CN117751283A - 一种改进的样品保持器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于分子吸收光谱法的样品保持器。所述样品保持器包括具有第一预定几何形状的第一表面和具有第二预定几何形状的第二表面。所述第一表面与所述第二表面相对。所述样品保持器被配置为在所述第一表面与所述第二表面之间保持测量样品,使得所述第一表面与所述第二表面之间的距离限定所述样品保持器的光学路径长度。所述第一表面和所述第二表面的预定几何形状提供横跨所述样品保持器的连续可变截面,以便提供连续的光学路径长度范围。
Description
技术领域
本发明涉及一种改进的样品保持器。具体地,本发明的实施方案涉及用于分子吸收光谱法的样品保持器、包括样品保持器的分光光度计、以及使用分光光度计分析设置在样品保持器中的测量样品的方法。
背景技术
在吸收光谱法领域,会测量液体物质的光学吸收光谱。所述吸收光谱是对作为光波长函数的光衰减的测量。在简单的分光光度计中,测量样品被放入透明容器中,通常称为比色皿、样品池或样品保持器。已知波长和强度的光入射到样品保持器的一侧,并且检测器测量从样品保持器离开的光的强度。样品保持器的形状决定了光穿过样品的距离。这个距离被称为样品保持器的光学路径长度。通常,穿过测量样品的光遵循已知的关系,使得可以基于吸收光谱来确定测量样品的性质。换句话说,如果给定物质的吸收光谱是已知的,则可以确定其在测量样品中的存在和浓度。
通常溶液中感兴趣的化合物是高度浓缩的。例如,当测量吸光度时,某些生物样品,如蛋白质、DNA或RNA的浓度通常在分光光度计的线性范围之外。因此,通常需要稀释样品来测量落在仪器线性范围内的吸光度值。传统上,浓缩的样品在分析前被稀释,以获得合适的吸光度(通常在0.2至1.2吸光度单位的范围内),光学路径长度大约在1至10mm之间。在某些情况下,需要对样品进行多次稀释,这就有可能在测量和下游应用中引入人为错误和不准确性。此外,执行额外稀释步骤的需要导致测量耗时且费力。因此,理想的情况是可以在不知道可能浓度的情况下采集现有样品并在不稀释的情况下测量这些样品的吸收。
传统上,分光光度计中与样品保持器相关联的光学路径长度是固定的。近年来,已经开发了分光光度计和样品处理技术,以允许在一个以上的光学路径长度上进行样品测量,从而获得在可测量的范围内的吸光度值。
例如,CTechTM 系统通过提供一个可在样品保持器内竖直方向上移动的光纤探针,使得可以在可变路径长度下测量样品吸光度。探针提供光线来测量样品保持器内的样品。检测器被设置成接收从探针发出并穿过样品的光。探针在样品保持器中样品内的移动有效地为分析提供了可变的路径长度。
然而,相对于检测器在样品内缓慢移动探针以实现准确且可行的测量可能是一个耗时的过程。此外,CTechTM 系统移动探针,一次测量一个路径长度,并基于回归分析计算样品属性。通常,很难实现测量的最佳信噪比。
探针的移动还会导致从探针发出的光辐射强度不稳定,这会影响低吸光度样品的测量准确度。此外,探针与驱动组件相关联,该驱动组件包括用于影响探针的直线运动的马达。系统提供准确且可重复测量的能力依赖于驱动组件操作的准确度和可重复性。不可避免地,机械部件在驱动组件内的运动将产生不准确性,例如由于滞后、热膨胀、摩擦、由于间隙产生的运动、以及各种与马达相关的误差。驱动组件也会受到磨损。因此,需要经常检查和维护,以保持可接受的准确度。此外,对于低浓度样品,必须使用相对较长的路径长度(例如高达15mm),这需要相对较大的样品体积。如果样品供应非常短缺和/或非常昂贵,这可能是不利的。
在另一个例子中,NanoDropTM分光光度计提供了一种样品保持器,用于在两个相对的表面之间保持测量样品。两个相对的表面可以相对于彼此移动,以有效地提供光学路径长度的变化。然而,依靠移动部件来提供路径长度的变化在测量的准确度和可重复性方面具有固有的限制。在另一个例子中,Unchained Labs Lunatic分光光度计提供具有两种路径长度的用于承载样品的样品池。样品池在测量方向上提供样品池厚度的离散变化,从而提供两种不同的离散路径长度。在这两个例子中,仅提供了有限数量的离散路径长度。此外,在某些测量中可能难以达到可接受的准确度,特别是在短路径长度下(例如,通常在50-100um的区域内)。对于50μm的路径长度,需要小于500nm的误差才能达到1%的准确度,这可能非常难以实现。
本发明的实施方案可提供一种样品保持器、一种分光光度计、以及一种操作方法,其克服或改善上述一个或多个缺点或问题,或者至少为消费者提供有用的选择。
本文对专利文件或被鉴定为现有技术的任何其他事项的引用,不应被视为承认该文件或其他事项是已知的,或者其包含的信息是在任何权利要求的优先权日的常识的一部分。
发明内容
根据本发明的一个方面,提供了一种用于分子吸收光谱法的样品保持器,所述样品保持器包括
具有第一预定几何形状的第一表面,以及
具有第二预定几何形状的第二表面,所述第一表面与所述第二表面相对,
所述样品保持器被配置为在所述第一表面与所述第二表面之间保持测量样品,使得所述第一表面与所述第二表面之间的距离限定所述样品保持器的光学路径长度,
其中,所述第一表面和所述第二表面的预定几何形状提供横跨所述样品保持器的连续可变截面,以便提供连续的光学路径长度范围。
所述样品保持器可以被配置成保持具有任何合适黏稠度的任何合适的测量样品。例如,所述测量样品可以具有任何粘度。典型地,所述样品是液体样品。
第一预定几何形状可以与第二预定几何形状相同。可替代地,第一预定几何形状可以不同于第二预定几何形状。
第一和第二表面的预定几何形状提供了横跨所述样品保持器的连续可变截面,这有利地提供了连续的光学路径长度范围,而不需要与测量样品接触的移动部件,从而避免了与这种移动部件相关的不准确性。
所述连续可变截面可以包括:第一测量区,在所述第一测量区中所述第一表面与所述第二表面之间的最小距离限定了最小光学路径长度;以及第二测量区,在所述第二测量区中所述第一表面与所述第二表面之间的最大距离限定了最大光学路径长度。所述连续可变截面可以在所述第一测量区与所述第二测量区之间提供连续的光学路径长度范围。
在一些实施方案中,第一表面可以接触第二表面,以在第一测量区中提供为零的最小光学路径长度。在其他实施方案中,第一表面可以不接触第二表面,并且最小光学路径长度可以接近于零。因此,所述样品保持器可以有利地提供从零到任何期望的最大路径长度的连续光学路径长度范围。实际上,如本文所述,将所述样品保持器的第一和第二表面布置成具有接触点或接近接触点提供了表面相对于彼此的准确定位和非零路径长度的准确控制。
第一和第二表面可以具有任何合适的几何形状,以提供所述样品保持器所需的连续可变截面。例如,第一和第二表面中的一者或两者可以是弯曲的。一个或多个表面的曲率可以遵循规则或不规则的预定几何形状。典型地,第一表面可以是弯曲的。第二表面可以是平坦的或基本平坦的。
在一些实施方案中,所述第一预定几何形状和所述第二预定几何形状中的一者或两者由以下中的任一项定义:
球体,
抛物面圆柱体,
圆形抛物面,
椭圆抛物面,以及
任意光滑的非球面。
在根据本发明实施方案的样品保持器中,连续的光学路径长度范围能够提供约1μm至3mm数量级的光学路径长度变化。这有利地允许以高速进行高分辨率和准确的样品测量。
因此,所述样品保持器可以提供在空间上从0变化到任意最大路径长度的连续光学路径长度范围,路径长度变化约为1μm的数量级,而没有任何移动部件与测量样品接触。因此,所述样品保持器能够在样品保持器的至少一个区域中为任何未知浓度或在可接受浓度的宽范围内的任何浓度的样品提供可测量的路径长度。
此外,由于所述样品保持器允许测量连续路径长度范围内的所有路径长度,因此避免了操作者手动选择可测量路径长度范围的需要,从而提高了操作效率并减少了人为错误。
实际上,所述样品保持器可以包括平凸透镜,所述平凸透镜具有提供第一表面的弯曲侧。所述平凸透镜可以在所述第一表面与所述第二表面分离的打开位置与所述第一表面接触所述第二表面并与所述第二表面相对设置的闭合位置之间可移动。
通常,在所述闭合位置,第一表面的位置相对于第二表面是固定的,并且第一与第二表面之间的可变距离由它们各自的预定几何形状产生。
所述样品保持器可以由任何合适的材料或不同合适材料的组合制成。在一些实施方案中,所述样品保持器可以是一次性的。在这些实施方案中,所述样品保持器可以由塑料材料制成。在其他实施方案中,所述样品保持器可以是可重复使用的,并且由玻璃材料制成。
在一些实施方案中,所述样品保持器可以是具有入口和出口的流动池,以允许所述测量样品经由所述入口注射到所述样品保持器中。在这些实施方案中,所述样品保持器的第一表面和第二表面可以是柔性的,以允许清洁所述第一和第二表面,例如通过冲洗所述样品保持器。
有利地,根据本发明实施方案的样品保持器允许仅使用非常小的样品体积(例如几微升)在宽动态范围(例如超过4个数量级)内快速、准确地定量浓度(例如通常是蛋白质浓度),而不需要与样品接触的移动部件。
由于本发明的样品保持器能够提供1μm数量级的路径长度变化,具有从零或接近零开始的连续路径长度范围,所述样品保持器还允许准确测量小体积样品。
根据本发明的另一方面,提供了一种具有如本文所述的样品保持器的分光光度计。
所述分光光度计可以具有任何合适的配置,并且所述样品保持器可以设置在所述分光光度计内的任何合适的位置。
在一些实施方案中,所述分光光度计可以在紫外可见(UV-VIS)范围内工作。在一些实施方案中,可以在近红外(NIR)或红外(IR)范围内工作。
所述分光光度计可以进一步包括检测器,用于在所述连续的光学路径长度范围的每个路径长度处检测所述测量样品的吸光度。可以使用任何合适的检测器。在一些实施方案中,所述检测器可以是下列检测器中的任意一种:
单点检测器,
一维阵列检测器,或
二维阵列检测器。
所述分光光度计可以进一步包括光源。可以使用任何合适的光源。在一些实施方案中,所述光源可以包括以下中的任一项:
宽带光源,
LED,以及
激光。
在一些实施方案中,所述光源在整个所述测量样品上同时地提供光线。在这些实施方案中,所述光源可以是固定的。在具有固定光源的分光光度计中,整个仪器不需要移动部件。这进一步提供了在保持测量结果的高准确度的同时加快测量速度的优点。此外,不需要维护移动部件,从而降低了下游成本。
所述分光光度计可以具有任何合适的配置,并且所述样品保持器可以设置在分光光度计内相对于所述光源和所述检测器的任何合适位置。
所述分光光度计可以进一步包括掩模,所述掩膜位于所述光源与所述样品保持器之间,使得穿过所述掩模的光投射预定的阴影图案以供所述检测器检测,所述分光光度计被配置成基于所检测到的阴影图案来校准由所述样品保持器的所述第一和第二表面中的一者或两者处的折射引起的影响。
在一些实施方案中,所述分光光度计可以进一步包括一个或多个光学元件。所述一个或多个光学元件可以相对于所述样品保持器、光源和检测器定位在任何合适的位置。所述一个或多个光学元件可以是光分散元件或光聚焦元件等中的任何一种或多种。例如,所述光学元件可以包括一个或多个反射镜、透镜、衍射光栅、棱镜、晶体、纤维、波导或其任意组合。
在一些实施方案中,所述光源可以提供光束,所述光束相对于所述测量样品可移动以扫描所述测量样品,使得能够依序检测针对所述路径长度范围内每个路径长度的透射值。在一个实施方案中,所述光束从所述样品保持器的一端移动到所述样品保持器的相对端。在其他实施方案中,所述光束可以圆周运动。
所述分光光度计可以进一步包括用于控制所述测量样品的温度的温度控制器。
根据本发明的另一方面,提供了一种使用分光光度计分析设置在如本文所述的样品保持器中的测量样品的计算机实现的方法,所述分光光度计包括用于发射穿过所述测量样品的光的光源、以及用于检测穿过所述测量样品的光强的检测器。所述方法包括以下步骤:
获得对应于所述样品保持器的每个光学路径长度的检测透射值,所述检测透射值基于来自所述检测器的一个或多个光强测量值,
计算对应于所述样品保持器的每个光学路径长度的估计透射值,
确定使所述检测透射值与所述估计透射值之间的误差最小化的所述测量样品的衰减系数。
所述计算估计透射值的步骤可以包括以下步骤
基于相应的检测透射值计算所述测量样品的估计衰减系数,以及
基于所述估计衰减系数计算估计透射值。
所述确定所述测量样品的衰减系数的步骤可以是一个迭代过程。
所述方法可以进一步包括以下步骤:确定作为所述测量样品的折射率的函数的每个光学路径长度的值。
根据本发明的又一方面,提供了一种使用分光光度计分析设置在如本文所述的样品保持器中的测量样品的计算机实现的方法。所述分光光度计包括用于发射穿过所述测量样品的光的光源、用于检测穿过所述测量样品的光强的检测器、以及较高空间频率调制图案,所述较高空间频率调制图案与所述光源相关联,使得高空间频率特征能够由所述检测器检测到。所述方法可以包括以下步骤:
提供预定调制模型,用于预测对应于预定折射率范围内的每个折射率并且对应于每个光学路径长度的所述检测器的光强值,
获得对应于每个光学路径长度的检测透射值,所述检测透射值基于来自所述检测器的一个或多个光强测量值,
基于所述预定调制模型计算对应于每个光学路径长度和每个折射率的所述测量样品的估计透射值,
确定使所述检测透射值与所述估计透射值之间的误差最小化的所述测量样品的衰减系数。
根据本发明的另一方面,提供了一种使用分光光度计分析设置在如本文所述的样品保持器中的测量样品的计算机实现的方法。所述分光光度计包括用于发射穿过所述测量样品的光的光源、用于检测代表穿过所述测量样品的光强的照明信号的检测器、以及较高空间频率调制图案,所述较高空间频率调制图案与所述光源相关联,使得高空间频率特征能够在所述检测器的照明信号中被检测到。所述方法可以包括以下步骤:
对所述照明信号进行滤波,以获得其中从所述照明信号中提取了所述高空间频率特征的第一滤波照明数据以及其中从所述照明信号中去除了所述高空间频率特征的第二滤波照明数据,
基于所述第一滤波照明数据计算折射率值,
获得对应于每个光学路径长度的检测透射值,所述检测透射值基于所述第二滤波照明数据,
基于所计算的折射率,计算对应于每个光学路径长度的所述测量样品的估计透射值,
确定使所述检测透射值与所述估计透射值之间的误差最小化的所述测量样品的衰减系数。
根据本发明的又一方面,提供了一种或多种有形的非暂时性计算机可读介质,其具有用于执行如本文所述的计算机实现的方法的计算机可执行指令。
根据本发明的另一方面,提供了一种制造本文所述样品保持器的方法。所述方法可以包括以下步骤:
形成所述样品保持器的第一部分以提供所述第一表面,以及
形成所述样品保持器的第二部分以提供所述第二表面,
将所述第一部分附接到所述第二部分,使得所述第一部分能够相对于所述第二部分在以下两个位置之间移动
打开位置,所述打开位置允许被测量样品的放置或移除,以及
闭合位置,在所述闭合位置中,所述第一表面相对于所述第二表面处于固定位置,以提供横跨所述样品保持器的连续可变截面。
根据本发明的另一方面,提供了一种制造本文所述样品保持器的方法,所述方法包括以下步骤:
形成所述样品保持器的第一部分以提供所述第一表面,以及
形成所述样品保持器的第二部分以提供所述第二表面,
将所述第一部分附接到所述第二部分,使得所述第一表面相对于所述第二表面固定,以提供横跨所述样品保持器的连续可变截面,
形成开口以允许将所述测量样品注入所述第一部分与所述第二部分之间的空腔中。
为了更容易理解和实施本发明,现在将参照附图,仅通过举例的方式描述本发明的一个或多个优选实施方案。
附图说明
图1A是示出根据本发明实施方案的样品保持器的部分截面的示意图。
图1B是示出根据本发明另一实施方案的样品保持器的部分截面的示意图。
图2是根据本发明一个实施方案的分光光度计的示意图。
图3是根据本发明另一实施方案的分光光度计的示意图。
图4是根据本发明的另一实施方案的分光光度计的示意图。
图5是示出根据本发明实施方案的使用分光光度计分析样品的方法的流程图。
图6A是X-Y坐标图,示出了如图1A所示的样品保持器的第一表面与第二表面之间预先计算的采样路径长度。
图6B是X-Y坐标图,示出了对于具有不同吸光度的样品使用图1A的样品保持器的相对样品透射率。相对于一维阵列检测器上的多个像素位置绘制相对样品透射率。
图7A是XYZ坐标图,示出了使用图1A的样品保持器的相对样品透射率。相对于二维阵列检测器上的多个像素位置绘制相对样品透射率。
图7B是XYZ坐标图,示出了使用图1A的样品保持器的相对样品透射率。与图7A相比,对应于图7B的样品具有更高的吸光度。相对于二维阵列检测器上的多个像素位置绘制相对样品透射率。
图8是X-Y坐标图,示出了测量透射值和衰减系数和相对源强的参数优化后的预期透射值。
图9是示出根据本发明实施方案的使用分光光度计分析样品的方法的流程图。
图10A是线图,示出了当光源照明被掩模调制时阵列检测器上的强度变化,掩模根据图2所示的分光光度计配置产生规则间隔的细窄阴影。
图10B是线图,示出了由于折射率变化而在阵列检测器上的高空间频率特征的预期位移。
图11A和图11B是线图,示出了从原始检测器信号中去除高空间频率特征的低通滤波输出。
具体实施方式
图1A示出了根据本发明实施方案的用于分子吸收光谱法的样品保持器100的部分截面图。样品保持器100具有提供具有第一预定几何形状的第一曲面102的第一部分112和提供具有第二预定几何形状的第二基本平坦表面104的第二部分114。虽然在附图中没有具体示出,但是第一曲面102的第一预定几何形状可以是球体、抛物面圆柱体、圆形抛物面和椭圆抛物面中的任何一种。
这些几何形状的对称性质的一个优点是,可以容易地检测到任何现象,例如样品201中的气泡或第一和第二表面102、104之间的空腔填充不足,从而可以采取适当的行动来纠正任何误差。此外,在第一曲面102是球形的实施方案中,由于球形几何形状的对称性质,样品保持器100的第一和第二部分102、104之间的角度的任何变化都不会影响操作。
样品保持器100被配置成在第一表面102与第二表面104之间保持测量样品201(也参见图2),使得第一表面102与第二表面104之间的距离d(图1A)限定了样品保持器100的多个不同的光学路径长度106。特别地,第一表面102和第二表面104的预定几何形状提供了横跨样品保持器100的连续可变截面,以便提供不同光学路径长度106的连续范围。
如图1A所示,样品保持器100的连续可变截面包括第一测量区108,其中第一表面102与第二表面104之间的最小距离定义了最小光学路径长度106。最小光学路径长度106可以为零,在这种情况下,第一表面102与第一测量区108中的第二表面104接触。可替代地,最小光学路径长度106是接近零的小值,在这种情况下,第一表面102不与第一测量区108中的第二表面104接触。样品保持器100的连续可变截面进一步包括第二测量区110,其中第一表面与第二表面之间的最大距离限定了最大光学路径长度106。提供了从第一测量区108中的最小路径长度106到第二测量区110中的最大路径长度106的不同光学路径长度106的连续范围。
由于样品保持器100关于与第一测量区108相交的中心平面(未示出)对称,在中心平面的一侧设置第一组连续范围的光学路径长度106,在中心平面的相对侧设置与第一组相匹配的第二组连续范围的光学路径长度106。在第一曲面102具有规则几何形状(例如球体、抛物面圆柱体、圆形抛物面或椭圆抛物面)的实施方案中,可以提供一组无限的匹配光学路径长度连续范围。通常,每组连续的光学路径长度范围可提供约1μm至3mm数量级的光学路径长度变化。在连续的路径长度范围内提供小的路径长度变化的能力允许为大范围的不同样品浓度确定合适的测量范围,并且在合适的测量范围内进行高准确度测量。
虽然没有在图1A中示出,但是应当理解,第一部分112可以可移动地附接到或固定地附接到第二部分114。可替代地,第一部分112可以与第二部分114分开。样品保持器100可以由任何合适的材料制成,包括一种或多种塑料材料和/或玻璃材料。
有利地,可以产生具有非常高准确度的连续范围的光学路径长度106,因为光学路径长度的准确度仅取决于第一和第二表面102、104的几何形状的准确度。使用今天的光学制造技术,有可能在预定的表面几何形状中实现高准确度。
在使用中,来自光源208(见图2)的光113入射到样品保持器100的一侧。光束113穿过样品保持器100和测量样品201,并透射到检测器202上。由检测器202检测到的不同波长的透射光可以用于构建测量样品201的吸收光谱,如下面参考图2至图4进一步详细描述的。
典型地,在样品保持器100(或第一测量区108)的中心附近,其中路径长度接近0,光束108几乎没有衰减。在路径长度最大的边缘(或第二测量区110)处,光束108被更强地衰减(参见图6B)。
实际上,穿过样品保持器100和测量样品201的光110发生折射116。在一些实施方案中,当分析样品201时,有必要通过确定折射率的值来考虑光110的折射的影响。在这些实施方案中,样品201的折射率影响由检测器202检测到的强度图案或吸收光谱。如图2所示,可以提供掩模210来将已知的阴影图案投射到检测器202的表面上。可以检测该阴影图案的变化来计算折射率。这可用于校正吸收光谱或作为额外的分析输出,或两者兼而有之。下面将参考图9至图11B进一步详细讨论与折射率相关的计算。
图1B示出了根据本发明另一实施方案的样品保持器120的部分截面图。样品保持器120具有弯曲的第一表面122和基本平坦的第二表面124。第一表面122是任意光滑的非球面。图1B中的相似标记指的是先前参考图1A描述的相似特征。第一表面122和第二表面124的预定几何形状提供了横跨样品保持器120的连续可变截面,从而提供了不同光学路径长度106的连续范围。
图2示出了根据本发明一个实施方案的分光光度计200。通常,分光光度计被配置为在紫外可见(UV-Vis)范围内工作。分光光度计200包括根据图1A所示的部分截面的样品保持器100。在分光光度计200中,样品保持器100包括平凸透镜204,该平凸透镜在其下侧提供第一部分112和第一曲面。样品保持器100还包括基本平坦的窗口206,该窗口在窗口206的上侧提供第二部分和第二基本平坦的表面。平凸透镜204在透镜204的中心部分接触或接近接触窗口206。测量样品201设置在透镜204与窗口206之间。
在分光光度计200中,来自光源208的光113被投射到掩模210上,用于在光源照明中产生更高的空间频率调制图案。掩模210在检测器202上创建阴影图案,以便于计算折射率。阴影图案的变化是可检测的,并且可以基于阴影图案的测量变化来估计折射率。样品的吸收率是折射率的虚部。折射率的测量实部可用于校正样品的吸收率,如下面参考图9至图11B进一步详细讨论的。
在图2所示的特定配置中,聚焦元件212和213将掩模210成像到检测器202上,穿过样品保持器100和测量样品201。检测器202检测光113通过样品保持器100和测量样品201的透射。由检测器202检测到的透射率例如由处理器处理,以确定测量样品201的吸收光谱和其他特性。虽然图2中未示出,但应当理解,处理器可以是任何合适的处理器,或者内置到分光光度计200硬件中,或者单独提供给分光光度计200。
此外,在其他具体实施方案中,在不脱离本发明范围的情况下,分光光度计200的不同配置是可能的。例如,在一些实施方案中,波长选择元件可以设置在样品保持器100之前的光路中。在一些实施方案中,单色仪可以设置在样品201上游的光路中。在一些实施方案中,可以在样品201下游的光路中提供多色器。
此外,透镜204相对于检测器202的位置并不重要,因为吸收光谱中对称图案的中心可以容易地确定为参考。实际上,样品保持器100可以设置在分光光度计200内相对于光源208和检测器202的任何合适位置。
典型地,检测器202是二维(2D)阵列检测器。实际上,检测器202可以包括电荷耦合器件(CCD)阵列检测器、互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器阵列检测器、或微测辐射热计阵列检测器。在一些实施方案中,可以使用一维(1D)阵列检测器。
在一些实施方案中,光源208可以提供白光,并且波长选择性可以通过测量样品201之后的多色器来提供。这种配置可用于例如在2D阵列检测器上创建透射与波长和路径长度的输出,其中波长分散在一个维度上,路径长度变化分布在另一个维度上。
在一些实施方案中,LED(260、280、320nm)可用于光源208。在这些实施方案中,不需要额外的波长选择性来进行样品分析。
在一些实施方案中,预色散元件可以设置在测量样品201之前的光路中。在一些实施方案中,后色散元件可以设置在样品201之后的光路中。
典型地,对于高吸光度样品201,吸收图像的外部通常具有非常小的光和差的信噪比。在一些实施方案中,可以将优化的加权函数应用于计算,使得吸收光谱图像中有足够的光来给出良好信噪比的部分被包括在内,而差区域被排除。
此外,检测器202不必在非常低的光水平下工作,因为对于样品保持器100中的任何样品201,相关联的吸收光谱图像将总是包括具有相对高光水平的区域。
在图2所示的分光光度计200中,光源208是静止的,并且同时向整个测量样品201提供光。对于分光光度计200,整个仪器不需要移动部件。
在如图3所示的替代实施方案中,分光光度计300的光源302提供相对于测量样品201可移动的光束304,以从样品保持器100的一端扫描测量样品201到样品保持器100的相对端。根据该配置,当光源302从样品保持器100的一端移动到另一端时,检测器202依序检测针对路径长度范围内每个路径长度的透射值。图3所示的分光光度计300可用于在近红外(NIR)或红外(IR)范围内工作。通过使用如图3所示的可移动光源302,可以通过将光束304设置为基本垂直于表面122和样品201来降低折射率的影响。
一般来说,红外测量带来的挑战通常与UV-VIS光谱范围无关。特别重要的是水对某些波长范围的高度衰减。例如,大约1650cm-1的蛋白质酰胺I带被以1653cm-1为中心的吸水带明显重叠。这意味着,为了能够检测小浓度的蛋白质,分光光度计300必须能够在存在由溶剂(水)引起的巨大吸光度的情况下分辨由分析物引起的吸光度的非常小的变化。样品保持器100中的第一表面102和第二表面104的几何形状的可重复性允许准确减去参考测量值,这不依赖于表面102、104之间的间距。
在另一个实施方案中,光源302是静止的,样品保持器100是可移动的,以允许光束304从样品保持器100的一端移动到另一端,以便实现具有相对于时间变化的路径长度的测量。在上述实施方案中,单点检测器可用于检测通过样品201的光透射。在一个例子中,单点检测器可以是碲化镉汞(MCT)检测器。在一些实施方案中,光源302可以与单点检测器径向对准。
实际上,样品保持器100的移动可以相对较小,例如在几毫米的数量级。在一些实施方案中,样品保持器100的移动可以使用弯曲机构来实现。在一些实施方案中,检测器202可以相对于样品201是可移动的。
在另一替代实施方案中,为了在IR或NIR范围内工作,分光光度计可以被配置成允许在两个样品之间进行比较。特别地,仅溶剂样品的吸收可以与包含溶剂和分析物的样品进行比较。分光光度计可以包括两个相同的样品保持器来保持两个样品,或者具有两个腔来保持两个样品的单个样品保持器。比较分析可以使用双光束配置同时进行,其中光束同时投射到两个样品上。可替代地,可以提供单个样品保持器来依序保持两个样品。
在这些实施方案中,分光光度计可以包括用于控制测量样品温度的温度控制器。特别地,所述温度控制器可用于确保样品的温度在测量过程中基本恒定。温度的变化经常会引起溶剂吸光度的变化。因此,通过使用温度控制器来保持测量样品中基本恒定的温度,可以最小化与温度变化相关的误差。特别地,如果同时进行两个比较样品的测量,温度控制器可以被设置成在空间上保持样品之间基本恒定的温度。可替代地,如果依序进行两个比较样品的测量,温度控制器可以被设置为在时间上为样品保持基本恒定的温度。
实际上,量子级联激光器(QCL)可以用作光源302。QCL是单色IR辐射的强大来源。它是一个相对较小的光源,可以有效地耦合到光学系统。相对高的功率使得能够相对有效地获得结果。此外,对检测器的要求将不那么重要,从而可能节省成本和复杂性。例如,可以使用室温或热电冷却检测器来代替低温温度检测器。在一些应用中,只有少数波长是感兴趣的。对于这样的应用,使用QCL源将是特别合适的。
在一些实施方案中,检测器202可以是微测辐射热计阵列检测器。在其他实施方案中,检测器202可以是1D或2D碲化镉汞检测器。
图4示出了根据本发明的另一实施方案的分光光度计400。在分光光度计400中,样品保持器402包括在其下侧提供弯曲的第一表面的平凸透镜204,以及在其上侧提供基本平坦的第二表面的镜面样品载玻片404。样品保持器402适于在第一与第二表面之间保持测量样品201。在分光光度计400中,来自光源406的光束经由聚焦镜408被重定向到样品保持器402和样品201上。镜面样品载玻片404通过样品201和平凸透镜204将光反射回成像镜410上,该成像镜将反射光聚焦到位于样品201与光源406同一侧的检测器412上。当光两次穿过测量的样品201时,在图4所示的实施方案中检测到的有效路径长度将大约加倍。可选地,可以提供掩模403用于在检测器412上创建阴影图案,以便于折射率的计算,如下面进一步详细讨论的。
下面将参考图5至图11B讨论根据本发明实施方案的使用样品保持器和分光光度计计算测量样品201中分析物的衰减系数的方法。典型地,下面讨论的方法是在计算机处理器上自动执行的计算机实现的方法,该计算机处理器与分光光度计一起提供或单独提供给分光光度计。计算机处理器可以包括安装在其上的软件应用,用于执行计算机实现的方法的一个或多个步骤。在替代实施方案中,软件应用可以是经由诸如互联网的网络可访问的基于云的应用。在一些实施方案中,软件应用可以经由本地网络远程访问。
来自1D或2D阵列检测器(或来自单点检测器)的每个像素测量通过光路测量光强。通常,每个像素测量对应于样品保持器100的路径长度。实际上,光路包括来自光学部件的透射和/或反射损耗、部件之间界面处的透射损耗、由于检测器的量子效率引起的检测损耗以及测量样品201内的吸光度。
虽然下面的计算方法涉及来自阵列检测器的像素测量,但是应当理解,如图3所示的具有可移动光源的替代配置可以使用等效的计算。
在图5的流程图所示的计算方法500中,假设不同样品之间的样品折射率变化很小,或者样品保持器100的几何形状被设计成保持由于折射引起的图像移动可以忽略不计。在一些实施方案中,这可以通过提供样品保持器100来实现,其中第一曲面102具有曲率半径相对大的规则几何形状。在这些场景中,可以基于样品保持器100的第一和第二表面102、104的预定几何形状来预先计算对应于每个像素的样品201内的光学路径长度。在一个例子中,可以使用商业上可获得的光学光线跟踪软件程序来预先计算路径长度。在一个实施方案中,在503中,每个检测器像素的采样路径长度的查找表可以针对特定的样品保持器设计预先计算,并存储在计算机处理器的存储器中。可替代地,计算机处理器可以基于样品保持器100的预定几何形状实时计算采样路径长度。
一旦知道了每个像素的光学路径长度,就可以使用下面的计算方法,而不管检测器阵列是一维还是二维,或者是否使用多个检测器的任意定位。这种计算方法也可以应用于具有不同光学几何形状和不同采样路径长度分布的样品保持器。
对于图5至图11B中提供的示例性图示,当与1D阵列检测器一起使用时,采样路径长度用于具有用于第一表面的抛物面圆柱体和基本平坦的第二表面的样品保持器,或者当与2D阵列检测器一起使用时,用于具有球形第一表面和基本平坦的第二表面的样品保持器。
在方法500的步骤502中,将参考或基线样品放置在样品保持器100中。检测器202的每个像素接收来自光源208的光,所述光由于总光路和检测器灵敏度而具有一些衰减。路径衰减随着时间的推移有效地保持恒定,但是源强可能不会。在检测器202的每个像素处接收的信号在这里被称为参考信号Sref。参考信号由检测器202测量并由计算机处理器记录。每个检测器像素的测量和记录的参考信号Sref可以使用等式(1)表示如下:
Sref[p]=Iref×T[p] (1)
其中:
Sref[p]是检测器像素p接收的参考信号,
Iref是参考信号Sref[p]被测量和记录时的源强,
T[p]是从光源208到检测器像素p的总光路(包括参考采样路径)的透射。
在步骤504,测量样品q被放置在样品保持器100中。到达每个检测器像素的光由于样品q的吸光而衰减。在检测器202的每个像素处接收的信号在本文中被称为采样信号Sq。每个检测器像素的测量和记录的采样信号Sq可以使用等式(2)表示如下:
其中:
Sq[p]是检测器像素p接收的针对样品q的采样信号,
Iq是样品q的采样信号被测量和记录时的源强,
T[p]是总光路的透射
Aq是样品q与参考样品之间的十进衰减系数之差。
L[p]是预先计算的像素p的采样路径长度(例如,在503中,由数据库中的查找表提供)。
在步骤506中,等式(1)和(2)的比值抵消变量T[p](总光路的透射),下面的等式(3)可以如下导出。
或者,
其中:
Tq[p]表示检测器像素p的针对样品q的样品透射,其中,不校正源变化(即像素p的单光束样品透射率)。
Kq是相对于参考测量值的样品q的源强比。
当在每个像素p处检测到的信号为等式(3)提供一组新的值时,源的相对强度(Kq)和样品的相对衰减系数(Aq)可以在步骤506中基于检测到的信号和503中预先计算的路径长度来计算。
例如,图6A中的图表示出了对应于线性阵列检测器的像素的采样路径长度的范围。图6B中的图表示出了对于具有不同吸光度的多个不同样品,线性阵列检测器的每个像素的预期相对样品透射率。对于对应于零或接近零的采样路径长度(即,在两个光学表面接触的样品保持器的第一测量区108中)的任何检测器像素,预期会有异常透射。对于这些光路,从光学表面到样品的菲涅耳损耗消失,并在预期的透射中产生不连续性。因此,对应于零或接近零的采样路径长度的检测器像素可以从测量中省略。
图7A和图7B中的图表示出了2D阵列检测器的相对样品透射率,其中样品保持器100包括球形第一表面102和平坦第二表面104。图7B中对应于透射值的样品吸光度高于图7A中的样品吸光度。
在一个实施方案中,在应用上述等式(1)至(3)来执行计算方法500之前,处理器将图7A和图7B所示的2D数据点转换为多个1D透射与路径长度阵列(例如,如图6B所示)。
在步骤508,处理器使用等式(3)中的源的相对强度(Kq)和样品的相对衰减系数(Aq)的初始猜测值或近似值来计算估计透射值,并使用优化算法来细化这些值,以确定样品的衰减系数(Aq)的最终值,该最终值使每个像素的估计透射值与相应的检测透射值之间的误差最小化。在一个实施方案中,可以使用基于以下FitError函数(4)的迭代优化处理:
最小化FitError(Aq,Kq)服从于Aq≥0;Kq≥0 (4)
FitError函数计算一组预测的透射值,并生成一个值,表示这些透射值与测量透射值相差多远。最小化误差的一种选择是最小化平方差的和,例如如下所示:
FitError=Sum((Tq[p]-Test[p])2)
图8中的坐标图是由数据点“+”标记的测量透射率和在步骤508中应用优化算法之后由数据点“·”标记的拟合透射率的曲线图。本文中讨论的迭代优化过程不限于规则对称的光学表面,从而有利地避免了过度约束光学设计,同时提供了系统灵活性。
在一些情况下,由于折射率的影响,在检测器202处接收的信号的失真不能被忽略。典型地,在这些场景中,对应于每个检测器像素的路径长度由于折射而改变。
当样品保持器100的第一表面102的几何形状是抛物面圆柱体或球体,并且第二表面104基本上是平坦的时,折射率的变化将产生与样品衰减系数的变化类似的透射图案变化。测量中的这种模糊性可以以多种不同的方式解决,例如:
(a)通过使用均匀的光源照明并选择样品保持器100的第一和第二表面102、104的几何形状,使得当折射率或衰减系数改变时,透射图案以容易区分的方式改变。
(b)在光源照明中包括较高空间频率调制图案(例如,在光路中使用图案化滤波器210,将阴影图案聚焦在检测器202上,如图2所示),使得样品衰减系数的变化产生透射图案中基于吸收的变化,但是折射率的变化扭曲了空间调制的位置。
在一个实施方案中,方案(a)使用样品保持器100的第一表面102的几何形状,该几何形状在两个不同维度上具有不同的表面斜率,例如抛物面表面,其中:
z=a×x2+b×y2
其中,a≠b
在该实施方案中,光学光线跟踪程序用于计算对应于每个检测器像素的采样路径长度。在这种情况下,路径长度取决于样品的折射率。通过使用具有不同假设折射率的多个光线跟踪,可以为每个检测器像素创建作为折射率函数的路径长度模型。作为折射率函数的路径长度查找表或定义特定样品保持器表面几何形状的路径长度和折射率之间关系的一组预定函数可以存储在存储器510中(参见图5)。
对于上述方案(a),每个路径长度是样品折射率n的函数以及检测器像素的函数,即L[p,n]。可以遵循上面参考图5描述的方法500的一般步骤。然而,方法500考虑折射率作为要优化的额外参数。在优化的每次迭代中,可以基于下面的等式(5)来确定估计的透射:
在上述情况(b)中,高空间频率特征被有意引入光源照明中,例如如图2所示。基于折射率变化的检测器信号中的失真将影响由检测器202检测到的高空间频率特征的位置。为了解决吸光度和折射率的组合影响,下面参考图9至图11B描述两种示例方法。
图9是示出使用空间滤波确定测量样品201的衰减系数的方法900的流程图。根据方法900,光源照明提供可以由检测器202的像素分辨的快速变化的空间图案。特别是,折射率的任何变化都会拉伸或扭曲检测器信号图案。检测器各部分中图案的拉伸量取决于样品保持器100的表面102、104的光学几何形状,但与样品201的衰减系数无关。
通过提供采样路径长度的平滑变化,检测器202上照明的低空间频率模式允许估计样品的衰减系数。如所讨论的,由于折射率差异引起的失真在该估计中引入误差。根据方法900的折射率的独立估计允许校正这些误差。
在步骤902,对原始检测器信号应用空间滤波,将高空间频率特征与低空间频率特征分离。图10A示出了当光源照明被在检测器202处产生规则间隔的细窄阴影的光学掩模210空间调制时包括从阵列检测器202接收的高空间频率特征的原始检测器信号。如图10A所示,当样品吸光度变化且折射率保持恒定时,高空间频率特征在检测器信号中对齐。图10B示出了当样品吸光度保持恒定且折射率变化时,高空间频率特征的横向位移。
在步骤904,可以基于提取的检测器信号的高空间频率分量来估计样品201的折射率。在一个实施方案中,可以使用峰值发现技术来估计高空间频率特征之间的间距。在一个实施方案中,具有不同折射率的多个光线跟踪用于创建模型或查找表,其用于确定特征间距和相应折射率之间的关系。在这些实施方案中,可以确定最佳预测观察到的特征间距的折射率n。
在步骤902,检测器信号也被滤波以提取低空间频率,以提供衰减或避免高频照明特征的每个检测器像素的一组透射值:
Tq=LPF(Sq)/LPF(Sref)
其中:
LPF是一个低通空间滤波器(具有被选择用于匹配检测器的维数:1D或2D)
Sref是从参考样品接收的像素信号阵列
Sq是从样品q接收的像素信号阵列
Tq是对于所有像素p的像素透射阵列Tq[p]
图11A示出了中值滤波和Savitzky-Golay滤波的组合的输出,以去除高空间频率特征。图11B示出了滤光器的输出,该滤光器排除了在预期样品折射率范围内可能受细窄阴影影响的任何像素。
在步骤906,然后可以将先前在步骤904中估计的折射率n代入L[p,n],允许参数优化来估计下式(6)中的参数Kq(源的相对强度)和Aq(样品q的相对衰减系数):
在步骤908,应用优化算法以最小化目标函数中的拟合误差,例如:
FitError=Sum((Tq[p]–Test[p])2)
优化还提供了对样品衰减系数Aq的估计,其针对样品折射率的失真而被校正。
根据另一示例方法,可以创建调制模型来确定每个检测器像素的相对强度如何作为折射率的函数而变化。调制模型可以包括查找表,该查找表为样品衰减系数和折射率的任何可能组合提供检测器像素上的预期相对信号分布。通常,如果可以预测任何样品衰减系数和折射率的预期相对照明模式,那么在测量由样品产生的相对照明模式之后,可以确定将预测与已经观察到的匹配的模式的衰减系数和折射率。
调制模块可用于优化参数(包括折射率n),以根据下面的等式(7)得到与观察到的透射相匹配的估计透射:
其中,M[p,n]是一个调制模型,其确定对于给定的折射率n源空间调制如何出现在检测器上的每个像素p处。与上述方法类似,参数n、Kq和Aq的优化,可用于最小化目标函数中的拟合误差,例如
FitError=Sum((Tq[p]-Test[p])2)
解释
包括权利要求在内的本说明书旨在解释如下:
说明书中描述的实施方案或示例旨在说明本发明,而不是限制其范围。如本领域技术人员容易想到的,本发明能够通过各种修改和添加来实施。因此,应当理解,本发明的范围不限于所描述或图示的确切构造和操作,而是仅由所附权利要求来限定。
说明书中方法步骤或产品元素的仅仅公开不应该被解释为对于这里要求保护的发明是必要的,除非有明确声明,或者在权利要求中有明确陈述。
权利要求中的术语具有本领域普通技术人员在相关日期已经给出的最广泛的含义范围。
除非另有明确说明,否则术语“一”、“一个”意味着“一个或多个”。
无论是本申请的标题还是摘要都不应被视为以任何方式限制所要求的发明的范围。
当权利要求的前序叙述了所要求保护的发明的目的、益处或可能的用途时,它并不将所要求保护的发明限制为仅具有该目的、益处或可能的用途。
在说明书(包括权利要求)中,术语“包括”以及该术语的变体(例如“包含”或“其包括”)用于表示“包括但不限于”,除非另有明确说明,或者除非在上下文或用法中需要该术语的排他性解释。
在此引用的任何文献的披露内容作为本公开文本的一部分通过引用结合到本专利申请中,但是仅用于书面描述和实施的目的,并且决不应该用于限制、定义或以其他方式解释本申请的任何术语,其中本申请在没有通过引用结合的情况下不会无法提供可确定的含义。任何以引用方式并入的文件,其本身并不构成对任何并入文件中所包含的任何声明、观点或论点的认可或批准。
Claims (29)
1.一种用于分子吸收光谱法的样品保持器,所述样品保持器包括:
具有第一预定几何形状的第一表面,以及
具有第二预定几何形状的第二表面,所述第一表面与所述第二表面相对,
所述样品保持器被配置为在所述第一表面与所述第二表面之间保持测量样品,使得所述第一表面与所述第二表面之间的距离限定所述样品保持器的光学路径长度,
其中,所述第一表面和所述第二表面的预定几何形状提供横跨所述样品保持器的连续可变截面,以便提供连续的光学路径长度范围。
2.根据权利要求1所述的样品保持器,其中,所述连续可变截面包括
第一测量区,在所述第一测量区中所述第一表面与所述第二表面之间的最小距离限定了最小光学路径长度,以及
第二测量区,在所述第二测量区中所述第一表面与所述第二表面之间的最大距离限定了最大光学路径长度,并且
其中,所述连续可变截面在所述第一测量区与所述第二测量区之间提供连续的光学路径长度范围。
3.根据权利要求2所述的样品保持器,其中,在所述第一测量区中,所述第一表面接触所述第二表面以提供为零的最小光学路径长度。
4.根据前述权利要求中任一项所述的样品保持器,其中,所述连续的光学路径长度范围提供了大约1μm至3mm数量级的路径长度变化。
5.根据前述权利要求中任一项所述的样品保持器,其中,所述第一表面是弯曲的。
6.根据权利要求5所述的样品保持器,其中,所述第一预定几何形状和所述第二预定几何形状中的一者或两者由以下中的任一项定义:
球体,
抛物面圆柱体,
圆形抛物面,
椭圆抛物面,以及
任意光滑的非球面。
7.根据权利要求5所述的样品保持器,其中,所述第二表面基本上是平坦的。
8.根据前述权利要求中任一项所述的样品保持器,其中,所述样品保持器包括
平凸透镜,其具有提供所述第一表面的弯曲侧,所述平凸透镜能够在所述第一表面与所述第二表面分离的打开位置与所述第一表面接触所述第二表面并与所述第二表面相对设置的闭合位置之间移动。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的样品保持器,其中,所述第一表面的位置相对于所述第二表面是固定的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的样品保持器,其中,所述样品保持器由一种或多种塑料材料制成。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的样品保持器,其中,所述样品保持器由一种或多种玻璃材料制成。
12.一种分光光度计,其具有根据前述权利要求中任一项所述的样品保持器。
13.根据权利要求12所述的分光光度计,其中,所述分光光度计在UV-VIS范围内工作。
14.根据权利要求12所述的分光光度计,其中,所述分光光度计在NIR或IR范围内工作。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的分光光度计,其进一步包括检测器,用于在所述连续的光学路径长度范围的每个路径长度处检测所述测量样品的吸光度,其中,所述检测器是下列检测器中的任意一种:
单点检测器,
一维阵列检测器,或
二维阵列检测器。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的分光光度计,其进一步包括光源,所述光源包括以下中的任一项:
宽带光源,
LED,以及
激光。
17.根据权利要求16所述的分光光度计,其中,所述光源在整个所述测量样品上同时地提供光线。
18.根据权利要求16所述的分光光度计,其中,所述光源提供光束,所述光束相对于所述测量样品可移动以扫描所述测量样品,使得能够依序检测针对所述路径长度范围内每个路径长度的透射值。
19.根据权利要求16或17所述的分光光度计,其进一步包括掩模,所述掩膜位于所述光源与所述样品保持器之间,使得穿过所述掩模的光投射预定的阴影图案以供所述检测器检测,所述分光光度计被配置成基于所检测到的阴影图案来校准由所述样品保持器的所述第一和第二表面中的一者或两者处的折射引起的影响。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的分光光度计,其进一步包括用于控制所述测量样品的温度的温度控制器。
21.一种使用分光光度计分析设置在根据权利要求1至11中任一项所述的样品保持器中的测量样品的计算机实现的方法,所述分光光度计具有用于发射穿过所述测量样品的光的光源以及用于检测穿过所述测量样品的光强的检测器,所述方法包括以下步骤:
获得对应于所述样品保持器的每个光学路径长度的检测透射值,所述检测透射值基于来自所述检测器的一个或多个光强测量值,
计算对应于所述样品保持器的每个光学路径长度的估计透射值,
确定使所述检测透射值与所述估计透射值之间的误差最小化的所述测量样品的衰减系数。
22.根据权利要求21所述的方法,其中,所述计算估计透射值的步骤包括
基于相应的检测透射值计算所述测量样品的估计衰减系数,以及
基于所述估计衰减系数计算估计透射值。
23.根据权利要求21至22中任一项所述的方法,其中,所述确定所述测量样品的衰减系数的步骤是一个迭代过程。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法,其进一步包括以下步骤:
确定作为所述测量样品的折射率的函数的每个光学路径长度的值。
25.一种使用分光光度计分析设置在根据权利要求1至11中任一项所述的样品保持器中的测量样品的计算机实现的方法,所述分光光度计具有用于发射穿过所述测量样品的光的光源、用于检测穿过所述测量样品的光强的检测器、以及较高空间频率调制图案,所述较高空间频率调制图案与所述光源相关联,使得高空间频率特征能够由所述检测器检测到,所述方法包括以下步骤:
提供预定调制模型,用于预测对应于预定折射率范围内的每个折射率并且对应于每个光学路径长度的所述检测器的光强值,
获得对应于每个光学路径长度的检测透射值,所述检测透射值基于来自所述检测器的一个或多个光强测量值,
基于所述预定调制模型计算对应于每个光学路径长度和每个折射率的所述测量样品的估计透射值,
确定使所述检测透射值与所述估计透射值之间的误差最小化的所述测量样品的衰减系数。
26.一种使用分光光度计分析设置在根据权利要求1至11中任一项所述的样品保持器中的测量样品的计算机实现的方法,所述分光光度计包括用于发射穿过所述测量样品的光的光源、用于检测代表穿过所述测量样品的光强的照明信号的检测器、以及较高空间频率调制图案,所述较高空间频率调制图案与所述光源相关联,使得高空间频率特征能够在所述检测器的照明信号中被检测到,所述方法包括以下步骤:
对所述照明信号进行滤波,以获得其中从所述照明信号中提取了所述高空间频率特征的第一滤波照明数据以及其中从所述照明信号中去除了所述高空间频率特征的第二滤波照明数据,
基于所述第一滤波照明数据计算折射率值,
获得对应于每个光学路径长度的检测透射值,所述检测透射值基于所述第二滤波照明数据,
基于所计算的折射率,计算对应于每个光学路径长度的所述测量样品的估计透射值,确定使所述检测透射值与所述估计透射值之间的误差最小化的所述测量样品的衰减系数。
27.一种或多种有形的非暂时性计算机可读介质,其具有用于执行根据前述权利要求21至26中任一项所述的计算机实现的方法的计算机可执行指令。
28.一种制造根据权利要求1至11中任一项所述的样品保持器的方法,其中,所述方法包括
形成所述样品保持器的第一部分以提供所述第一表面,以及
形成所述样品保持器的第二部分以提供所述第二表面,
将所述第一部分附接到所述第二部分,使得所述第一部分能够相对于所述第二部分在以下两个位置之间移动
打开位置,所述打开位置允许被测量样品的放置或移除,以及
闭合位置,在所述闭合位置中,所述第一表面相对于所述第二表面处于固定位置,以提供横跨所述样品保持器的连续可变截面。
29.一种制造根据权利要求1至11中任一项所述的样品保持器的方法,其中,所述方法包括
形成所述样品保持器的第一部分以提供所述第一表面,以及
形成所述样品保持器的第二部分以提供所述第二表面,
将所述第一部分附接到所述第二部分,使得所述第一表面相对于所述第二表面固定,以提供横跨所述样品保持器的连续可变截面,
形成开口以允许将所述测量样品注入所述第一部分与所述第二部分之间的空腔中。
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