DE19906047A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Detektion biotischer Kontaminationen auf Oberflächen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion biotischer Kontaminationen auf einer Oberfläche. Die Oberfläche wird mit Licht mit einer Wellenlänge im unteren Bereich oder unterhalb des sichtbaren Spektrums bestrahlt und wird von der bestrahlten Oberfläche emittiertes Fluoreszenzlicht zumindest teilweise erfaßt.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver­ fahren sowie auf eine Vorrichtung zur Detektion bio­ tischer Kontaminationen auf Oberflächen, insbesondere technischen Oberflächen. Derartige Verfahren werden im Bereich der Qualitätssicherung im Gesundheitswe­ sen, wie beispielsweise in Krankenhäusern, Arztpraxen und medizinischen Laboren sowie im Bereich der Phar­ mazie, Lebensmittelindustrie und Biotechnologie benö­ tigt. In diesen Bereichen ist die Überwachung der Reinheit der dort vorhandenen Oberflächen eine abso­ lute Notwendigkeit und wird häufig auch gesetzlich vorgeschrieben. Dies erfordert die gezielte Messung und Identifizierung von Kontaminationen biotischen Ursprungs.

Empfehlungen für die Reinheit von Oberflächen in die­ sen Bereichen sind beispielsweise durch die FDA (Food and Drug Administration), GMP (Good Manufacturing Practices) sowie durch die FIP gegeben, die eine ma­ ximal tolerierbare Anzahl an Oberflächenkeimen ange­ ben. Auch in Blatt 3 der VDI-Richtlinie 2083 wird die Überwachung der Keimzahl in regelmäßigen Abständen vorgeschrieben. Dabei werden die folgenden Grenzwerte für die maximal tolerierbare Keimzahl auf Oberflächen innerhalb von aseptischen Räumen empfohlen:

Tabelle 1

Nach dem Stand der Technik werden bei den bislang verfügbaren Nachweisverfahren die zu betrachtenden Kontaminanten grundsätzlich auf einen geeigneten Pro­ benträger übertragen, der dann auf unterschiedliche Art und Weise ausgewertet werden kann. Die Auswertung erfolgt entweder durch Anzucht der übertragenen Mi­ kroorganismen auf Agarplatten unter für die gesuchten Mikroorganismen günstigen Bedingungen, so daß nach mehreren Tagen die koloniebildenden Einheiten (KBE) ausgezählt werden können. Andererseits ist es mög­ lich, die übertragenen Mikroorganismen auf dem Ob­ jektträger unter einem Mikroskop oder Fluoreszenzmi­ kroskop auszuzählen. Nachteilig ist hier jedoch der große Zeitaufwand für das Auszählen der Mikroorganis­ men unter dem Mikroskop sowie, daß nicht immer ein­ deutig zwischen Kontamination biotischen und abloti­ schen Ursprungs unterschieden werden kann. Daher wur­ den Verbesserungen dieses Verfahrens entwickelt, bei denen die Zellen, d. h. die Kontaminationen biotischen Ursprungs mittels eines Farbstoffes wie bei­ spielsweise Methylenblau eingefärbt und dadurch bes­ ser sichtbar gemacht werden.

Diese oben aufgeführten Verfahren sind sämtlich indi­ rekte Nachweisverfahren. Keines der Verfahren ermög­ licht einen Echtzeitnachweis der Kontaminationen. Insbesondere setzt das Verfahren, bei dem die Mi­ kroorganismen angezogen und bebrütet werden, lebende Mikroorganismen voraus. Tote Mikroorganismen oder Zellfragmente von Mikroorganismen können durch dieses Verfahren nicht nachgewiesen werden. Lediglich Pyro­ gene, Zellwandbestandteile gramnegativer Bakterien, können mit einem Koagulationstest nachgewiesen wer­ den. Der wichtigste Nachteil der derzeit zur Verfü­ gung stehenden Meßverfahren besteht darin, daß die Auswertung erst nach einer zeitaufwendigen mikro­ skopischen Untersuchung oder einer längeren Bebrü­ tungszeit der Kulturen von drei bis sieben Tagen er­ folgen kann, so daß kein Echtzeit-Meßverfahren vor­ liegt. In allen Fällen sind aufwendige Probenahmevor­ bereitungen erforderlich, so daß die Messungen hoch­ qualifiziertes Personal und äußerst sorgfältiges Vor­ gehen erfordern. Dies verhindert auch eine weitge­ hende Automatisierbarkeit der Messungen ebenso wie die Tatsache, daß für die jeweiligen Messungen die Geräte zusätzlich kalibriert und qualifiziert werden müssen, was mit einem erhöhten Arbeitszeitaufwand einhergeht. Da die oben beschriebenen Messungen die Oberflächen nicht direkt und störungsfrei auf bioti­ sche Kontaminationen untersuchen, ist durch die zeit­ liche Verschiebung meist auch ein direktes Zurückver­ folgen der möglichen Ursachen für die Kontamination nicht mehr exakt möglich. Die in der Zwischenzeit produzierten und kontaminierten Produkte müssen im ungünstigsten Fall komplett entsorgt werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es folglich, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektion bio­ tischer Kontaminationen zur Verfügung zu stellen, mit dem eine Oberfläche unmittelbar direkt auf biotische Kontaminationen untersucht werden kann.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach dem Ober­ begriff des Anspruchs 1, die Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 9 sowie deren Verwendungen nach Anspruch 15 in Verbindung mit ihren jeweiligen kennzeichnenden Merkmalen gelöst.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfin­ dungsgemäße Vorrichtung werden Fluoreszenzemissionen bestimmt, die spezifisch für biotische Kontaminatio­ nen sind. Aus dem Auftreten derartiger Fluoreszenz­ emission läßt sich daher unmittelbar auf das Vorhan­ densein einer biotischen Kontamination und auf den Grad der Kontamination schließen. Vorteilhaft ist dabei, daß eine Echtzeitmessung erfolgt, so daß die Reaktionszeiten für einen Eingriff in den Betrieb bei der Produktion oder Forschung durch die kurze Zeit zwischen Messung und Auswertung stark vermindert wird. Die erhaltenen Meßergebnisse weisen nur geringe Ungenauigkeiten auf und sind daher sehr gut reprodu­ zierbar. Die Unwägbarkeiten, die durch das Sammeln der Kontaminationen auf Probenträgern nach dem Stand der Technik entstehen, fallen vollständig weg. Diese direkte und zerstörungsfreie Methode bewirkt einen hohen Wirkungsgrad bei der Erfassung der biotischen Oberflächenkontaminationen ohne jegliche Probenverlu­ ste.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Detektion bioti­ scher Kontaminationen auf Oberflächen weist einen modularen, kompakten Geräteaufbau mit einer hohen Gerätesicherheit, geringen Anlagen-, Betriebs- und Wartungskosten, einen hohen Automatisierungsgrad und einer besonders einfachen Handhabung auf. Dadurch können auch weniger qualifizierte Mitarbeiter die Oberflächen auf biotische Kontaminationen untersu­ chen.

Insbesondere ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfah­ ren und dem erfindungsgemäßen Gerät möglich, sowohl lebende als auch tote biotische Kontaminationen zu erfassen.

Weiterhin ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, die Überwachung einer Oberfläche auf bioti­ sche Kontaminationen zu automatisieren und dadurch ein kontinuierliches Monitoring der Oberfläche durch­ zuführen.

Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden in den abhängigen Ansprüchen gegeben.

Wird das Gerät gleichzeitig mit einem bekannten Streulichdetektor zur Bestimmung der Partikelzahl kombiniert, so ist sowohl eine Bestimmung der allge­ meinen Partikelkontamination der Oberfläche als auch eine Bestimmung der Kontamination rein biotischen Ursprungs möglich.

Besonders vorteilhaft kann die Fluoreszenz der in jeder Zelle auftretenden Bestandteile NAD(P)H sowie Riboflavin zur Bestimmung der biotischen Kontamina­ tionen verwendet werden. Bei Bestrahlung mit Licht mit einer Wellenlänge zwischen 310 nm und 370 nm, idealerweise mit einer Mittenwellenlänge um etwa 340 nm, dem Absorptionsmaximum von NAD(P)H, wird Fluores­ zenzlicht im Bereich von ca. 400 nm bis ca. 540 nm mit einem Maximum bei 470 nm emittiert. Bei Bestrah­ lung mit Licht einer Wellenlänge zwischen 400 nm und 480 nm, idealerweise um 440 nm, dem Absorptionsmaxi­ mum von Riboflavin, einem Bestandteil der Coenzyme FAD und FMN, wird von Riboflavin Fluoreszenzlicht im Bereich von ca. 480 nm bis ca. 580 nm mit einem Maxi­ mum bei ca. 520 nm emittiert. Beide Emissionsspektren sind fluoreszenztypisch weitgehend unabhängig von der Wellenlänge des anregenden Lichtes. Das Fluoreszenz­ spektrum wird jedoch von verschiedenen Parametern beeinflußt, wie beispielsweise die Verbindung mit einem Enzym oder durch ein Lösungsmittel.

Im folgenden werden einige Beispiele des erfindungs­ gemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrich­ tung beschrieben werden.

Es zeigen

Fig. 1 die Bestimmung biotischer Kontaminationen auf einer Oberfläche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und

Fig. 2 eine erfindungsgemäße Vorrichtung.

Fig. 1 zeigt, wie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Oberfläche 1 auf Kontaminationen 2, 7 untersucht wird. Die Kontaminationen 2, 7 unterscheiden sich in abiotische Kontaminationen 7 wie beispielsweise Staub, Ruß, Mineralien, Rost, Kalk oder Salze sowie Kontaminationen 2 biotischen Ursprungs wie beispiels­ weise Mikroorganismen (Luftkeime, Pilze, Bakterien) und tote Mikroorganismen, Bruchstücke von Mikroorga­ nismen, Hautteile, Produktionsrückstände aus der Le­ bensmittelproduktion, Haare, Schweiß oder Hautfett.

Die Oberfläche 1 wird mit Licht 5 bestrahlt aus einer Strahlungsquelle 3. Die Einstrahlung erfolgt dabei flach und seitlich auf die Oberfläche. Eine Meßzelle 4 erfaßt längerwelliges Fluoreszenzlicht, das ledig­ lich von den Kontaminationen 2 biotischen Ursprungs emittiert wird. Dieses Fluoreszenzlicht 6 wird dabei weitgehend rechtwinklig zum eingestrahlten Licht 5 von einer Meßzelle 4 erfaßt, wodurch sich nur minima­ le Einflüsse des anregenden Lichtes 5 auf das Meßsi­ gnal der Meßzelle 4 ergeben.

Das Licht 5 weist dabei eine Wellenlänge von 340 nm auf, während die Meßzelle 4 lediglich Licht mit einer Wellenlänge oberhalb 400 nm detektiert. Beim Auftref­ fen auf die Kontamination 2 biotischen Ursprungs regt das Licht 5 die NADH bzw. NAD(P)H-Moleküle in den Kontaminationen 2 biotischen Ursprungs an, so daß diese anschließend Fluoreszenzlicht bei ca. 470 nm aussenden. Dieses Fluoreszenzlicht 6 wird von der Meßzelle 4 detektiert. Die Kontamination 7 nichtbio­ tischen Ursprungs enthalten kein NADH bzw. NAD(P)H und fluoreszieren nicht.

Fig. 2 zeigt eine weitere Vorrichtung zur Detektion biotischer Kontaminationen auf einer Oberfläche 1. Bei dieser Oberfläche kann es sich um eine technische Oberfläche wie beispielsweise in Produktionsräumen, medizinisch genutzten Räumen, Labors etc. handeln. Oberhalb der Oberfläche 1 ist eine Meßzelle 4 ange­ ordnet, wobei sich zwischen der Oberfläche 1 und der Meßzelle 4 eine Linse 8c sowie ein Farbfilter 9b be­ findet. Die Linse 8c fokussiert das von biotischen Kontaminationen 2 auf der Oberfläche 1 ausgehende Fluoreszenzlicht 6 auf die Meßzelle 4 zur Verstärkung des Meßsignals, während der Filter 9b ein Kantenfil­ ter ist, der lediglich Licht oberhalb einer Wellen­ länge von 400 nm durchläßt. Das Meßsignal aus der Meßzelle 4 wird von einem Analog-/Digitalwandler 11 in ein digitales Signal umgewandelt und anschließend von einer Auswerteeinheit 12 in ein Signal umgesetzt, das das Vorhandensein sowie das Ausmaß der Kontamina­ tion biotischen Ursprungs der Oberfläche 1 anzeigt.

Seitlich zu der Meßzelle 4, ist eine Lichtquelle 3 angeordnet, die über zwei Linsen 8a und 8b Anregungs­ licht 5 mit einer Wellenlänge von ca. 340 nm aussen­ det. Dieses Anregungslicht 5 durchläuft einen Farb­ filter 9a, das als Kantenfilter ausgebildet ist, wo­ bei das Farbfilter 9a lediglich Licht mit einer Wel­ lenlänge unterhalb von 400 nm durchläßt. Das so ge­ filterte Anregungslicht 5 wird über einen Spiegel 10 derart umgelenkt, daß es unter einem flachen Winkel nahezu streifend auf die Oberfläche 1 fällt. Auf der Oberfläche 1 regt es die Kontamination 2 biotischen Ursprungs an, das oben erwähnte Fluoreszenzlicht 6 auszusenden.

Durch diese Anordnung ist es möglich, möglichst unge­ stört von Anregungslicht 5 das Fluoreszenzlicht 6 zu erfassen. Durch die Kombination der Farbfilter 9a und 9b werden Anregungslicht 5 und Fluoreszenzlicht 6 zu­ sätzlich spektral getrennt, so daß das Signal-Rausch- Verhältnis des Signals der Meßzelle 11 stark verbes­ sert wird.

Claims (17)

1. Verfahren zur Detektion biotischer Kontaminatio­ nen auf einer Oberfläche (1), dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche (1) mit Licht (5) mit einer Wellenlänge im unteren Bereich oder unterhalb des sichtbaren Spektrums bestrahlt wird und von der bestrahlten Oberfläche emittierte Fluores­ zenzlicht (6) zumindest teilweise erfaßt wird.

2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da­ durch gekennzeichnet, daß auf das Vorhandensein einer biotischen Kontamination (2) geschlossen wird, wenn die Menge an erfaßtem Fluoreszenz­ licht (6) einen bestimmten Wert überschreitet.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Menge an erfaßtem Fluoreszenzlicht (6) das Ausmaß der biotischen Kontamination (2) der Oberfläche (1) bestimmt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche (1) mit UV-Licht und/oder UV-nahem sichtbarem Licht (5) bestrahlt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche (1) mit Licht einer Mittenwellenlänge zwischen 310 nm und 370 nm oder einer Mittenwellenlänge zwischen 400 und 480 nm bestrahlt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Oberfläche emittierte Fluoreszenzlicht (6) im Wellenlängenbereich des Fluoreszenzlichtes, das von NADH oder Riboflavin emittiert wird, erfaßt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Oberfläche emittierte Fluoreszenzlicht (6) bei einer Wellenlänge zwischen 400 und 540 nm und/­ oder 480-580 nm erfaßt wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Oberfläche emittierte Fluoreszenzlicht (6) bei einer Wellenlänge von 470 nm oder 520 nm erfaßt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung (5) unter einem flachen Winkel zur Oberfläche erfolgt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die von der Oberfläche emittierte Fluoreszenzstrahlung (6) senkrecht zur bestrahlten Oberfläche (1) und/­ oder senkrecht zur Bestrahlungsrichtung erfaßt wird.

11. Vorrichtung zur Detektion biotischer Kontamina­ tion (2) auf einer Oberfläche (1) mit einer Lichtquelle (3), die Licht (5) mit einer Wellen­ länge im unteren Bereich oder unterhalb des sichtbaren Spektrums emittiert, einer Meßzelle (4) zur Erfassung von Licht (6) mit größerer Wellenlänge als das von der Lichtquelle emit­ tierte Licht (5) sowie einer Auswerteeinheit (12) zur Erzeugung eines Ausgangssignals auf der Grundlage des erfaßten Lichtes (6).

12. Vorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle (4) einen optischen Filter (9b) aufweist, der nur für Licht (6) einer Wellenlänge größer als die Wellenlänge des von der Lichtquelle (3) emit­ tierten Lichtes (5) durchlässig ist.

13. Vorrichtung nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (3) so angeordnet ist, daß der von ihr emittierte Lichtstrahl (5) unter einem fla­ chen Winkel auf die Oberfläche (1) auftritt.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßvorrichtung (4) so angeordnet ist, daß sie das von der Ober­ fläche (1) ausgesandte Fluoreszenzlicht (6) senkrecht zur Oberfläche (1) erfaßt.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Licht­ quelle (3) und der Oberfläche (1) und/oder der Oberfläche (1) und der Meßzelle (4) optische Bauelemente (8a, 8b, 9a, 10, 8c, 9b) zum Sam­ meln, Umlenken und/oder Filtern des von der Lichtquelle (3) emittierten Lichtes (5) bzw. des von der Oberfläche (1) ausgesandten Fluoreszenz­ lichtes (6) angeordnet sind.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Meßzelle (4) erzeugte Signal mittels eines Analog/Digi­ tal-Wandlers (11) in ein digitales Signal gewan­ delt und anschließend in die Auswerteeinheit (12) eingegeben wird.

17. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der An­ sprüche 9 bis 14 zur Detektion biotischer Kon­ taminationen (2) auf technischen Oberflächen (1) in Produktionsräumen, medizinisch genutzten Räu­ men, Labors und dergleichen.