DE102005021205B4

DE102005021205B4 - Verfahren und Anordnung zur lokalen Erfassung der Vitalität von lebenden Zellen in Zellkulturen oder im Gewebe

Info

Publication number: DE102005021205B4
Application number: DE200510021205
Authority: DE
Inventors: Werner Dr.-Ing. Schramm; Bernd Dr. Lecher; Simone Maurer
Original assignee: Mfd Diagnostics GmbH
Current assignee: Mfd Diagnostics GmbH
Priority date: 2005-05-07
Filing date: 2005-05-07
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2025-05-08
Also published as: DE102005021205A1

Abstract

Verfahren zur lokalen Erfassung der Vitalität von lebenden Zellen in Zellkulturen oder im Gewebe mittels NADH-Fluoreszenzspektroskopie,
dadurch gekennzeichnet, dass ein spezieller optischer Messkopf für die Aufnahme von optischen Signalen zur Bestimmung der Vitalität auf eine die Zellkultur tragende Glasplatte oder nicht invasiv auf eine Gewebeoberfläche aufgesetzt wird, mit folgenden Verfahrensschritten
• die zu untersuchenden Zellen werden mit kurzen periodisch erzeugten Lichtimpulsen im nahen UV beleuchtet, das infolge der Impulsbelichtung vom Gewebe remittierte Licht wird spektral aufgelöst über empfindliche Photoempfänger registriert;
• intermittierend zwischen den Lichtimpulsen werden die Zellen mit Rotlicht bestrahlt und
• das aus dem Gewebe zurückgestreute Rotlicht wird gleichfalls über Photoempfänger registriert;
• die von den Photoempfängern abgegebenen elektronischen Signale werden kanalweise verstärkt, über A/D-Wandler in digitale Signale umgesetzt und gespeichert;
• die gespeicherten Signale der einzelnen Kanäle werden rechentechnisch korreliert, um Beeinträchtigungen des Signalpegels durch gewebebedingte Streueinflüsse und Durchblutungsänderungen zu korrigieren;...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur zeitabhängigen Erfassung der Vitalität von lebenden Zellen in Zellkulturen oder im Gewebe.
Sie ist für die Beurteilung des Energiestoffwechselzustandes von einzelnen Zellgruppen in Zellkulturen oder in biologischem Gewebe, insbesondere zur Erkennung zeitlicher pathologischer Veränderungen der Zellvitalität an bestimmten Stellen anwendbar.

Anordnungen zur Erfassung der Spektraldaten von lebendem Gewebe, vornehmlich für die Feststellung örtlicher pathologischer Veränderungen, wie zum Beispiel beim Tumor sind aus den letzten Jahren bekannt.

In WO 021057757 A2 wird z.B. ein System zur Ermittlung von Gewebekenngrößen mittels Fluoreszenz-, Reflexions- und Lichtstreuungsspektroskopie vorgeschlagen. Hierbei wird eine auch in Endoskope einführbare Lichtleitfaseranordnung verwendet mit einer Belichtungsfaser in der Mitte und 6 Empfangsfasern, die um diese herum angeordnet sind. Die örtliche Verteilung der NADH-Fluoreszenz über ein bestimmtes Gewebeareal wird zwar spektroskopisch mit erfasst, jedoch nicht die zeitliche Änderung dieser Fluoreszenz an einzelnen Stellen der Oberfläche als Maß für den lokalen Energiestoffwechsel gemessen und explizit ausgewertet.

In EP 1 340 452 wird ein optisches Analysensystem für lebendes Gewebe beschrieben, bei dem eine Messsonde aus Lichtleitfasern verwendet wird, bei der für die Untersuchung von flächenhaften Arealen mehrere Anregungsfasern (FEi) mit Empfangsfasern (FRi) gemischt in einem Kreisquerschnitt angeordnet sind.

Für eine lokal und zeitlich aufgelöste Vitalitätsuntersuchung ist diese Anordnung jedoch nicht geeignet, wenn eine punktförmige Betrachtung kleiner Zellareale oder von Einzelzellen notwendig ist.

Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren und eine Anordnung zu schaffen, die es gestattet, punktweise an Zellkulturen oder Gewebeoberflächen die Vitalität einzelner Zellen, dargestellt als rechnerkorrigierter zeitlicher Verlauf der gemessenen NADH-Fluoreszenz zu erfassen.

Die Aufgabe wird mit der Anordnung gemäß Patentanspruch 2 und 3 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand weiterer Unteransprüche.

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen erläutert:
Dabei zeigt
1 eine schematische Darstellung der Messanordnung zur Erfassung der Vitalität von Zellen
2 die Darstellung einer Variante des Lichtleitfasermesskopfes in 2 Ebenen
3 eine andere Variante der Anordnung von Lichtleitfaserbündeln in einem Messkopf
Für die Durchführung der Vitalitätsmessungen wird eine Anordnung verwendet, wie sie in 1 skizziert ist. Auf das Messobjekt 1, das eine Gewebeoberfläche 1a oder das optische Fenster 1b einer Zellkulturkammer sein kann, an dem unterseitig die Zellen 3 einer Zellkultur aufsitzen, wird eine Lichtleitfasermesssonde 4 aufgesetzt, wie sie in 2 im Schnitt oder in 3 dargestellt und näher beschrieben wird.
Durch das in der Lichtleitfasersonde 4 zentral angeordnete Beleuchtungsfaserbündel 16 wird das Messobjekt 1 zunächst mit Lichtimpulsen im nahen UV (nahe 340 nm), wie z.B. mit den Impulsen eines Stickstofflasers (bei 337 nm) belichtet, wobei sowohl die Remission dieses Lichtes von der Gewebeoberfläche 1a oder vom optischen Fenster 1b der Zellkulturkammer 2 als auch die in den Zellen durch die UV-Einstrahlung angeregte NADH-Fluoreszenz zur Ermittlung der Vitalität der betrachteten Zellen gemessen werden. Zeitlich versetzt werden die genannten Flächen 1a und 1b mit rotem Licht bestrahlt, um die Streuung des roten Lichtes im Messobjekt 1 als Maß für dessen Homogenität zu erfassen, was besonders bei Messungen am lebenden Gewebe für die Vitalitätsauswertung wichtig ist.
Die Messsonde 4 ist durch ein Lichtleitfaserkabel 5, in dem das Beleuchtungsfaserbündel über eine lösbare Trennstelle 6 mit einem Gerätemodul 7 verbunden, der die Lichtquellen 8 mit vorgesetzten Einkopplungsoptiken 9, die Photoempfänger 10 mit davor angeordneten Filterbausteinen 11, die elektronischen Verstärker 12, die den Verstärkerkanälen zugeordneten Analog/Digital-Wandler 13, einen Mikrocomputer 14 und ggf. einen Monitor 15 beinhaltet. Letzterer kann auch getrennt in einem eigenen Gehäuse angeordnet sein.
Die Lichtquellen 8 für die Beleuchtung des Messobjektes 1 können entweder Impulslichtquellen, wie z.B. mit 8a angedeutet, oder kontinuierliche Strahlquellen, wie z.B. 8b, geeigneter Wellenlänge sein. Für die Fluoreszenzanregung des für den Energiestoffwechsel der Zellen relevanten Coenzyms NADH (Nikatinamid-Adenin-Dinukleotid) ist eine Wellenlänge um 340 nm zweckmäßig, da hier das Absorptionsmaximum des genannten Coenzyms liegt. Diese Wellenlänge wird wie oben beschrieben zugleich verwendet, um über die Lichtleitfasermesssonde 4 das Remissions- und Absorptionsverhalten des Messobjekts 1 zu ermitteln. Zur Messung des Streuverhaltens der Messprobe 1 wird Licht aus dem Spektralbereich von 630 nm bis 780 nm verwendet.
Die Charakteristiken der Filterbausteine sind für die einzelnen Kanäle entsprechend ihrer Aufgabenstellung unterschiedlich ausgelegt. Zur Messung der Fluoreszenzwellenlänge von NADH besitzt der zugeordnete Filterbaustein 11 eine Durchlass-Charakteristik für den Bereich von 450 bis 480 nm, für die Erfassung der Remission, unter der die Reflexion von der Oberfläche 1a bzw. 1b und aus dem Inneren des Messobjektes 1 begrifflich zusammengefasst wird, liegt der Durchlassbereich der Filteranordnung 11 zwischen 320 und 420 nm und der für für die Messung der Streuung zwischen 630 und 780 nm.
2 zeigt den erfindungsgemäßen Aufbau einer zylinderförmigen Lichtleitfasermeßsonde 4, die vorzugsweise mit einem metallischen Mantel 1c umgeben ist, in Querschnitt (2a) und Längsschnitt (2b). Dabei ist in der Mitte die Beleuchtungsfaser bzw. das Beleuchtungsfaserbündel 16, im umgebenden ringförmigen Bereich sind in gemischter Verteilung die Lichtleitfasern 17 zur Erfassung der Fluoreszenz die Lichtleitfasern 18 zur Messung der Remission aus der Oberfläche des Messobjekts 1 und im äußeren Ringbereich die Lichtleitfasern 19 zur Messung der Lichtstreuung angeordnet. Der Bereich 20 gewährleistet einen deutlichen Abstand der Remissionsfasern 18 und Fluoreszenzfasern 17 von den Lichtleitfasern 19 zur Erfassung der Streuung und liegt je nach Durchmesser des Beleuchtungsfaserbündels 16 zwischen 0,3 mm und 1 mm.
Die Stirnseite 21 der Lichtleitfasermesssonde 4 ist im wesentlichen eben mit Ausnahme des Bereiches der Beleuchtungsfaser 16, wo eine fokussierende Wirkung durch eine angearbeitete oder vorgesetzte Linse 22 vorteilhaft ist.
Zur Beurteilung der Homogenität des Messobjektes 1 kann es von Vorteil sein, wenn, wie in 3 skizziert ist, die Gewebestreuung in vier an der Peripherie der Sonde angeordneten Bereichen von Lichtleitfasern 19a bis 19d gemessen wird, wobei z.B. ein Bereich pro Quadrant vorgesehen ist, und anschließend ein Vergleich der Streuwerte vorgenommen wird.

1: Meßobjekt
1a: Gewebeoberfläche
1b: Optisches Fenster
1c: Mantel der Meßsonde
2: Zellkulturkammer
3: Lebende Zellen in der Zellkulturkammer
4: Lichtleitfasermeßsonde
5: Lichtleitfaserkabel
6: Lösbare Trennstelle
7: Gerätemodul
8: Lichtquelle
8a: Impulslichtquelle
8b: Kontinuierlich strahlende Lichtquelle
9: Einkoppeloptiken
10: Photoempfänger
11: Optische Filterbausteine
12: Elektronische Verstärker
13: Analog/Digital-Wandler
14: Mikrocomputer
15: Monitor
16: Beleuchtungsfaserbündel
17: Lichtleitfasern für die Fluoreszenzmessung
18: Lichtleitfasern für die Remissionsmessung
19: Lichtleitfasern für die Messung der Streuung
20: Abstandsbereich
21: Stirnseite der Messsonde 4
22: Linse

Claims

Verfahren zur lokalen Erfassung der Vitalität von lebenden Zellen in Zellkulturen oder im Gewebe mittels NADH-Fluoreszenzspektroskopie, dadurch gekennzeichnet, dass ein spezieller optischer Messkopf für die Aufnahme von optischen Signalen zur Bestimmung der Vitalität auf eine die Zellkultur tragende Glasplatte oder nicht invasiv auf eine Gewebeoberfläche aufgesetzt wird, mit folgenden Verfahrensschritten • die zu untersuchenden Zellen werden mit kurzen periodisch erzeugten Lichtimpulsen im nahen UV beleuchtet, das infolge der Impulsbelichtung vom Gewebe remittierte Licht wird spektral aufgelöst über empfindliche Photoempfänger registriert; • intermittierend zwischen den Lichtimpulsen werden die Zellen mit Rotlicht bestrahlt und • das aus dem Gewebe zurückgestreute Rotlicht wird gleichfalls über Photoempfänger registriert; • die von den Photoempfängern abgegebenen elektronischen Signale werden kanalweise verstärkt, über A/D-Wandler in digitale Signale umgesetzt und gespeichert; • die gespeicherten Signale der einzelnen Kanäle werden rechentechnisch korreliert, um Beeinträchtigungen des Signalpegels durch gewebebedingte Streueinflüsse und Durchblutungsänderungen zu korrigieren; • das korrigierte NADH-Signal wird als Maß für die Vitalität der Zellen auf einem Monitor als Funktion der Zeit dargestellt wobei NADH-Fluoreszenz, Remission und Streuung erfasst werden.
Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, wobei der Messkopf (1) aus Lichtleitfaserkanälen gebildet wird, die von einem gemeinsamen Mantel (1c) umschlossen sind und je nach Funktion Licht zu den lebenden Zellen oder von den lebenden Zellen zu den Photoempfängern transportieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleitfasern bzw. Lichtleitfaserbündel funktionsgemäß so angeordnet sind, dass im Zentrum des Messkopfes (1) das Lichtleitfaserbündel (16) für die Beleuchtung der Zellen, konzentrisch dazu die Lichtleitfasern (17) für den Empfang des Fluoreszenzlichtes sowie die Lichtleitfasern (18) für die Erfassung der Remission und in bestimmtem Abstand weiter außen die Lichtleitfasern (19) für die Messung der Streuung liegen und dieser Messkopf (1) das distale Ende eines Lichtleitfaserkabels (5) darstellt, welches am proximalen Ende über eine lösbare Trennstelle (6) mit einem Gerätemodul (7) verbunden ist, in welchem die Lichtquellen (8) für die Beleuchtung des Meßobjekts (1) mit den Einkoppeloptiken (9) in die optischen Fasern, die Photoempfänger (10) mit vorgeschalteten optischen Filtern (11) für die Aufnahme der Photosignale, die elektronischen Verstärker (12), die A/D-Wandler (13) für die einzelnen Meßkanäle sowie ein Mikrocomputer (14) für die Steuerung der Signalabläufe und die Auswertung der Signale untergebracht sind, an den weiterhin ein Monitor (15) für die Darstellung der Signalverläufe angeschlossen ist.
Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleitfasermesssonde (1) die vorzugsweise von einem Metallmantel umschlossen wird, zentral ein Beleuchtungsfaserbündel (16) aufweist, das unmittelbar konzentrisch von einem Gemisch aus Lichtleitfasern für die Fluoreszenzmessung (17) und Lichtleitfasern für die Remissionsmessung (18) umschlossen wird, wobei die Durchmesser der jewweiligen Lichtleitfasern unterschiedlich sein können, während in deutlichem Abstand davon die Lichtleitfasern für die Messung der Streuung entweder konzentrisch oder punktförmig angeordnet sind.
Anordnung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Lichtleitfaserkanal mindestens aus einer Lichtleitfaser besteht.
Anordnung nach Anspruch 2, 3 oder 4 dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Filter jeweils ein Bandpassfilter oder ein Kantenfilter oder eine Kombination von beiden sind oder die Filterfunktion durch entsprechend gewähltes Lichtleitfasermaterial von den Lichtleitfasern selbst realisiert wird.
Anordnung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche Messabläufe von einem Programmspeicher des Mikrocomputers abrufbar sind.
Anordnung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsfaserbündel (16) oder eine Beleuchtungsfaser mit einer angearbeiteten oder vorgesetzten Linse (22) ausgestattet ist.