DE3604815C2

DE3604815C2 -

Info

Publication number: DE3604815C2
Application number: DE3604815A
Authority: DE
Inventors: Peter Dr. 7080 Aalen De Baurschmidt
Original assignee: Carl Zeiss AG
Current assignee: Carl Zeiss AG
Priority date: 1986-02-15
Filing date: 1986-02-15
Publication date: 1988-12-08
Also published as: JPS62192632A; DE3604815A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskopphotometer zur Messung der Fluoreszenz oder Absorption einer Probe bei zwei verschiedenen Wellenlängen gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Für zellbiologische Untersuchungen werden zur Markierung der Proben zunehmend fluorochrome Substanzen eingesetzt, die eine Messung ganz spezieller Zell- bzw. Probeeigenschaften erlauben. Die Wirkungsweise der Markierungen beruht darauf, daß Änderungen im spektralen Verhalten der fluorochromen Substanz unter dem Einfluß von chemisch/biologischen Reaktionen auftreten, wie das in Fig. 4 schematisch dargestellt ist.

Beispielsweise ändert die Markiersubstanz FURA-2 ihr Fluoreszenzverhalten in der in Fig. 5 skizzierten Form, wenn sie Änderungen in der Konzentration freier CA-Ionen in der zu untersuchenden Zellprobe, ausge setzt ist. Durch fluorometrische Messungen bei zwei Anregungswellenlängen unter einem Mikroskopphoto meter läßt sich deshalb die Konzentration von freien Kalziumionen in Zellen bestimmen.

Gegenüber früher verwendeten Markierungen, die nur im absoluten Intensitätsmaß und nicht im spektralen Verhalten variieren, besitzt die neue Markierung die Vorteile einer Relativmessung. Es werden deshalb Geräteeigenschaften und Instabilitäten z. B. der Beleuchtung eliminiert (Quotientenverfahren).

In der Zeitschrift "Cell Calcium" 6 (1985) Seite 145- 157 ist von Tsien et al. ein Mikroskopphotometer beschrieben, das zur Anregung der Probe bei zwei verschiedenen Wellenlängen zwei Lichtquellen und zwei der Lichtquelle nachgeschalteten durchstimmbare Monochromatoren besitzt. Das Licht beider Monochromatoren wird über einen Zer hacker sequentiell in den Beleuchtungsstrahlengang des Mikro skops eingekoppelt. Diese bekannte Anordnung ist sehr aufwendig und teuer und läßt sich nicht ohne weitere nachträglich an bereits vorhandenen Mikroskope bzw. Mikroskopphotometer anbauen.

Es ist auch vorgeschlagen worden, anstelle der Monochromatoren und des Zerhackerrads ein rotierendes Paar von Interferenz filtern einzusetzen. Eine derartige Beleuchtungsanordnung ist z. B. in der US-PS 34 97 690 für einen anderen Zweck be schrieben. Beide Lösungen haben aber grundsätzlich den Nachteil, daß die zu den zwei unterschiedlichen Wellenlängen gehörenden Signale vom Detektor des Photometers nacheinander erfaßt werden. Diese Art des Nachweises, der aus der US-PS 41 00 416 auch für 2-Wellenlängen-Fluoreszenzanregung bekannt ist, stellt ein reines Umschaltverfahren dar, bei dem die Signalform weitgehend erhalten bleiben muß und das deshalb eine hohe Verstärkungsbandbreite erfordert. Eine hohe Verstärkungs brandbreite macht jedoch das Meßsystem empfindlich gegenüber Störungen von Umgebungslicht und Rauschen des Detektors und der Verstärker. Die Nachweisgrenzen dieses Verfahrens sind deshalb beschränkt.

Aus der DE-OS 24 49 244 ist eine Vorrichtung zur 2-Wellenlängen- Fluoreszenzanregung in einem Mikroskop entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bekannt, bei der das Licht in beiden Anregungsstrahlengängen gleichzeitig mit unterschiedlicher Frequenz moduliert und das vom Detektor gelieferte Signal nach beiden Modulationsfrequenzen aufgetrennt nachgewiesen wird. Die simultane Anregung der Probe erfolgt jedoch über zwei getrennte Beleuchtungsstrahlengänge im Auflicht und gleichzeitig im Durchlicht. Bei dieser Lösung werden zwei Anregungslichtquellen benötigt und ist die Abstimmung zweier Anregungsstrahlengänge erforderlich. Da man mit einer Anregungswellenlänge zwangsläufig auf Durchlichtanregung festgelegt ist, ergeben sich außerdem Probleme im Hinblick auf die ausreichende Unterdrückung des in Richtung auf den Detektor mit hoher Intensität vorwärts gesteuerten Anregungslichtes.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop photometer gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 derart weiterzubilden, daß eine besonders empfindliche Messung bei zwei verschiedenen Wellenlängen ermöglicht ist, wobei die dafür nötige Beleuchtungseinrichtung leicht und ohne großen Aufwand nachträglich an ein bereits vorhandenes Mikroskop adaptiert werden kann.

Diese Aufgabe wird durch eine Ausbildung gemäß den im Kennzeichen des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen gelöst.

Durch diese Maßnahme werden vom Detektor des Photometers die der Anregung bei unterschiedlicher Wellenlänge entsprechenden Signale gleichzeitig erfaßt und parallel ausgewertet. Aufgrund der schmalbandigen Signalverarbeitung in den beiden parallelen Zweigen der Nachweiselektronik ergibt sich ein hohes Signal/ Rauschverhältnis, so daß die Nachweisempfindlichkeit stark verbessert ist.

Die Beleuchtungseinrichtung läßt sich zudem als modulare Bau gruppe leicht anstelle des sonst üblichen Lampengehäuses am Mikroskopphotometer anbringen. Es ist vorteilhaft, ein Zer hackerrad mit mehreren Spuren unterschiedlicher Teilung oder separat ansteuerbare Lichtverschlüsse zur gleichzeitigen Modulation des Lichts beider Wellenlängen mit zwei ver schiedenen Frequenzen vorzusehen.

Die für die Trennung des Lichts in verschiedene Wellenlängen verwendeten Filter, wie z. B. Interferenzfilter, sind zweckmäßig auswechselbar im Beleuchtungsblock angeordnet, damit die Anregungswellenlänge an das spektrale Verhalten unterschiedlicher Markiersubstanzen angepaßt werden können.

Die Erfindung wird in der nachstehenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Fig. 1-7 der Zeichnung erläutert.

Fig. 1a ist eine schematische Schnittzeichnung eines ersten Ausführungsbeispiels für den Beleuch tungsblock des Photometers;

Fig. 1b ist eine vergrößerte Detailzeichnung des Zerhackerrades (19) aus Fig. 1;

Fig. 2 ist eine schematische Schnittzeichnung eines zweiten Ausführungsbeispiels für den Beleuchtungsblock des Photometers;

Fig. 3 ist eine schematische Schnittzeichnung eines dritten Ausführungsbeispiels für den Beleuchtungsblock des Photometers;

Fig. 4 ist eine Prinzipskizze, die den spektralen Verlauf der Extinktion einer Markiersubstanz unter dem Einfluß von chemisch-biologischen Reaktionen zeigt;

Fig. 5 stellt das Anregungsspektrum der fluorochromen Markiersubstanz FURA-2 für zwei verschiedene Ca²⁺-Konzentrationen dar;

Fig. 6 ist eine Prinzipskizze des gesamten Photometeraufbaus einschließlich des Nachweiskanals;

Fig. 7 ist ein Diagramm des zeitlichen Signalverlaufs am Ausgang des Detektors (2) aus Fig. 6.

Das in Fig. 6 in seinem Gesamtaufbau skizzierte Photometer besteht aus einem Mikroskop (1) herkömmlicher Bauart, das einen Photomultiplier als photoelektrischen Empfänger (2) für den Nachweis der von der Probe (3) ausgehenden z. B. Fluoreszenzstrahlung besitzt. Zur Anregung der Probe (3) mit Licht zweier verschiedener Wellenlängen dient ein Beleuchtungsblock (4), der eine Modulationseinheit (5) enthält. Der Beleuchtungsblock (4) wird noch im Zusammenhang mit den Fig. 1-3 näher beschrieben.

Die Modulationseinheit (5) wird von einem Steuergerät (6) angesteuert und moduliert die Intensität der beiden Teilbündel des Beleuchtungslichtes mit zwei unterschiedlichen Frequenzen f 1 und f 2. Beide Frequenzen werden außerdem über die mit ref 1 und ref 2 bezeichneten Leitungen als Referenzfrequenz zwei parallel geschalteten Schmalbandverstärkern PSD 1 und PSD 2 zugeführt, deren Eingänge mit dem Ausgang eines dem Photomultiplier nachgeschalteten Vorverstärkers (7) verbunden sind.

Die Schmalbandverstärker PSD 1 und PSD 2 enthalten pha senempfindliche Gleichrichter, die auf der jeweiligen Referenzfrequenz arbeiten (lock-in- Technik). Dabei entstehen aus dem vom Photomultiplier gelieferten Signal E, dessen zeitlichen Verlauf Fig. 7 zeigt, zwei Einzelsignale A 1 und A 2 an den Ausgängen der Schmalbandverstärker PSD 1 und PSD 2, die der Intensität der Fluoreszenzstrahlung der Probe (3) bei zwei verschiedenen Anregungswellenlängen entspre chen. Die Einzelsignale A 1 und A 2 werden von einem Multiple xer (8) abgefragt und nach Wandlung im Analog/Digital wandler (9) einen Computer (10) zur Berechnung z. B. der Konzentration der in der Probe (3) enthaltenen Ca²⁺-Ionen zugeführt. Eine Synchronisierung zwischen dem Steuergerät (6) der Modulationseinheit (5) und der Arbeitsfrequenz des Multiplexers (8) bzw. des Computers (10) ist bei dieser Anordnung nicht erforderlich.

In Fig. 1a ist der verwendete Beleuchtungsblock (4) detaillierter dargestellt. Er besteht aus einem geschlossenen Gehäuse (26), das anstelle der sonst dort befestigten Mikroskopleuchte mit Hilfe der üblichen Aufnahmeschwalbe (11) an dem Stativ (25) des Mikroskopphotometers befestigt ist. Im Innern des Gehäuses (26) befindet sich eine Hochleistungslicht quelle (12) wie z. B. eine Quecksilberhochdrucklampe mit zwei einander diametral gegenüberstehenden Lampen kollektoren (13 und 14). Die beiden von der Hochleistungslichtquelle (12) ausgehenden Lichtbündel werden von Umlenkspiegeln (15 und 16) je einem Filter (17 und 18) mit unterschiedlicher spektraler Transmission zugeführt. Bei den Filtern (17 und 18) handelt es sich z. B. um Interferenzfilter, deren Durchlaßbereich in der Nähe der beiden in Fig. 5 mit g 1 und λ 2 bezeichneten Wellenlängen bei etwa 340 nm und 380 nm liegen.

Die beiden durch die Filter (17 und 18) hindurchtretenden Teilstrahlen unterschiedlicher Wellenlängen werden von einem Zerhackerrad (19), das von einem Motor (20) angetrieben wird, periodisch aber mit unterschiedlicher Frequenz moduliert.

Fig. 1b zeigt einen vergrößerten Ausschnitt des Zerhackerrades. Darauf sind die beiden Spuren (23 und (24) mit unterschiedlicher Teilung deutlich zu erkennen. Nach Modulation durch das Zerhackerrad (19) werden beide Teilstrahlen über einen Strahlteiler (21) gemeinsam in den Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskopphotometers eingespiegelt.

Bei rechteckförmiger Modulation des Anregungslichtes entstehen Oberwellensignale, die den Nachweis der Signale auf den Frequenzen f 1 und f 2 durch die Schmalbandverstärker PSD 1 und PSD 2 stören können. Es ist möglich diese Störungen zu verringern, indem man das Verhältnis der Teilungen beider Spuren (23 und 24) des Zerhackerrades und damit das Verhältnis der Fre quenzen f 1 und f 2 ungeradzahlig wählt. Durch diese Maßnahme wird verhindert, daß Oberwellen z. B. der Frequenz f 1 den Nachweis auf der Frequenz f 2 beein flussen. Geht man außerdem dazu über, die Intensität des Anregungslichts zumindest annähernd sinusförmig zu modulieren, werden Oberwellen von vornherein unter drückt. Eine sinusförmige Modulation erreicht man durch geeignete Anpassung des Bündelquerschnitts des Beleuchtungsstrahlenganges in der Ebene des Zerhacker rades an die Abmessungen der Öffnungen des Zerhacker rades.

Dazu enthält der Beleuchtungsblock im Ausführungsbei spiel nach Fig. 2 zwei Kollektoren (33 und 34) unter schiedlicher Brennweite, die das Licht der Lampe (32) jeweils so in die Ebene des Zerhackerrades (29) fokus sieren, daß zwei kreisförmige Felder unterschiedlichen Durchmessers entsprechend der Größe der Öffnungen auf beiden Spuren des Zerhackerrades entstehen. Die beiden Linsen (35 und 36) in Lichtrichtung hinter dem Zer hackerrad (29) dienen dazu, die beiden unterschied lichen Teilstrahlengänge im Beleuchtungsblock wieder einander anzupassen. Die übrigen Bauteile entsprechen denen im Ausführungsbeispiel nach Fig. 1, so daß auf eine Wiederholung an dieser Stelle verzichtet werden kann.

In Fig. 3 ist ein alternatives Ausführungsbeispiel für den Beleuchtungsblock aus Fig. 1/2 dargestellt. Der Beleuchtungsblock (104) in Fig. 3 enthält in seinem Gehäuse (124) anstelle des von einem Motor angetriebe nen Zerhackerrades eine Modulationseinheit (105) ge bildet aus zwei einzeln ansteuerbaren, elektro-opti schen Lichtverschlüsse (119 und 120). Die Lichtver schlüsse modulieren die beiden durch die Filter (117 und 118) hindurchtretenden Teilstrahlen unabhängig voneinander. Um eine möglichst hohe Modulationsfre quenz erreichen zu können sind z. B. Kerrzellen für die Lichtverschlüsse verwendet.

Diese Lösung mit zwei Lichtverschlüssen bietet den Vorteil, daß die Öffnungszeiten bzw. die Modulationsfrequenzen frei wählbar und für beide Beleuchtungsstrahlengänge unabhängig voneinander einstellbar sind. Sie können dann im Hinblick auf das Signal/Rauschverhältnis im Nachweiskanal optimiert werden.

Claims

1. Mikroskopphotometer zur Messung der Fluoreszenz oder der Absorption einer Probe bei zwei verschiedenen Wellenlängen, mit

- einer Beleuchtungseinrichtung, die zwei Filter (17, 18; 117, 118) in zwei Teilstrahlengängen und eine Modulationseinheit (5; 105) zur Modulation des durch die zwei Filter hindurchtretenden Lichts gleichzeitig mit jeweils unterschiedlichen Frequenzen aufweist,
- einem photoelektrischen Empfänger (2) zur Intensitätsmessung des von der Probe ausgehenden Lichts,
- zwei, dem photoelektrischen Empfänger (2) nachgeordneten Schmalbandverstärkern (PSD 1; PSD 2), die auf die unterschiedlichen Frequenzen der Modulationseinheit abgestimmt sind,

dadurch gekennzeichnet, daß

- die Beleuchtungseinrichtung in einem am Mikroskop anbringbaren Beleuchtungsblock (4; 104) angeordnet ist und daß
- das Licht in den zwei Teilstrahlengängen nach Durchgang durch die beiden Filter und die Modulationseinheit an einem Strahteiler (21) vereinigt und gemeinsam in den Beleuchtungstrahlengang des Mikroskopphotometers eingespiegelt wird.

2. Mikroskopphotometer nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die Filter (17, 18; 117, 118) auswechselbar sind.

3. Mikroskopphotometer nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die Modulationseinheit (5) ein mehrere Spuren (23, 24) unterschiedlicher Teilung aufweisendes Zer hackerrad (19) ist.

4. Mikroskopphotometer nach Anspruch 3, dadurch ge kennzeichnet, daß der Beleuchtungsblock zwei Teilstrahlen gänge enthält, die das Licht in die Ebene des Zerhacker rades fokussieren.

5. Mikroskopphotometer nach Anspruch 4, dadurch ge kennzeichnet, daß der Bündeldurchmesser der beiden Teil strahlengänge in der Ebene des Zerhackerrades unter schiedlich ist.

6. Mikroskopphotometer nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die Modulationseinheit (105) aus zwei separat ansteuerbaren Lichtverschlüssen (119, 120) besteht.