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Beschreibung Die Erfindung betrifft eine Meßkammer zur Messung und
Beobachtung von Partikeln, bestehend aus zwei über eine Uffnung miteinander verbundenen
Räumen, in deren Strömungsrichtung eines Trägermediums vor der Uffnung gelegenem
Raum ein Partikel-Zuführungsröhrchen hineinragt.
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Solche Meßkammern dienen im weitesten Sinn zur Partikelanalyse. Die
Messungen und Beobachtungen erfolgen z.B. als elektrische Volumenmessungen nach
dem Coulter-Prinzip, als Auflichtfluoreszenz-Messungen, als Transmissionsmessungen,
oder als Kleinwinkelstreuungs-Messungen, usw.
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Man will, ganz allgemein gesprochen, mit Gerartigen Míjtiammern nicht
nur einen, sondern möglichst viele Par.am:tc messen. Dadurch ergeben sich in der
Biochemie und in der Medizin neue Möglichkeiten der Diagnose bzw. Analyse (siehe
Valet et al., J. Histochem. Zytochem. 27:398 (1979) als Beispiel einer 2-Parametermessung,
sowie Malin-Berdel and Valet, J. Histochem. Zytochem. 1:122 (1980) als Beispiel
einer 3-Parametermessung. FU eine vergleichende Darstellung siehe den Abschnitt
"Example of cmblned Electrical-Opticai
Cell-Analysis by V. Kachel
in: Cell-Analysis, edited by N. Catsimpoulas, Vol. 1, Plenum Press, New York and
London, pp. 290 et seq.).
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Man kann Mehr-Parameter-Meßkammern so aufbauen, daß an einer Stelle
der Meßkammer, die von den Partikeln auf einer genau definierten Bewegungsbahn durchlaufen
wird, sämtliche Beobachtungen gleichzeitig erfolgen. Dabei ist es extrem schwierig,
alle Beobachtungseinrichtungen räun.llich und konstruktiv auf diese eine Stelle
hin anzuordnen. Man kann als Alternative hierzu entlang der Bewegungsbahr. aii verschiedenen
Stellen Beobachtungseinrichturlge, vorse'len. Dabei ht man jedoch - besonders bei
schnellen Messunyen - das Problem, daß man genau die Koizidenz der Meßwerte, d.h.
die gemeinsame Zuordnung mehrerer Meßwerte zu einem Partikel, feststellen und bei
der Auswertung berücksichtigen muß. Dies vermindert meist die Schnelligkeit der
Analyse.
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Bei optischen Beobachtungen und Messungen (z.B. Fluoreszenz, Streulicht,
usw.) entsteht ferner folgendes Problem: Man strebt eine hohe Lichtausbeute, hohe
numerische Apertur an und verwendet daher im allgemeinen besonders große Linsen,
um das Fluoreszenzlicht zu sammeln (siehe Prospekt Becton-Dickinson, FACS-ANALYSER)
. Man liat auc: ver.ueht, Teile der
Meßkammer selbst so auszubilden,
daß sie das Licht der Partikel besonders lenken bzw. als Linse wirken (US-PS 4 348
107). Nachteilig bei dieser Anordnung ist, daß die Beobachtbarkeit der Partikel
und der Meßzone nicht optimal ist. Die Beobachtbarkeit vor allem der Partikel ist
aber von großer Bedeutung für die Möglichkeit, Zellen im Durchfluß abzubilden ("Imaging
in flow"), um ihre morphologischen Bilder zu analysieren. Eine gute Beobachtung
und Messung ist mit Mikroskop,Objektiven hoher numerischer Apertur möglich.
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Die konstruktive Schwierigkeit beim Meßkammerbau mit solchen Objektiven
besteht darin, daß man mit den Objektiven zur Beobachtung und Messung nicht nahe
genug an die Meßöffnung herankommt.
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Aufgabe der Erfindung ist es, eine Meßkammer der eingangs genannten
Art zu schaffen, die so ausgebildet ist, daß Messungen und Beobachtungen ("Imaging")
mit Objektiven hoher Apertur und Vergrößerung möglich sind. Ferner sollen jeweils
gleichzeitig an einer Stelle der Bewegungsbahn der Partikel durch die Meßkammer
mehrere Messungen und/oder Beobachtungen durchgeführt werden können.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gel:«¢zX daß die Meßkammer
einteilig als leicht gebogenes Röhrchen ageildet
ist, das an der
Biegestelle innen eine die genannte Oeffnung bildende Verengung und außen auf der
Außenseite der Biegung Beobachtungsflächen aufweist. Vorteilhafte Weitere bildungen
sind in den Unteransprüchen definiert.
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Die spezielle konstruktive Ausbildung als gebogenes Röhrchen mit einer
Verengung und abgeschliffenen vorzugsweise ebenen Beobachtungsflächen ermöglicht
die Verwendung von Objektiven, die zur Erhöhung der Lichtausbeute in Flüssigkeitimmersion
arbeiten. Z.B. kann ein Objektiv mit dem Vergrößerungsfaktor 63 01 bei einem Objektabstand
von 0,82 mm und einer numerischen Apertur von «] = 1.25 verwendet werden.
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Gleichzeitig kann gegenüber ein weiteres Objektiv 40 Wasser mit einem
Objektabstand von 1,77 mm und einer numerischen Apertur αO = 0.75 angebracht
werden. Durch das erste Objektiv kann die Auflichtfluoreszenz gemessen werden. Erregung
und Messung erfolgt durch dasselbe Objektiv, das infolge der hohen Apertur eine
hohe Lichtausbeute bringt; der Vorteil der erfindungsgemäßen Meßkammer liegt darin,
daß man ein solches Objektiv trotz des geringen Objektabstandes von Ca.
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0,8 mm einsetzen kann. Bei Einblendung von Blitzen können fotografische
Abbildungen ("Imaging") erfolgten. Gleichzeitig kann man mit dem zweiten Objektiv
die Messung der Transmission oder der Kleinwinkel-Streuung vornehmen. Ferner kann
man
beim Durchtritt der Partikel durch die Cffnurlg, die die Stelle der Beobachtung
ist, in bekannter Weise ebene eletrische Volumenmessung nach dem Coulter-Verfahren
durchführen.
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Die erfindungsgemäße Meßkammer ist also optimal für Mehr-Parameter-Messungen
geeignet.
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Oie Meßkammer nach der Erfindung läßt sich besonders einfach durch
Stauchung und Schrumpfung eines Glasröhrchens herstellen. Bei Glas ,sind im Bereich
der Beobachtungsstelle bzw.
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Meßöffnung zwischen den beiden Kammern die optischen und strömungstechnischen
Verhältnisse günstig. Alte} iv hierzu kann man aber die Meßkammer auch aus tränsparententränsparentem
Kunststoff spritzen.
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Weitere vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
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Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen näher beschrieben. Es stellen dar: Figur 1 ein Ausführungsbeispiel Figur
2 verschiedene Schritte in der Herstellung der Meßkammer ndch Fig. 1.
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Die Meßkammer wird gebildet durch ein Glasröhrchen 1, das -wie dargestellt
- an der Biegestelle 30 leicht gebogen ist.
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Die Darstellung in Fig. 1 entspricht etwa dem Maßstab 10:1.
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Das Glasröhrchen 1 ist somit ca. 2,5 cm lang. Dabei ergibt sich bezüglich
der Achse A an der Biegestelle 30 ein Offnungswinkel « von ca. 1600 bis 170".Die
äußere Kontur des noch nicht weiter bearbeiteten Glasröhrchens 1 ist gestrichelt
bei 2 bzw. 3 eingezeichnet.
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An der Stelle, an der die Achse A das Glasröhrchen 1 trifft, weist
das Glasröhrchen 1 eine Verengung 4 auf. Durch sie ergibt sich die Uffnung 5, die
einen Durchgang bildet zwischen der ersten Kammer 6 im oberen Teil und der zweiten
Kammer 7 im unteren Teil. Die Oeffnung 5 ist also Beobachtugs- bzw.
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Meßstelle bei optischen Messungen; sie ist die sogenannte "Meßöffnung"
bei elektrischen Volumenmessungen nach dem Coulter-Verfahren. Der Bereich 8 innerhalb
der ersten Kammer 6 vor der Uffnung 5 ist so bearbeitet, daß er sich kugelsegmentförmig
oder trichterförmig hin zur Oeffnung 5 verjüngt.
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Damit ergibt sich auf die Öffnung 5 hin eine Fokussierung des Trägermediums,
das von der Kammer 6 in die Kammer 7 strömt. In die erste Kammer 6 ragt von oben
eine erste Kapillare 9 mit einer Austrittsöffnung 10 hinein. Sie dienst als Partikel-Zuführungsröhrchen.
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In die untere zweite Kammer 7 ragt eine zweite Kapillare 11 hinein.
Sie dient als Partikel-Absaugröhrchen. Bei der elektrischen Volumenmessung wird
über die erste Kammer 6 ein partikel freies Trägermedium (z.B. ein Elektrolyt) zugeführt.
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Das Trägermedium wird auf die Oeffnung 5 hin fokussiert und erfaßt
dabei die aus der Austrittsöffnung 10 des Partikel-Zuführungsröhrchens 9 austretende
Partikel suspension (hydrodynamische Fokussierung). Das Trägermedium führt die Partikel
auf einer exakt definierten Durchtrittsbahn durch die Uffnung 5. Ein partikel freies
Medium wird ebenfalls der zweiten Kammer 7 von unten her zugeführt. An dem Partikel-Absaugröhrchen
11, das in den Raum 7 von unten hineinragt, ist ein Unterdruck wirksam. Daher wird
das Trägermedium, wie durch die Pfeile angedeutet, am oberen Ende der Kammer 7 umgelenkt
und in die Eintrittsöffnung 12 am oberen Ende des Partikel-Absaugröhrchens 11 abgesaugt.
Durch diese Saugströmung wird der aus der Uffnung 5 nach unten austretende Partikel
strom erfaßt. Diese "Partikelabsaugung" verhindert die RUckkehr einzelner Partikel
an die Me-öf,nung 5. Das Glasröhrchen 1 ist an beide Enden in Fassunen 13 bzw. 14
aufgenommen. Die Abdichtung erfolgt durch Dichtungsringe 15.
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Innerhalb der Fassungen 13, 14 sind die Kapillaren 9, 11 ebenfalls
gehalten. Für elektrische Messungen sind 5m Innenraum der Fassung 13 eine Elektrode
16, in- Innenraum der Fassung
14 eine Elektrode 17 angeordnet.
Handelt es sich bei dem Trägermedium um einen Elektrolyten und .¢t zwischen den
Elektroden 16, 17 ein konstanter Gleichstrom eingeprågt, so findet beim Durchtritt
eines Partikels durch die Uffnung 5 eine Widerstandsänderung zwischen den Elektroden
statt. Sie ergibt eine Spannungserhöhung, die dem Volumen des Partikels proportional
ist.
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Die bei 2 für das unbearbeitete Glasröhrchen 1 gestrichelt eingezeichnete
Kontur ist plan abgeschliffen. Es ist also außen auf der Außenseite der Biegung
an der Biegestelle 30.
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Dadurch ergibt sich die ebene Fläche 18. Ferner ist auf der gegenüberliegenden
Seite also auch außen, jedoch an der Innenseite der Biegung eine zweite ebene Fläche
19 eingeschliffen. Das Einschleifen dieser Flächen hat zur Folge, daß die Objektive
20 bzw. 21 sehr nah an die Flächen 18 bzw.
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19 herangebracht und auf die Offnung 5 e.ngestt werden können.
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Da es bei solchen Messungen sehr auf die Anwendbarkeit vorhandener
Objektive und die Anpassung der Meßkammer an diese ankommt, soll im folgenden darauf
etwas näher eingegangen werden. Für die Objektive 20 bzw. 21 gelten folgende Angaben:
(a)
Objektiv 20: Neofluar, Vergrößerungsfaktor: 63, Messung in dlimmersion (zwischen
Objektiv 20 und Fläche 18 befindet sich zur Minderung von Licht- und Uffnungswinkel-Verlusten
ein Oltropfen).
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Numerische Apertur: G = 1.25, Objektabstand (Abstand Vorderfläche
der Linse des Objektivs zum Zentrum der Uffnung 5 entlang Achse -A): 0,82 mm.
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(b) Objektiv 21: Achromat, Vergrößerungsfaktor: 40, Messung in Wasserimmersion,
Objektabstand: 1,77 mm. Numerische Apertur: O( - 0.75.
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Die dargestellte Meßkammer ermöglicht es also, m,t einem Objektiv
mit dem Vergrößerungsfaktor 63 und der numerischen Apertur von 1.25, die für eine
hohe Lichtausbeute kennzeichnend ist, unter Wahrung des für dieses Objektiv charakteristischen
Objektabstandes von 0,82 mm eine Messung vo;zunehmen. Das bedeutet: Die Oeffnung
5 hat in aller Regel einen Durchmesser von 100 pm. Der Spalt zwischen Fläche 18
und dem Objektiv, der den Ultropfen aufnehmen muß, ist ca. 0,3 mm (einschl. Toleranzen).
Weitere 50 um sind erforderlich, um ggf. die gegenüberliegende Seite der Uffnung
5 sichtbar zu machen. Qie Wandstärke des Glasröhrchens 1 an der Stelle der
Verengung
4 darf also nicht mehr als ca. 450 bis 470 jjm betragen. Dies ist in der dargestellten
Weise durch Abschleifen einer ebenen Fläche 18 an einem gekrümmten Glasröhrchen
zu erreichen.
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Das gegenüber der Fläche 19 angeordnete Objektiv 21 arbeitet bei etwas
weiterem Objektabstand mit kleinerer Apertur und kleinerem Vergrößerungsfaktor.
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Damit werden beim Durchtritt von Partikeln einer Partikesuspension
folgende Beobachtungen bzw. Messungen möglich, die zusätzlich zu der genannten elektrischen
Volumenmessung vorgenommen werden können: (a) Fluoreszenzmessungen: Diese Messung
erfolgt mittels des Objektivs 20 als sog. Auflichtfluoreszenz-Messung (Epiillumination).
Sowohl Anregung als auch Messung erfolgen durch das Objektiv 20.
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(b) Bei Beleuchtung der Oeffnung 5 mit Objektiv 20 wird das hindurchgetretene
Licht mit Objektiv 21 gemessen (Transmissions-Messung). Bei kleinem Uffnungswinkel
und Dunkelfeldanregung spricht man von einer Kleinwinkel-Streulichtmessun.
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(c) Man kann durch eines der genannten Objektive beim Durchtritt eines
Partikels durch die Uffnung mit Hilfe eines kurzen Blitzes (ca. 20 nsec) eine fotografische
oder elektronische (Bildverstärker-Kamera) Abbildung machen ("Imaging"). Durch das
Objektiv 20 bei gleichzeitiger Anregung der Fluoreszenz (siehe oben bei (a)), erhält
man ein Fluoreszenzbild; durch das Objektiv 21 erhält man ein Absorptionsbild.
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(d) Man kann die Prtikel in der Meßöffnung aber auch mittels eines
Laserstrahls senkrecht zur Bildebene von Fig. 1 z.B. über die ebene Fläche 25 (Figur
2) anstrahlen. Es ergibt dann in Richtung der Objektive 20 und 21 die sog. Orthogonalfluoreszenz-Strahlung,
bei Weglassen des Fluoreszenzfilters an einem Objektiv die 90" Lichtstreuung. An
der ebenen Fläche 26 kann die Kleinwinkel-Lichtstreuung abgenommen werden.
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Der Vorteil der Meßkammer liegt darin, daß an derselben Stelle der
Partikeldurchtrittsbahn, d.h. beim Durchtritt durch die Uffnung 5, die genannten
Messungen an einem Partikel gleichzeitig vorgenommen werden können, wobei insbesondere
ein durch einen so geringen Objektabstand von 0,82 mm gekennzeichnetes Objektiv
der Apertur 1.25 eingesetzt
werden kann.
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Figur 2 zeigt die Herstellung einer Meßkammer nach Fig. 1 aus einem
Glas- oder Quarzröhrchen, das bei (a) noch ungebogen dargestellt ist. Als nächster
Schritt erfolgt bei (b) eine Schrumpfung und Stauchung unter Erwärmung, so daß sich
im mittleren Bereich die Verengung als erhöhte Wandstärke ergibt, wie bei 2(b) dargestellt.
Als nächster Schritt erfolgt eine erneute Stauchung, in einem sehr viel kleineren
inneren Bereich, so daß bei 2(c) Wülste 4' bzw. 4'' entstehen, zwischen denen sich
später die oeffnung 5 ergibt. Als nächster Schritt erfolgt die Biegung in die bei
20(d) gezeigte Form. Es entsteht der bereits erwähnte Winkel von 1600 bis 1700 bezüglich
einer durch die Uffnung 5 gehenden Achse A. Bei Figur 2(e) erfolgt das Abschleifen
der ebenen Flächen 18 und 19. Die Schleifwerkzeuge 27 bzw. 28 sind angedeutet. Dabei
erfolgt das Einschleifen der Fläche 19 durch ein Stirn-Schleifwerkzeug. Die Fläche
19 wird also praktisch in die Kniekehle der Biegung des Glasröhrchens als Kreisfläche
eingeschliffen. Die weitere Bearbeitung der aufeinander zuweisenden stumpfen Enden
der Kammern 6, 7 folgt dann gemäß Figur 2(f) durch Diamantbohrer bzw. -fräser 22
bzw.
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23. Es ergibt sich dann die gewünschte trichterförmige bis kugelkalottenförmige
Ausbildung der Kammern 6 bzw. 7 vor der
Uffnung 5; siehe Figur
2(9).
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Die Ausbildung aus Glas, wobei die Verengung 4 durch Schrumpfung und
Stauchung eines Glasröhrchens hergestellt wird, hat den entscheidenden Vorteil,
daß von vorneherein in der Uffnung eine glatte Oberfläche gegeben ist. Alternativ
hierzu kann man bei der Stauchung und Schrumpfung einen Draht einlegen, der danach
wieder herausgeätzt wird. Die Meßkammer ist einstückig ausgebildet, dadurch entfallen
Undichtigkeiten an Verklebungs- oder Dichtstellen. Außerdem ist eine gute Stabilität
und leichte Herausnahme des Röhrchens aus der Haltevorrichtung zwecks Reinigung
möglich.
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Das Röhrchen 1 hat beispielsweise einen Außendurchmesser von 5 mm
und einen Innendurchmesser von 3 mm und damit eine Wandstärke von 1 mm. Die inneren
Kapillaren 9 bzw. 11 haben z.B. einen Außendurchmesser von 1,5 mm und einen Innendurchmesser
von 0,8 mm.
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Der Querschnitt durch das Röhrchen, wie es sich gemäß Figur 2(e) ergibt,
ist in Figur 2(f) dargestellt. Dabei ist ersichtlich, daß der Durchgang, der sich
in der Verengung 4 ausbildet und nach der Fertigbearbeitung die Uffnung ' ergibt,
asymmetrisch zwischen den Flächen 18 und 19 liegt.
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Dies ist eine Folge der Materialanhäufung auf der linken Seite nach
Figur 2(d) und einer Materialerstreckung auf der rechten Seite derselben bei der
Biegung und des Abtrags durch die Schleifvorgänge. Aus Figur 2(f) ist ersichtlich,
daß auch senkrecht zu den Flächen 18, 19 weitere Flächen 25, 26 eingeschliffen werden
können. Diese Flächen 25, 26 liegen seitlich der Ebene, in der die Krümmung des
Röhrchens 1 liegt, also gemäß Figur 1 parallel zur Ebene der Zeichnung.
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Dies ist beispielsweise zur Einstrahlung von Laserlicht an die Uffnung
5 bei der Orthogonalfluoreszenz oder Orthogonallichtstreuungsmessung zweckmäßig.
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- Ende der Beschreibung -