DE19906047C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Detektion biotischer Kontaminationen auf einer Oberfläche - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver­ fahren sowie auf eine Vorrichtung zur Detektion bio­ tischer Kontaminationen auf einer Oberfläche, insbesondere auf technischen Oberflächen. Derartige Verfahren werden im Bereich der Qualitätssicherung im Gesundheitswe­ sen, wie beispielsweise in Krankenhäusern, Arztpraxen und medizinischen Laboren sowie im Bereich der Phar­ mazie, Lebensmittelindustrie und Biotechnologie benö­ tigt. In diesen Bereichen ist die Überwachung der Reinheit der dort vorhandenen Oberflächen eine abso­ lute Notwendigkeit und wird häufig auch gesetzlich vorgeschrieben. Dies erfordert die gezielte Messung und Identifizierung von Kontaminationen biotischen Ursprungs.

Empfehlungen für die Reinheit von Oberflächen in die­ sen Bereichen sind beispielsweise durch die FDA (Food and Drug Administration), GMP (Good Manufacturing Practices) sowie durch die FIP gegeben, die eine ma­ ximal tolerierbare Anzahl an Oberflächenkeimen ange­ ben. Auch in Blatt 3 der VDI-Richtlinie 2083 wird die Überwachung der Keimzahl in regelmäßigen Abständen vorgeschrieben. Dabei werden die folgenden Grenzwerte für die maximal tolerierbare Keimzahl auf Oberflächen innerhalb von aseptischen Räumen empfohlen:

Tabelle 1

Nach dem Stand der Technik ist es möglich, die zu betrachtenden Kontaminanten auf einen geeigneten Pro­ benträger zu übertragen, der dann auf unterschiedliche Art und Weise ausgewertet werden kann. Die Auswertung erfolgt entweder durch Anzucht der übertragenen Mi­ kroorganismen auf Agarplatten unter für die gesuchten Mikroorganismen günstigen Bedingungen, so daß nach mehreren Tagen die koloniebildenden Einheiten (KBE) ausgezählt werden können. Andererseits ist es mög­ lich, die übertragenen Mikroorganismen auf dem Ob­ jektträger unter einem Mikroskop oder Fluoreszenzmi­ kroskop auszuzahlen. Nachteilig ist hier jedoch der große Zeitaufwand für das Auszahlen der Mikroorga­ nismen unter dem Mikroskop sowie, daß nicht immer eindeutig zwischen Kontamination biotischen und abio­ tischen Ursprungs unterschieden werden kann. Daher wurden Verbesserungen dieses Verfahrens entwickelt, bei denen die Zellen, d. h. die Kontaminationen bioti­ schen Ursprungs mittels eines Farbstoffes wie bei­ spielsweise Methylenblau eingefärbt und dadurch bes­ ser sichtbar gemacht werden.

Die US 5 474 910 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erfassung fluoreszierender biologi­ scher Moleküle und/oder Mikroorganismen, die derarti­ ge fluoreszierende biologische Moleküle enthalten, innerhalb eines vorgegebenen Bereiches oder Raumes. Hierzu wird dieser Bereich oder Raum mit Licht pas­ sender Wellenlänge bestrahlt, um die fluoreszierenden biologischen Moleküle anzuregen. Daraufhin wird das emittierte Fluoreszenzlicht bei einer entsprechenden geeigneten Wellenlänge erfaßt. Als zu untersuchende Bereiche werden dabei Schlachtfelder, Krankenhäuser, Operationssäle, Privathäuser, Schlachthäuser oder medizinische Büros angegeben.

Die DE 297 04 185 U1, die DE 195 41 686 A1 sowie die DE 42 00 741 A1 offenbaren Verfahren und Vorrichtun­ gen zum Erkennen von Karies, Plaque oder bakteriellem Befall an Zähnen. Hierzu wird ein Anregungslicht­ strahl auf einen zu untersuchenden Zahn gerichtet und dadurch eine Fluoreszenzstrahlung des Zahnes hervor­ gerufen. Diese Fluoreszenzstrahlung des Zahnes wird in einem geeigneten Wellenlängenbereich erfaßt. Da sich das Fluoreszenzspektrum von kariösem Zahnberei­ chen und von gesunden Zahnbereichen unterscheidet, kann so Karies, Plaque oder bakterieller Befall an Zähnen erkannt werden.

Die DE 41 20 688 A1 offenbart eine Meßvorrichtung zur quantitativen Erfassung eines fluoreszierenden Stof­ fes in menschlichem Hautgewebe. Hierzu wird das Haut­ gewebe mit Anregungslicht bestrahlt und die von dem Hautgewebe ausgesandte Fluoreszenzstrahlung erfaßt. Die lichtaussendenden Flächen der Anregungslicht- Beleuchtungseinrichtung und die lichtempfangenden Flächen der Fluoreszenzlicht-Empfangseinrichtung sind jeweils im senkrechten Abstand von der Hautkontakt­ fläche des Meßkopfes angeordnet, so daß eine homogene Beleuchtung der gesamten zu erfassenden Hautfläche sowie die Erfassung des Fluoreszenzlichtes auf der gesamten beleuchteten Hautfläche bewirkt wird.

Die DE 44 43 130 A1 offenbart ein Verfahren zur Über­ wachung von Versatz- und Verfüllmaterial. Hierzu wird in das Versatz- und Verfüllmaterial eine Sonde eingebracht, die das Versatz- oder Verfüllmaterial mit An­ regungslicht bestrahlt und die in Mikroorganismen an­ geregte und von diesen emittierte Fluoreszenzstrah­ lung erfaßt wird. Als erfaßte Fluoreszenz wird dabei die Fluoreszenz des NADH-Moleküls gemessen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Ver­ fahren und eine Vorrichtung zur Detektion biotischer Kontaminationen zur Verfügung zu stellen, mit dem ei­ ne Oberfläche unmittelbar direkt auf biotische Konta­ minationen untersucht werden kann.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach dem Ober­ begriff des Anspruchs 1, die Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 9 sowie deren Verwendung nach Anspruch 13 in Verbindung mit ihren jeweiligen kennzeichnenden Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Wei­ terbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden in den jeweili­ gen abhängigen Ansprüchen gegeben.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfin­ dungsgemäße Vorrichtung werden Fluoreszenzemissionen bestimmt, die spezifisch für biotische Kontaminatio­ nen sind. Aus dem Auftreten derartiger Fluoreszenz­ emission läßt sich daher unmittelbar auf das Vorhan­ densein einer biotischen Kontamination und auf den Grad der Kontamination schließen. Vorteilhaft ist da­ bei, daß eine Echtzeitmessung erfolgt, so daß die Re­ aktionszeiten für einen Eingriff in den Betrieb bei der Produktion oder Forschung durch die kurze Zeit zwischen Messung und Auswertung stark vermindert wird. Die erhaltenen Meßergebnisse weisen nur geringe Ungenauigkeiten auf und sind daher sehr gut reprodu­ zierbar. Diese direkte und zerstörungsfreie Methode bewirkt einen hohen Wirkungsgrad bei der Erfassung der biotischen Oberflächenkontaminationen ohne jegliche Probenverlu­ ste.

Dadurch, daß das Anregungslicht für die Fluoreszenz unter einem flachen Winkel nahezu streifend einge­ strahlt wird, wird die Genauigkeit des Signals durch mehr erfaßtes Fluoreszenzlicht erhöht. Insbesondere wird von der Oberfläche emittierte Fluoreszenzstrah­ lung weitgehend senkrecht zur Bestrahlungsrichtung erfaßt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem erfin­ dungsgemäßen Gerät ist es folglich möglich, sowohl lebende als auch tote biotische Kontaminationen zu erfassen.

Erfindungsgemäß wird gleichzeitig mit einem bekannten Streulichdetektor die Partikelzahl bestimmt, so daß sowohl eine Bestimmung der allgemeinen Partikelkonta­ mination der Oberfläche als auch eine Bestimmung der Kontamination rein biotischen Ursprungs möglich ist.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Detektion bioti­ scher Kontaminationen auf Oberflächen weist einen mo­ dularen, kompakten Geräteaufbau mit einer hohen Gerätesicherheit, geringen Anlagen-, Betriebs- und War­ tungskosten, einen hohen Automatisierungsgrad und ei­ ner besonders einfachen Handhabung auf. Dadurch kön­ nen auch weniger qualifizierte Mitarbeiter die Ober­ flächen auf biotische Kontaminationen untersuchen.

Weiterhin ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, die Überwachung einer Oberfläche auf bioti­ sche Kontaminationen zu automatisieren und dadurch ein kontinuierliches Monitoring der Oberfläche durch­ zuführen.

Besonders vorteilhaft kann die Fluoreszenz der in je­ der Zelle auftretenden Bestandteile NAD(P)H sowie Riboflavin zur Bestimmung der biotischen Kontamina­ tionen verwendet werden. Bei Bestrahlung mit Licht mit einer Wellenlänge zwischen 310 nm und 370 nm, idealerweise mit einer Mittenwellenlänge um etwa 340 nm, dem Absorptionsmaximum von NAD(P)H, wird Fluo­ reszenzlicht im Bereich von ca. 400 nm bis ca. 540 nm mit einem Maximum bei 470 nm emittiert. Bei Bestrah­ lung mit Licht einer Wellenlänge zwischen 400 nm und 480 nm, idealerweise um 440 nm, dem Absorptionsmaxi­ mum von Riboflavin, einem Bestandteil der Coenzyme FAD und FMN, wird von Riboflavin Fluoreszenzlicht im Bereich von ca. 480 nm bis ca. 580 nm mit einem Maxi­ mum bei ca. 520 nm emittiert. Beide Emissionsspektren sind fluoreszenztypisch weitgehend unabhängig von der Wellenlänge des anregenden Lichtes. Das Fluoreszenz­ spektrum wird jedoch von verschiedenen Parametern be­ einflußt, wie beispielsweise die Verbindung mit einem Enzym oder durch ein Lösungsmittel.

Im folgenden werden das Verfahren und die Vorrich­ tung mit Hilfe der Zeichnung beschrieben.

Es zeigen:

Fig. 1 die Bestimmung biotischer Kontaminationen auf einer Oberfläche und

Fig. 2 eine Vorrichtung.

Fig. 1 zeigt, wie mit dem Verfahren eine Oberfläche 1 auf Kontaminationen 2, 7 untersucht wird. Die Kontaminationen 2, 7 unterscheiden sich in abiotische Kontaminationen 7 wie beispielsweise Staub, Ruß, Mineralien, Rost, Kalk oder Salze sowie Kontaminationen 2 biotischen Ursprungs wie beispiels­ weise Mikroorganismen (Luftkeime, Pilze, Bakterien) und tote Mikroorganismen, Bruchstücke von Mikroorga­ nismen, Hautteile, Produktionsrückstande aus der Le­ bensmittelproduktion, Haare, Schweiß oder Hautfett.

Die Oberfläche 1 wird mit Licht 5 bestrahlt aus einer Strahlungsquelle 3. Die Einstrahlung erfolgt dabei flach und seitlich auf die Oberfläche. Eine Meßzelle 4 erfaßt längerwelliges Fluoreszenzlicht, das ledig­ lich von den Kontaminationen 2 biotischen Ursprungs emittiert wird. Dieses Fluoreszenzlicht 6 wird dabei weitgehend rechtwinklig zum eingestrahlten Licht 5 von einer Meßzelle 4 erfaßt, wodurch sich nur minima­ le Einflüsse des anregenden Lichtes 5 auf das Meßsignal der Meßzelle 4 ergeben.

Das Licht 5 weist dabei eine Wellenlänge von 340 nm auf, während die Meßzelle 4 lediglich Licht mit einer Wellenlänge oberhalb 400 nm detektiert. Beim Auftref­ fen auf die Kontamination 2 biotischen Ursprungs regt das Licht 5 die NADH- bzw. NAD(P)H-Moleküle in den Kontaminationen 2 biotischen Ursprungs an, so daß diese anschließend Fluoreszenzlicht bei ca. 470 nm ausenden. Dieses Fluoreszenzlicht 6 wird von der Meß­ zelle 4 detektiert. Die Kontamination 7 nichtbioti­ schen Ursprungs enthalten kein NADH bzw. NAD(P)H und fluoreszieren nicht.

Fig. 2 zeigt die Vorrichtung zur Detektion biotischer Kontaminationen auf einer Oberfläche 1. Bei dieser Oberfläche kann es sich um eine technische Oberfläche wie beispielsweise in Produktionsräumen, medizinisch genutzten Räumen, Laboren etc. handeln. Oberhalb der Oberfläche 1 ist eine Meßzelle 4 ange­ ordnet, wobei sich zwischen der Oberfläche 1 und der Meßzelle 4 eine Linse 8c sowie ein Farbfilter 9b be­ findet. Die Linse 8c fokusiert das von biotischen Kontaminationen 2 auf der Oberfläche 1 ausgehende Fluoreszenzlicht 6 auf die Meßzelle 4 zur Verstärkung des Meßsignals, während der Filter 9b ein Kantenfil­ ter ist, der lediglich Licht oberhalb einer Wellen­ länge von 400 nm durchläßt. Das Meßsignal aus der Meßzelle 4 wird von einem Analog-/Digitalwandler 11 in ein digitales Signal umgewandelt und anschließend von einer Auswerteeinheit 12 in ein Signal umgesetzt, das das Vorhandensein sowie das Ausmaß der Kontamination biotischen Ursprungs der Oberfläche 1 anzeigt.

Seitlich zu der Meßzelle 4, ist eine Lichtquelle 3 angeordnet, die über zwei Linsen 8a und 8b Anregungs­ licht 5 mit einer Wellenlänge von ca. 340 nm aussen­ det. Dieses Anregungslicht 5 durchläuft einen Farb­ filter 9a, das als Kantenfilter ausgebildet ist, wo­ bei das Farbfilter 9a lediglich Licht mit einer Wel­ lenlänge unterhalb von 400 nm durchläßt. Das so ge­ filterte Anregungslicht 5 wird über einen Spiegel 10 derart umgelenkt, daß es unter einem flachen Winkel nahezu streifend auf die Oberfläche 1 fällt. Auf der Oberfläche 1 regt es die Kontamination 2 biotischen Ursprungs an, das oben erwähnte Fluoreszenzlicht 6 auszusenden.

Durch diese Anordnung ist es möglich, möglichst unge­ stört von Anregungslicht 5 das Fluoreszenzlicht 6 zu erfassen. Durch die Kombination der Farbfilter 9a und 9b werden Anregungslicht 5 und Fluoreszenzlicht 6 zu­ sätzlich spektral getrennt, so daß das Signal-Rausch- Verhältnis des Signals der Meßzelle 11 stark verbes­ sert wird.

Claims (13)

1. Verfahren zur Detektion biotischer Kontaminatio­ nen auf einer Oberfläche (1), wobei
die Oberfläche (1) mit Licht (5) mit einer Wel­ lenlänge im unteren Bereich oder unterhalb des sichtbaren Spektrums bestrahlt wird und von der bestrahlten Oberfläche emittiertes Fluoreszenz­ licht (6) zumindest teilweise durch eine Meßzel­ le (4) erfaßt wird,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Bestrahlung (5) unter einem flachen Win­ kel nahezu streifend zur Oberfläche erfolgt, wo­ bei von der Oberfläche emittierte Fluoreszenz­ strahlung (6) weitgehend senkrecht zur Bestrah­ lungsrichtung durch die Meßzelle (4) erfaßt wird und
wobei gleichzeitig die Partikelzahl auf der Oberfläche mit einem Streulichtdetektor bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß auf das Vorhandensein einer biotischen Kontamination (2) geschlossen wird, wenn die Menge an erfaßtem Fluoreszenzlicht (6) einen be­ stimmten Wert überschreitet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß aus der Menge an erfaßtem Fluoreszenz­ licht (6) das Ausmaß der biotischen Kontaminati­ on (2) der Oberfläche (1) bestimmt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da­ durch gekennzeichnet, daß die Oberfläche (1) mit UV-Licht und/oder UV-nahem sichtbarem Licht (5) bestrahlt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich­ net, daß die Oberfläche (1) mit Licht einer Mit­ tenwellenlänge zwischen 310 nm und 370 nm oder einer Mittenwellenlänge zwischen 400 und 480 nm bestrahlt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da­ durch gekennzeichnet, daß das von der Oberfläche emittierte Fluoreszenzlicht (6) bei einer Wel­ lenlänge zwischen 400 und 540 nm und/oder 480 bis 580 nm erfaßt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da­ durch gekennzeichnet, daß das von der Oberfläche emittierte Fluoreszenzlicht (6) bei einer Wel­ lenlänge von 470 nm oder 520 nm erfaßt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da­ durch gekennzeichnet, daß das von der Oberfläche emittierte Fluoreszenzlicht (6) im Wellenlängen­ bereich des Fluoreszenzlichtes, das von NADH oder Riboflavin emittiert wird, erfaßt wird.

9. Vorrichtung zur Detektion biotischer Kontamina­ tion (2) auf einer Oberfläche (1) mit einer Lichtquelle (3), die Licht (5) mit einer Wellen­ länge im unteren Bereich oder unterhalb des sichtbaren Spektrums emittiert, einer Meßzelle (4) zur Erfassung von Licht (6) mit größerer Wellenlänge als das von der Lichtquelle emit­ tierte Licht (5) sowie einer Auswerteeinheit (12) zur Erzeugung eines Ausgangssignals auf der Grundlage des erfaßten Lichtes (6), dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Lichtquelle (3) so ange­ ordnet ist, daß der von ihr emittierte Licht­ strahl (5) unter einem flachen Winkel nahezu streifend auf die Oberfläche (1) auftritt, wobei von der Oberfläche emittierte Fluoreszenz­ strahlung (6) weitgehend senkrecht zur Bestrah­ lungsrichtung durch die Meßzelle (4) erfaßt wird und wobei ein Streulichtdetektor zur Bestimmung der Partikelzahl auf der Oberfläche (1) vorhan­ den ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Meßzelle (4) einen optischen Filter (9b) aufweist, der nur für Licht (6) ei­ ner Wellenlänge größer als die Wellenlänge des von der Lichtquelle (3) emittierten Lichtes (5) durchlässig ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Licht­ quelle (3) und der Oberfläche (1) und/oder der Oberfläche (1) und der Meßzelle (4) optische Bauelemente (8a, 8b, 9a, 10, 8c, 9b) zum Sam­ meln, Umlenken und/oder Filtern des von der Lichtquelle (3) emittierten Lichtes (5) bzw. des von der Oberfläche (1) ausgesandten Fluoreszenz­ lichtes (6) angeordnet sind.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Meßzelle (4) erzeugte Signal mittels eines Analog/Digi­ tal-Wandlers (11) in ein digitales Signal gewan­ delt und anschließend in die Auswerteeinheit (12) eingegeben wird.

13. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der An­ sprüche 9 bis 12 zur Detektion biotischer Kon­ taminationen (2) auf technischen Oberflächen (1) in Produktionsräumen, medizinisch genutzten Räu­ men oder Laborräumen.