JPH01196536A - 粒子解析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は粒子解析装置に関し、特にフローセル内を通過
する被検粒子にレーザ光等を照射し、該被検粒子からの
散乱光または蛍光を検出して検体粒子の性質、構造等を
解析するようにした、いわゆるフローサイトメータに関
する。

［従来の技術］ 従来フローサイトメータにおいては、クロスランド・テ
ィラーによって考案された細胞溶液の外側に高速層流を
流す方法によって個々の細胞を分離し、これによって個
々の細胞についての情報を得ることが可能となったわけ
であるが、特に細胞への光ビームの照射によってその散
乱光の測定、さらには被検粒子を蛍光染料により染色し
ておき光ビームの照射によって励起されて発する蛍光を
測定することにより多くの情報が得られる。ここで微小
な細胞による散乱光や蛍光を精度よく得るためには大出
力でノイズが少なく、かつ集光性の良い光ビームが必要
であり、一般にレーザ光が用いられる。散乱光からは細
胞の大きさ、形状、細胞核の径、体積、核内構造の複雑
さ等の情報が得られる。また蛍光からはＤＮＡ、ＲＮＡ
の染色によってＤＮＡ量、ＲＮＡ量を求めることが可能
である。特に蛍光色素を抗原もしくは抗体と結合させ、
抗原もしくは抗体と反応させることにより、フローサイ
トメータにて蛍光−を測定することで抗原もしくは抗体
の定量的な測定が可能となる。これらの場合、照射する
光ビームは蛍光色素を励起する波長のものでなければな
らない。

［発明が解決しようとしている問題点コしかしながら前
記フローサイトメータにおけるり、新しい粒子解析デー
タを検出できなかった。

また蛍光測定において−は、照射光ビームが蛍光色素を
励起するものでなければならないが、用いられる蛍光色
素がフルオレツセイン系、ローダミン系、ウンベリフェ
ロン系等の限られたものしかない。そしてこの限られた
蛍光色素に対し、照射光ビームとしては、Ａｒ”　レー
ザ（４８８，５１５ｎｍ）、Ｈｅ−Ｃｄ”レーザ（４４
２，３２５ｎｍ）、Ｎ２レーザ（３３７ｎｍ）等の短波
長気体レーザや、短波長レーザによって励起される色素
レーザが用いられる。このような短波長レーザや色素レ
ーザは大出力を得る場合には大型化してしまい、かつ安
定性にも欠けるために、それを用いた粒子解析装置も大
型化し、かつ複雑で安定性に欠ける欠点があった。

また吸収波長の異なった複数の蛍光色素を用いた場合に
単一波長の励起光を用いると、蛍光の強度が著しく低減
し、極端な場合には全く蛍光を発しない。そのために各
蛍光色素に対応した複数の光源を用意する場合には更に
装置が大型化し、検体粒子への照射のための光学系が複
雑化してしまう。

本発明は照射光の波長を短波長側に変換することにより
新たな波長の光を得て新しい粒子解析データを得る粒子
解析装置を提供することを目的としている。さらに従来
使用できなかった蛍光染料を使用して粒子解析を行なう
ことを目的としている。また半導体レーザを照射光源と
して用いることによってコンパクトな粒子解析装置を提
供することを目的とする。

［問題点を解決するための手段］ 上述した問題点を解決するため本発明は、被検粒子に照
射光を照射し該被検粒子からの光を測光して粒子解析を
行なう粒子解析装置において、光路中に入射光の波長に
対し短波長側に変換した光を少なくとも出射する光波長
変換手段を設ける。

［実施例１］ 本発明は前記光波長変換手段として非線形光学材料を用
いることにより、レーザ照射光の波長を短波長化してい
る。実施例の説明にあたり、まず本発明に用いた前記非
線形光学材料について以下に説明する。

非線形光学材料とは本願出願人が先に出願した特願昭６
２−５１７８６および特願昭６２−５４４３９に示され
る非線形光学効果を持つ材料である。

本発明で用いる非線形光学効果とは、下式ｆｌ）で示さ
れるところの物質の非線形分極において、χ＋ｎｌ　（
ｎ≧２）で表現されるところの非線形感受率を用いたも
のである。

Ｐ＝ε。χ（１）Ｅ＋ε。χ（２）Ｅ２＋ε。χ１３ゝ
　Ｅ３＋・・・・・　　　　　（’ｌ）前記非線形感受
率χ″′、χ１２）、χ（３１・・・χ＋ｎ＋を用いた
非線形光学効果として代表的なものは光第ｎ高調波発生
がある。これは周波数ωのレーザ光を前記非線形感受率
χ員ゝを有する化合物へ照射した時に周波数ｎω（ｎ≧
２）で示される光第ｎ高調波が発生する現象である。す
なわち基本となるレーザ光の短波長化が可能となる。

このような非線形感受率において特に重要なものとして
２次非線形感受率χ１２）　　と３次非線形感受率χ１
３６　がある。それぞれの非線形感受率を用いた非線形
効果のうち、本発明の粒子解析装置に通用可能なものを
次に示すが、中でも光第２高調波発生（以下、ＳＨＧと
いう）が効率の点でも優れており、本発明の実施例にお
いてもＳＨＧを用いている。

２次非線形感受率 ・光第２高調波発生（ＳＨＧ）　　ω＋ω−２ω・和・
差周波発生　　　　　ω１±ω２−ω３・光パラメトリ
ツク発振　　ω３−ω１＋ω２３次非線形感受率 ・光第３高調波発生（Ｔ）ＩＧ）ω＋ω＋ω→３ω・四
光波混合　　　　ω１±ω２±ω３−ω４・電場誘導光
第二高調波発生　ω＋ω＋０−２ω・三光波混合　ω１
−ω２＋ω３→ω２−２ωル−ザ光を前記非線形光学材
料へ入射し、非線形光学効果により入射光の波長変換を
行なうためには、入射する基本レーザ光と波長変換され
た光が干渉して減衰しないように位相整合を行なう必要
がある。位相整合の方法としては下記に示すようなもの
があり、素子形態に応じて適した方法が選択される。

（ａ）　１１結晶もしくはバルク材料において屈折率の
異方性を用いる（第４図参照） （ｂ）光ファイバ、先導波路においてモードの差を用い
る（第５図参照） （Ｃ）光ファイバ、先導波路においてチェレンコフ放射
を用いる（第６図参照） 以上のようにして構成された素子は、レーザパワー密度
、位相整合長、非線形感受率等によって決まる変換効率
で基本レーザ光を波長変換する。

例えば、ＳＨＧであれば、現在１００ｍ　Ｗ程度の半導
体レーザ（波長８３０ｎｍ）を用いて１ｍｍ程度の結晶
で約２５％の変換効率が得られる。すなわち２５ｍＷの
光第２高調波（波長４１５ｎ　ｍ　）が得られる。また
この時変換されなっかた基本レーザ光も前記光第２高調
波と同時に取り出すことが可能であり、これによって本
発明の粒子解析装置に複数波長のレーザ照射光を用いる
ことができる。

非線形光学効果によって基本レーザ光を波長変換し、基
本レーザ光と１つ以上の波長変換レーザ光を本発明の粒
子解析装置に用いる場合に、それぞれの波長λ１〜λ。

を同一の位置に照射することも可能であるしまた位置を
分離してｎ個の場所へ照射することも可能である。

なお、本発明において利用可能なレーザとしてはＹＡＧ
レーザ（波長１０６４μｍ）、ルビーレーザ（６９０ｎ
　ｍ　）　、Ｎｄ”ガラスレーザ（１０５４〜１０８２
μｍ）、カラーセンタレーザ、イオン添加結晶レーザ（
７００〜２２００ｎｍ）等の固体レーザ、また、Ｈｅ−
Ｎｅ　レーザ（８３３ｎ　ｍ）　、Ｘｅレーザ（２，０
３，４Ｚ　ｍ　）　、八ｒ４　レーザ（４８８，５１５
ｎ　ｍ　）、にビ　レーザ（６４７ｎｍ）、ＨＦレーザ
（２，６〜３．３μｍ）、ヨウ素レーザ（１，３２μｍ
）等の気体レーザ、 さらに、色素レーザ（０，３〜１．６μｍ）、半導体レ
ーザ（０，７〜１．５μｍ）等がある。

基本レーザ光を非線形光学効果を用いて波長変換して用
いるときに波長変換レーザ光の波長は好ましくは０．２
〜１．５μｍであり、より好ましくは０．２〜０．８μ
ｍである。０．２μｍ以下では非線形光学材料が光吸収
により破壊されてしまい、　１．５μｍ以上では蛍光を
測定する上で有効でない。上記のレーザは単独で使用し
ても、また２つ以上を組み合わせても良い。これらのレ
ーザの中で半導体レーザは変調が容易であり、かつ非常
に小型でコスト的にも手頃であることから本発明の粒子
解析装置に適している。

次に上述した非線形光学材料を用いた本発明の第１実施
例について説明する。第１図は基本レーザ光および光第
２高調波の同波長の光を選択して被検粒子に照射するこ
とが可能な本発明の第１実施例の構成図である６ レーザ光源ｌ　（出力１００ｍ　Ｗ　、波長４８８ｎｍ
のＡｒ”レーザ）より発射された基本レーザ光をレンズ
２にてＳＨＧ用に設計された非線形光学材料３へ収斂し
て入射させる。ここで収斂して入射させるのは入射光の
パワー密度が大きいほど非線形光学材料の変換効率が良
いからである。非線形光学材料３において位相整合がと
られているために、基本レーザ光は光第２高調波へ変換
されて出射する。この時、光第２高調波に変換されなか
った基本レーザ光も同時に出射する。光路中、前記非線
形光学材料３の後方に設けられた基本レーザ光のみを通
過させるフィルタ５および光第２高調波のみを通過させ
るフィルタ６は光路中に出し入れ自在であり、いずれか
を選択して基本レーザ光のみまたは光第２高調波のみを
通過させる。この時、ＳＨＧ以外の非線形光学効果によ
って極僅かながら発生する他波長の光は前記フィルタに
よって除去される。なお両方のフィルタを光路中から外
すことによって基本レーザ光および光第２高調波の両波
長を含んだ照射光を得ることもできる。選択された波長
の照射光は、集光しンズ７にてフローセル８内の被検粒
子ｌＯが通過するフローセル流通部９へ収斂して照射さ
れ、被検粒子ｌＯから散乱光および蛍光が発せられる。

そしてストッパ１１にて散乱されなかった直接光がカッ
トされ、前方散乱光は集光レンズ１２にて集光され、基
本レーザ光と光第２高調波が一方の光を透過し他方の光
を反射するダイクロイックミラー１３にて分離されて、
それぞれ他の波長の光を除去する波長選択フィルタ２２
、光検出器２３、および他の波長の光を除去する波長選
択フィルタ２４、光検出器２５の組にて受光される。

また、被検粒子の粒状性の情報を側方散乱光から得るた
めに、集光レンズ１４、ダイクロイツクミ。

ラー１５．１６を通過した側方散乱光（基本レーザ光と
光第２高調波）を波長選択フィルタ２６、光検出器１７
の組にて強度検出する。なお波長選択フィルタ２６は基
本レーザ光と光第２高調波のいずれか一方を選択するフ
ィルタであり、このフィルタ２６を光路外へ退去させれ
ば基本レーザ光と光第２高調波を共に検出できる。なお
ダイクロイックミラー１５．１６は側方散乱光（基本レ
ーザ光と光第２高調波）を透過し、蛍光（基本レーザ光
に対応した蛍光と光第２高調波に対応した蛍光）を反射
する。

さらに被検粒子を蛍光染料にて染色して、照射光により
励起されて被検粒子より発する蛍光を受光してその細胞
化学的性買を知るのに、ダイクロイックミラー１５、基
本レーザ光に対応した蛍光のみを波長選択する波長選択
フィルタ１８、光検出器１９で構成される光学系で蛍光
強度を検出し、ダイクロイックミラー１６、光第２高調
波に対応した蛍光のみを波長選択できる波長選択フィル
タ２０、光検出器２１で構成される光学系で別波長の蛍
光強度が検出される。

光検出器２３．２５．１７．１９．２１の検出信号は不
図示の演算回路に人力されて粒子解析の演算が行なわれ
る。

なお本実施例においては、基本レーザ光を１つだけ用い
、非線形光学材料にて２波長の照射光を得ているが、波
長の違う２つ以上の基本レーザ光を同時に非線形光学材
料に入射させて、複数波長の光を含む照射光を得ること
も可能である。この場合、得られた複数波長の光を各波
長の分離用に設けられた波長選択フィルタ群の選択によ
って波長選択して被検部に照射する。

次に本実施例の変形例として第２図に照射系の光学配置
図を示す。第１図と比較して、基本レーザ光のみを通過
させるフィルタ５が省かれ、また非線形光学材料３が光
路中に出し入れ自在となっている。非線形光学材料３を
光路中に入れフィルタ６を光路中から外すことによって
、基本レーザ光、光第２高調波の両方が得られ、また両
方の部材を光路中に入れることによって、光第２高調波
のみが得られる。また両方の部材を光路中から外すこと
によって、基本レーザ光のみが得られる。

［実施例２］ 第３図は基本レーザ光と光第２高調波を分離して両波長
を別々の位置で被検粒子に照射する本発明の第２実施例
を示す。

レーザ光源３１（出力ｌｏｏｍ　Ｗ　、波長８３０ｎｍ
の半導体レーザ）から基本レーザ光を発射し、集光レン
ズ３２にてＳＨＧ用に設計された非線形光学材料３３に
収斂させて入射させる。基本波と共に発生した光第２高
調波をダイクロイックミラー３５で分離し、該光第２高
調波を光学系３７にてフローセル３９内の被検粒子が通
過するフローセル流通部４０へ照射する。さらに前記ダ
イクロイックミラー３５を通過した基本波は全反射ミラ
ー３６で反射させ、前記光学系３７とはフローセル流通
部４０への照射位置が２００μｍ程度離れている光学系
３８にてフローセル流通部４０に照射する。そしてスト
ッパ４１．４４にて直接光がカットされ、被検粒子から
の前方散乱光は受光レンズと光検出器の組４１．４２お
よび４３．４４にて別々に検出される。また不図示の２
組の別々の側方光学系にて側方散乱光と蛍光が検出され
る。これらの検出された信号は不図示の演算回路に人力
され粒子解析の演算が行なわれる。

なお本実施例においては、基本レーザ光を１つだけ用い
、非線形光学材料にて２波長の照射光を得ているが、波
長の違う２つ以上の基本レーザ光を同時に非線形光学材
料に入射させて、複数波長の光を含む照射光を得ること
も可能である。この場合、第７図または第８図に示すよ
うな方法にて波長の違う光をを分離してフローセル流通
部に照射すれば良い。

なお以上２つの実施例においては、非線形光学材料のＳ
ＨＧを利用したが、ＴＨＧ用に設計された非線形光学材
料を用いることによって、基本波の３分の１の波長を持
つ照射光を得ることも可能である。さらに使用する基本
レーザ光も実施例には限らず、測定目的に適したレーザ
を選択して用いれば良い。

［発明の効果］ 以上説明したように、入射光を非線形光学材料を用いて
短波長側に波長変換することにより、従来蛍光励起用と
して波長が長過ぎて利用できなかった半導体レーザやＹ
ＡＧレーザのような長波長レーザが使用可能となり、ま
た従来使われていたＡｒ”レーザ等の半波長化により、
今までにない新たな波長の照射光を得ることができる。

その結果、測定パラメータが増え、解析精度・解析情報
量を向上させることが可能となる。

例えば、今までに無い新たな波長の励起光に適した蛍光
染料が使用できるため、従来得ることができなかった粒
子情報が測定可能となる。また逆に新たな蛍光染料の開
発にも貢献度が大である〜さらには従来蛍光の励起に使
用される照射光は単波長であったため、１回の測定では
被検粒子の染色に用いられる蛍光染料は１種類または発
生する蛍光波長分布が重なり合わない種類の組み合わせ
しか使用することができなかった。しかしながら本発明
によれば蛍光励起用照射光を複数波長とすることができ
るので、複数の蛍光染料を自由に組み合わせることがで
き、同時に複数の蛍光を受光することにより解析力を大
幅に向上させることができる。

また、半導体レーザを光源として用いることにより、装
置のコンパクト化、低コスト化にも大きな効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第１実施例の構成図、第２図は第１実
施例の変形例の照射光学系、第７図、第８図は複数波長
を分離しフロ一部に照射する方法の説明図、 である。図中、 ｌはＡｒ”レーザ光源、　３は非線形光学材料、５は基
本レーザ光のみを通過させるフィルタ、６は光第２高調
波のみを通過させるフィルタ、８はフローセル、　９は
フローセル流通部、１０は被検粒子、１１はストッパ、 １３．１５．１６はダイクイックミラー、１７．１９．
２１．２３は光検出器、 １８．２０．２２．２４．２６は波長選択フィルタ、３
１は半導体レーザ光源、３３は非線形光学材料、３５は
ダイクロイックミラー、３６は全反射ミラー３９はフロ
ーセル、４０はフローセル流通部、である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被検粒子に照射光を照射し該被検粒子からの光を測
   光して粒子解析を行なう粒子解析装置において、光路中
   に入射光の波長に対し短波長側に変換した光を少なくと
   も出射する光波長変換手段を設けたことを特徴とする粒
   子解析装置。 ２、被検粒子に照射光を照射し該被検粒子からの光を測
   光して粒子解析を行なう粒子解析装置において、光路中
   に入射光の波長を短波長側に変換した光と共に入射光と
   同じ波長の光も出射する光波長変換手段と、前記被検粒
   子より発する光を波長ごとに別々に受光する第１、第２
   の受光手段を設けたことを特徴とする粒子解析装置。 ３、前記光波長変換手段は非線形光学効果を有する非線
   形光学材料である請求項１または２記載の粒子解析装置
   。 ４、前記入射光が半導体レーザより発射された光であり
   、前記照射光が前記光波長変換手段より出射された光で
   ある請求項１または２記載の粒子解析装置。 ５、前記被検粒子からの光は前記照射光により励起され
   て発する蛍光である請求項１または２記載の粒子解析装
   置。