DE2742957C2

DE2742957C2 - Mikroskop-Photometer

Info

Publication number: DE2742957C2
Application number: DE2742957A
Authority: DE
Inventors: Kensaku Machida Tokio/Tokyo Miyazaki; Ichiro Hachioji Tokio/Tokyo Sawamura; Ken Hachioji Tokio/Tokyo Yonekubo
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1976-09-25
Filing date: 1977-09-23
Publication date: 1984-08-09
Also published as: US4269517A; JPS5856107B2; JPS5340541A; DE2742957A1

Description

Mikroskop und gleichzeitig die Meßfeldblende mit dem darin auszumessenden Objektdetail voll sichtbar. Die Messung am Objekt erfolgt mit einer räumlich eingeengten Meßbeleuchtung. Durch verschiedene einschiebbare Meßfeldblenden im Photometertubus lassen sich die Größe der Meßfelder stufenlos kreisförmig oder quadratisch einstellen, um Objektfelder von 0,5 bis 5 m zu erfassen. Mit Hilfe einer manuellen Feinregulierung des dem Lichtempfänger nachgeschalteten Meßverstärkers wird bei Ausführung einer Messung zunächst eine Leerstelle im Objekt auf 100 abgeglichen und werden dann nach Einbringung der Objektstelle in die Meßfeldblende die Transmission und die Extinktion abgelesen. Mit diesem bekannten Mikroskop-Photometer könne lediglich die Absorption oder Transmission unmittelbar an einem Meßinstrument abgelesen werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine direkte Bestimmung der Gesamtmenge einer Substanz in einer Probe auf photometrischem Wege zu ermöglichen.

Ein diese Aufgabe lösendes Mikroskop-Photometer ist mit seinen Ausgestaltungen in den Patentansprüchen gekennzeichnet

Es erfolgt eine spezielle Verarbeitung des vom Lichtempfänger kommenden Signals derart, daß sich als Ergebnis das Produkt des Ausgangssignals des Lichtempfängers mit der Fläche der punktbeleuchteten Zone ergibt

Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop-Photometer werden die Größe einer Probe und die Gesamtmenge einer Substanz, die in der Probe enthalten ist, zur Bildung von Standards für die quantitative Bestimmung im Rahmen klinischer Untersuchungen gemessen. Hierdurch werden die bisher subjektiven Bestimmungen objektiviert, und es wird ermöglicht, daß klinische mikroskopische Untersuchungen zu einer Routine vereinfacht werden, die mit dem sonst im Labor üblichen Mikroskopieren vergleichbar ist.

im Rahmen der Zelldiagnose dient das neue Mikroskop/Photometer beispielsweise zur Bestimmung der Zellkern-Größe und der Desoxiribonucleinsäure-Menge, wodurch eine Reihen-Vorprüfung auf normale und abnormale Zellen für die Diagnose möglich ist. Dieses quantitative Vorgehen kann zu einer automatisierten Reihen-Vorprügung entwickelt werden, mit deren Hilfe die schnelle Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben möglich ist, was schließlich der Popularität der Reihen-Untersuchungen zugute kommt.

Im folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten anhand eines schematisch dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen

Fig. IA und IB stark vereinfachte perspektivische Ansichten zur Erläuterung der Beziehung zwischen der Fläche und dem Volumen verschiedener typischer Objekte;

Fig.2 eine vereinfachte Seitenansicht des optischen Systems eines Mikroskop/Photometers nach der Erfindung;

Fig.'} ein Blockschaltbild einer Recheneinheit des Mikroskop-Photorneters:

F ι g. 4 eine Draufsicht zur Veranschaulichung des Zustandes, bei dem eine punktbeleuchtete Zone in Dekkung mit dem Umriß einer Probe gebracht ist.

Bevt>r Einzelheiten der Konstruktion des Mikroskop-Photoifheters erläutert werden, soll das ihm zugrundeliegende Arbeitsprinzip dargestellt werden. Der Inhalt bzw. d'e Gesamtmenge M einer in einer Probe enthaltenen Substanz kann durch folgende Gleichung ausgedrückt werden:

M=--C- V

Hierin stellt Cdie Konzentration der Substanz in der Probe und V das Volumen der Probe dar. Gemäß dem Lambert-Beerschen Gesetz ergibt sich die Lichtabsorption Ader Probe zu:

A = q ■ C ■ d

wobei q einen molekularen Licht-Absorptionskoeffizienien der Probe bei einer bestimmten Wellenlänge und c/die Dicke der Probe bedeuten. Dieser Ausdruck kann zur Definition der Konzentration umgeschrieben werden in

C = A/q - d

Unter der Annahme, daß die Prob" die Gestalt eines Parallelepipeds gemäß Fig. iA hai und daß die Größe der zur optischen Achse normalen Oberfläche der Probe bzw. der Projektionsfläche 5 ist, ergibt sich das VoIumen Vzu:

d- S

Entsprechend kann die Gesamtmenge M der Substanz in der Probe nach Umschreibung durch folgenden Ausdruck erhalten werden:

M - - · A ■ S = k ■ A ■ S

wobei k eine ProportionaHtätskonstante ist. Für die kugelförmige Gestalt der Probe gemäß Fig. IB ist die Konzentration C gegeben durch A/2qr, so daß die Gesamtmenge M der Substanz in der Probe

M = 4 - 3 q

- Ic¹AS

ergibt, wobei k'eine andere Proportionalitäiskonstante ist. In beiden Fällen ist die Gesamtmenge Aidem Produkt aus· dem Flächeninhalt Seiner zur optischen Achse normalen Fläche und der Lichtabsorption A proportional. Die Erfindung bezweckt die Bestimmung nicht des absoluten Wertes der Gesamtmenge, sondern der relativen Größen der Gesamtmenge bei verschiedenen Zellen oder Geweben. Wenn die zu vergleichenden Proben gleiche Gestalt haben, ist die relative Menge durch d?s Verhältnis der Produkte aus Flächeninhalt und Lichtabscrpiior der einzelnen Proben gegeben.

Das Mikroskop-Photometer bestimmt die Gesamtmenge einer in einer Probe enthaltenen Substanz durch Einstellung der Flächengröße einer punktbeleuchteten Zone S[U konform, ohne wesentliche Abweichung, mit dem Urnriß Spc p-ner Probe, und durch Verwendung monochromatischen Lichtes als Punktbeleuchtung zur Bestimmung des Flächeninhaltes S und der Lichtabsorption! A, was photometrisch anhand der Lichttransmission gemessen wird.

Fig.:! zeigt ein typisches optisches System eines Mikroskop-Photoniete."s. Das System umfaßt eine Lampe 1, die als Punktbeleuchtungsquelle dient und deren Bild auf die Eintrittspupille einer später zu erläuternden Kondensorlinse fokussiert wird, und zwar durch eine

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Feldlinse 2, einen Chopper 3, ein Interferenzfilter 4, das zur Umsetzung des Gleichspannungssignales vom wahlweise zur Anpassung an die Wellenlänge maxima- Gleichrichter in eine entsprechende Transmissionsrate ler Absorption einer Probe benutzt wird, sowie eine pro Flächeneinheit umsetzt. Der Verstärkungsfaktor Lochblende 5 hindurch, die zusammen eine monochro- der Wandlerschaltung 23 wird verändert, wenn das matische Punktbeleuchtungseinheit darstellen. Die 5 Blendenloch 5a geändert wird, und zwar in umgekehrter Lochblende umfaßt mehrere Blendenflügel mit Blen- bzw. inverser Beziehung zur Größe des jeweiligen Rlen denlöchern 5a unterschiedlichen Durchmessers, die ge- denloches 5a. Die Wandlerschaltung 23 beaufschlagt geneinander austauschbar sind und so die Möglichkeit über eine Glättungsschaltung 24 eine zweite logarithmibieten, die Flächengröße der punktbeleuchteten Zone sehe Wandlerschaltung 25, welche das Transmissionsraeinzustellen. Nach Durchgang durch das Blendenloch 5a io ten-Signal in ein Lichtabsorptions-Signal umsetzt. Die geht das monochromatische Licht durch ein halbdurch- logarithmische Wandlerschaltung 25 beaufschlagt ihrerlässiges Prisma 6 und wird an einen Umlenkspiegel 7 zu seits eine zweite Wandlerschaluing 26, welche das einer Objektivlinse 8 abgelenkt, die als Kondensorlinse Lichtabsorptions-Signal in ein Signal umsetzt, welches dient und ein verkleinertes Abbild des Blendenloches 5a der Gesamtmenge an Substanz in der Probe proportio auf der Oberfläche einer Probe 9 erzeugt. Die Probe 9 15 nal ist. Diese Umsetzung findet durch vorherige Bestimkann über einen optischen Weg beobachtet werden, mung der Flächenverhältnisse der Blendenlöcher 5;i und welcher eine Objektivlinse 10, ein Abzweigprisma 11 Änderung des Verstärkungsfaktors dieser Wandler- und ein Okular 12 umfaßt. Jenseils des Abzweigprismas schaltung bei Änderung des Blendenloches 5;i m einer 11 ist ein Umlenkspiegel 13 in Fluchtung mit der durch- festgelegten Zuordnung dazu statt. Ein als Digitalanzeigehenden optischen Achse des Abzweigprismas ange- 20 ge arbeitendes Meßgerät 27 kann mitteis eines Umordnet, welcher das Licht zu einem photoclektrischen schalters 31 wahlweise mit jeweils einem der Ausgänge Wandlerelement 14 leitet, z. B. zu einem Photovervielfa- der Wandlerschaltung 23, 25 und 26 verbunden werden. eher, der einen Lichtempfänger bildet. Eine Blende 15 Es ist außerdem mit einem Eingang eines Vergleichers und ein Verschluß 16 sind zwischen dem Umlenkspiegel 28 verbunden, dessen anderer Eingang mit einem Refe-13 und dem Wandlerelement 14 angeordnet, wobei eine 25 renzwert beaufschlagt wird, der von einem Schalter 29 Linse 17 vor dem Umlenkspiegel 13 die Pupille der Ob- kommt. Der Vergleicher 28 bringt eine rote Lampe 30 jektivlinse 10 auf die Blende 15 projiziert. Das System zum Aufleuchten, sobald das über den Schalter 31 zugekann durch eine strichpunktierte angedeutete Kamera führte Signal einen entsprechenden Referenzwert über-

18 ergänzt sein. Das optische System umfaßt ferner eine schreitet. Der Photovervielfacher 14 und die gesinnte Lichtquelle 19, die zur Beleuchtung des vollen Feldes 30 weitere Schaltung wird von einem Netzteil 32 gespeist, des Mikroskops über Linsen L, einen Umlenkspiegel M Im Betrieb erzeugt der Photovcrvielfacher 14 ein und die mit der Punktbeleuchtung gemeinsamen opti- Wechselspannungs-Ausgangssignal, da das für die Phoschen F.lemente6bis8bewirkt. tometrie benutzte monochromatische Licht mittels des

Im Betrieb wird gleichzeitig eine Punktbeleuchtung Choppers 3 periodisch unterbrochen wird. Ein entsprc-

der Probe 9 mit monochromatischem Licht und eine 35 chendes Gleichspannungssignal, das am Ausgang des

Gesamtbeleuchtung der Probe mittels der Lichtquelle Gleichrichters 22 erhalten wird, wird mittels der ersten

19 zur guten Sichtbarmachung der Probe bewirkt. Die Wandlerschaltung 23 in eine Transmissionsrate pro Flä-

Probe 9 kann daher unter beiden Beleuchtungen be- cheneinheit umgesetzt, deren Weiiigkeii mittels der _ trachtet werden. Glättungsschaltung 24 beseitigt wird. Anschließend Während die punktbeleuchtete Zone auf der Probe 9 40 wird das Transmissionsraten-Signal mittels der zweiten durch das Okular 12 beobachtet wird, können die Flügel Wandlerschaltung 25 in ein Lichtabsorptions-Signal iimder Lochblende 5 zur Einstellung der Größe des Blen- gesetzt, das seinerseits mittels der Wandlerschaltung 26 denloches 5a gewechselt werden, so daß der Umfangs- in ein Signal umgesetzt wird, welches die Gesamtmenge rand der punktbeleuchteten Zone gerade den Umriß darstellt. In der Stellung Cdes Umschalters 31 wird die der zu bestimmenden Probe umgibt. Anschließend wird 45 Gesamtmenge mittels des Meßgerätes 27 angezeigt. Aldie Voll-Feldbeleuchtung durch die Lichtquelle 19 mit- ternativ wird in den Stellungen rund A des Umschalteis eines Verschlusses 20 unterbrochen, so daß nur die ters 31 am Meßgerät 27 digital die Transmissionsrate Punktbeleuchtung übrig bleibt und für eine Photometrie pro Flächeneinheit bzw. die Lichtabsorption angezeigt, mittels des Wandlerelementes 14 wirksam ist. Sowohl Es sollte bedacht werden, daß die so erhaltenen phodie Beobachtung als auch die Photometrie kann mit 50 tometrischen Werte auf der Anwendbarkeit des Lambefriedigendeir Ergebnis durchgeführt werden, wenn bert-Beerschen Gesetzes beruhen. Natürlich '"iben in das Abzweigprisma 11 so eingestellt ist. daß ungefähr der Praxis die tatsächlichen Proben keine ideale Gestalt, 20% der Gesamt-Lichtenergie in den Beobachtungs- z. B. die Gestalt eines Parallelepipeds oder eine Kugel; strahlengang eintritt, während der Rest zur Photometrie hieraus folgt, daß die Fehlausrichtung zwischen dem geleitet wird. Als Abzweigprisma 11 kann auch ein ver- 55 Umriß der Probe und der Punktbeleuchtungszone zu schiebliches Reflexior.sprisma verwendet werden, damit einem Fehler des photometrischen Wertes führt. Jedoch nahezu 100% des durch die Probe hindurchgehenden wurde statistisch festgestellt, daß der aus der Fehlaus-Lichtes zur Beobachtung herangezogen werden kann. richtung resultierende Fehler höchstens 8% oder weni-F i g. 3 zeigt das Blockschaltbild einer Recheneinheit, ger beträgt und daher der Anwendung der Erfindung welche die Gesamtmenge in einer Probe bzw. das vor- to zur Unterscheidung zwischen normalen und abnormagenannte Produkt aus der Lichtabsorption und dem Flä- len Zellen nicht entgegensteht. Zwar könnte eine Abcheninhalt auf der Basis der Lichttransmission durch die tast- und Integrier-Methode zur Vermeidung der aus Probe bei Punktbeleuchtung anhand des auf den Photo- der Fehlausrichtung resultierenden Fehler angewandt vervielfacher 14 auftreffenden Lichtes berechnet. Die werden. Jedoch sind die dazu notwendigen Maßnahmen Recheneinheit umfaßt einen Verstärker 21, an den der f>5 kompliziert, und die Abtastung erfordert eine exakte Photovervielfacher 14 angeschlossen ist und der einen Bewegung des Mikroskop-Tisches, was ebenfalls zu ei-Gleichrichter 22 beaufschlagt. An den Gleichrichter 22 ner Komplizierung und Verteuerung führt. Beim Verist eine erste Wandlerschaltung 23 angeschlossen, die gleich mit der Abtast-Methode wurde festgestellt, daß

eine enge Korrelation zwischen den mittels des erfindungsgemäßen Mikroskopes erhaltenen photometrischen Werten und solchen photometrischen Werten besteht, die mit de*· Abtast-Methode erhalten wurden. Dies rechtfertigt die Anwendung der Erfindung. 3

Abwandlungen sind in mancher Weise möglich. Beispielsweise können die Flügel der Lochblende entweder manue¹.¹ oder automatisch gewechselt werden. Auch kann die Lochblende durch einen Mechanismus ersetzt sein, welcher die Querschnittsfläche des Lichtflusses, der io die Punktbeleuchtung erzeugt, verändert.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche: 10

1. Mikroskop-Photometer für die quantitative Bestimmung einer Substanz in einer Probe, mit einer Vollfeld-Beleuchtungseinheit, mit einer Punkt-Beleuchtungseinheit, die gleichzeitig mit der Vollfeld-Beleuchtungseinheit einschaltbar ist, monochromatisches Licht abgibt und eine verstellbare Blende zur Veränderung der Größe ihres Beleuchtungspunktes aufweist, mit einem photoelektrischen Wandler für durch das Gebiet des Beleuchtungspunktes von der Punkt-Beleuchtungseinheit hindurchgegangenes Licht und mit einer an den photoelektrischen Wandler angeschlossenen Photometrie-Recheneinheit, in der ein der Transmission des Gebiets des Beleuchtungspunktes entsprechendes Transmissions-Signal entsteht, dadurch gekennzeichnet, daß die Recheneinheit (F i g. 3) eine die der durch die Probe hindurchgegangene Lichtmenge entsprechende Gleichspannung in eine flächenbezogene Durchgangsratt umwandelnde erste Wandlerschaltung (23) umfaßt, die eine auf die Einstellung der einstellbar ausgebildeten Blende (5) hin den Verstärkungsfaktor umgekehrt proportional zur Größe des punktbeleuchteten Bereichs (1,2,3,4,6,7,8) verändernde Schaltung und eine zweite Wandlerschaltung (23) mit einer auf die Einstellung der einstellbaren Blende (5) hin deren Verstärkungsfaktor verändernde Schaltung zur Umwandlung eines Absorptions-Signals in ein der Gesamtmenge der in der Probe enthaltene η Substanz proportionales Ausgangssignal nach Abschalten der Vollfeld-Beleuchtungseinheit (19) umfaßt, daß das Ausgangssignal eine Funkchungen so weitgehend automatisiert und vereinfacht worden, daß praktisch jede Untersuchung, einschließlich hochkomplexer Untersuchungen als Routine durchgeführt werden kann. Andererseits ist demgegenüber die Automatisierung und Vereinfachung von Untersuchungen, bei denen Mikroskope zur Anwendung kommen, zurückgeblieben, da die Behandlung und Feststellung von Proben sowohl Erfahrung und Geschicklichkeit als euch Arbeitseinsatz und -zeit erfordern. Beispielsweise kann es für die Diagnose von Kreb; notwendig sein. Zellen unter dem Mikroskop zu untersuchen, um eine frühe Diagnose und eine frühe Behandlung zu ermöglichen. Dies gilt besonders für Gebärmutterhalskrebs, welcher der häufigste bösartige Tumor in der Gynäkologie ist. Es ist anerkannt, daß die Untersuchung von Zellen unter dem Mikroskop für die frühe Diagnose wichtig und zweckmäßig ist, weshalb sie bei Reihenuntersuchungen und periodischen Vorsorgeuntersuchungen angewandt wird. Dies hat dazu geführt, dpö die Zahl der untersuchten Proben immer größer geworden ist. Zur Diagnose der Zellen unter dem Mikroskop gehört eine subjektive Bestimmung morphologischer Unterschiede zwischen normalen und bösartigen Zelien. Diese Bestimmung ist nur mit guten zytologischen Kenntnissen und einer sorgfältigen Untersuchung möglich. Eine genaue und schnelle Bestimmung verschiedener Merkmale einer Reihe von Proben, wie z. B. des Kerndurchmessers, des Kern/Zytoplasma-Verhältnisses. der Kernfärbung, des Chromatingranuloms, des Nucleins oder dgl. ist selbst für einen geübten Mitarbeiter nicht ohne weiteres möglich.

Entsprechend können die Entscheidungen von Ärzten, die mit der Diagnose von Zellen vertraut sind, \ on-

20 einander abweichen. Es ist daher für die Genauigkeit

tion des Produkts des Ausgangssignals des photo- 35 der Bestimmung wichtig, daß subjektive Standards aufelektrischen Wandlers (14) und der Fläche des gegeben und dafür objektive Standards für die Bestimmungen im Rahmen der Diagnose von Zellen eingeführt werden. Zur Anwendung objektiver Standards ist es notwendig, eine Reihe von Parametern meßbar zu ma-40 chen, welche zur Bestimmung herr-gezogen werden. In jüngerer Zeil ist versucht worden, anhand morphologischer Beobachtungen verschiedene meßbare Parameter auszusuchen und für sie Referenzwerte festzulegen, welche für die quantitative Bestimmung normaler und anomaler Zustände herangezogen werden können. Man ist hierbei zu dem Ergebnis gekommen, daß die Unterscheidung zwischen normalen und abnormen Zuständen anhand der Größe des Nucleus bzw. Zellkerns und der Menge der Desoxiribonucleinsäure möglich ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop zu schaffen, welches die Durchführung schwieriger Untersuchungen, z. B. von Zelidiagnosen. durch quantitative Bestimmung der Größe und Gesamtmenge einer Substanz in einer Probe auf relativ einfache, physikalische Weise gestattet.

Diese Aufgabe wird ertindungsgemäß mit den· im Anspruch 1 und bezüglich einer vorteilhaften Ausgestaltung im Unteranspruch 2 gekennzeichneten Mikroskop gelöst.

Zur Erleichterung der Untersuchung»π ist für quantitative Messungen an mikroskopischen Objekten im Durchlicht und zur Ermittlung von stoff- und behandlungsspezifischen Daten ist ein Mikroskop-Photometer bekannt (G + T Fach/. Lab. 20 (1976) II. I. S. 48). bei

punktbeleuchteten Bereichs ist und daß die zweite Wandlerschaitung (26) eine zweite Schaltung zur Größenänderung der Blende (5) direkt proportional zur Veränderung deren Verstärkungsfaktors aufweist.

2. Mikroskop-Photometer nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die Blende (5) der PuHa-Beleuchtungseinheit (1) mehrere, gegeneinander auswechselbare Blendenflügel mit Blendenlöchcrn (Sa) unterschiedlichen Durchmessers aufweist, die jeweils wahlweise in den Strahlengang der monochromatischen Punkt-Beleuchtungseinheit (1) einbringbar sind.

3. Mikroskop-Photometer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Recheneinheit (F i g. 3) einen der ersten Wandlerschaltung (23) vorgeschalteten Verstärker (21) mit nachfolgendem Gleichrichter (22) umfaßt und daß zwischen die erste Wandlerschaltung und die logarithmische Wandlerschaltung (25) eine Glättungsschaliung (24) eingefügt ist.

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Die Erfindung betrifft ein Mikroskop-Photometer zur quantitativen Bestimmung einer Substanz in einer Probe, z. B. einer Krebszelle, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

In jüngerer Zeit sind auf dem Gebiet der klinischen Untersuchungen bedeutende Fonschritte gemacht worden. Insbesondere sind chemische klinische Untersub5 dem die Transmission und/oder Extinktion di-> /u untersuchenden Stoffs gemessen wird. Eine regelbare Lampe beleuchtet das Objekt im gesamten Sehfeld. Während der Einstellung des Objektivs ist das gesamte Sehfeld im