DE3507407C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Durchfluß-Zytometriegerät nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Durchfluß-Zytometriegeräte verwendet man um eine oder mehrere Charakteristiken von Zellen oder anderen Partikeln in einer Flüssigkeitsströmung zu untersuchen. Beispielsweise wird eine Zellen enthaltende Flüssigkeitsprobe durch das Durchfluß- Zytometriegerät in einer sich schnell bewegenden Flüssigkeitsströmung so geführt, daß jede Zelle im wesentlichen eine nach der anderen einen Meßbereich passiert. Änderungen der elektrischen Impedanz werden mit der Bestimmung des Zellenvolumens in Verbindung gebracht, wenn eine jede Zelle den Meßbereich durchläuft. Auf ähnliche Weise streuen die hindurchströmenden Zellen, wenn ein einfallender Lichtstrahl auf den Meßbereich gerichtet ist, ein solches Licht, wenn sie den Meßbereich durchströmen. Dieses gestreute Licht ist eine Funktion der Zellenform, des Refraktionsindex, der Lichtdurchlässigkeit, der Rauheit o. dgl. Darüber hinaus ist die von markierten Zellen emittierte Fluoreszenz, die beim Hindurchtreten der Zellen durch den Lichtstrahl aufgrund der Anregungsenergie des einfallenden Lichtstrahls angeregt worden ist, zur Identifikation der speziell markierten Zellen meßbar. Mit dem Durchfluß- Zytometriegerät kann nicht nur eine Zellenanalyse, sondern auch das Sortieren der Zellen durchgeführt werden. Laser werden als Lichtquelle für den einfallenden Lichtstrahl in Durchfluß-Zytometriegeräten verwendet, aber auch Lichtquellen für inkohärentes Licht, wie beispielsweise Quecksilber-Bogenlampen.

Bei der Strömungs-Zytrometrie mit Laseranregung wird im einzelnen ein scharf fokussierter Laserstrahl üblicherweise in Koinzidenz mit den Zellen o. dgl. gebracht, die in Verbindung mit dem Lichtstrahl analysiert werden sollen. Auf diese Weise erlaubt der Lichtstrahl die Ausführung der Analyse aufgrund des von den Zellen gestreuten Lichtes oder der von ihnen emittierten Fluoreszenz. Wenn die Zellen auf einem normalerweise vertikalen Weg in ihrer Flüssigkeitsstrombahn von der Düsenspitze bis zum Zellenkollektor bewegt werden, kreuzen sie den fokussierten Laserstrahl, der normalerweise entlang eines im wesentlichen horizontalen Wegs verläuft. Das optische System, häufig ein Mehrkanalsystem, zur Messung der Fluoreszenz oder des Streulichts hat üblicherweise eine Betrachtungsachse, die gegenseitig senkrecht auf beiden Achsen, sowohl auf der Achse der Flüssigkeitsströmung als auch auf der Achse des Laserstrahls steht. Jedesmal wenn ein Laserstrahl auf eine Zelle trifft, wird ein optischer Impuls erzeugt, dessen Intensität und Wellenlängenprofil die Zelle charakterisiert. Optische Impulse werden letztlich in Digitalwerte umgewandelt und von einem Computer entsprechend vorgewählter Bedienungsfunktionen verarbeitet. Die Ausgangsdaten werden üblicherweise der Bedienungsperson in Verbindung mit dieser digitalen Information präsentiert. Da es wünschenswert ist, daß die Impulse eine Intensitätsinformation über die Zelle geben und nicht vom Laserstrahl, ist es weiterhin erwünscht, daß die vertikale Dimension des fokussierten Laserbrennflecks derart reduziert ist, daß er kleiner ist als die typischen zu untersuchenden Zellen.

Darüber hinaus erfaßt das elektrische Meßsystem zum Analysieren der Impulse manchmal nur die Höhe der Impulse anstelle der Fläche. In diesem Fall erzeugt die Reduzierung der vertikalen Brennpunkteinschnürung des Laserstrahls zu einem Durchmesser, der sich dem Zellendurchmesser nähert, eine Vergrößerung des erhaltenen Signals im direkten Verhältnis hierzu. Andererseits führt die Reduzierung der horizontalen Brennpunkteinschnürung des Laserstrahls auf einen geringeren Durchmesser als der Zellendurchmesser üblicherweise zu fehlerhaften Ergebnissen durch Vergrößerung der Unsicherheit hinsichtlich der präzisen horizontalen Position der Flüssigkeitsströmung. In diesem Fall ergibt sich eine geringere Auflösung, die in diesem Technologiebereich als vergrößerter Variationskoeffizient bezeichnet wird. Entsprechend weist ein verbessertes Beleuchtungssystem wunschgemäß einen Fokussierbereich auf, bei dem der vertikale Strahldurchmesser wesentlich kleiner als der horizontale Strahldurchmesser ist. Eine derartige asymmetrische Strahlgestaltung ist nicht unüblich in der Laserdurchfluß- Zytometrie.

Beispielsweise ist es bekannt, daß Einzelbetriebsart- Laser mit kontinuierlichem Laserlicht, wie sie in Durchfluß-Zytometriegeräten verwendet werden, ein Strahlintensitätsprofil Gaußscher Art aufweisen und daß die folgende Gleichung die Strahleinschnürung wiedergibt, wenn mit einer Linse fokussiert wird:

wobei

λdie Laserwellenlänge ist;fdie Linsenbrennweite;wdie Breite des unfokussierten Laserstrahls undδder durch die Fraktion begrenzte minimale Strahldurchmesser(w und δ werden üblicherweise auf die 1/ ε ² Intensitätspunkte dimensioniert)

Aus der obigen Gleichung ist offensichtlich, daß, um den Strahldurchmesser zu reduzieren, entweder die Linsenbrennweite (f) verkleinert werden muß oder die unfokussierte Laserstrahlbreite (w) vergrößert oder erweitert werden muß. Beide Möglichkeiten sind nur so lange erfolgreich wie die Winkel so klein sind, daß geometrische Aberrationen keine Rolle spielen.

Aus der DE-OS 22 46 380 ist eine Vorrichtung zum Sortieren von Teilchen bekannt, die zur Erzeugung einer Verbreiterung des fokussierten Strahls, die in der vertikalen Ebene kleiner ist als in der horizontalen, Zylinderlinsen verwendet. Üblicherweise kann eine elliptische Strahlform erzeugt werden, in der der vertikale Strahldurchmesser größer ist als der horizontale Strahldurchmesser. Das Fokussieren erfolgt dann mit einer sphärischen Linse mit einer bestimmten Brennweite.

Die bekannte Vorrichtung weist einen chromatischen Fehler auf, wenn mehr als ein Laser als Anregungslichtquelle verwendet und in einem gemeinsamen Strahlengang den vorstehend genannten Einrichtungen zugeführt wird und wenn eine der zuvor beschriebenen zylindrischen Linsen zum Fokussieren verwendet wird. Jede zylindrische Linse fokussiert die Laser mit unterschiedlichen Wellenlängen in unterschiedlich von der Linse auftretenden Entfernungen. Auf diese Weise würden die Zellen, wo der Flüssigkeitsstrom mit den Zellen den ersten Laser in einer scharf fokussierten Zone kreuzt, wenige µsec später den zweiten Laserstrahl in einer größeren im wesentlichen unfokussierten Zone mit einer entsprechenden Verschlechterung der Arbeitsweise kreuzen. Wenn zylindrische Linsen verwendet werden, erfordert die Korrektur dieses Fehlers zwei oder drei komplizierte Linsenelemente, die sorgfältig unter Verwendung verschiedener Gläser mit geeignet verändernden Dispersionen entworfen sind. Üblicherweise können solche Kombinationen die chromatischen Aberrationen nur über einen Teil des erforderlichen Wellenlängenbereichs ausreichend korrigieren. Darüber hinaus müssen die Achsen der individuellen zylindrischen Elemente sorgfältig überprüft werden. Selbst wenn die zylindrischen Linsen sorgfältig zusammengestellt sind, können sie optische Aberrationen erzeugen, die innerhalb der Diffraktionsgrenze am Zellenraum gehalten werden müssen, um eine Strahlform, mit optimaler Wirkungsweise zu erzeugen.

In dem Lehrbuch der Experimentalphysik, Bergmann- Schaefer, Band III, Optik, Walter de Gruyter, Berlin- New York, 1978, S. 49-51, ist die Querschnittsveränderung eines Lichtbündels beim Durchgang durch ein Prisma beschrieben. Der Querschnitt des Lichtbündels wird bei schrägem Auftreffen auf die Grenzfläche eines optisch dichteren Mediums nach der Brechung in der Brechungsebene vergrößert. Umgekehrt wird beim Übergang von einem optisch dichteren Medium zu einem dünneren der Lichtbündeldurchmesser in der Brechungsebene verkleinert. Dagegen tritt in der zur Brechungsebene senkrechten Richtung keine Querschnittsveränderung auf.

Es ist ferner aus der DE-AS 27 32 272 bekannt, daß zwei zueinander parallel verlaufende Laserlichtstrahlen von einer gemeinsamen Fokussierlinse fokussiert werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Durchfluß- Zytometriegerät der eingangs genannten Art zu schaffen, bei dem zwei Laserlichtstrahlen ohne chromatische und optische Aberrationen an unterschiedlichen Stellen der Strömungsbahn mit einer gemeinsamen, aus einfachen Elementen bestehenden, optischen Einrichtung elliptisch fokussierbar sind.

Zur Lösung dieser Aufgabe dienen erfindungsgemäß die kennzeichnenden Merkmale des Hauptanspruchs.

Die Erfindung sieht zwei lichtbrechende Prismen vor, die in dem von den beiden Lasern erzeugten gemeinsamen Strahlengang angeordnet sind. Die Prismen sind derart angeordnet, daß zwischen ihnen ein Luftspalt besteht. Jedes Prisma weist einen derartigen spitzen Winkel auf, daß der Einfallwinkel des Laserstrahls im wesentlich in der Nähe des Brewster-Winkels liegt. Jedes Prisma hat vorzugsweise eine Austrittsfläche, die so orientiert ist, daß sie im wesentlichen senkrecht zum Strahlengang des Laserstrahls ist. Jedes Prisma hat lichtbrechende Eigenschaften zum Erweitern des einfallenden Lichtstrahls in einer im wesentlichen parallel zur Richtung der Zellflußbahn verlaufenden Richtung. Eine Fokussierlinse fokussiert den Lichtstrahl auf die Flüssigkeitsbahn, so daß der Brennpunktbereich einen vertikalen Strahldurchmesser aufweist, der kleiner ist als der horizontale Strahldurchmesser.

Entsprechend den Prinzipien der vorliegenden Erfindung wird die Lichtstrahlfokussierung ohne Verwendung der derzeit bekannten und verwendeten zylindrischen Fokussierlinsen erreicht. Bei Verwendung einer prismatischen Refraktionsanordnung werden chromatische Aberrationen entweder eliminiert oder wesentlich reduziert, da die Wellenfront, die bei Eintritt in eine prismatische Fläche plan verläuft, beim Austritt aus einer solchen prismatischen Fläche plan bleibt. In der vorliegenden Erfindung ist das einzige optische Element, das achromatisch sein muß, eine sphärische Probenfokussierlinse, die leichter herzustellen ist als eine zylindrische Linse. Ein zusätzlicher Vorteil des prismatischen Strahlerweiterers aus der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß in manchen Fällen der Einfallswinkel und das Prismenmaterial ausgewählt werden kann, um dem Brewster-Winkel näher zu kommen, um dadurch einen sehr hohen Transmissionswirkungsgrad des polarisierten Laserstrahls ohne eine Mehrschicht-Antireflexionsbeschichtung zu benötigen, sicherzustellen. Eine andere signifikant vorteilhafte Eigenschaft besteht darin, daß die erfindungsgemäße prismatische Strahlerweiterungsanordnung leicht für die Anwendung mit vielfachen Lichtquellen, wie beispielsweise mit unterschiedlichen Wellenlängen arbeitenden Lasern in der Simultananalyse der in dem Durchfluß-Zytometriegerät fließenden Zellen anpaßbar ist. Ein besserer Arbeitswirkungsgrad der Systemoptiken wird ebenfalls erreicht.

im folgenden wird unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ein Ausführungsbeispiel der Erfindung näher erläutert.

Es zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung der optischen Elemente und der Strahlengänge bei einem Durchfluß-Zytometriegerät zur Bestimmung der Eigenschaften von Zellen o. dgl.,

Fig. 2 eine schematische Darstellung der optischen Elemente in dem Gerät gemäß Fig. 1, wobei die Expansion des Laserstrahls in vertikaler Richtung eingezeichnet ist,

Fig. 3 eine vergrößerte Stirnflächenansicht des fokussierten Laserstrahls, durch den die Zellen in der Flüssigkeitsströmung fließen, wobei gezeigt ist, daß der vertikale Strahldurchmesser wesentlich kleiner ist als der horizontale Strahldurchmesser und

Fig. 4 eine schematische Darstellung der optischen Elemente in dem Durchfluß-Zytometriegerät gemäß Fig. 1, in der die Achsen von zwei Laserstrahlen eingezeichnet sind.

Wie in Fig. 1 dargestellt, stellen zwei Laser 12 und 14 die Lichtenergie für das vorliegende Durchfluß-Zytometriegerät zur Verfügung. Bei diesem Ausführungsbeispiel weist das Durchfluß-Zytometriegerät 10 zwei Lichtquellen auf, so daß es möglich ist, eine Vielzahl verschiedener Zellentypen mit unterschiedlicher Fluoreszenz, unterschiedlichem Streulicht, unterschiedlichem Volumen oder anderen meßbaren Eigenschaften zu messen und zu quantifizieren.

Die Laser 12 und 14 sind ausgewählt, um Primäremissionen kohärenten Lichtes und spezifischer Wellenlängen zu erzeugen, die voneinander im Spektralbereich getrennt sind. Ein solcher geeigneter Laser 12 ist ein Argon-Ionen-Laser mit einer Primäremission bei 488 nm. Der Laser 14 arbeitet mit einer unterschiedlichen, vom Laser 12 abweichenden Wellenlänge. Ein solcher Laser 14 kann ein Rhodamin-6-G-Farbstofflaser sein, der eine Primäremission bei 600 nm aufweist. Auch andere Laser können verwendet werden. Es können auch Nicht-Laser-Lichtquellen, wie beispielsweise Quecksilber- oder Xenon-Bogenlampen anstelle einer Laserbestrahlung verwendet werden. Wenn jedoch ein Betrieb mit getrennten Wellenlängen bei dem Durchfluß-Zytometriegerät erwünscht ist, fällt die Wahl der Lichtbestrahlung auf Laser.

Laserlichtstrahlen 16 und 18 treten aus den Lasern 12 bzw. 14 aus. Diese austretenden Laserlichtstrahlen sind zu diesem Zeitpunkt in bezug auf die in der Flüssigkeitsströmung 20 fließenden Zellen unfokussiert. Der Laser 12 ist in bezug auf die Flüssigkeitsströmung 20 im wesentlichen horizontal ausgerichtet angeordnet, so daß der unfokussierte Laserlichtstrahl 16 direkt in Richtung der Flüssigkeitsströmung gerichtet ist. Andererseits ist der unfokussierte Laserlichtstrahl 18 über zwei Umlenkprismen 21 und 22 umgelenkt, um so in Richtung des Laserlichtstrahls 16 zu verlaufen. Wenn auch die Laserlichtstrahlen 16 und 18 in Richtung auf die fließenden Zellen auf einer im wesentlichen quer zur Richtung des Strömungsdurchgangs der Zellen verlaufenden Achse strahlen, ist der Laserlichtstrahl 18 vertikal nach unten in bezug auf den Strahl 16 verschoben, wenn er aus dem Umlenkprisma 22 austritt. Beide unfokussierte Laserlichtstrahlen 16 und 18 sind konvergierend auf einen prismatischen Strahlenerweiterer 24 gerichtet, der aus zwei Prismen 25 und 26 besteht. Beim Austritt aus dem prismatischen Strahlerweiterer 24 sind die jeweiligen Strahlen in vertikaler Richtung erweitert. Die erweiterten Laserlichtstrahlen sind in Fig. 1 mit dem Bezugszeichen 28 bzw. 29 gekennzeichnet. Die erweiterten Laserstrahlen verlaufen durch eine Fokussierlinse 30, die die Laserlichtstrahlen in zwei Fokussierbereiche 31 und 32 der Flüssigkeitsströmung 20 fokussiert. Die Fokussierbereiche 31 und 32 sind im wesentlichen mit vertikalem Abstand voneinander angeordnet.

Eine Düse 34, die in dem Durchfluß-Zytometriegerät eingebaut ist, vereinzelt die Zellen innerhalb der Flüssigkeitsströmung 20. Die Verwendung einer derartigen Düse ist bekannt und beispielsweise in der US-PS 38 26 364 beschrieben. Da jede Zelle die Fokussierbereiche 31 und 32 passiert, kann das davon gestreute Licht von einem geeigneten Fotodetektor 36 gemessen werden. Auf ähnliche Weise kann die Fluoreszenz, falls sie von den durch die Laserbestrahlung aktivierten Zellen emittiert wird, von Fluoreszenzdetektoren 38 und 39 gemessen werden. Wenn das Durchfluß-Zytometriegerät Zellen mit bestimmten Charakteristiken sortierend sammeln soll, können aufladbare Platten 40 verwendet werden, um die Zellen in verschiedenen Behältern 42 a, b und c zu sammeln.

In Fig. 2 ist eine detailliertere Darstellung des prismatischen Strahlerweiterers 24 in Richtung seiner optischen Achse dargestellt. Zum Zwecke der Klarheit ist lediglich der Durchgang des Laserlichtstrahls 16 in Fig. 2 eingezeichnet, so daß der Effekt der Strahlerweiterung klarer verdeutlicht werden kann. Beide Prismen 25 und 26 sind im wesentlichen dreieckig gestaltete lichtbrechende Prismen mit einem rechten Winkel, die in dem Laserstrahlengang angeordnet sind. Diese Prismen sind mit engem Abstand voneinander, aber mit einem dazwischenliegenden Luftspalt 50 angeordnet, dessen Zweck im folgenden erläutert wird. Jedes Prisma ist darüber hinaus derart ausgesucht, daß sein Eintrittswinkel im wesentlichen der Polarisationswinkel (Brewster-Winkel) ist. Der spitze Winkel jedes Prismas ist mit den Bezugszeichen 52 bzw. 54 gekennzeichnet. Wie in der Optik allgemein bekannt, stellt der Brewster-Winkel den Eintrittswinkel dar, bei dem der Reflexionsbetrag für polarisiertes zur Einfallebene paralleles Licht minimiert ist. Auf diese Weise entstehen bei einem solchen Eintrittswinkel geringe oder keine Reflexionsverluste. Darüber hinaus ist der Brewster-Winkel eine Funktion des Prismenmaterials. Wie in Fig. 2 zu sehen ist, ist das Prisma 25 so orientiert, daß die Oberfläche 55 zwischen dem spitzen Winkel 52 und dem rechten Winkel 56 die Eintrittsfläche für den unfokussierten Laserlichtstrahl 16 ist. Der Laserlichtstrahl 16 verläuft in Richtung auf die Oberfläche 55 auf einer Achse 60, die im wesentlichen senkrecht zur Richtung der Flüssigkeitsströmung 20 verläuft. Wenn das Licht von einem dünnen zu einem dichten Medium übergeht, wie beispielsweise von Luft in ein Prisma, wird der Lichtstrahl bei einem großen Einfallwinkel als Ergebnis der lichtbrechenden Eigenschaft des Prismas abgelenkt. Des weiteren ergibt sich, nachdem der Laserlichtstrahl 16, wie durch das Bezugszeichen 16 a gekennzeichnet, abgelenkt worden ist, eine Erweiterung der Strahlweite. Der erweiterte Laserlichtstrahl 16 a fällt dann auf die Fläche 58, die eine interne reflektierende Fläche ist. Entsprechend unterliegt der erweiterte Laserlichtstrahl 16 a einer internen Reflexion, mit 16 b gekennzeichnet. Der Laserlichtstrahl 16 b ist ebenfalls erweitert in bezug auf den einfallenden Laserlichtstrahl 16. Dieser erweiterte Laserlichtstrahl 16 b tritt aus dem Prisma 25 über die Austrittsfläche 59, wie in Fig. 2 gezeigt, aus. Der erweiterte Laserlichtstrahl 16 b durchläuft die Austrittsfläche in einer im wesentlichen senkrecht zur ihr verlaufenden Richtung. Die Austrittsfläche 59 kann mit einer Schicht aus Antireflexionsmaterial beschichtet sein, um den Transmissionswirkungsgrad durch diese zu verbessern. Sobald der erweiterte Laserlichtstrahl 16 b aus dem Prisma 25 heraustritt, tritt er in den Luftspalt 50 ein.

Von dem Luftspalt 50 aus tritt der erweiterte Laserlichtstrahl 16 b noch einmal von einem dünnen in ein dichtes Medium ein, wenn er auf die Fläche 62 des zweiten Prismas 26 fällt. Der Laserlichtstrahl 16 b wird dann innerhalb des Prismas 26 derart in eine Richtung umgelenkt, daß er an der Fläche 64 im wesentlichen in Normalrichtung austritt. Wie bei dem Prisma 25 bewirkt das Umlenken des Laserlichtstrahls 16 b im Prisma 26 eine zusätzliche Erweiterung in vertikaler Richtung, so daß sich beim Austritt aus dem Prisma 26 ein erheblich erweiterter Laserlichtstrahl 28 ergibt. Es sei darauf hingewiesen, daß die Prismen 25 und 26 mit ihren spitzen Winkeln komplementär zueinander angeordnet sind, so daß der sich ergebende erweiterte Laserlichtstrahl 28 auf einer im wesentlichen parallel und in Ausrichtung mit der Richtung 60 des einfallenden Laserlichtstrahles 16 in der Achse 65 verläuft. Aufgrund der Orientierung der Prismen 25 und 26 wird der Laserlichtstrahl 16 nur in einer Richtung, d. h. in vertikaler Richtung, verbreitert, das ist im wesentlichen parallel zur Richtung der Flüssigkeitsströmung 20. Auf diese Weise bleibt der verbreiterte Laserlichtstrahl 28, während er in vertikaler Richtung expandiert, im wesentlichen konstant in bezug auf die ursprüngliche Strahlbreite in der horizontalen Ebene.

Der erweiterte Laserlichtstrahl 28 tritt durch die Fokussierlinie 30, so daß der Strahl in dem Bereich 31 fokussiert werden kann, durch den die Flüssigkeitsströmung 20 verläuft. Der Fokussierbereich 31 ist in einer Phantomdarstellung in Fig. 3 gezeigt. Es ist erkennbar, daß die vertikale Strahlbreite, mit w _v bezeichnet, wesentlich kleiner ist als die horizontale Strahlbreite, mit δ _h bezeichnet. Das ist darauf zurückzuführen, daß nur die vertikale Komponente des einfallenden Laserlichtstrahls von den Prismen verbreitert worden ist. Entsprechend der zuvor erwähnten Gaußschen Beziehung ergibt die Aufweitung oder Vergrößerung der Breite des unfokussierten Laserstrahls eine Verminderung oder Abnahme der minimalen Fokussiereinschnürung in der Ebene, in der die unfokussierte Laserbreite vergrößert wurde. Die elliptische Gestalt des fokussierten Laserstrahls im Bereich 31 ist derart, daß w _v typischerweise kleiner ist als der Durchmesser der zu analysierenden Zellen, während δ _h gleich oder geringfügig größer ist als der Durchmesser der zu untersuchenden Zellen. Als Ergebnis dieser elliptischen Anordnung des fokussierten Laserstrahls wird die optische Signalintensität oder Impulshöhe vergrößert, um dadurch die Elektronik dieses Gerätes effektiver zu machen.

In Fig. 4 sind die Achsen beider Laserlichtstrahlen dargestellt, wie die jeweiligen Laserlichtstrahlen durch die Prismen verlaufen. In Fig. 4 ist die Strahlerweiterung nicht dargestellt, so daß die Divergenzcharakteristik der zwei Laserlichtstrahlen deutlicher gesehen werden kann. Selbstverständlich ist jeder Laserlichtstrahl in der vertikalen Richtung in ähnlicher Weise, wie in Verbindung mit Fig. 2 erläutert, verbreitert, wenn er durch das Prisma verläuft.

Wie zuvor beschrieben, ist die Richtung 60 des Laserlichtstrahls 16 im wesentlichen quer zur Richtung der Flüssigkeitsströmung 20. Darüber hinaus ist die Achse 65 des erweiterten Laserlichtstrahls 28 im wesentlichen parallel zur Richtung 60 und mit dieser ausgerichtet als Ergebnis der Orientierung der Prismen 25 und 26. Die Achse des unfokussierten Laserlichtstrahls 18 wird durch die Achsenlinie 70 wiedergegeben. Wie zuvor in Verbindung mit Fig. 1 erwähnt, ist der unfokussierte Laserlichtstrahl 18 in bezug auf den unfokussierten Laserlichtstrahl 16 vertikal verschoben. Entsprechend ist, wie in Fig. 4 gezeigt, die Achse 70, die für den Laserlichtstrahl 18 repräsentativ ist, vertikal in bezug auf die Richtung 60, die den Laserlichtstrahl 16 repräsentiert, verschoben. Beide Achsen konvergieren, wenn sie auf die Oberfläche 55 des ersten Prismas 25 auftreffen. Nach der Strahlerweiterung repräsentiert die Achse 65 die Erweiterung des Laserlichtstrahls 16, während die Achse 75 die Achse des Laserlichtstrahls 18 repräsentiert. Die Achse 65 verbleibt im wesentlichen horizontal in bezug auf die Flüssigkeitsströmung 20 und schneidet die Flüssigkeitsströmung im Fokussierbereich 31. Andererseits hat die Achse 75 nach dem Durchstrahlen des zweiten Prismas 26 und der Fokussierlinse 30 einen relativ kleinen Winkel in bezug auf die Achse 65. Dieser Winkel ist von dem vertikalen Abstand, der zwischen den Fokussierbereichen 31 und 32 der jeweiligen fokussierten Laserstrahlen gewünscht ist, abhängig. Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel ist der Fokussierbereich 32 des zweiten fokussierten Laserlichtstrahls typischerweise 0,25 mm vertikal von dem Fokussierbereich 31 des ersten fokussierten Laserlichtstrahls verschoben. Auf diese Weise wird die Achse 75 bei Austritt aus dem prismatischen Strahlerweiterer und der Fokussierlinse auf einem vertikal nach unten verlaufenden Weg unter relativ kleinem Winkel gehalten. Um den Abstand zwischen den jeweiligen Fokussierbereichen zu erhalten, kann die Fokussierlinse 30 aus einer sphärischen achromatischen Linse bestehen, die das Fokussieren des zweiten Laserstrahls an einem von dem ersten fokussierten Laserstrahl unterschiedlichen Punkt erleichtert.

Es kann ein Prisma oder mehr als zwei Prismen in Abhängigkeit von der strukturellen Gestaltung der optischen Elemente des Durchfluß-Zytometriegerätes verwendet werden. Während die Prismen aus verschiedenen lichtbrechenden Materialien hergestellt werden können, ist geschmolzenes Quarz (Silizium-Dioxyd) das Material der Wahl. Prismen einer Gestalt, die keinen rechten Winkel aufweist, können ebenfalls verwendet werden.

Auf diese Weise wird ein verbessertes Durchfluß-Zytometriegerät vorgeschlagen, das insbesondere in Verbindung mit Laserstrahlbeleuchtung vorteilhaft ist und das den fokussierten Laserstrahl zur Verbesserung der optischen Effizienz gestaltet. Die beschriebene Optik hat die Eigenschaft, frei von chromatischen Aberrationen zu sein, und sie vermeidet die Notwendigkeit komplizierter zylindrischer Optiken, wobei sie für einen hohen optischen Transmissions-Wirkungsgrad keine speziellen Beschichtungen benötigt.

Claims (4)

1. Durchfluß-Zytometriegerät zur Bestimmung der Eigenschaften von in einem Flüssigkeitsstrom fließenden Partikeln, insbesondere von Zellen

• - mit zwei Laserlichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen zur Erzeugung von auf den Flüssigkeitsstrom gerichteten Laserlichtstrahlen,
• - mit einer optischen Einrichtung im Strahlengang der jeweiligen Laserlichtstrahlen zum Erzielen einer Erweiterung des Laserlichtstrahls derart, daß die Erweiterung die Form einer Ellipse aufweist, deren eine Halbachse kleiner ist als deren andere Halbachse,
• - mit einer Fokussiereinrichtung für jeden Laserlichtstrahl um Fokussieren der erweiterten Laserlichtstrahlen auf den Flüssigkeitsstrom, wobei der erste erweiterte Laserlichtstrahl in einem ersten Bereich des Flüssigkeitsstroms und der zweite erweiterte Laserlichtstrahl in einem zweiten Bereich des Flüssigkeitsstroms fokussierbar ist, der in Richtung des Flüssigkeitsstroms, gesehen vom ersten Bereich, einen Abstand aufweist,
• - mit einer Detektoreinrichtung, und
• - mit einer Auswerteeinrichtung,

dadurch gekennzeichnet,

• - daß Umlenkmittel (21, 22) zur Erzeugung einer Versetzung in Richtung des Flüssigkeitsstroms und einer geringfügigen Konvergenz der auf die Einrichtung zum Erzielen einer Erweiterung der Laserlichtstrahlen (16, 18) gerichteten Laserlichstrahlen (16, 18) vorgesehen sind,
• - daß die Einrichtung zum Erzielen einer Erweiterung der Laserlichtstrahlen (16, 18) aus mindestens zwei rechtwinkligen Prismen (25, 26) besteht, die in dem Strahlengang (60, 70) der beiden Laserlichtstrahlen (16, 18) angeordnet sind und die zwischen sich einen Luftspalt (50) bilden, wobei die spitzen Winkel der Prismen (25, 26) so gewählt sind, daß der Eintrittswinkel der Laserlichtstrahlen (16, 18) an jedem Prisma (25, 26) dem Brewsterwinkel entspricht und die Austrittsfläche des im Strahlengang (60, 70) der Laserlichtstrahlen (16, 18) gesehenen letzten Prismas (26) normal zur Richtung der Laserlichtstrahlen (16, 18) vor den Prismen (25, 26) ist,
• - daß die erweiterten Laserlichtstrahlen (65, 75) unter einem gegenseitigen Winkel α aus dem letzten Prisma (26) divergierend austreten, und
• - daß die Fokussiereinrichtung für beide erweiterte Laserlichtstrahlen (65, 75) aus einer einzigen Fokussiereinrichtung (30) besteht.

2. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß einer (65) der erweiterten Laserlichtstrahlen (65, 75) aus dem im Gang der Laserlichtstrahlen gesehenen letzten Prisma (26) parallel zur Richtung des Laserlichtstrahles (16) vor dem Durchgang durch die Prismen (25, 26) austritt, während der andere der erweiterten Laserlichtstrahlen unter dem Winkel α in bezug auf diese Richtung austritt.

3. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prismen (25, 26) so angeordnet sind, daß die Laserlichtstrahlen (65, 75) hinter den Prismen (25, 26) in Richtung des Flüssigkeitsstroms erweitert sind.