DE60115591T2

DE60115591T2 - Verfahren zur Messung des Volumens von einzelnen roten Blutkörperchen

Info

Publication number: DE60115591T2
Application number: DE60115591T
Authority: DE
Inventors: Klaus W. Timonioum Berndt
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2001-01-03
Filing date: 2001-12-10
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2021-12-11
Also published as: EP1223428A1; EP1223428B1; US6633369B2; ATE312346T1; JP2002323438A; DE60115591D1; US20020118354A1; MXPA01013032A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der quantitativen Mikrospektroskopie und insbesondere ein Verfahren zum Messen des Volumens einzelner roter Blutzellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Bestimmen des Volumens einzelner roter Blutzellen und, basierend auf dieser Messung, das Berechnen des mittleren Zellvolumens ("MCV") und der Rotzellen-Verteilungsbreite ("RDW") sind von klinischem Interesse. Normalerweise werden auf elektrischer Impedanzmessung (Coulter Counter) oder auf Lichtstreuung (Flow Cytometer [Strömungszytometer]) basierende Systeme verwendet (siehe z.B. J. B. Henry, "Clinical diagnosis and management by laboratory methods", W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1996, S. 548 ff. oder D. H. Tycko, M. H. Metz, E. A. Epstein, A. Grinbaum, "Flowcytometric light scattering measurement of red blood cell volume and hemoglobin concentration", Applied Optics 24 (1985), 1355–1365). Impedanzzähler sind komplexe und teuere Geräte, bei denen eine sehr sorgfältige Einstellung und Steuerung von Gerät und Probenparametern erforderlich ist. Ein großer Nachteil bei Strömungszytometern ist die Tatsache, dass die Parameter der Lichtstreuung nicht nur von dem Zellvolumen abhängig ist, sondern auch von der Zellform.
1983 schlugen Gray, Hoffman und Hansen ein neues optisches Verfahren zum Bestimmen des Zellvolumens in einem Strömungszytometer vor (M. L. Gray, R. A. Hoffman, W. P. Hansen "A new method for cell volume mea surement based on volume exclusion of a fluorescent dye", Cytometry 3 (1983), 428–432). Bei diesem Verfahren werden die Zellen in einem fluoreszierenden Farbstoff suspendiert, der nicht in die Zellmembran eindringen kann. Der Fluoreszenzpegel, der erzeugt wird, wenn ein kleiner Strom der Zellsuspension von einem fokussierten Laserstrahl angeregt wird, bleibt konstant, bis eine Zelle in der beleuchteten Region ankommt, wodurch eine Verringerung der Fluoreszenzintensität verursacht wird, die zu dem Zellvolumen direkt proportional ist. In einem Strömungszytometer durchläuft eine einzelne Zelle die laserbeleuchtete Stelle in ungefähr 10 μSek. Aufgrund dieses kurzen Datenerfassungs-Zeitraums muss die Bandbreite für die elektronische Detektion relativ groß sein, was zu einem unzureichenden Signal-Rausch-Verhältnis und geringer Präzision bei der Volumenbestimmung führt.
Die zur Verfügung stehende Datenerfassungszeit kann durch Suspendieren der Zellen in einer stationären Probe und Durchführen der digitalen bildgebenden Fluoreszenzmikroskopie beträchtlich verlängert werden (siehe P. L. Becker, F. S. Fay "Cell-volume measurement using the digital imaging fluorescence microscope", Biophysical Journal 49 (1986), A465). Bei der die digitale Fluoreszenzmikroskopie involvierenden Vorgehensweise ist ein Kalibriervorgang zum Bestimmen des Zellvolumens erforderlich. Recktenwald und Kollegen haben ein Verfahren eingeführt, bei dem die Kalibrierung mit optischen transparenten und nicht fluoreszierenden Mikrokugeln durchgeführt wird, die zusammen mit den Zellen suspendiert werden (D. Recktenwald, J. Phi-Wilson, B. Verwer "Fluorescent quantitation using digital microscopy", Journal Physical Chemistry 97 (1993) 2868–2870). Das Volumen einzelner Kugeln wird durch Messen ihrer Projektionsfläche unter dem Mikroskop und Transformieren dieser Zahl in ein Volumen bei Annahme einer idealen Kugelform bestimmt. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität aufgrund des vom Ausstrahlen einer Fluoreszenz ausgenommenen Kugelvolumens wird als erforderlicher Kalibrierparameter verwendet. Der Vorteil dieser Vorgehensweise liegt in der Tatsache, dass sich die Kalibrierpartikel in der Probe selbst befinden. Mit anderen Wor ten: es wird eine Kalibrierung in demselben Probenbehälter durchgeführt, und es ist keine zusätzliche Kalibrierprobe erforderlich.
Die Verwendung von Kalibrierkugeln in einer Zellsuspension ist nicht unproblematisch. Erstens stellt das Einbringen von Kugeln einen zusätzlichen Schritt beim Arbeitsablauf dar. Bei Systemen, die für hohen Durchsatz ausgelegt sind, stellt dieser zusätzliche Schritt einen Nachteil dar. Zweitens haben Recktenwald und Kollegen beobachtet, dass die Fluoreszenzfarbstoffmoleküle dazu neigen, sich auf der Kugeloberfläche abzusetzen; wodurch ein Fehler hervorgerufen wird. Drittens treten, wenn der optische Brechungsindex der Kugeln nicht mit dem Flüssigkeitsindex übereinstimmt, brechungsbasierte Artefakte in der gemessenen Fluoreszenzintensität an den Kugelrändern auf. Schließlich kann die Verwendung von Mikrokugeln problematisch sein, wenn beispielsweise eine geringe Probendicke in der Größenordnung von einigen wenigen Mikrometern oder weniger benötigt wird.
Angesichts der oben beschriebenen beim Stand der Technik auftretenden Nachteile und Probleme besteht Bedarf an einem einfachen und zuverlässigen Verfahren zum Messen des Volumens von einzelnen in einer Flüssigkeit suspendierten roten Blutzellen.
In EP 1 150 114 A1 ist ein Verfahren zum Bestimmen des Volumens von Partikeln beschrieben, die in einer Flüssigkeitsprobe suspendiert sind. Eine Flüssigkeitsprobe, die suspendierte Partikel enthält, wird in eine optische Küvette mit einem Eintrittsfenster und einem Austrittsfenster, die einen bekannten Abstand zueinander aufweisen, eingebracht. Ein lichtabsorbierender Farbstoff, der nicht in die suspendierten Partikel eindringt, wird in die Flüssigkeitsprobe eingemischt. Licht wird mit einer solchen Wellenlänge durch die Küvette gesendet, dass es in hohem Maße von dem zugegebenen Farbstoff, jedoch nur schwach von den suspendierten Partikeln absorbiert wird. Die Küvette wird vor einen bildgebenden Photodetektor platziert, und Lichtintensitäten werden gemessen. Zum Bestimmen des Volumens der suspendierten Par tikel wird eine Messung von die Flüssigkeitsprobe durchlaufendem Licht zwischen dem Eintrittsfenster und dem Austrittsfenster durchgeführt. Es wird eine weitere Messung von Licht durchgeführt, das einen Bereich der Küvette, bei der die beiden Küvettenfenster einen anderen Abstand zueinander aufweisen, durchläuft. Ein anderer, d.h. reduzierter Abstand kann durch Kleben eines kleinen flachen Glasstücks mit bekannter Dicke auf eines der Küvettenfenster erzielt werden.
ZUSAMMENFASSENDER ÜBERBLICK ÜBER DIE ERFINDUNG
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Messen des Volumens einzelner roter Blutzellen oder anderer Partikel, die in Flüssigkeiten suspendiert sind, zu schaffen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in Anspruch 1 definiert.
Bei roten Blutzellen wird die oben genannte Aufgabe durch folgende Schritte gelöst: durch Einbringen einer Flüssigkeitsprobe, die suspendierte rote Blutzellen enthält, in eine optische Küvette mit einem Eintrittsfenster und einem Austrittsfenster, durch Zugeben und gleichmäßiges Verteilen eines Absorptions-Farbstoffs in die Flüssigkeit, der nicht in die roten Blutzellen eindringt und in der Lage ist, Licht mit Wellenlängen zu absorbieren, die von den roten Blutzellen nur schwach absorbiert werden, durch Beleuchten der Probe durch das Eintrittsfenster mit einer Wellenlänge, die von dem Farbstoff absorbiert wird, von den roten Blutzellen jedoch nur schwach absorbiert wird, durch Messen der Intensität des gesendeten Lichts, das durch das Austrittsfenster in einen Bereich wiederaustritt, in dem keine roten Blutzellen enthalten sind, durch Verändern der Küvettendicke in diesem Bereich um ein definiertes Maß und Messen der Intensität des in demselben Bereich wiederaustretenden Lichts, durch Messen der Intensität des in einem Bereich wiederaustretenden Lichts, in dem eine rote Blutzellen vorhanden ist, durch Messen der Intensität des in einem Bereich wiederaustretenden Lichts, der nahe der roten Blutzelle liegt, und durch Berechnen des Volumens der roten Blutzelle anhand dieser Lichtintensitätswerte und der bekannten Küvettendicke.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Messeinrichtung mit einer optischen Küvette, die ein starres Eintrittsfenster und ein flexibles Austrittsfenster aufweist und eine Flüssigkeitsprobe mit suspendierten roten Blutzellen enthält.
2 zeigt eine vollständige Einrichtung mit einem Probenbehälter, einem XYZ-Tisch, einem Transmissionsmikroskop, einer CCD-Kamera und einem Computer.
3 zeigt schematisch eine optische Küvette mit einer Region mit einer schwachabsorbierenden roten Blutzelle und einer weiteren Region ohne Zellen. Der Pfeil zeigt den die Probe durchlaufenden Photonenstrom an, wobei die Breitenreduzierung als Anzeichen für die abnehmende Lichtintensität infolge der Absorption gedacht ist.
4 zeigt den Kalibriervorgang, bei dem die Küvettendicke in einem Bereich ohne rote Blutzellen um ein definiertes Maß h verändert wird, und die Intensitäten I₁ und I₂ des wiederaustretenden Lichts vor und nach der Veränderung der Dicke gemessen werden. Bei diesem Beispiel ist die Küvettendicke reduziert worden.
5 zeigt den Messvorgang, bei dem die Intensitäten I₄ und I₃ des wiederaustretenden Lichts in einem Bereich, in dem sich eine rote Blutzelle befindet, und in einem Bereich nahe dieser Zelle gemessen werden. In 5 wird eine zylindrische Zelle mit einer Höhe h_RBC angenommen.
6 zeigt eine berechnete graphische Darstellung der Intensität des wiederaustretenden Lichts in willkürlichen Einheiten, wenn eine Küvettendicke von ungefähr 18 μm in zehn Schritten von jeweils 0,2 μm auf ungefähr 20 μm erhöht wird. Bei diesem Beispiel ist TO-PRO-3 in einer Konzentration von c = 1 mM/L als Absorptions-Farbstoff angenommen worden, der einen Absorptionskoeffizienten von a = 1,144·10⁵ L/M cm und eine Wellenlänge von 640 nm aufweist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine suspendierte rote Blutzellen enthaltende Flüssigkeitsprobe in eine optische Küvette mit einem Eintrittsfenster und einem Austrittfenster eingebracht. Vorzugsweise ist die Küvette relativ dünn und dazu geeignet, auf den Probentisch eines Transmissionsmikroskops positioniert zu werden. Beispielsweise kann die Küvette durch Platzieren eines flexiblen #1 Deckglases mit einer Größe von 24 mm × 50 mm auf Abstandshaltern ausgebildet werden, die auf einem normalen Objektträger mit einer Größe von 25 mm × 75 mm angeordnet sind. Die bevorzugte Höhe der Abstandshalter beträgt ungefähr 200 μm. Durch Drücken auf das flexible Deckglas können Dickenwerte in der mittleren Region der Küvette zwischen weniger als 1 μm und 200 μm erreicht werden. Eine optimale Küvette ist ein beliebiger Behälter, der in der Lage ist, eine Flüssigkeitsprobe in seinem Innenraum aufzunehmen, und ein transparentes Eintrittsfenster und ein transparentes Austrittsfenster aufweist, die normalerweise auf entgegengesetzten Seiten angeordnet sind, um eine Transmissionsmessung zu ermöglichen. Es ist auch möglich, einen Behälter mit einem transparenten Fenster auf der einen Seite und einem Spiegel auf der anderen Seite zu verwenden. In diesem Fall tritt Licht durch das eine transparente Fenster in den Behälter ein, durchquert zweimal die Flüssigkeitsprobe und tritt durch dasselbe Fenster aus dem Behälter aus. Das eine Fenster fungiert sowohl als Eintrittsfenster als auch als Austrittsfenster. Die Erfindung ist nicht auf Behälter für mikroskopi sche Analysen beschränkt, sondern auch auf größere Behälter anwendbar, die bei anderen optischen Systemen als bei Mikroskopen verwendet werden.
Ein Absorptions-Farbstoff wird der Flüssigkeitsprobe zugefügt und gleichmäßig in dieser verteilt. Der Farbstoff ist derart ausgewählt, dass er nicht in die roten Blutzellen eindringt. Ferner sollte er Anregungslicht in einer Spektralregion absorbieren, in der die Absorption durch die roten Blutzellen nur schwach ist. Da Hämoglobin der vorherrschende Absorber in roten Blutzellen ist, muss die Beleuchtungswellenlänge länger als 600 nm sein. Ein guter Farbstoffkandidat ist TO-PRO-3 (beispielsweise von Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon), der in einem Wellenlängenbereich von ungefähr 640 nm beleuchtet werden kann, in dem er einen Absorptionskoeffizienten von 1,14·10⁵ L/Mcm aufweist. Ein weiterer möglicher Farbstoff ist TO-PRO-5 (von Molecular Probes, Inc.), der ebenfalls nicht in die roten Blutzellen eindringt, bei ungefähr 750 nm beleuchtet werden kann und einen Absorptionskoeffizienten von 1,21·10⁵ L/Mcm aufweist.
Es ist für einen Fachmann offensichtlich, dass die Efindung nicht auf die beiden oben beschriebenen Farbstoffe beschränkt ist. Es stehen zahlreiche andere Farbstoffe zur Verfügung, die die Spektralbedingungen für Messungen an roten Blutzellen erfüllen, und es stehen sogar noch mehr Farbstoffe zur Verfügung, die die Spektralbedingungen für andere Partikel erfüllen. Es fiele selbstverständlich in den Geist der vorliegenden Erfindung, den Absorptions-Farbstoff vor dem Platzieren der Probe in den Behälter der Flüssigkeitsprobe zuzugeben und gleichmäßig in dieser zu verteilen.
1 zeigt eine Messeinrichtung mit einer optischen Küvette (20), die ein starres Eintrittsfenster (1) und ein flexibles Austrittsfenster (3) aufweist und eine Flüssigkeitsprobe (4) mit suspendierten roten Blutzellen enthält. Die Küvette wird von einem normalen Objektträger (1) gebildet, der Abstandshalter (2, 2') zum Halten eines flexiblen Deckglases (3) trägt. Die Suspension aus roten Blutzellen in einer Flüssigkeit, wie z.B. Blutplasma (4), befindet sich zwischen dem Träger (1) und dem Deckglas (3). Die optische Küvette ist auf einem XYZ-Tisch (5) eines normalen Transmissionsmikroskops (7) mit austauschbaren Objektivlinsen (8, 9 und 10) und einer Proben-Beleuchtungsquelle (6) positioniert. Gemäß 2 ist das Mikroskop (7) mit einer CCD-Kamera (21) bestückt, die zum Speichern von Daten und Durchführen von bildgebenden Verarbeitungsvorgängen mit einem Computer (22) verbunden ist. Der Computer (22) ist zum erforderlichen Bewegen der Küvette (20) ferner mit dem XYZ-Tisch (5) verbunden.
3 zeigt schematisch eine optische Küvette mit einer Region, die eine schwachabsorbierende rote Blutzelle enthält, und einer weiteren Region ohne Zellen. Die Pfeile zeigen den die Probe durchlaufenden Photonenstrom an, wobei die Breitenreduzierung als Anzeichen für die abnehmende Lichtintensität infolge der Absorption gedacht ist. Gemäß 3 ist die optische Absorption in einer roten Blutzelle so schwach, dass kein Absinken der Intensität erfolgt.
Gemäß 1 und 2 wird bei Betrieb die Küvette (20) von dem Tisch (5) aufwärtsbewegt, bis das flexible Fenster (3) mit einem feststehenden Kolben (11) in physischen Kontakt kommt, der derart an der Objektivlinse (10) befestigt ist, dass die Brennebene des Mikroskops (7) in der Flüssigkeitsprobe (4) liegt, wenn das flexible Fenster (3) den Kolben (11) berührt. Falls erforderlich, wird die Küvette (20) in X- und Y-Richtung bewegt, bis ein Probenbereich, in dem keine roten Blutzellen enthalten sind, in das Sichtfeld kommt. Wenn die Probe insgesamt aus Blut besteht, ist es zweckmäßig, eine Küvettendicke im Bereich von 2 μm bis 30 μm zu verwenden, damit Bereiche ohne rote Blutzellen immer verfügbar sind. Bei verdünnten Blutproben können dickere Küvetten verwendet werden.
Wenn ein Bereich ohne roten Blutzellen gefunden worden ist, wird die Probe mittels einer Beleuchtungsquelle (6) mit Licht mit geeigneter Wellenlänge beleuchtet und wird die wiederaustretende Intensität I₁ des durchgelas senen Lichts in diesem Bereich mittels der CCD-Kamera (21) gemessen und wird das Ergebnis in dem Computer (22) gespeichert. Dies ist in 4 gezeigt. In einem nächsten Schritt wird die Küvette (20) mittels des Tischs (5) um eine kleine, aber genau bekannte Distanz h weiter aufwärtsbewegt. Das Aufwärtsbewegen der Küvette (20) gegen den feststehenden Kolben (11) führt zu einer Reduzierung der Länge des optischen Wegs in der Küvette um ein mit h identisches Maß. Wenn die Küvette (20) bewegt worden ist, wird die Intensität I₂ eines neuen wiederaustretenden Lichts in demselben Bereich gemessen und wird das Ergebnis in dem Computer (22) gespeichert: Die neue Lichtintensität I₂ hat einen höheren Wert als die erste Intensität I₁, da eine kleinere Probendicke zu einer geringeren Absorption von Licht in der Probe führt.
Die beiden Intensitätswerte I₁ und I₂ des wiederaustretenden Lichts können zusammen mit der Veränderung der Länge des optischen Wegs h zum Kalibrieren der Einrichtung durch Berechnen eines Verhältnisses "Veränderung der Intensität des wiederaustretenden Lichts/Veränderung der Probendicke" verwendet werden. Anhand von 4 kann diese Kalibrierung wie folgt erläutert werden.
Unter der Annahme, dass die Flüssigkeitsprobe von Anregungslicht gleichmäßig beleuchtet wird, wird die Intensität I₁ des ersten wiederaustretenden Lichts wie folgt angegeben I1 = I0·10–ac·h1 (1)wobei I₀ die Beleuchtungsintensität ist, a der Absorptionskoeffzient des lichtabsorbierenden Farbstoffs ist und c die Konzentration des Farbstoffs ist. Die Größe h₁ ist die Länge (oder Dicke) des optischen Wegs der Küvette (20) in dem gemessenen Bereich.
Die Lichtintensität I₂, die nach dem Verändern der Küvettendicke um ein Maß h gemessen wird, wird wie folgt angegeben I2 = I0·10–ac·(h1-Δh) (2)
Durch Dividieren der Gleichung (2) durch die Gleichung (1) und Logarithmieren erhält man einen Ausdruck für das Produkt a·c, das die Kalibriergröße repräsentiert:
Die Gleichung (3) zeigt an, dass die absolute Küvettendicke h₁ nicht bekannt sein muss oder dass die Beleuchtungsintensität I₀ nicht gemessen werden muss, da diese beiden Größen aufgehoben sind.
Nach der Durchführung einer Kalibrierung wie oben beschrieben wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Volumen einer einzelnen roten Blutzelle wie folgt bestimmt:
In einem ersten Schritt wird die Intensität I₄ des wiederaustretenden Lichts in einem Bereich A_RBC gemessen, in dem sich eine rote Blutzelle befindet. Für den Moment sei angenommen, dass die rote Blutzelle eine zylindrische Form des Bereichs A_RBC und eine Höhe h_RBC aufweist (siehe 5). Es sei ferner eine Höhe des Flüssigkeitsprobenfilms h₂, der nicht gleich h₁ sein muss, und eine Beleuchtungsintensität I'₀, die nicht mit I₀ identisch sein muss, angenommen. Unter diesen Bedingungen erhält man I4 = I4·10–ac·(h2-hRBC) (4)für die Intensität des wiederaustretenden Lichts.
In einem zweiten Schritt wird die Intensität I₃ des wiederaustretenden Lichts in einem Bereich mit identischer Größe A_RBC, der sich nahe derselben roten Blutzelle befindet, gemessen. Unter den gleichen Bedingungen wie bei I₄ erhält man I3 = I'0·10–ac·h2(5)
Durch Dividieren der Gleichung (4) durch die Gleichung (5) erhält man
Bei einer zylindrischen Zelle mit dem Bereich A_RBC kann das Zellvolumen V_RBC durch Multiplizieren des Zellbereichs mit der Zellhöhe, wie in Gleichung (7) angegeben, errechnet werden, was zu folgendem Ergebnis führt
oder mit Gleichung (3) für das Produkt a·c in
Gleichung (9) zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren auf Differentialmessungen hinsichtlich der Dicke der Küvette und auf ratiometrischen Messungen hinsichtlich der Intensitäten des wiederaustretenden Lichts basiert. Mit anderen Worten: die absolute Dicke der Küvette muss nicht bekannt sein. Ferner muss die Anregungsintensität, die in die Küvette eingekoppelt wird, nicht bekannt sein.
Gleichung (9) zeigt ferner, dass eine langfristige Drift bei den Geräteparametern aufgehoben wird. Der Grund dafür liegt darin, dass das Volumen einer roten Blutzelle V_RBC aus einem Verhältnis von Photoströmen berechnet wird. Mit anderen Worten: wenn der Kalibriervorgang in engem zeitlichen Zusammenhang mit der Messung durchgeführt wird, ist das erfindungsgemäße Verfahren sehr stabil. Diese Bedingung wird immer erfüllt, da der Kalibriervorgang an derselben Probe, die auch für die Messung verwendet wird, durchgeführt wird.
Bisher ist angenommen worden, dass die rote Blutzelle eine zylindrische Form aufweist. Es kann gezeigt werden, dass die Form der roten Blutzelle ungleichmäßig sein kann und die Z-Position der Zelle in der Küvette keinen Einfluss auf das berechnete Zellvolumen hat. Das Zellvolumen V_RBC ist auf die räumlich abhängige Zellhöhe h_RBC(,) bezogen, und zwar gemäß der Gleichung VRBC = ∫hRBC(ξ; η)dξdη (10)
In Gleichung (10) repräsentieren die Größen und die unabhängigen X- und Y-Variablen in der roten Blutzelle. Die erforderliche Integration erfolgt auf einfache Weise durch Hinzufügen der Pixelintensitäten I₄( , ) in dem Bereich A·_RBC, der von der roten Blutzelle eingenommen ist, und zwar auf dem
photoempfindlichen Target der CCD-Kamera. Durch Kombinieren der Gleichungen (7) und (10) wird bestimmt, welche den endgültigen Ausdruck für das Volumen der roten Blutzelle, wie gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt, repräsentiert.
Das in Gleichung (11) dargestellte Integrationsverfahren ist nicht exakt über den von einer roten Blutzelle eingenommenen Bereich durchgeführt worden. Stattdessen kann es über einen etwas größeren Bereich durchgeführt werden, der die Zelle einschließt. Außerhalb der Zelle ist I₄(ξ, η) mit I₃ identisch; daher ist Ig[I₄(ξ, η)/I₃] = 0. Mit anderen Worten: das Erweitern der Integration über einen größeren Bereich über den Zellumfang hinaus führt nicht zu weiteren Kontributionen zu dem berechnete Zellvolumen. Dieser Aspekt der Erfindung ermöglicht die Verwendung einfacher Integrationsbereiche mit einer Größe und einer Form für sämtliche einzelnen Zellen, die untersucht werden. Folglich können die erforderlichen Berechnungen innerhalb eines kürzeren Zeitraums durchgeführt werden. Es sei darauf hingewiesen, dass angenommen wird, dass, wie Gleichung (11) impliziert, die Intensität I₃ nahe der Zelle konstant ist. Während I₄(ξ, η) in der Praxis als Intensität einzelner CCD-Kamera-Pixel gemessen wird, kann I₃ mit maximaler Präzision als die Summe sämtlicher Pixelintensitäten über einen Bereich dividiert durch die Anzahl von Pixeln bestimmt werden. Mit anderen Worten: I₃ ist die Durchschnitts-Pixelintensität nahe der Zelle.
Zum Verbessern der Kalibriergenauigkeit ist es möglich, mehr als eine Veränderung h der Küvettendicke durchzuführen. 6 zeigt eine berechnete graphische Darstellung der Intensität von wiederaustretendem Licht in willkürlichen Einheiten, wenn eine Küvettendicke von ungefähr 18 μm in zehn Schritten von jeweils 0,2 μm auf ungefähr 20 μm erhöht wird. Bei diesem Beispiel ist TO-PRO-3 in einer Konzentration von c = 1 mM/L als Absorptions-Farbstoff angenommen worden, der einen Absorptionskoeffizienten von a = 1,144·10⁵ L/M cm und eine Wellenlänge von 640 nm aufweist. Gemäß 6 kann in einem relativ kleinen Bereich der Dickenveränderung die Lichtintensi tät als Funktion der Dicke durch eine geradlinige Beziehung repräsentiert werden. Unter Verwendung der vollständigen 5,4%igen Veränderung der Intensität, die in 6 durch die gestrichelte Linie gezeigt ist, welche das Optimum zeigt, wird ein Wert von a·c = Ig(0,6223/0,5903)/(2,0·10^–4 cm) = 114,63 cm^–1 berechnet, der selbstverständlich dem erwarteten Wert von 114,44 cm^–1 entspricht.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Messen des Volumens einzelner roter Blutzellen ist auf Proben anwendbar, die entweder insgesamt aus Blut oder aus verdünntem Blut bestehen. Die vorliegende Erfindung ist ferner auf einen ganzen Klumpen aus roten Blutzellen oder anderen Partikeln in einer Flüssigkeitssuspension und nicht nur auf einzelne Partikel oder Zellen anwendbar. Es ist ferner möglich, dieses Verfahren auf andere in Flüssigkeiten suspendierte Partikel anzuwenden, wie z.B. auf Kügelchen oder andere Partikel oder Zellen, beispielsweise prokaryotische, bakterielle, eukaryotische, Säuger-, Gewebekultur- oder Humanzellen. Es ist für den Fachmann ferner offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung auch auf Partikel oder Zellen in anderen Flüssigkeitssuspensionen oder -proben oder Verdünnungen davon anwendbar ist, wie z.B. auf andere medizinische oder biologische Proben, einschließlich Gewebekulturen oder andere Zellen in Kulturen, einschließlich Bakterienkulturen und andere Körperfluide, wie z.B. Blut, Urin, Sputum, Speichel und Lymphflüssigkeit.
Je nach optischen Eigenschaften einer Flüssigkeitsprobe kann das Verfahren ferner in Küvetten mit größerer Dicke durchgeführt werden. Die Verwendung eines flexiblen Fensters ist nur ein Beispiel für das Realisieren einer Veränderung der Küvettendicke. Es ist ferner möglich, ein starres Fenster zu verwenden, es müssen jedoch Abstandshalter aus einem flexiblen Material, wie z.B. Gummi, vorgesehen sein. Eine weitere Ausführungsform ist durch Verwendung einer flexiblen Küvettenwand anstelle lokaler Abstandshalter realisierbar. Ferner kann die Veränderung der Küvettendicke dadurch erreicht werden, dass der Hauptteil der Küvette fixiert bleibt und mit einer positiven oder negativen Kraft derart auf das Fenster eingewirkt wird, dass sich das Fenster bewegt. Solche positiven oder negativen Kräfte können sogar die Verwendung von Druck oder Vakuum umfassen.
Wie oben beschrieben, ist die Erfindung nicht auf optische Mikroskope beschränkt. Ein beliebiges bildgebendes System, das die Messung der Intensitäten von durchgelassenem Licht in Bereichen, die ein Partikel enthalten, und in Bereichen ohne Partikel ermöglichen, ist zum Durchführen der vorliegenden Erfindung geeignet. Das bildgebende System kann Linsen aufweisen, es können jedoch auch faseroptische Elemente in sogenannten Nachbarschaftskonfigurationen verwendet werden. In diesem Fall ist ein kohärentes faseroptisches Bündel zwischen einem Küvettenfenster und einem bildgebenden Photodetektor angeordnet. Schließlich ist es auch möglich, einen Lichtstrahl über das Küvettenfenster zu führen und das durchgelassene Licht während der Veränderung der Küvettendicke mit einem nicht bildgebenden Photodetektor zu überwachen.
Es sei angemerkt, dass der Kalibrierschritt, d.h. das Bestimmen der Größe "Veränderung der Intensität des wiederaustretenden Lichts/Veränderung der Probendicke" gemäß Gleichung (3), auch in großer Nähe zu dem Partikel, das untersucht wird, durchgeführt werden kann. In diesem Fall wird gemäß 4 zuerst die Intensität des wiederaustretenden Lichts in Nachbarschaft eines einzelnen Partikels gemessen. In einem nächsten Schritt wird die Dicke der optischen Küvette in diesem Bereich um ein Maß Δh verändert und wird die neue Intensität des wiederaustretenden Lichts gemessen. In einem dritten Schritt wird die Intensität des wiederaustretenden Lichts in dem von dem Partikel eingenommenen Bereich gemessen. Während die ersten beiden Schritte zu der erforderlichen Kalibrierung führen, liefern der zweite und der dritte Schritt die beiden Intensitätswerte des wiederaustretenden Lichts, die für die eigentliche Volumenmessung benötigt werden. Dieser zweite erfindungsgemäße Vorgang hat den Vorteil, dass drei statt vier Schritte erforderlich sind. Der erste erfindungsgemäße Vorgang ermöglicht das Durchführen der Kalibrierung in einem Küvettenbereich mit größerer Dicke, wodurch ein präziserer Kalibrierwert aufgrund höherer Intensitätspegel des wiederaustretenden Lichts realisierbar ist. In der Praxis muss der Benutzer anhand von vorliegenden Prioritäten eine Entscheidung treffen.

Claims

Verfahren zum Messen des Volumens von Partikeln in einer Flüssigkeit, mit folgenden Schritten: (a) Entnehmen einer Suspension von Partikeln in einer Flüssigkeit; (b) Einbringen der Suspension in einen Behälter, der mindestens ein flexibles oder flexibel angebrachtes Fenster aufweist und zum Durchführen von Transmissionsmessungen geeignet ist; (c) Hinzufügen eines Absorptions-Farbstoffs zu der Suspension in dem Behälter, welcher nicht in die Partikel eindringt, wobei der Farbstoff in der Lage ist, Anregungslicht bei Wellenlängen zu absorbieren, die von den Partikeln derart schwach absorbiert werden, dass keine Intensitätsverringerung auftritt; (d) Beleuchten der Suspension mit Licht, wobei die Wellenlänge des Lichts derart gewählt ist, dass das Licht von dem Farbstoff absorbiert wird, jedoch derart schwach von den Partikeln absorbiert wird, dass keine Intensitätsverringerung auftritt; (e) Messen einer ersten Intensität (I₁) von durchgelassenem Licht, das in einem ersten Bereich der Suspension aus der Suspension wiederaustritt, wobei der erste Bereich keine Partikel enthält oder sich nahe einem Partikel befindet; (f) Verändern der Dicke des Behälters in dem ersten Bereich um ein bekanntes Maß durch Drücken von außen auf das mindestens eine flexible oder flexibel angebrachte Fenster und Messen einer zweiten Intensität (I₂) von durchgelassenem Licht, das in dem ersten Bereich der Suspension wiederaustritt; (g) Messen einer dritten Intensität (I₄) von durchgelassenem Licht, das in einem zweiten Bereich der Suspension aus der Suspension wiederaustritt, wobei der zweite Bereich mindestens ein Partikel enthält; und (h) Bestimmen des Volumens (V_RBC) des mindestens einen Partikels anhand der Intensitätswerte des durchgelassenen Lichts und der bekannten Veränderung der Dicke (Δh) des Behälters.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner mit folgendem Schritt zwischen den Schritten (g) und (h): Messen einer vierten Intensität (I₃) von durchgelassenem Licht, das aus einem dritten Bereich der Suspension nahe dem mindestens einen Partikel in dem zweiten Bereich wiederaustritt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die Schritte (b) und (c) in folgender Reihenfolge durchgeführt werden: Schritt (c) – Schritt (b).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, bei dem das Partikel eine Humanzelle oder eine rote Blutzelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, bei dem die Flüssigkeit eine biologische oder medizinische Probe ist, die ein Körperfluid, Gewebekulturzellen oder bakterielle Zellen aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, bei dem der Behälter eine optische Küvette (20) ist und der Farbstoff aus der Gruppe von TO-PRO-3 und TO-PRO-5 ausgewählt ist.