DE4228366C2

DE4228366C2 - Fluoreszenz-Meßvorrichtung

Info

Publication number: DE4228366C2
Application number: DE19924228366
Authority: DE
Inventors: Rainer Dr Uhl
Original assignee: Individual
Current assignee: Till Id De GmbH
Priority date: 1992-08-26
Filing date: 1992-08-26
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2012-08-27
Also published as: DE4228366A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Fluoreszenz-Meßvorrichtung zum Bestimmen von Ionenkon zentrationen eines mit die Absorptions- oder Fluoreszenzeigenschaften in Abhängigkeit von der Ionenkonzentration ändernden Fluoreszenzfarbstoff angefärbten Untersu chungsobjekts, gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Bei einer bekannten Fluoreszenz-Meßvorrichtung dieser Art (Rev. Sci. Instrum., 58, 1987, Seiten 1996 bis 2003) ist als Mittel zur Auswahl der vorgebbaren Wellenlängen ein akustisch-optisch abstimmbares Filter vorgesehen, das einen mit einem Kristall verbun denen piezoelektrischen Wandler aufweist. Wenn der Wandler mittels eines angelegten Hochfrequenzsignals angeregt wird, werden in dem Medium akustische Wellen erzeugt. Die sich ausbreitenden akustischen Wellen bewirken über den elasto-optischen Effekt eine periodische Modulation des Brechungsindex. Dies führt zu einem bewegten Pha sengitter, das Teile eines einfallenden Lichtstrahls bricht.

Es ist ferner eine Fluoreszenz-Meßvorrichtung zum Bestimmen der Ionenkonzentration in einem mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen angefärbten Untersuchungs objekt bekannt (DE 40 26 564 A1), die eine einzige polychromatische Lichtquelle, eine Einrichtung zur Beleuchtung des Untersuchungsobjektes mit mehreren unterschiedli chen vorwählbaren Anregungswellenlängen in kurzem zeitlichem Abstand und eine De tektoreinheit zur Umwandlung des resultierenden Fluoreszenzlichtes in ein Meßsignal aufweist. Dabei ist die Beleuchtungseinrichtung mit mehreren Interferenzfiltern unter schiedlicher Durchlaßcharakteristik ausgestattet, die mittels eines Schrittmotors wahl weise auf der optischen Achse positioniert werden. Das Verstellen der Filter kann aber selbst mit den schnellsten bekannten Schrittmotoren nicht so rasch vorgenommen wer den, daß eine bichromatische Anregung mit ausreichender Zeitauflösung möglich wird.

Des weiteren ist ein Monochromator bekannt (DD 1 36 775), bei dem zur Frequenz selektierung zwei holographische Volumengitter mit verschiedener Dicke und Ortsfre quenz angeordnet sind, die sowohl in Transmission als auch in Reflexion einsetzbar sind. Dabei kann ein Lichtbündel auf ein erstes Volumengitter gerichtet werden, das zur Vorselektion des Wellenlängenbereichs dient. Eine im Strahlengang hinter dem ersten Volumengitter liegende Blende blendet alle Beugungsordnungen außer der ersten aus. Ein weiteres Volumengitter dient dann der Hochauflösung des vorzerlegten Spektralbe reichs. Bei dem weiteren Volumengitter kann es sich auch um ein Kopplungsgitter han deln, d. h. ein Volumenhologramm, bei dessen Herstellung im Verlauf des Einschreibens mehrere Gitter sequentiell oder simultan überlagert worden sind. Mit Hilfe des Kopp lungsgitters können gleichzeitig mehrere Spektralbereiche selektiert werden.

Ferner ist es bekannt (Optical and Quantum Electronics, 11, 1979, Seiten 87-96), ein holographisches Volumengitter zwecks Frequenzselektion drehbar anzuordnen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Fluoreszenz-Meßvorrichtung zu schaf fen, die sich durch einen besonders einfachen Aufbau auszeichnet und die es erlaubt, die gewünschten Messungen besonders rasch und zuverlässig durchzuführen, d. h. bei mehreren Wellenlängen entweder gleichzeitig oder mit einem zeitlichen Abstand von z. B. wenigen Millisekunden anzuregen.

Diese Aufgabe wird durch eine Fluoreszenz-Meßvorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.

Bei den vorliegend eingesetzten Volumengittern werden mittels einer holographischen Methode Brechungsindexvariationen in einem insbesondere aus Gelatine bestehenden Film erzeugt, so daß Braggsche Beugungsphänomene auftreten. Solche Volumengitter lassen sich so dünn und klein fertigen, daß sie unter Einsatz etablierter Scanner-Tech nologien rechnergesteuert mit der vorliegend nötigen Geschwindigkeit und Genauigkeit gedreht werden können. Es wird auf diese Weise möglich, in kürzester Zeit, beispiels weise wenigen Millisekunden, jede beliebige Wellenlänge eines großen Spektralbereichs einzustellen. Es kann daher unter Verwendung einer einzigen Lichtquelle ein Beleuch tungssystem aufgebaut werden, das für alle oder fast alle Fluoreszenzmeßzwecke ge eignet ist.

Zwischen der Lichtquelle und dem holographischen Volumengitter ist vorzugsweise ein einzelner Lichtleiter angeordnet, dessen Eintrittsöffnung mit Licht von der Lichtquelle beaufschlagt ist und dessen Austrittsöffnung auf der Ausgangsseite des Volumengitters liegt. Dabei ist zweckmäßig zwischen der Austrittsöffnung des Lichtleiters und der Ein gangsseite des holographischen Volumengitters ein Parabolspiegel angeordnet.

Die einzige Lichtquelle kann gepulst, beispielsweise als Blitzlampe ausgelegt, sein. Blitzlampen erlauben es, ihre gesamte Lichtenergie in weniger als beispielsweise einer Mikrosekunde freizusetzen. Dadurch kann das Dunkelrauschen eliminiert werden, da in dem kurzen Zeitfenster, während dessen der Detektor offen gehalten werden muß, nur wenige Rauschelektronen akkumulieren können. Weil zudem die Anzahl der Blitze pro Anregungswellenlänge variabel gestaltet werden kann, lassen sich Unterschiede in der Fluoreszenz-Effizienz bequem ausgleichen. Sollte bei einer Anregungswellenlänge z. B. die Fluoreszenz des Untersuchungsobjekts fünfmal geringer sein als bei der anderen verwendeten Anregungswellenlänge, können fünf Blitze der erstgenannten Wellenlänge integriert werden, während bei der anderen Anregungswellenlänge nur einmal geblitzt wird. Bei einer Verhältnismessung, bei welcher die Fluoreszenz bei zwei verschiedenen Anregungswellenlängen ermittelt wird, ist der Quotient der Meßwerte von Zelldicke und Indikatorkonzentration unabhängig und ein direktes Maß für die Ionenkonzentra tion in dem Untersuchungsobjekt, beispielsweise einer Zellkultur. Für das Signal/Rausch-Verhältnis einer solchen Verhältnisbildung ist es aber vorteilhaft, wenn beide Meßwerte (d. h. Zähler und Nenner) in etwa gleich groß sind, was auf die vorste hend skizzierte Art und Weise leicht erreicht werden kann. Für die Aufnahme von Bil dern mit einer CCD-Kamera ist wegen deren langer Auslesezeit eine stroboskopartige Beleuchtung ebenfalls von Vorteil. Eine solche Beleuchtung stellt sicher, daß während des Ausleseprozesses keine weiteren Photonen akkumuliert werden, die das Bild ver schmieren könnten.

Die Beleuchtungsvorrichtung kann aber auch mit einer kontinuierlichen Lichtquelle ausgestattet sein.

Zwischen der Austrittsseite des Volumengitters und einem im Strahlengang zwischen dem Volumengitter und dem Untersuchungsobjekt abbildenden System, beispielsweise einem Mikroskop, kann gleichfalls ein Lichtleiter angeordnet sein. Die Lichtleiter kön nen in ihrem Querschnitt genau dem optimalen Lichtdurchsatz des abbildenden Systems (Mikroskops) angepaßt sein. Ein weiterer Vorteil der Lichtleiter liegt in der räumlichen Trennung zwischen der Lichtquelle und dem abbildenden System (Mikroskop). Probleme durch die Wärmeentwicklung der Lampe sowie elektrische Artefakte durch den Zündvorgang bei Verwendung einer gepulsten Lichtquelle werden sicher verhin dert. Zur Fokussierung des gebeugten Lichtes auf dem Austrittslichtleiter wird bevor zugt ebenfalls ein Parabolspiegel eingesetzt. Man kann sich dazu des Parabolspiegels bedienen, der bereits das Licht vom Eintrittslichtleiter auf das Gitter geworfen hat. Im Idealfall müßten dann Eintritts- und Austrittslichtleiter die gleiche Position einnehmen. Dies ist selbstverständlich praktisch undurchführbar. Es wird jedoch dafür gesorgt, daß Eintritts- und Austrittslichtleiter an ihrem gitterseitigen Ende unmittelbar untereinan der bzw. nebeneinander liegen. In einem solchen Fall kann mit einem einzigen Spiegel, insbesondere Parabolspiegel, gearbeitet werden.

Sollen Eintritts- und Austrittslichtleiter jedoch deutlich voneinander getrennt sein, benötigt man insgesamt zwei Parabolspiegel, einen für den Eintritt und einen für den Austritt. Dazu ist es dann aber notwendig, daß Einfalls- und Ausfallswinkel des vom Gitter gebeugten parallelen Lichtes unterschiedlich sind.

Es versteht sich, daß das beschriebene Gerät auch zur Mikrospektralphotometrie einge setzt werden kann.

Die Meßvorrichtung kann derart ausgelegt sein, daß die bei mehreren unterschiedlichen Wellenlängen angeregten Fluoreszenzwerte nacheinander bestimmt werden, d. h. die Zuordnung über das Zeitprofil erfolgt. Bei Fluoreszenzfarbstoffen, mit denen sich bei spielsweise die lebende Zelle anfärben und die räumliche Verteilung von für den Zell metabolismus wichtigen Ionen (Magnesium, Kalium und Chlorid, vor allem aber Cal cium) registrieren läßt, beträgt die Lebensdauer des für die Fluoreszenzmessung heran gezogenen angeregten Zustandes in der Regel nur einige Nanosekunden. Während die ser kurzen Zeit, in der die angeregten Moleküle Photonen aussenden, können die Mo leküle ihre Lage und Orientierung nur sehr geringfügig ändern. Ein mit einer de finierten Polarisationsrichtung angeregtes Molekül wird demnach auch polarisiertes Licht emittieren. Dieser Umstand läßt sich bei der Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach der Erfindung dadurch ausnutzen, daß die Meßvorrichtung derart ausgelegt ist, daß das Untersuchungsobjekt mit den beiden unterschiedlichen Anregungswellenlängen gleich zeitig, aber mit unterschiedlicher Polarisationsrichtung angeregt wird. Die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes erfolgt also gleichzeitig mit zwei Wellenlängen, und zwar bei der einen Wellenlänge mit der einen und bei der anderen Wellenlänge mit der dazu ortho gonalen Polarisationsrichtung. Trotz der gleichzeitigen Anregung läßt sich bei der Detektion eine genaue Zuordnung treffen, welcher Anteil der Fluoreszenz von der jeweiligen An regungswellenlänge herrührt. Dazu muß lediglich das emittierte Licht in seine Polarisa tionskomponenten zerlegt werden, und diese Komponenten müssen getrennt registriert werden.

Die anregungsseitige bichromatische Polarisationsaufspaltung geschieht vorzugsweise unmittelbar vor dem Beugungsgitter mit Hilfe eines polarisierenden Prismas, insbeson dere eines Rochon-Prismas oder eines Wollaston-Prismas, welches den ordentlichen und den außerordentlichen Strahl um einen bestimmten, vorgebbaren Winkel gegenein ander versetzt. Der Winkelversatz kann so gewählt werden, daß der resultierende unter schiedliche Eintrittswinkel auf dem Beugungsgitter genau den gewünschten Wellenlän genunterschied ergibt.

Zur Registrierung benutzt man bei photometrischen Spotmessungen vorzugsweise einen polarisierenden Strahlteilerwürfel mit zwei nachgeschalteten Detektoren. Durch die Möglichkeit, Halbleiterdetektoren einsetzen zu können, ist dies ohne große Kosten zu realisieren. Die Verhältnisbildung der simultan ermittelten Meßwerte geschieht dann entweder analog (z. B. über logarithmische Verstärker) oder digital, wobei in jedem Fall Schwankungen der Anregungsenergie vollständig eliminiert werden.

Bei zweidimensionalen Aufnahmen mit einer CCD-Kamera müssen entweder zwei Ka meras eingesetzt werden, oder man erzeugt mit Hilfe eines zweiten Prismas (insbesondere Rochon-Prismas) zwei nebeneinanderliegende Halbbilder auf einem CCD-Chip.

Die Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach der Erfindung läßt sich in Verbindung mit einem Mikroskop anwenden, wobei zwischen der Austrittsseite des holographischen Volumen gitters und dem Auflichtkondensor des Mikroskops eine Blende sitzt die direkt in die Objektiv-Pupille des Mikroskops abgebildet wird.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Meßvorrichtung nach der Erfindung sind nachste hend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert. Es zeigt

Fig. 1 schematisch eine Fluoreszenz-Meßvorrichtung mit scannergesteuer tem, in Reflexion betriebenem Volumengitter zur zeitlich versetzten Erzeugung der unterschiedlichen Anregungswellenlängen,

Fig. 2 eine schematische Darstellung eines Teils einer Meßvorrichtung ähn lich Fig. 1, die jedoch für simultane Anregung mit zwei Wellenlängen ausgelegt ist,

Fig. 3 eine Ausführungsform des abbildenden Systems der Meßvorrichtung gemäß Fig. 2 und

Fig. 4 eine abgewandelte Ausführungsform des abbildenden Systems.

Die in Fig. 1 veranschaulichte Fluoreszenz-Meßvorrichtung weist eine gepulste Licht quelle 1, beispielsweise in Form einer Stroboskop-Blitzlampe, auf, deren Licht über ein zweckentsprechendes, nicht näher dargestelltes abbildendes System (Optik) in einen Lichtleiter 2 eingekoppelt wird. Aus dem Austrittsende des Lichtleiters 2 austreten des Licht trifft auf einen Parabolspiegel 3, und es wird von diesem auf ein holographi sches Volumengitter 4 gerichtet. Das Volumengitter 4 wird bei der veranschaulichten Ausführungsform in Reflexion betrieben. Es ist auf einem Scanner 5 befestigt, dessen Treiberelektronik nicht dargestellt ist. Licht, welches vom Volumengitter unter dem gleichen Winkel wieder zurückgebeugt wird, trifft wieder auf denselben Parabolspie gel 3 und wird von diesem in die Eintrittsöffnung eines austrittsseitigen Lichtleiters 6 fokussiert. Durch entsprechende Ansteuerung des das Volumengitter 4 tragenden Scan ners 5 läßt sich das Volumengitter 4 rasch und genau drehen. Innerhalb weniger Millisekunden kann so jede beliebige Wellenlänge innerhalb eines großen Spektralbereichs eingestellt werden, um sich unterschiedlichen Meßanforderungen, insbesondere unterschiedlichen Indikatorfarbstoffen, anzupassen.

Das aus dem Lichtleiter 6 austretende polychromatische Anregungslicht wird mittels ei nes abbildenden Systems (7, 8) zu dem beispielsweise eine Linse 7 gehört, in den Auflicht strahlengang eines Mikroskops 8 eingekoppelt und mit einem dichroitischen Spiegel 9 in den Mikroskoptubus eingespiegelt. Der dichroitische Spiegel 9 reflektiert die beiden Anregungswellenlängen, welche danach von einem Objektiv 10 in einer Objektebene 11 fokussiert werden. Dort regen sie Indikatormoleküle zur Fluoreszenz an. Teile des abge strahlten Fluoreszenzlichtes werden von dem Objektiv 10 wieder aufgefangen und pas sieren den dichroitischen Spiegel 9, der so ausgelegt ist, daß die verschiedenen Anregungswellenlängen reflektiert, das von der Probe ausgesandte Fluoreszenzlicht da gegen transmittiert wird. Abgestrahltes Fluoreszenzlicht wird danach von einer Projektionslinse 12 in einer Beobachtungsebene 13 fokussiert, wobei ein vergrößertes Bild des Objekts in der Objektebene 11 erhalten wird. Für Spotmessungen ist in der Beobachtungsebene 13 ein einzelner Detektor, vorzugsweise ein Halbleiterdetektor, für zweidimensionale Messungen beispielsweise eine CCD-Kamera angebracht.

Die Anordnung gemäß Fig. 2 eignet sich zur Simultananregung mit zwei Wellenlängen unter Verwendung von polarisiertem Licht. Dabei ist zur anregungsseitigen bichromati schen Polarisationsaufspaltung im Strahlengang unmittelbar vor dem Volumengitter 4 ein polarisierendes Prisma 16, insbesondere ein Rochon- oder Wollaston-Prisma 16 angeordnet, welches den ordentlichen Strahl 17 und den außerordentlichen Strahl 18 um einen bestimmten, vorgebbaren Winkel gegen einander versetzt, wie dies in Fig. 2 angedeutet ist. Der Winkelversatz kann so gewählt werden, daß der resultierende unterschiedliche Eintrittswinkel auf dem Volumengitter 4 genau den gewünschten Unterschied der Anregungswellenlängen ergibt.

Zur Registrierung ist bei photometrischen Spotmessungen gemäß Fig. 3 vorzugsweise ein polarisierender Strahlteilerwürfel 19 vorgesehen, dem zwei Detektoren 20 und 21 nachgeschaltet sind. Bei den Detektoren 20 und 21 handelt es sich zweckmäßig um Halbleiterdetektoren. Das Verhältnis der simultan ermittelten Meßwerte kann, bei spielsweise über logarithmische Verstärker, analog gebildet werden. Die Meßwertverar beitung kann aber auch digital geschehen. In jedem Fall werden Schwankungen der Anregungsenergie vollständig eliminiert.

Fig. 4 zeigt eine abgewandelte Ausführungsform bei der im Strahlengang zwischen dem Objektiv 10 und der Tubuslinse 12 ein weiteres polarisierendes Prisma 22, insbesondere ein Rochon- oder Wollaston-Prisma sitzt, mit dessen Hilfe in der angedeuteten Weise zwei nebeneinanderliegende Halbbilder auf ein und den selben CCD-Chip erzeugt werden, wobei eine Hälfte 23 für das aus "ordent lichem Licht" zusammengesetzte Bild, und die zweite Hälfte 24 für das aus "außerordentlichem Licht" zusammengesetzte Bild benutzt wird.

Bei manchen Farbstoffen besteht die Möglichkeit einer Verhältnisbildung, indem bei nur einer selektierten Wellenlänge angeregt und bei zwei Wellenlängen die Fluoreszenz bestimmt wird. Dazu lassen sich die gezeigten Anordnungen auch verwenden, indem man den Polwürfel im Mikroskop durch einen dichroitischen Teilerspiegel ersetzt, der das emittierte Licht in die beiden gewünschten Wellenlängen aufspaltet.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der Apparatur besteht darin, während der Mes sung für kurze Zeit mit UV-Licht anzuregen (ca. 360 nm) und damit die Photolyse einer sogenannten "caged compound" auszulösen. Diese Verbindungen setzen durch einen Lichtblitz Ionen (z. B. Calcium) oder zellaktive Substanzen wie ATP oder cykIische Nucleotide frei und ermöglichen es so, zellinterne Regelprozesse gezielt und stoßförmig anzuregen. Danach kann dann wieder mit dem üblichen Meßprotokoll die eigentliche Messung fortgesetzt und die Wirkung der freigesetzten Substanz verfolgt werden.

Claims

1. Fluoreszenz-Meßvorrichtung zum Bestimmen von Ionenkonzentrationen eines mit die Absorptions- oder Fluoreszenzeigenschaften in Abhängigkeit von der Ionenkon zentration ändernden Fluoreszenzfarbstoff angefärbten Untersuchungsobjekts, mit

- einer polychromatischen Lichtquelle,
- Mitteln zur Auswahl von vorgebbaren Wellenlängen in kurzem zeitlichem Ab stand zur Fluoreszenzanregung oder zur gleichzeitigen Fluoreszenzanregung des Untersuchungsobjektes mit beliebig vorgebbarer Belichtungszeit für jede Wellenlänge und beliebig vorgebbaren Dunkelpausen,
- einer Detektoreinheit zum Empfang des Fluoreszenzlichts und mit
- einer Auswerteeinrichtung,
dadurch gekennzeichnet, daß
- die Mittel zur Auswahl der vorgebbaren Wellenlängen ein holographisches Volumengitter (4) sind, das auf einem verstellbaren Scanner (5) angeordnet ist, der zur Erzeugung der Wellenlängen und Einstellung der Belichtungszeit in die entsprechende Wellenlängenposition und zur Einstellung der Dunkelpau sen in eine das System nicht anregende Wellenlängenposition einstellbar ist.

2. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwi schen der Lichtquelle (1) und dem holographischen Volumengitter (4) ein einzelner Lichtleiter (2) angeordnet ist, dessen Eintrittsöffnung mit Licht von der Lichtquelle (1) beaufschlagt ist und dessen Austrittsöffnung auf der Eingangsseite des Volumengit ters (4) liegt.

3. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwi schen der Austrittsöffnung des Lichtleiters (2) und der Eingangsseite des hologra phischen Volumengitters (4) ein Parabolspiegel (3) angeordnet ist.

4. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumengitter (4) als Reflexionsgitter betrieben ist.

5. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (1) gepulst ist.

6. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtquelle (1) eine Blitzlampe vorgesehen ist.

7. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtquelle eine kontinuierliche Lichtquelle vorgesehen ist.

8. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Austrittsseite des Volumengitters (4) und einem im Strahlengang zwischen dem Volumengitter und dem Untersuchungsobjekt liegenden abbildenden System (7, 8) ein austrittsseitiger Lichtleiter (6) angeordnet ist.

9. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein Parabolspiegel (3) zum Fokussieren des aus dem Volumengitter (4) austretenden Lichts in die Eintrittsöffnung des austrittsseitigen Lichtleiters (6) vorgesehen ist.

10. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zur Erzeugung eines ordentlichen Strahls (17) und eines außerordentlichen Strahls (18) vorgesehen sind, um das Untersuchungsobjekt mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen gleichzeitig, aber mit jeweils unterschiedlicher Polarisierung anzuregen.

11. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß unmittelbar vor dem holographischen Volumengitter (4) ein polarisierendes Prisma (16) angeordnet ist, welches ausgangsseitig den ordentlichen Strahl (17) und den außerordendlichen Strahl (18) um einen vorbestimmten Winkel gegeneinander versetzt, wobei der Winkelversatz so gewählt ist, daß die resultierenden unterschiedlichen Eintrittswinkel der Strahlen auf dem Beugungsgitter den gewünschten Wellenlängenunterschied bewirken.

12. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das abbildende System mit einem polarisierenden Strahlteilerwürfel (19) versehen ist, dem zwei Detektoren (20, 21) nachgeschaltet sind.

13. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang nach dem Objekt ein weiteres polarisierendes Prisma (22) liegt, das für die beiden unterschiedlichen Wellenlängen zwei nebeneinanderliegende Halbbilder erzeugt.

14. Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein CCD- Chip vorgesehen ist, auf dessen jeweiliger Hälfte (23, 24) je eines der Halbbilder erzeugt wird.

15. Verwendung der Fluoreszenz-Meßvorrichtung nach einem der vorhergehenden An sprüche in Verbindung mit einem Mikroskop (8), wobei zwischen der Austrittsseite des holographischen Volumengitters (4) und dem Auflichtkondensor des Mikroskops (8) eine Blende sitzt, die direkt in die Objektiv-Pupille des Mikroskops abgebildet wird.