DE60109128T2

DE60109128T2 - Vorrichtung zur Bestimmung des Volumens einer einzigen roten Blutzelle

Info

Publication number: DE60109128T2
Application number: DE60109128T
Authority: DE
Inventors: Klaus W. Timonioum Berndt
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2001-01-02
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2021-12-08
Also published as: ATE290204T1; EP1219951A1; EP1219951B1; DE60109128D1; MXPA01013120A; JP2002323437A; US6714287B2; US20020126271A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der quantitativen Mikrospektroskopie und insbesondere eine Vorrichtung zum Bestimmen des Volumens einzelner roter Blutkörperchen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Bestimmung des Volumens einzelner roter Blutkörperchen und die auf der Grundlage dieser Messung erfolgende Berechnung des durchschnittlichen Zellvolumens (Mean Cell Volume; "MCV") und der Verteilungsbreite der roten Blutkörperchen (Red Cell Distribution Width; "RDW") ist von klinischem Interesse. Üblicherweise werden Systeme verwendet, die auf der Messung der elektrischen Impedanz (Coulter-Zähler) oder auf der Lichtstreuung (Durchflußzytometer) basieren (siehe z.B. J.B. Henry, "Clinical diagnosis and management by laboratory methods", W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1996, 5. 548 ff., oder D.H. Tycko, M.H. Metz, E.A. Epstein, A. Grinbaum, "Flow-cytometric light scattering measurement of red blood cell volume and hemoglobin concentration", Applied Optics 24 (1985), 1355 – 1365). Impedanzzähler sind komplexe und teure Instrumente, die eine sehr sorgfältige Einstellung und Steuerung der Instrument- und Probenparameter erfordern. Ein großer Nachteil bei Durchflußzytometern besteht darin, daß die Parameter der Lichtstreuung nicht nur vom Zellvolumen, sondern auch von der Zellform abhängig sind.
1983 schlugen Gray, Hoffman und Hansen ein neues optisches Verfahren zur Bestimmung des Volumens von Zellen in einem Durchflußzytometer vor (M.L. Gray, R.A. Hoffman, W.P. Hansen, "A new method for cell volume measurement based on volume exclusion of a fluorescent dye", Cytometry 3 (1983), 428-432). Bei diesem Verfahren sind die Zellen in einem fluoreszierenden Farbstoff suspendiert, der die Zellmembran nicht durchdringen kann. Das Niveau der Fluoreszenz, die erzeugt wird, wenn ein dünner Strom der Zellsuspension durch einen fokussierten Laserstrahl erregt wird, bleibt konstant, bis eine Zelle in dem beleuchteten Bereich ankommt, wodurch eine Verringerung der Fluoreszenzintensität verursacht wird, die direkt proportional zum Volumen der Zelle ist. In einem Durchflußzytometer passiert eine einzelne Zelle den laserbeleuchteten Fleck innerhalb von ungefähr 10 s. Aufgrund dieses kurzen Datenerfassungszeitintervalls muß die elektronische Erkennungsbandbreite relativ groß sein, was ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis und eine geringe Präzision bei der Volumenbestimmung zur Folge hat.
Die verfügbare Datenerfassungszeit kann durch Suspendieren der Zellen in einer stationären Probe und Anwenden digitaler Abbildungsfluoreszenzmikroskopie bedeutend verlängert werden (siehe P.L. Becker, F.S. Fay, "Cell-volume measurement using the digital imaging fluorescence microscope", Biophysical Journal 49 (1986), A465). Bei dem Digitalfluoreszenzmikroskopieansatz ist ein Kalibrierungsvorgang zur Bestimmung des Zellvolumens erforderlich. Recktenwald und Mitarbeiter haben ein Verfahren eingeführt, bei dem die Kalibrierung mittels optischer transparenter und nicht-fluoreszierender Mikrosphären, die zusammen mit den Zellen suspendiert sind, durchgeführt wird (D. Recktenwald, J. Phi-Wilson, B. Verwer, "Fluorescence quantitation using digital microscopy", Journal Physical Chemistry 97 (1993), 2868 – 2870). Das Volumen der einzelnen Sphären wird durch Messen ihrer Projektionsfläche unter dem Mikroskop und Transformieren dieser Zahl in ein Volumen bestimmt, wobei eine ideale sphärische Form angenommen wird. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität infolge des Volumens der Sphären, das vom Aussenden von Fluoreszenz ausgeschlossen ist, wird als der erforderliche Kalibrierungsparameter verwendet. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, daß die kalibrierenden Partikel sich in der Probe selbst befinden. Mit anderen Worten, eine Kalibrierung wird genau an diesem Probenbehälter durchgeführt und es ist keine gesonderte Kalibrierungsprobe erforderlich.
Die Verwendung von Kalibrierungssphären innerhalb einer Zellsuspension ist nicht ohne Probleme. Zunächst stellt das Einbringen der Sphären einen zusätzlichen Schritt im Arbeitsablauf dar. Bei für hohen Durchsatz ausgelegten Systemen würde dieser zusätzliche Schritt einen Nachteil darstellen. Zweitens beobachteten Recktenwald und seine Kollegen eine Tendenz der Moleküle des fluoreszenten Farbstoffs, sich auf der Oberfläche der Sphäre niederzulassen, wodurch Fehler verursacht werden. Drittens treten an den Rändern der Sphären auf der Brechung basierende Artefakte bei der gemessenen Fluoreszenzintensität auf, falls der optische Brechungsindex der Sphären nicht gut auf den Index der Flüssigkeit abgestimmt ist. Und schließlich kann die Verwendung von Mikrosphären ein Problem darstellen, falls z.B. eine dünne Probenstärke in der Ordnung von wenigen Mikrometern oder weniger benötigt wird.
EP 1 150 114 A1 , die gemäß Artikel 54(3) EPÜ als Stand der Technik gilt, beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des Volumens von in einer Flüssigkeit suspendierten Partikeln. Die Flüssigkeit ist in einer optischen Küvette enthalten, die ein Eintrittsfenster und ein Austrittsfenster aufweist. Durch die Küvette wird Licht einer Wellenlänge gesendet, die von dem hinzugefügten Farbstoff in hohem Maße, von den suspendierten Partikeln jedoch nur schwach absorbiert wird. Um das Volumen der suspendierten Partikel zu bestimmen, wird die Küvette vor einem abbildenden Photodetektor angeordnet und die Lichtintensitäten werden gemessen. Anstatt den Gesamtabstand zwischen den beiden Küvettenfenstern zu kennen, ist es auch möglich, auf dieser Strecke einen definierten Sprung vorzusehen. Dies erfolgt durch Aufkleben eines kleinen flachen Glasstücks auf die Küvettenfenster.
Der Probenbehälter für die Zellsuspension, deren optische Wege in verschiedenen Bereichen von unterschiedlicher Länge sind. Vorzugsweise wird in einem der Behältertenster ein stufenartiges Profil verwendet. In der unmittelbaren Nachbarschaft einer solchen Stufe ist die Veränderung der Länge des optischen Wegs wohlbekannt und unabhängig von einem möglichen Kippen des Probenbehälters in bezug auf die optische Z-Achse des Mikroskops. Die Veränderung der Intensität aufgrund der bekannten Stufenbreite gestattet die Kalibrierung des Volumenbestimmungsvorgangs. Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, daß an der Stufe keine Zellen zugelassen sind, was in der Praxis nicht immer garantiert ist. Ferner ist die Herstellung von Probenbehältern, die in einem der Behälterfenster mit sehr genauen Kalibrierungsstufen versehen sind, wahrscheinlich kostspielig.
In Anbetracht der oben beschriebenen Nachteile und Probleme beim Stand der Technik besteht ein Bedarf an einem einfachen und zuverlässigen Verfahren zur Bestimmung des Volumens einzelner roter Blutkörperchen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung des Volumens einzelner roter Blutkörperchen oder anderer Partikel, die in Flüssigkeiten suspendiert sind, zu schaffen.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist durch Anspruch 1 definiert. Demnach ist der Behälter zum Suspendieren von Partikeln in einer einen fluoreszierenden Farbstoff enthaltenden Flüssigkeit vorgesehen. Es ist eine Einrichtung zum Beleuchten der Flüssigkeit mit Erregungslicht vorgesehen; das aus der Flüssigkeit wieder austretende Fluoreszenzlicht wird gemessen, und die Einrichtung zum Verändern der Dicke des Behälters um einen bekannten Betrag ist eine Einrichtung zum Drücken auf den Behälter von außen.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden durch Einbringen einer suspendierte rote Blutkörperchen enthaltenden Flüssigkeitsprobe in eine optische Küvette mit mindestens einem transparenten Fenster, durch Hinzufügen und gleichmäßiges Verteilen eines fluoreszenten Farbstoffs in die Flüssigkeit, der nicht in die Blutkörperchen eindringt und imstande ist, Erregungslicht bei Wellenlängen zu absorbieren, die von den roten Blutkörperchen nur schwach absorbiert werden, und imstande ist, Fluoreszenzlicht mit Wellenlängen auszusenden, die von den roten Blutkör perchen nur schwach absorbiert werden; durch Beleuchten der Probe bei einer Wellenlänge, die von dem fluoreszenten Farbstoff absorbiert, von den roten Blutkörperchen jedoch nur schwach absorbiert wird, durch Messen der Intensität der wieder austretenden Fluoreszenz in einem Bereich, der keine roten Blutkörperchen enthält, durch Verändern der Küvettendicke in diesem Bereich um einen genau festgelegten Betrag und erneutes Messen der Intensität der wieder austretenden Fluoreszenz in demselben Bereich, durch Messen der Intensität der wieder austretenden Fluoreszenz in einem Bereich, in dem sich ein rotes Blutkörperchen befindet, durch Messen der Intensität der wieder austretenden Fluoreszenz in einem Bereich nahe demselben roten Blutkörperchen und durch Berechnen des Volumens des roten Blutkörperchens auf der Basis dieser Fluoreszenzintensitätswerte und der bekannten Veränderung bei der Küvettendicke.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt einen Meßaufbau mit einer optischen Küvette dar, die ein flexibles Fenster aufweist und eine suspendierte rote Blutkörperchen enthaltende Flüssigkeitsprobe enthält.
2 stellt einen vollständigen Aufbau dar, der einen Probenbehälter, einen XYZ-Objekttisch, ein Fluoreszenzmikroskop, eine CCD-Kamera und einen Computer aufweist.
3 zeigt schematisch eine optische Küvette mit einem ein schwach absorbierendes rotes Blutkörperchen enthaltenden Bereich und einem anderen, keine Zellen enthaltenden Bereich. Die Pfeile stellen die wieder aus der flüssigen Suspension austretenden Fluoreszenzphotonen dar.
4 zeigt schematisch eine optische Küvette mit einem ein schwach absorbierendes rotes Blutkörperchen enthaltenden Bereich und einem anderen, keine Zellen enthaltenden Be reich, wobei das flexible Küvettenfenster zweimal um eine Stufenbreite h bewegt worden ist.
5 stellt den Kalibrierungsvorgang dar, bei dem die Küvettendicke in einem Bereich, der keine roten Blutkörperchen enthält, um einen festgelegten Betrag h verändert wird und die Intensitäten I₁ und I₂ der wieder austretenden Fluoreszenz vor und nach Veränderung der Dicke gemessen werden. In diesem Beispiel wurde die Küvettendicke reduziert.
6 stellt den Meßvorgang dar, bei dem die Intensitäten I₃ und I₄ der wieder austretenden Fluoreszenz in einem Bereich, in dem sich ein rotes Blutkörperchen befindet, und in einem Bereich in der Nähe genau dieser Zelle gemessen werden. In 6 sei eine zylindrische Zelle mit einer Fläche A_RBC und mit einer Höhe h_RBC angenommen.
7 zeigt eine typische Kurve der Intensität der wieder austretenden Fluoreszenz, die als Pixelintensität der CCD-Kamera ausgedrückt wird, falls eine Küvettendicke von ungefähr 10 μm in zehn Stufen von jeweils 0,2 μm auf ungefähr 8 μm reduziert wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß dem Verfahren und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird eine Flüssigkeitsprobe, die suspendierte rote Blutkörperchen enthält, in eine optischen Küvette mit mindestens einem transparenten Fenster eingebracht. Vorzugsweise ist die Küvette relativ dünn und eignet sich zum Positionieren auf dem Probentisch eines Fluoreszenzmikroskops. Die Küvette kann beispielsweise durch Anordnen eines flexiblen #1-Abdeckstreifens von einer Größe von 24 mm × 50 mm auf Abstandhaltern, die sich auf einem gewöhnlichen Mikroskop-Objektträger von einer Größe von 25 mm × 75 mm befinden, aufgebaut werden. Die bevorzugte Höhe der Abstandhalter beträgt ungefähr 200 μm. Durch Drücken auf den flexiblen Abdeckstreifen können Dickenwerte im Mittelbereich der Küvette zwischen weniger als 1 μm und 200 μm erzielt werden. Eine optische Küvette ist ein Behälter, der eine Flüssigkeitsprobe in seinem Innenraum halten kann und mindestens ein transparentes Fenster aufweist, so daß eine Fluoreszenzmessung möglich ist. Es wäre auch noch im Sinne der Erfindung, einen Behälter mit einem transparenten Fenster auf einer Seite und einem Spiegel auf der anderen Seite zu verwenden. In diesem Falle gelangte das Erregungslicht durch das eine transparente Fenster in den Behälter, kreuzte die Flüssigkeitsprobe zweimal und das Fluoreszenzlicht verließe den Behälter durch dasselbe Fenster. Das eine Fenster würde sowohl als Eintritts- als auch als Austrittsfenster fungieren. Die Erfindung ist nicht auf Behälter für mikroskopische Analysen beschränkt, sondern läßt sich auch bei größeren Behältern anwenden, die bei anderen optischen Systemen, die keine Mikroskope sind, abgefragt werden.
Der Flüssigkeitsprobe wird ein fluoreszenter Farbstoff hinzugefügt, der gleichmäßig darin verteilt wird. Der Farbstoff ist so ausgewählt, daß er nicht in die roten Blutkörperchen eindringt. Außerdem sollte er innerhalb eines Spektralbereichs, in dem die Absorption innerhalb der roten Blutkörperchen nur schwach ist, Erregungslicht absorbieren und Fluoreszenzlicht aussenden. Da Hämoglobin in roten Blutkörperchen der dominierende Absorber ist, muß die Erregungswellenlänge länger als 600 nm sein. Eine gute Möglichkeit für einen Farbstoff ist TO-PRO-3 (vertrieben beispielsweise von Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon), der innerhalb eines Wellenlängenbereichs um 640 nm erregt werden kann und Fluoreszenz über 640 nm aussendet. Ein weiterer möglicher Farbstoff wäre TO-PRO-5 (vertrieben von Molecular Probes, Inc.), der ebenfalls nicht in die roten Blutkörperchen eindringt, um 750 nm erregt werden kann und über 750 nm Fluoreszenz aussendet. Für den Durchschnittsfachmann ist ersichtlich, daß die Erfindung nicht auf die zwei oben erwähnten Farbstoffe begrenzt ist. Es stehen viele andere Farbstoffe zur Verfügung, die die spektralen Bedingungen für Messungen an roten Blutkörperchen erfüllen, und es sind noch mehr Farbstoffe erhältlich, die die spektralen Bedingungen für andere Partikel erfüllen. Es läge natürlich auch im Rahmen der Erfindung, der Flüssigkeitsprobe den fluoreszenten Farbstoff vor dem Einbringen der Probe in den Behälter zuzufügen und ihn gleichmäßig darin zu verteilen.
1 stellt einen Meßaufbau mit einer optischen Küvette (20) dar, die ein flexibles Fenster (3) aufweist und eine suspendierte rote Blutkörperchen umfassende Flüssigkeitsprobe (4) enthält. Die Küvette ist unter Verwendung eines gewöhnlichen Mikroskop-Objektträgers (1), der Abstandhalter (2,2') zum Halten eines flexiblen Abdeckstreifens (3) trägt, aufgebaut. Die Suspension der roten Blutkörperchen in einer Flüssigkeit, wie beispielsweise Blutplasma (4), ist zwischen dem Objektträger (1) und dem Abdeckstreifen (3) enthalten. Die optische Küvette ist auf einem XYZ-Objekttisch (5) eines gewöhnlichen Fluoreszenzmikroskops (8) mit austauschbaren Objektivlinsen (7, 9 und 10) positioniert. Wie in 2 gezeigt, ist das Mikroskop (8) mit einer CCD-Kamera (21) ausgestattet, die mit einem Computer (22) zur Speicherung von Daten und Durchführung von Bildbearbeitungsabläufen verbunden ist. Der Computer (22) ist ebenfalls mit dem XYZ-Objekttisch (5) verbunden, um die Küvette (20) in der erforderlichen Weise zu bewegen.
3 stellt eine Situation gemäß der vorliegenden Erfindung dar, bei der die einen fluoreszenten Farbstoff enthaltende Flüssigkeitsprobe mit Erregungslicht beleuchtet wird und wieder Fluoreszenzphotonen aussendet. Wie in 3 angegeben, ist die optische Absorption innerhalb eines roten Blutkörperchens so schwach, daß Farbstoffmoleküle "hinter" einem roten Blutkörperchen erregt werden können, und von diesen Molekülen emittierte Fluoreszenzphotonen können die Zellen auf ihrem Weg zu der CCD-Kamera durchdringen.
Im Betrieb wird die Küvette (20) mittels des Objekttisches (5) nach oben bewegt, bis das flexible Fenster (3) in physischen Kontakt mit einem feststehenden Kolben (6) kommt, der derart auf einer Objektivlinse (7) befestigt ist, daß die Fokalebene des Mikroskops (8) innerhalb der Flüssigkeits probe (4) liegt, falls das flexible Fenster (3) den Kolben (6) berührt. Falls erforderlich, wird die Küvette (20) in X- und Y-Richtung bewegt, bis ein keine roten Blutkörperchen enthaltender Probenbereich ins Blickfeld gelangt. Falls die Probe Vollblut ist, ist die Verwendung einer Küvettendicke im Bereich von 2 μm bis 30 μm angemessen, damit Bereiche, die keine roten Blutkörperchen enthalten, leicht verfügbar sind. Für verdünnte Blutproben können dickere Küvetten verwendet werden.
Sobald ein keine roten Blutkörperchen enthaltender Bereich gefunden worden ist, wird die Probe mit Erregungslicht einer geeigneten Wellenlänge aus dem Inneren des Fluoreszenzmikroskops heraus beleuchtet und die Fluoreszenzintensität I₁ in diesem Bereich wird mittels einer CCD-Kamera (21) gemessen und das Ergebnis im Computer (22) gespeichert. In einem nächsten Schritt wird die Küvette (20) mittels eines Objekttisches (5) um eine geringe, aber genau bekannte Strecke Δh weiter nach oben bewegt. Das Bewegen der Küvette (20) nach oben gegen den feststehenden Kolben (6) führt zu einer Verringerung der Länge des optischen Weges innerhalb der Küvette um einen Betrag, der gleich Δh ist. Wenn die Küvette (20) bewegt worden ist, wird eine neue Fluoreszenzintensität I₂ in demselben Bereich gemessen und das Ergebnis wird im Computer (22) gespeichert. Die neue Fluoreszenzintensität I₂ hat einen geringeren Wert als die erste Intensität I₁, weil ein geringeres Probenvolumen Fluoreszenzphotonen aussendet. Dies ist in 4 und 5 dargestellt.
Die beiden Fluoreszenzintensitätswerte I₁ und I₂ können zusammen mit der Veränderung der Länge des optischen Wegs, Δh, zum Kalibrieren des Aufbaus durch Berechnen eines Verhältnisses "Veränderung bei der Fluoreszenz/Veränderung bei der Länge des optischen Weges" verwendet werden. Mit Bezug auf 5 kann diese Kalibrierung wie folgt erläutert werden.
Wenn man annimmt, daß die Flüssigkeitsprobe gleichmäßig von dem Erregungslicht bestrahlt wird, dann wird die erste Fluoreszenzintensität I₁ angegeben durch I1 = K·h1 + IAF (1)wobei die Größe K Parameter wie Erregungsintensität, Fluoreszenzquantenausbeute, Konzentration der fluorophoren Absorption, Übertragungsfunktion der Spektralerregungs- und Emissionsfenster, optische Übertragungsfunktion des Mikroskops, Photodetektionsempfindlichkeit enthält. K ist die eine Größe, die kalibriert werden muß. Für die folgende Erläuterung sei angenommen, daß K konstant und unabhängig von den verwendeten X- und Y-Positionen ist. Die Größe h₁ ist die Länge des optischen Wegs (oder Dicke) der Küvette (20) in dem Bereich, der gemessen wird. I_AF stellt einen möglichen Autofluoreszenzbeitrag von dem Küvettenmaterial dar. Die Fluoreszenzintensität I₂, die nach Veränderung der Küvettendicke um einen Betrag Δh gemessen wird, wird angegeben durch I2 = K·(h1 – Oh) + IAF (2)
Durch Subtraktion der Gleichung (2) von Gleichung (1) erhält man einen Ausdruck für K, der die Kalibrierungsgröße darstellt:
Gleichung (3) zeigt an, daß es nicht notwendig ist, die absolute Küvettendicke h₁ zu kennen und daß jeglicher Autofluoreszenzbeitrag I_AF aufgehoben wird.
Zur Verbesserung der Kalibrierungsgenauigkeit ist es möglich, mehr als eine Veränderung Δh bei der Küvettendicke zu verwenden, wie in 4 angegeben ist. 7 zeigt eine typische Kurve der Intensität der wieder austretenden Fluoreszenz, die als Pixelintensität der CCD-Kamera ausgedrückt wird, wenn eine Küvettendicke von ungefähr 10 μm in zehn Stufen von jeweils 0,2 μm auf ungefähr 8 μm reduziert wird. Aus der Kurve in 7 ergibt sich ein Kalibrierungswert K = 39,993 m^–1.
Nach der Durchführung einer Kalibrierung in der oben beschriebenen Weise wird bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung das Volumen eines einzelnen roten Blutkörperchens wie folgt bestimmt:
In einem ersten Schritt wird, wie in bezug auf 6 gezeigt, die Intensität I₄ der wieder austretenden Fluoreszenz in einem Bereich gemessen, in dem sich ein rotes Blutkörperchen befindet. Vorläufig sei angenommen, daß das rote Blutkörperchen eine zylindrische Form mit einer Fläche A_RBC und einer Höhe h_RBC hat. In einem zweiten Schritt wird die Intensität I₃ der wieder austretenden Fluoreszenz in einem diesem roten Blutkörperchen nahegelegenen Bereich gemessen. Unter Berücksichtigung dessen, daß I₄ durch I4 – K·(h3 – hRBC) + IAF (4)angegeben und I₃ durch I3 = K·h3 + IAF (5)angegeben wird, ergibt sich I3 – I4 = K·hRBC (6)worin die Kalibrierungsgröße K enthalten ist, wie in Gleichung (3) gezeigt. Gleichung (6) kann neu geschrieben werden als
was den Ausdruck für das Volumen V_RBC eines einzelnen zylindrischen roten Blutkörperchens darstellt.
Es sei betont, daß das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auf Differenzmessungen hinsichtlich der Dicke der Küvette sowie der Intensitäten der wieder austretenden Fluoreszenz basiert. Mit anderen Worten, die absolute Dicke der Küvette muß nicht bekannt sein. Darüber hinaus besteht keine Notwendigkeit einer Kenntnis der Erregungsintensität, die in die Küvette injiziert wird. Die Kombination der Gleichung (7) für das Zellvolumen mit Gleichung (3) für die Kalibrierungsgröße K ergibt
Gleichung (8) zeigt, daß eine Langzeitabweichung bei den Instrumentenparametern aufgehoben wird. Dies ergibt sich daraus, daß das Volumen eines roten Blutkörperchens, V_RBC, aus einem Verhältnis von Photoströmen berechnet wird. Mit anderen Worten, falls der Kalibrierungsvorgang in zeitlicher Nähe zur Messung durchgeführt wird, ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sehr widerstandsfähig. Diese Bedingung wird immer erfüllt, da der Kalibrierungsvorgang an derselben Probe durchgeführt wird, die auch gemessen wird.
Bislang wurde angenommen, daß das rote Blutkörperchen zylindrisch ist. Es kann bewiesen werden, daß die Form des roten Blutkörperchens unregelmäßig sein kann und daß die Z-Position der Zelle innerhalb der Küvette keine Auswirkung auf das berechnete Zellvolumen hat. Das Volumen einer Zelle, V_RBC, hängt mit der räumlich abhängigen Zellhöhe h_RBC (ξ,η) zusammen, und zwar über die Gleichung VRBC = ∫hRBC(ξ,η)dξdη (9) wobei die Größen ξ und η die unabhängigen X- und Y-Variablen innerhalb des roten Blutkörperchens repräsentieren. Durch Kombination der Gleichungen (8) und (9) ergibt sich
Der in Gleichung (10) gezeigte Integrationsvorgang muß nicht genau über dem von einem roten Blutkörperchen besetzten Bereich durchgeführt werden. Stattdessen könnte er über einem etwas größeren Bereich, der die Zelle enthält, durchgeführt werden. Außerhalb der Zelle ist I₄ (ξ,η) identisch mit I₃; daher ist I₃ – I₄(ξ,η) = 0. Mit anderen Worten, das Ausweiten der Integration über einen größeren Bereich über den Umfang der Zelle hinaus hätte keine zusätzlichen Beiträge zu dem berechneten Zellvolumen zur Folge. Dieser Aspekt der Erfindung ermöglicht die Verwendung einfacher Einheitsgrößen- und -formintegrationsbereiche für jede einzelne untersuchte Zelle. Folglich können die erforderlichen Berechnungen innerhalb kürzerer Zeit ausgeführt werden. Es sei darauf hingewiesen, daß davon ausgegangen wird, wie Gleichung (10) impliziert, daß die Intensität I₃ nahe der Zelle konstant ist. Während I₄(ξ,η) in der Praxis als Intensität einzelner CCD-Pixel gemessen wird, kann I₃ mit maximaler Genauigkeit als Summe aller Pixelintensitäten über einem Bereich, geteilt durch die Anzahl der Pixel, bestimmt werden. Mit anderen Worten, I₃ ist die durchschnittliche Pixelintensität nahe der Zelle.
Das Verfahren zur Bestimmung des Volumens einzelner roter Blutkörperchen gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich bei Vollblut- oder bei verdünnten Blutproben anwenden. Die vorliegende Erfindung kann auch auf einen ganzen Klumpen roter Blutkörperchen oder anderer Partikel in einer Flüssigkeitssuspension und nicht bloß auf einzelne Partikel oder Zellen angewendet werden. Es läge auch im Umfang der Erfindung, dieses Verfahren auf andere in Flüssigkeiten suspendierte Partikel, wie beispielsweise Perlen oder andere Partikel oder Zellen, beispielsweise prokaryotische, bakterielle, eukaryotische, Säugetier-, Gewebekultur- oder menschliche Zellen, anzuwenden. Für den Fachmann auf dem Gebiet ist auch klar, daß die vorliegende Erfindung auch auf Partikel oder Zellen in anderen Flüssigkeitssuspensionen oder Proben oder Verdünnungen derselben, wie beispielsweise andere medizinische oder biologische Proben, einschließlich Gewebekulturen oder andere in Kultur befindliche Zellen, einschließlich bakterieller Kulturen, und anderen Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin, Sputum, Speichel und Lymphflüssigkeit angewandt werden kann.
Abhängig von den optischen Eigenschaften einer Flüssigkeitsprobe kann das Verfahren auch in Küvetten von größerer Dicke angewandt werden. Die Verwendung eines flexiblen Fensters ist lediglich ein Beispiel für das Erreichen einer Veränderung der Dicke der Küvette. Es wäre auch möglich, ein starres Fenster, aber Abstandhalter aus einem flexiblen Material wie Gummi zu verwenden. Eine wieder andere Ausführungsform wäre möglich bei Verwendung einer flexiblen Küvettenwand anstelle von örtlich festgelegten Abstandhaltern. Die Veränderung der Küvettendicke kann auch dadurch erreicht werden, daß der Hauptteil der Küvette fixiert bleibt und mit einer positiven oder negativen Kraft auf das Fenster eingewirkt wird, so daß das Fenster sich bewegt. Derartige positiven oder negativen Kräfte können sogar die Verwendung von Druck oder eines Vakuums implizieren.
Wie bereits oben erwähnt, ist die Erfindung nicht auf optische Mikroskope beschränkt. Jedes Abbildungssystem, das die Messung der Intensitäten fluoreszenten Lichts in Bereichen, die einen Partikel enthalten, und in Bereichen, die keinen Partikel enthalten, ermöglicht, sind zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet. Das Abbildungssystem kann Linsen enthalten, kann aber auch faseroptische Elemente in sogenannten Näherungskonfigurationen verwenden. In diesem Falle ist ein kohärentes faseroptisches Bündel zwischen einem Küvettenfenster und einem Abbildungsphotodetektor angeordnet. Schließlich wäre es auch noch im Sinne der Erfindung, einen Erregungslichtstrahl über die Küvettenfenster streichen zu lassen und das wieder ausgetretene Fluoreszenzlicht mit einem nicht-abbildenden Photodetektor zu überwachen, während die Dicke der Küvette sich verändert.
Es sei erwähnt, daß der Schritt der Kalibrierung, d.h. der Bestimmung der Größe K, "Veränderung der Fluoreszenz/Veränderung des Volumens" gemäß Gleichung (3) auch dicht bei dem untersuchten Partikel durchgeführt werden kann. In diesem Falle würde, wie in bezug auf 4 deutlich wird, zunächst die Fluoreszenzintensität in der Nähe eines einzelnen Partikels gemessen. In einem nächsten Schritt wird die Dicke der optischen Küvette in diesem Bereich um einen Betrag Δh verändert, und eine neue Fluoreszenzintensität wird gemessen. In einem dritten Schritt wird die Fluoreszenzintensität in dem von dem Partikel besetzten Bereich gemessen. Während die beiden ersten Schritte die erforderliche Kalibrierungsgröße K liefern, können der zweite und der dritte Schritt die beiden Fluoreszenzintensitätswerte liefern, die für die eigentliche Volumenmessung notwendig sind. Dieser zweite Vorgang gemäß der vorliegenden Erfindung hat den Vorteil, daß statt vier drei Schritte erforderlich sind. Der erste Vorgang gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Durchführung der Kalibrierung innerhalb eines Küvettenbereichs von erhöhter Dicke, was aufgrund der erhöhten Intensitätspegel einen präziseren Kalibrierungswert ermöglichte. In der Praxis muß der Benutzer auf der Grundlage der bestehenden Prioritäten entscheiden.

Claims

Vorrichtung zum Bestimmen des Volumens einzelner Partikel n einer Flüssigkeit, wobei die Vorrichtung umfaßt: (a) einen Behälter (20) zum Suspendieren von Partikeln in einer Flüssigkeit, die einen fluoreszierenden Farbstoff enthält, wobei der Behälter mindestens ein transparentes Fenster (3) aufweist; (b) eine Einrichtung (5) zum Beleuchten der Flüssigkeit mit Erregungslicht; (c) eine Einrichtung (8) zum Messen der Intensität des aus der Flüssigkeit wieder austretenden Fluoreszenzlichts; und (d) eine Einrichtung (6) zum Verändern der Dicke des Behälters um einen bekannten Betrag durch Drücken auf den Behälter von außen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, ferner mit einem Mikroskop (8).
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Behälter (20) eine optische Küvette ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, bei der die optische Küvette einen Mikroskop-Objektträger (1) und einen Abdeckstreifen (3) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der ein feststehender Stößel (6) vorgesehen ist, der den Behälter (20) berührt, wenn der Behälter in Richtung der Objektivlinse (7) des Mikroskops (8) bewegt wird.