h. Anregungs- und Fluoreszenzlicht befinden sich im gleichen Winkel.
Eine in der Offenlegungsschrift DE 2938056A1 dargestellte Einrichtung zur fluorometrischen Auswertung von Proben ist eine Durchlichtmeßanordnung und vom Aufbau her für die Bestimmung des Chlorophyllgehaltes gedacht und deshalb für Untersuchungen an intakten Pflanzen nicht geeignet.
In der US-Patentschrift 4,084,905 wird das gleiche physikalische Phänomen, nämlich die Messung der Fluoreszenzinduktionskurve, verwendet, doch ist die apparative Ausführungsform von unserer stark verschieden und es wird kein Auswerteverfahren beschrieben.
Bei diesem hier entwickelten Fluorometer wurde das Prinzip verfolgt, durch einen relativ einfachen kompakten Meßaufbau sowohl qualitative als auch quantitative Aussagen über die Wirkung von Schadstoffen auf die Primärprozesse der Photosynthese machen zu können. Hierzu wurde eine Methodik entwickelt, die auf der Messung von Fluoreszenzinduktionskurven in einem kurzen Zeitbereich (einige Sekunden) beruht.
Unter der Fluoreszenzinduktion versteht man die Veränderung der Chlorophyllfluoreszenz als Funktion der Belichtungszeit, wenn die Pf lanzeh(bzw. die Chloroplasten) vor der Belichtung dunkeladaptiert waren. Bei geeigneter Wahl der Lichtintensität und des Zeitraumes der Messung der Induktionskurve läßt sich aus der Veränderung der Kurve bei Einwirkung eines Schadstoffes die Inhibierung des Elektronentransportes ablesen. Die Figur 1 zeigt das Schema der Auswertung einer Fluoreszenzinduktionskurve, die mit diesem Fluorometer an einer Pflanze gemessen wurde. Der Pfeil in der Figur zeigt den Beginn der Belichtung; die Fluoreszenz steigt zuerst schnell, dann langsam auf ihren Maximalwert an. Der langsame Anteil wird als variable Fluoreszenz (AFVar) bezeichnet, und bei Inhibierung des photosynthetischen Elektronentransportes ändert sich diese. Die Größe von AFvar/AFvar (max) (siehe Fig. 1) gibt die Schädigung der Photosynthese an.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, eine Methode zur Auswertung sowie eine kompakte Apparatur zu bieten, die sowohl in der Forschung (im Labor bzw. Gewächshaus) als auch in der Überwachung schnelle und reproduzierbare, quantitative als auch. qualitative Ergebnisse über die Schadstoffwirkung liefern kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale des Anspruches 1 und 2 gelöst.
Die Merkmale der Ansprüche 3 bis 7 geben wesentliche Vorteile der Erfindung an.
Dabei bestehen diese Vorteile besonders darin, daß das auf die zu untersuchenden Proben (z.B. Blätter an intakten Pflanzen) durch die gemischte flexible Faseroptik fallende Anregungslicht gezielt lokalisiert angewendet werden kann (dies wird auch durch die Merkmale des Anspruches 6 vorgegeben) und die dadurch nur von dieser Stelle emittierte Fluoreszenzstrahlung durch das gleiche Ende der gemischten Faseroptik beobachtet wird.
Durch diese Meßanordnung ist es also möglich, die Penetrationsfähigkeit als auch den Abbau von Schadstoffen an lebenden Pflanzen sehr gut reproduzierbar zu untersuchen.
Dies kann durch zahlreich durchgeführte Versuchsreihen belegt werden.
Das Anregungslicht wird durch einen He-Ne-Laser (Lichtlegung 2-4 mW) bei einer Wellenlänge von A632.8 nm erzeugt. Die Vorteile dieser Lichtquelle gegenüber herkömmlichen Quellen sind folgende: a) Durch die hohe Monochromatisie werden keine weiteren Filter benötigt; b) Durch die hohe Lichtleistung und Stabilität kann somit auf ein aufwendiges stromstabilisiertes Netzgerät verzichtet werden; c) Die große Lebensdauer (>15000 Betriebsstunden) und die dabei als Langzeiteffekt geringfügige Abnahme der Leistung macht diese Lichtquelle gegenüber allen herkömmlichen weit überlegen.
d) Bei der vorgegebenen Wellenlänge von A632.8 nm befindet man sich schon in der Absorptionsbande des Chlorophylls; somit ist eine gute Effizienz für die Fluoreszenz gewährleistet.
Ein weiterer Vorteil der Apparatur in Hinsicht auf geringen Stromverbrauch und Gewicht ist durch die Verwendung einer Si-Photodiode mit integriertem Verstärker gegeben.
Die Vorteile dieser Diode gegenüber sonst wegen geringer Fluoreszenzlichtausbeute benutzten Sekundärelektronenvervielfacher sind erheblich. Einge Vorteile seien hier genannt: Weit geringere Kosten; gute Stabilität sowie Empfindlichkeit für den Spektralbereich >X690 nm, niedrige Spannungsversorgung (+15 Volt), keine Hysterese oder Memorie und die weitaus kleinere Größe.
ErfindungsgemäB ist in das kompakt gebaute Fluorometer ein modular aufgebautes Mikrocomputersystem integriert, das folgende Aufgaben übernimmt: - Führung des Dialogs mit dem Benutzer zur Wahl der Meßparameter; - Steuerung des Meßablaufes; - Digitalisierung und Speicherung der Fluoreszenzkurven; - Ausgabe der gespeicherten Fluoreszenzkurven auf einem x/y-Schreiber bei Bedarf; - Auswertung der Fluoreszenzkurven zur Ermittlung der Maßzahl für die Schädigung der Pflanze; - Meldung von eventuellen Fehlmessungen bzw. Bedienungsfehlern und Vorschlag von veränderten Meßparametern; - Durchführung von Selbsttests zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit der Gesamtapparatur.
Durch die angegebenen Funktionen ist ein benutzerfreundlicher und fehlertoleranter Betrieb des Fluorometers gegeben. Je nach der Art der durchzuführenden Meßaufgabe kann die erhaltene Maßzahl für den Schädigungsgrad der Pflanze allein verwendet oder auch eine separate Interpretation der Fluoreszenzkurven vorgenommen werden.
Wegen des modularen Aufbaues des integrierten Mikrocomputerteiles ist eine Erweiterung, speziell im Laborbetrieb, durch verschiedene. Optionen möglich, wie z.B. eine Erweiterung auf Diskettensystem oder aber der Anschluß an einen Großrechner.
Durch dieses Steuer,-Aufnahme- und Auswertesystem ist eine direkte und schnelle Beurteilung der Schadstoffwirkung 'in vivo' und 'in vitro' gewährleistet, ohne einen x/y-Schreiber oder Speicheroszillographen benutzen zu müssen und die für systematische Untersuchungen nötige graphische Auswertung anzuwenden.
In der oben erwähnten Meßanordnung der US-Patentschrift 4,084,905 wird als Lichtquelle eine lichtemittierende Diode (Nachteil: geringe Lichtleistung und geringe Stabilität) verwendet. Außerdem wird bei der oben genannten Erfindung kein Blatthalter mit der Möglichkeit der Dunkeladaption benutzt. Dies bedingt eine zusätzliche Schwankung der Meßergebnisse.
Unseres Erachtens erfüllt dieses Gerät folgende zwei wesentliche Merkmale nicht: a) Es kann nicht für systematische Routineuntersuchungen der Schadstoffeinwirkung auf Pflanzen eingesetzt werden und b) weiterhin erlaubt die Nichtreproduzierbarkeit der Parameter AFVar und AF var (max) keine systematische rechnerische Auswertung für die Schädigung der Photosynthesetätigkeit und damit die Angabe einer normierten Maßzahl, die bei uns erfindungsgemäß erzielt wird.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von einem Ausführungsbeispiel mittels der Figuren 1, 2 und 3 näher erläutert.
Die Figur 2 zeigt den gesamten Aufbau des Fluorometers.
Das vom He-Ne-Laser (1) (2-4 mW, A632.8 nm) erzeugte Anregungslicht wird durch ein Linsensystem (2) genau auf die Eintrittsfläche des einen Armes (4a) des Lichtleiters abgebildet, dabei befindet sich der elektronische Verschluß (3) genau vor der Eintrittsfläche des Lichtleiters. Der Verschluß und die Verschlußzeiten werden vom Rechner gesteuert. Das Anregungslicht gelangt dann durch den gemischten Teil des Lichtleiters (4b), z.B. durch den Deckel des Blatthalters (5) auf das zu untersuchende Blatt bzw.
mittels des Küvettenhalters (6) auf die Chloroplastensuspension. Hierbei ist der Blatthalter (5) so konstruiert, daß das Blatt für kurze Zeit (im allgemeinen ca. 5 Minuten) dunkeladaptiert werden kann, um das Elektronentransportsystem im oxidierten Zustand vorliegen zu haben. Dabei wird durch die vorgegebene Konstruktion der Blattstengel nicht beschädigt,und das Blatt kann für nachfolgende Untersuchungen weiter verwendet werden; eine Explosionszeichnung des Blatthalters (5) ist in Fig. 3 dargestellt.-Das dann nach öffnen des Verschlusses durch das Anregungslicht vom Chlorophyll erzeugte Fluoreszenzlicht gelangt durch den gemischten Teil der Faseroptik (4b) in den Arm (4c). Ein geeignetes Filtersystem (7) läßt nur noch Licht der Wellenlänge>X690 nm durch und schneidet somit das reflektierte Primärlicht ab. Das hinter den Filtern durchkommende Licht wird durch eine Linse auf die Fläche einer Si-Photodiode abgebildet und anhand des eingebauten Verstärkers verstärkt. Nach einer A/D-Wandlung übernimmt dann der Rechner die Auswertung der Fluoreszenzkurve (siehe Abb. 1) und die Speicherung der Daten.
Dabei wird durch eine Normierung anhand einer unbehandelten Pflanze die Maßzahl AFvar (max) festgelegt, und die Schädigung kann dann z.B. nach einer Herbizidbehandlung durch die Veränderung von AFVar festgestellt werden.
Mit dieser Apparatur kann somit nach Neuherstellung eines Herbizids (oder aber auch an verschiedenen Formulierungen) sehr schnell dessen Wirksamkeit 'in vitro' überprüft werden. Die Meßzeit incl. Auswertung beträgt dafür ca. 5 Sekunden. Wird dabei eine Wirksamkeit festgestellt, können die Tests an lebenden Pflanzen fortgeführt werden.
Unter Berücksichtigung von verschiedenen Konzentrationen kann die Penetrationsfähigkeit schon nach 5 - 10 Minuten untersucht werden und im Laufe der nächsten Tage weiter verfolgt werden.
Außerdem kann die Entgiftung nach Herbizideinwirkung bei einer Pflanzenart sehr gut nachgewiesen werden. Dies ist ein erheblicher Vorteil, da durch Screening im Gewächshaus (Beobachtungsdauer 2 - 3 Wochen) zwischen Nichtwirksamkeit (z.B. wegen schlechter Penetrationsfähigkeit) und Entgiftungsmechanismen nicht unterschieden werden kann.
Mit dem Fluorometer kann z.B. durch eine Versuchsreihe die Entgiftung der Zuckerrübe nach einer Behandlung mit verschiedenen selektiv wirkenden Herbiziden nach 3 - 6 Tagen eindeutig nachgewiesen werden.
Leerseite

Claims

Dr. Manfred Voß Dr. Peter Gräber Prof. Dr. Gernot Renger Rechnergesteuertes Fluorometer mit Auswerteeinheit zur Schadstoffdetektion an intakten Pflanzen und isolierten Chloroplasten Patentansprüche 9 Methode zum schnellen Erkennen von Schadstoffwirkungen (z.B. Herbizide, toxische Gase) sowie deren Penetrationsfähigkeit an intakten Pflanzen und Chlorophyllsuspensionen, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Probe mit einer Primär strahlung zur Fluoreszenz angeregt wird und daß diese Emissionsstrahlung in Abhängigkeit einer einstellbaren Zeitdauer gemessen und gespeichert wird, wobei durch Auswertung der Signalkurve anhand eines internen Rechners eine normierte Maßzahl angegeben werden kann, mit der der Grad der Schädigung sowie auch der zeitliche Verlauf der Schädigung nachgewiesen werden kann.
2. Eine kompakte Apparatur zur rechnergesteuerten fluorometrischen Auswertung von mit Schadstoffen behandelten Pflanzen bzw. Proben (Chloroplasten), gekennzeichnet durch eine Lichtquelle,für die die Fluoreszenzstrahlung erregende Primärstrahlung, optischen Elementen für die genaue Abbildung der Primärstrahlung auf die zu untersuchenden Proben, einem variablen Blatthalter für 'in vivo'-Untersuchungen und einem Küvettenhalter für 'in vitro'-Messungen sowie einer speziellen Meßküvette für toxische Gase; ein modular aufgebautes Mikrocomputersystem für die Steuerung und Auswertung, wobei das Licht der Primärstrahlung (1) durch ein Linsensystem (2) und den geöffneten Verschluß (3) auf die Eintrittsluke eines zweiarmigen gemischten Lichtleiters fällt (4a) und hiermit flexibel auf die zu untersuchende Probe gerichtet werden kann (5 bzw. 6), und das ausgesandte Fluoreszenzlicht des angeregten Chlorophylls über den anderen Arm des Lichtleiters (4c) auf ein Filtersystem (7) gelenkt wird, das die reflektierte Primärstrahlung abschneidet, und anschließend durch eine Abbildung genau auf die Fläche einer Photodiode (8) mit integriertem Verstärker fällt, danach wird das so erhaltene Signal durch einen Mikrocomputer (9) weiterverarbeitet.
3. Apparatur nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine streng monochromatische und hinreichend stabile wie auch leistungsstarke Lichtquelle (1) verwendet wird, die auch unabhängig von der Netzversorgung betrieben werden kann.
4. Apparatur nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein elektronisch gesteuerter Verschluß (3) eingesetzt wird, bei dem die öff- nungszeiten einstellbar sind, und die Anstiegszeit einen wohl definierten Wert besitzt.
5. Apparatur nach Anspruch 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß durch das gemeinsame Ende des gemischten Lichtleiters (4b) eine flexible Handhabung der Lichtquelle gegeben ist.
6. Apparatur nach Anspruch 2, 3, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß durch das dunkeladaptierbare Blatthaltersystem (5) reproduzierbare Untersuchungen an lebenden Pflanzen sowie mit dem Küvettenhalter (6) reproduzierbare Messungen an isolierten Chloroplasten in wässriger Lösung durchgeführt werden können.
7. Apparatur nach Anspruch 2, 3, 4, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß anhand einer speziellen Meßküvette die Wirkung von toxischen Gasen gemessen werden kann.
8. Apparatur nach den vorherigen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß anhand des modular aufgebauten Mikrocomputers (9) die Wahl der Meßparameter, die Steuerung des Meßablaufes, die Digitalisierüng-und Speicherung der verschiedenen Meßkurven sowie die Auswertung als auch die Ausgabe der gespeicherten Daten vorgenommen werden kann.