DE102020131374B4 - Fluoreszenzdetektion - Google Patents

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Abstract

Verwendung einer Fluoreszenzmessanordnung, wobei die Anordnung umfasst:eine Messzelle, die zur Aufnahme der Probe ausgelegt ist,eine Anregungsstrahlungsanordnung, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung dazu konfiguriert ist, der Messzelle eine Anregungsstrahlung bereitzustellen, wobei die Anregungsstrahlung ein Anregungsspektrum der Intensität gegenüber der Wellenlänge (I(λ)) umfasst, wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst, undeinen Detektor, der dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil einer Emission der Probe zu detektieren und Erfassungsdaten zu generieren;zur Durchführung eines Verfahrens zum Messen der Fluoreszenz einer Probe in der Chromatographie, wobei das Verfahren umfasst:Bereitstellen von Anregungsstrahlung, umfassend ein Anregungsspektrum von Intensität gegenüber der Wellenlänge (I(λ)), wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst;Anregen der Probe mit der Anregungsstrahlung;Detektieren mindestens eines Anteils einer Emission der Probe;Verwenden mindestens eines Spektralfilters (F(λ)), das eine wellenlängenabhängige Transmission bereitstellt, wobei die wellenlängenabhängige Transmission eine Mehrzahl von lokalen Transmissionsminima und lokalen Transmissionsmaxima umfasst; undFiltern mindestens eines Anteils der Emission der Probe unter Verwendung eines des mindestens einen Spektralfilters (F(λ)) als Spektralemissionsfilter, wobei die Transmission des Spektralemissionsfilters für Wellenlängen lokaler Minima des Anregungsspektrums höher ist als für Wellenlängen lokaler Maxima des Anregungsspektrums.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die optische Detektion, insbesondere die Fluoreszenzdetektion. In einigen Aspekten betrifft die vorliegende Erfindung die Detektion in der Flüssigchromatografie (LC) und insbesondere der Hochleistungs-Flüssigchromatografie (HPLC).
  • Ganz allgemein betrifft das Gebiet der Fluoreszenzdetektion die Detektion der Fluoreszenz einer Probe, z. B., um eine Substanz zu identifizieren und/oder zu quantifizieren oder andere Eigenschaften zu bestimmen. Typischerweise wird die Probe mit einer Anregungsstrahlung angeregt, die beispielsweise Licht mit einer einzigen Wellenlänge sein kann. Die Probe kann mindestens einen Anteil der Anregungsstrahlung absorbieren und anschließend Strahlung mit einer Wellenlänge emittieren, die typischerweise länger ist als die Anregungsstrahlung - die Fluoreszenz. Somit kann die Fluoreszenz im Allgemeinen bei einer höheren Wellenlänge als die Anregungsstrahlung detektiert werden. Sowohl das Absorptionsspektrum der Probe, d. h. die Wellenlänge, bei der die Probe Anregungsstrahlung absorbiert, als auch das Spektrum, bei dem die Probe fluoresziert, sind typischerweise für das absorbierende Material charakteristisch und können somit die Identifizierung unbekannter Substanzen ermöglichen, z. B. durch Messen eines Absorptionsspektrums und/oder der Fluoreszenz.
  • In einigen Anwendungen, z. B. LC- oder HPLC-Detektion, ist die Kenntnis der Spektren unter Umständen nicht erforderlich, da die charakteristische Retentionszeit zur Identifizierung der Substanz dienen kann und die Fluoreszenz ein Maß für das Vorhandensein der Substanz zu einem bestimmten Zeitpunkt sein kann. Häufig kann jedoch die Kenntnis der Absorptions- und Emissionsspektren immer noch vorteilhaft sein, um die Wellenlängen zu bestimmen, bei denen die Probe absorbieren und emittieren kann, d. h. fluoreszieren kann, da es von Vorteil sein kann, die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge auf die jeweilige Probe einzustellen. Zusätzlich kann die Fluoreszenz vorteilhafterweise die Quantifizierung der Substanzmenge ermöglichen, d. h. über die gesamte Fluoreszenz kann nicht nur die Detektion, sondern auch die Quantifizierung einer Substanz in einer Probe ermöglicht werden. Darüber hinaus kann die Fluoreszenz im Gegensatz zu einer Absorptionsmessung eine hintergrundfreie Messung ermöglichen, da das Signal nur vorhanden ist, wenn eine Substanz vorhanden ist. Somit kann eine Fluoreszenzmessung vorteilhafterweise Messungen von wesentlich geringeren Substanzmengen im Vergleich zu beispielsweise einer Absorptionsmessung ermöglichen.
  • Mit anderen Worten kann man auf dem Gebiet der Fluoreszenzdetektion sowohl die Anregungswellenlänge als auch die Emissionswellenlänge bestimmen und sie auf die zu untersuchende Probe abstimmen. Zur Generierung von Licht können entweder direkt geeignete monochromatische Lichtquellen verwendet werden (z. B. Laser, LED, Spektrallampe usw.) oder die Anregungsstrahlung kann von einer Weißlichtquelle unter Verwendung von Filtern, z. B. Farbgläsern oder Interferenzfiltern oder anderen dispersiven Elementen (Gittern, Prismen, AOMs), die beispielsweise zu einem Monochromator zusammengebaut sein können, d. h. einer Vorrichtung, die selektiv nur ein schmales Wellenlängenband durchlässt, abgeleitet (d. h. „erhalten“) werden. Eine Weißlichtquelle stellt typischerweise ein Breitbandspektrum bereit, das beispielsweise im Wesentlichen alle Wellenlängen des sichtbaren Spektrums und in einigen Fällen sogar Anteile des UV-Spektrums umfassen kann. Mit anderen Worten kann eine Weißlichtquelle in einigen Fällen beispielsweise ein Breitbandspektrum bereitstellen, das auch im tiefen UV-Bereich beginnt, z. B. bei einer Wellenlänge kleiner als oder gleich 220 nm, vorzugsweise 200 nm oder sogar darunter. Eine solche Weißlichtquelle kann beispielsweise eine Kurzbogenlampe, eine Blitzröhre, eine Plasma-Lichtquelle oder eine Kombination mehrerer Lichtquellen sein. Hier dient der Begriff im Wesentlichen dazu, Weißlichtquellen einzuschließen, die die Ränder des sichtbaren Spektrums möglicherweise nicht vollständig abdecken, z. B. Wellenlängen unter 420 nm und/oder über 700 nm. Eine Weißlichtquelle kann beispielsweise eines von einer Xe-Lampe, Mischgaslampen, thermischen Lichtquellen einschließlich Wolfram- und/oder Plasma-Lichtquellen sein.
  • Die Anregungsstrahlung kann geleitet werden zu einer (z. B. strahlen auf eine) Messzelle, durch die im Fall von HPLC das Eluat der Trennsäule fließen kann. Die resultierende Fluoreszenz, die eine längere Wellenlänge als die Anregungsstrahlung aufweisen kann, kann gesammelt werden, und somit kann eine Detektion und Quantifizierung der im Eluat enthaltenen Substanzen möglich sein. Typischerweise werden Maßnahmen getroffen, um die Fraktion der gestreuten Anregungsstrahlung an der Emission zu minimieren. Mit anderen Worten stellt das Design im Allgemeinen sicher, dass die Menge an Streulicht, die die Emissionsseite direkt von der Anregung erreicht, minimiert wird (z. B. durch eine 90°-Anordnung und geeignete Streulichtfallen und/oder -Blenden).
  • Ferner kann die Emission typischerweise unter Verwendung von Filtern oder eines Monochromators auch gefiltert werden, um eine einzige Wellenlänge auszuwählen, und die gefilterte Emission kann dann unter Verwendung von (Avalanche-)Fotodioden oder Fotovervielfachern detektiert werden, wobei hochentwickelte Detektoren die Möglichkeit bieten können, die spektrale Bandbreite einzustellen. Alternativ kann ein Dioden-Array-Spektrometer auch Spektren bei geringeren Empfindlichkeitsanforderungen direkt detektieren. Darüber hinaus können weitere geeignete optische Detektoren verwendet werden, z. B. verstärkte Kameras, zweidimensionale Dioden-Arrays, gekühlte Detektoren wie ein flüssigstickstoffgekühltes CCD oder sogar supraleitende Nanodraht-Einzelphotonendetektoren. Oft kann es auf der Emissionsseite ein zusätzliches Filter geben, um höhere Ordnungen der Monochromatoren zu unterdrücken oder eine Optimierung des Streulichts im Allgemeinen zu ermöglichen.
  • Die Wellenlängen für Anregungsstrahlung und detektierte Emission können von den genauen Komponenten des verwendeten Systems abhängig sein, z. B. können aufgrund unterschiedlicher Empfindlichkeitseigenschaften und/oder unterschiedlicher spektraler Lampeneigenschaften die Wellenlängen von standardisierten Absorptions- und/oder Emissionsmaxima abweichen. Daher können die gewählten Wellenlängen auf das einzelne verwendete System eingestellt werden.
  • Daher können solche Fluoreszenzmessungen typischerweise unter Problemen hinsichtlich der optimalen Bestimmung der Wellenlängen für Anregungsstrahlung und detektierte Emission, der Wahl des richtigen Kantenfilters und möglicherweise der Anpassung der spektralen Bandbreiten an die Probe leiden. Um die optimalen Parameter zu bestimmen, können häufig eine oder beide Wellenlängen (d. h. Anregung und Emission) „abgetastet“ werden. Das heißt, bei fester Anregung kann die Emissionswellenlänge periodisch und kontinuierlich im Lauf der Zeit und schnell auf der Zeitskala des Probenaustauschs in der Durchflusszelle abgestimmt werden. Auf diese Weise kann das Fluoreszenzspektrum gegen die Zeit abgelesen werden und dann kann die optimale Emissionswellenlänge abgelesen werden. Anschließend kann der gesamte Prozess wiederholt werden, wobei die (optimale) Emission aufgezeichnet werden kann und wiederum die Anregung abgetastet werden kann, um den optimalen Wert für jede Probenkomponente zu bestimmen. Dies kann im Allgemeinen ein zeitaufwändiger Prozess sein und problematisch sein in Kombination mit einem laufenden Chromatogramm, bei dem sich die Probe nur kurz in der Messzelle befindet, da die möglichen Abtastgeschwindigkeiten begrenzt sind.
  • Im Falle einer nicht optimalen Wahl der Anregungsstrahlung, z. B. einer nicht optimalen Wellenlänge und/oder Bandbreite, kann die Effizienz der Anregung suboptimal sein, was wiederum zu einer geringeren Fluoreszenz führt. In ähnlicher Weise kann eine nicht optimale Wahl für die Emissionswellenlänge, d. h. die Wellenlänge der detektierten Emission, und möglicherweise die Bandbreite (wenn der Detektor die Manipulation der Bandbreite zulässt) die gemessene Fluoreszenzmenge verringern und damit beispielsweise das Signal-RauschVerhältnis und/oder die Detektionsgrenze beeinträchtigen. Somit kann die Empfindlichkeit für suboptimale Parameter stark verringert sein, z. B. um eine Größenordnung.
  • Ferner kann ein solcher Detektor für einige Substanzen im Prinzip vollständig „blind“ sein, beispielsweise wenn eine falsche Anregungs- und/oder Emissionswellenlänge gewählt wird, z. B. kann Naphthalin „übersehen“ werden, wenn die Anregungswellenlänge zu hoch gewählt wird. Daher werden Schadstoffe in der Probe möglicherweise nicht detektiert. Mit anderen Worten können sie „durchrutschen“.
  • Während solche Mängel im Prinzip zumindest teilweise überwunden werden könnten, indem mehrere Detektoren in Reihe verwendet werden, die unterschiedliche Messprinzipien verwenden (z. B. Massenspektrometer, Absorptionsmessungen, Brechungsindexmessungen, Leitfähigkeitsmessungen und/oder Erkennung von aufgeladenen Aerosolen), kann eine solche Anordnung im Allgemeinen sehr aufwändig und komplex sein und mehrere hochspezialisierte Werkzeuge erfordern.
  • Wiederum kann es auch möglich sein, Anregungs- und/oder Emissionswellenlängen abzutasten, jedoch kann das Abtasten die Geschwindigkeit, mit der Chromatogramme durchgeführt (z. B. „angetrieben“) werden können, erheblich verringern und zusätzlich die Detektionsgrenze reduzieren, da die Sonde nur für kurze Zeit mit der richtigen Einstellung gemessen wird.
  • Aus der DE 10 2014 016 850 A1 ist ein optisches System für eine Fluoreszenzbeobachtung bekannt, welches eine Optik mit einem Okular, eine Kamera, eine Anzeigevorrichtung, eine Lichtquelle, einen Beleuchtungsfilter, einen Beobachtungsfilter und eine Steuerung umfasst. Das Beobachtungsfilter weist mehrere Durchlass-Bereiche auf, welche dazu vorgesehen sind, durch eine Fluoreszenz erzeugtes Licht für eine Beobachtung oder eine Detektion der Fluoreszenz hindurchtreten zu lassen. Die Durchlass-Bereiche sind durch dazwischenliegende Sperr-Bereiche getrennt. Bei den Wellenlängenbereichen, bei denen das Beobachtungsfilter einen Durchlass-Bereich aufweist, weist das Beleuchtungsfilter einen Sperr-Bereich auf. Bei den Wellenlängenbereichen, bei denen das Beobachtungsfilter einen Sperr-Bereich aufweist, weist das Beleuchtungsfilter einen Durchlass-Bereich auf.
  • Die DE 11 2015 005 747 A1 offenbart eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung, umfassend eine Bestrahlungseinheit zum Einstrahlen von Anregungslicht mit mehreren Anregungswellenlängenbändern auf eine Probe, eine erste faseroptische Platte zum Leiten von Licht einschließlich der von der Probe durch die Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierten Fluoreszenz und zum Emittieren von diesem von einem ersten Emissionsteil, eine zweite faseroptische Platte zum Empfangen vom ersten Emissionsteil emittierten Lichts an einem zweiten Einfallsteil, zum Leiten von diesem und zum Emittieren von diesem von einem zweiten Emissionsteil, einen einzelnes Dielektrischer-Mehrschichtfilm-Interferenzfilter, das an einer Endfläche des zweiten Emissionsteils bereitgestellt ist, zumindest einen Teil der Fluoreszenz durchlässt und Licht aus mehreren Transmissionswellenlängenbändern, welche die Anregungswellenlängenbänder nicht einschließen, durchlässt, und eine zweidimensionale Detektionseinheit, die am Dielektrischer-Mehrschichtfilm-Interferenzfilter haftet und Licht detektiert, das durch das Dielektrischer-Mehrschichtfilm-Interferenzfilter hindurchgetreten ist.
  • Die DE 11 2015 005 826 T5 offenbart ebenfalls eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine optische Bestrahlungseinheit zum Bestrahlen einer Probe mit von einer Lichtquelle emittierten Licht als Anregungslicht, eine Fluoreszenzkondensationseinheit mit einem Fluoreszenzfilter, das von der Probe emittiertes Licht durchlässt und Licht von Transmissionswellenlängenbändern, die von den Anregungswellenlängenbändern verschieden sind, durchlässt, und einen zweidimensionalen Detektor, der mehrere Typen von Transmissionsfiltern zum Durchlassen vorgeschriebener Lichtwellenlängen aufweist und die Intensität des Lichts der vorgeschriebenen Wellenlänge für jedes Transmissionsfilter detektiert, aufweist.
  • Vor diesem Hintergrund besteht eines der Ziele darin, die Mängel und Nachteile des Standes der Technik zu überwinden oder zumindest zu mildern. Das heißt, es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Fluoreszenzmessanordnung zum Messen der Fluoreszenz einer Probe bereitzustellen, die weniger von der Wahl der Parameter für die Anregungsstrahlung und die Probenemission abhängig ist.
  • Diese Ziele werden durch die vorliegende Erfindung erreicht.
  • Die Erfindung ist durch die Ansprüche definiert.
  • In diesem Dokument wird ein Verfahren zum Messen der Fluoreszenz einer Probe beschrieben. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer Anregungsstrahlung, die ein Anregungsspektrum von Intensität gegenüber Wellenlänge (I(λ)) umfasst, wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und Minima umfasst. Das Verfahren umfasst ferner das Anregen der Probe mit der Anregungsstrahlung und das Detektieren mindestens eines Anteils einer Emission der Probe.
  • Hier bezieht sich die Intensität auf die relative Intensität des einfallenden Lichts für verschiedene Wellenlängen und wird daher typischerweise in willkürlichen Einheiten (arbitrary units, a.u.) angegeben. Das heißt, die gemessene Intensität eines Anregungsspektrums und/oder eines Emissionsspektrums, z. B. eines Fluoreszenzspektrums, kann eine relative Messung sein, die beispielsweise von dem verwendeten Detektor abhängig sein kann. Zum Beispiel kann die Intensität durch die Anzahl von Photonen pro Sekunde dargestellt werden, die am Detektor ankommen. Im Allgemeinen hängt die Intensität mit der Strahlungsenergie pro Zeiteinheit, dem Raumwinkel und der Wellenlänge zusammen. Somit kann es durch Kalibrierung möglich sein, eine gemessene Intensität in SI-Einheiten umzuwandeln. Typischerweise kann die relative Intensität jedoch ausreichende Informationen bereitstellen. Zum Identifizieren von Substanzen basierend auf einer Fluoreszenzmessung ist beispielsweise nur die relative Intensität der Fluoreszenz erforderlich, um beispielsweise charakteristische Peaks zu identifizieren.
  • Es versteht sich, dass das Anregungsspektrum alternativ als Intensität gegenüber Frequenz spezifiziert werden kann, da Wellenlänge und Frequenz in enger Beziehung zueinander stehen.
  • Das Spektrum (I(λ)) kann im Wesentlichen zeitunabhängig sein. Das heißt, im Wesentlichen zeitunabhängig auf der Skala einer Messung. Mit anderen Worten kann eine vorhandene Zeitabhängigkeit bewusst oder hauptsächlich durch die Messung beseitigt werden, z. B. Messen bei 100 Hz unter Verwendung einer gepulsten Lichtquelle, die bei 1 MHz arbeitet. Hier kann im Wesentlichen zeitunabhängig auch als im Wesentlichen zeitlich konstant bezeichnet werden. Der Begriff „im Wesentlichen“ soll technische Einschränkungen einschließen, wie beispielsweise Temperaturabweichungen, die zu geringfügigen Änderungen des Anregungsspektrums (I(λ)) führen können, je nachdem, wie es abgeleitet wird. Im Wesentlichen zeitunabhängig schließt jedoch keine beabsichtigte Zeitabhängigkeit des Anregungsspektrums ein.
  • Lokale Maxima des Anregungsspektrums können um mindestens einen Faktor 10, vorzugsweise mindestens einen Faktor 100, wie beispielsweise mindestens einen Faktor 1000, höher sein als die benachbarten lokalen Minima. Mit anderen Worten sind lokale Maxima größer als das 10-Fache benachbarter lokaler Minima, vorzugsweise größer als das 100-Fache benachbarter lokaler Minima, beispielsweise größer oder gleich dem 1000-Fachen benachbarter Minima.
  • Ferner kann jedes lokale Maximum um mindestens einen Faktor 5, vorzugsweise mindestens einen Faktor 10, wie beispielsweise einen Faktor 50, höher als jedes lokale Minimum sein. Das heißt, das niedrigste lokale Maximum des Anregungsspektrums kann um mindestens einen Faktor 5, vorzugsweise mindestens einen Faktor 10, wie beispielsweise einen Faktor 50, größer sein als das höchste lokale Minimum des Anregungsspektrums.
  • Das Anregungsspektrum kann mindestens 3, vorzugsweise mindestens 5, bevorzugter mindestens 10 lokale Maxima umfassen. Es versteht sich, dass ein Anregungsspektrum, das N lokale Maxima umfasst, typischerweise mindestens N-1 lokale Minima umfasst. Mit anderen Worten gibt es ein lokales Minimum zwischen zwei lokalen Maxima.
  • In einigen Ausführungsformen kann eine Wellenlängendifferenz zwischen zwei benachbarten lokalen Maxima im Anregungsspektrum kleiner als 50 nm, vorzugsweise kleiner als 30 nm, bevorzugter kleiner als 20 nm, wie beispielsweise 10 nm, sein.
  • Zusätzlich oder alternativ kann eine Wellenlängendifferenz zwischen zwei benachbarten lokalen Minima im Anregungsspektrum kleiner als 50 nm, vorzugsweise kleiner als 30 nm, bevorzugter kleiner als 20 nm, wie beispielsweise 10 nm, sein.
  • Die lokalen Maxima des Anregungsspektrums können gleichmäßig beabstandet sein. Das heißt, die lokalen Maxima zwischen dem lokalen Maximum bei der niedrigsten Wellenlänge und dem lokalen Maximum bei der höchsten Wellenlänge können gleichmäßig verteilt sein, so dass der Abstand zwischen zwei benachbarten lokalen Maxima im Wesentlichen gleich sein kann.
  • Zusätzlich oder alternativ können die lokalen Minima des Anregungsspektrums gleichmäßig beabstandet sein. Das heißt, die lokalen Maxima zwischen dem lokalen Minimum bei der niedrigsten Wellenlänge und dem lokalen Minimum bei der höchsten Wellenlänge können gleichmäßig verteilt sein, so dass der Abstand zwischen zwei benachbarten lokalen Minima im Wesentlichen gleich sein kann.
  • In einigen Ausführungsformen können die lokalen Maxima des Anregungsspektrums jedoch ungleichmäßig beabstandet sein. Das heißt, zumindest ein Teil der lokalen Maxima kann unregelmäßig beabstandet sein. Mit anderen Worten kann der Abstand zwischen zwei benachbarten Maxima in Abhängigkeit von den betrachteten lokalen Maxima variieren.
  • In ähnlicher Weise sind in einigen Ausführungsformen die lokalen Minima des Anregungsspektrums ungleichmäßig beabstandet. Das heißt, zumindest ein Teil der lokalen Minima kann unregelmäßig beabstandet sein. Mit anderen Worten kann der Abstand zwischen zwei benachbarten Minima in Abhängigkeit von den betrachteten lokalen Minima variieren.
  • Ein Verhältnis zwischen der Intensität, die einem von den lokalen Maxima des Anregungsspektrums und der Intensität des höchsten Maximums des Anregungsspektrums entspricht, kann unter Umständen höchstens 1:10, vorzugsweise höchstens 1:5, bevorzugter höchstens 1:2 über das Anregungsspektrum betragen. Mit anderen Worten kann ein Intensitätsverhältnis zwischen einem von den lokalen Maxima und dem höchsten lokalen Maximum des Anregungsspektrums höchstens 1:10, vorzugsweise höchstens 1:5, bevorzugter höchstens 1:2 betragen.
  • In einigen Ausführungsformen können alle lokalen Maxima des Anregungsspektrums im Wesentlichen die gleiche Intensität umfassen. Das heißt, alle lokalen Maxima können im Wesentlichen die gleiche Höhe umfassen, wobei der Begriff „im Wesentlichen“ technische Abweichungen einschließen soll, z. B. aufgrund von Einschränkungen bei der Bereitstellung und/oder Messung des Anregungsspektrums, das typischerweise unter 5 %, wie z. B. unter 1 %, liegen kann.
  • Die Intensität, die den lokalen Minima des Anregungsspektrums entspricht, kann sich um höchstens 25 % des höchsten Minimums, vorzugsweise höchstens 15 %, bevorzugter höchstens 10 % über das Anregungsspektrum unterscheiden. Ferner können in einigen Ausführungsformen alle lokalen Minima des Anregungsspektrums im Wesentlichen die gleiche Intensität umfassen. Wiederum können alle lokalen Minima im Wesentlichen die gleiche Höhe umfassen, wobei der Begriff „im Wesentlichen“ dazu dient, technische Abweichungen einzuschließen, z. B. aufgrund von Einschränkungen bei der Bereitstellung und/oder Messung des Anregungsspektrums, die typischerweise unter 5 % liegen können, wie z. B. unter 1 %.
  • Das Anregungsspektrum kann eine Mehrzahl von Peaks umfassen, wobei das Maximum eines Peaks einem lokalen Maximum entspricht. Ferner kann jeder Peak der Mehrzahl von Peaks eine Spektralbreite umfassen, wobei die Spektralbreite jedes Peaks kleiner als 30 nm, vorzugsweise kleiner als 20 nm, bevorzugter kleiner als 10 nm sein kann. Es versteht sich, dass die Spektralbreite eines lokalen Maximums die volle Breite bei halbem Maximum (full width at half maximum, FWHM) des entsprechenden Peaks ist.
  • Das Verfahren kann ferner das Verwenden mindestens eines Spektralfilters (F(A)) umfassen, das eine wellenlängenabhängige Transmission bereitstellt. Ferner kann die wellenlängenabhängige Transmission des Filters um einen Faktor von mindestens 10, vorzugsweise einen Faktor von mindestens 100, bevorzugter einen Faktor von mindestens 500 variieren. Das heißt, die höchste und niedrigste Transmission können sich um diesen Faktor unterscheiden.
  • Die wellenlängenabhängige Transmission kann eine Mehrzahl von lokalen Transmissionsminima und lokalen Transmissionsmaxima umfassen. Ferner können die lokalen Transmissionsmaxima jeweils einem Peak in der wellenlängenabhängigen Transmission entsprechen.
  • Jeder Peak in der wellenlängenabhängigen Transmission kann eine Spektralbreite umfassen und die Spektralbreite kann kleiner als 30 nm, vorzugsweise kleiner als 20 nm, bevorzugter kleiner als 10 nm sein.
  • Benachbarte lokale Transmissionsmaxima der wellenlängenabhängigen Transmission können um weniger als 50 nm, vorzugsweise weniger als 30 nm, bevorzugter weniger als 20 nm beabstandet sein, wie 10 nm. Zusätzlich oder alternativ können benachbarte lokale Transmissionsminima der wellenlängenabhängigen Transmission um weniger als 50 nm, vorzugsweise weniger als 30 nm, bevorzugter weniger als 20 nm beabstandet sein, wie 10 nm.
  • Die lokalen Transmissionsmaxima der wellenlängenabhängigen Transmission können gleichmäßig beabstandet sein. In ähnlicher Weise können die lokalen Transmissionsminima der wellenlängenabhängigen Transmission gleichmäßig beabstandet sein. In einigen Ausführungsformen können die lokalen Transmissionsmaxima der wellenlängenabhängigen Transmission jedoch ungleichmäßig beabstandet sein. In ähnlicher Weise sind in einigen Ausführungsformen die lokalen Transmissionsminima der wellenlängenabhängigen Transmission ungleichmäßig beabstandet.
  • Ein Verhältnis zwischen der Transmission, die einem der lokalen Transmissionsmaxima der wellenlängenabhängigen Transmission entspricht, und der Transmission, die dem höchsten Maximum des Anregungsspektrums entspricht, kann höchstens 1:10, vorzugsweise höchstens 1:5, bevorzugter höchstens 1:2 über die wellenlängenabhängige Transmission betragen. Mit anderen Worten kann ein Transmissionsverhältnis zwischen einem der lokalen Transmissionsmaxima und dem höchsten lokalen Maximum der wellenlängenabhängigen Transmission höchstens 1:10, vorzugsweise höchstens 1:5, bevorzugter höchstens 1:2 betragen.
  • In einigen Ausführungsformen können alle lokalen Transmissionsmaxima der wellenlängenabhängigen Transmission im Wesentlichen dieselbe Transmission umfassen.
  • Die Transmission, die den lokalen Transmissionsminima der wellenlängenabhängigen Transmission entspricht, kann sich über höchstens 20 % des höchsten Minimums, vorzugsweise höchstens 10 %, bevorzugter höchstens 5 % über das Anregungsspektrum unterscheiden. In einigen Ausführungsformen können alle lokalen Transmissionsminima der wellenlängenabhängigen Transmission im Wesentlichen dieselbe Transmission umfassen.
  • Das Verfahren kann ferner das Filtern mindestens eines Anteils der Emission der Probe unter Verwendung eines des mindestens einen Spektralfilters (F(A)) als Spektralemissionsfilter umfassen, wobei die Transmission des Spektralemissionsfilters bei Wellenlängen der lokalen Minima des Anregungsspektrums höher sein kann als bei Wellenlängen der lokalen Maxima des Anregungsspektrums. Das heißt, das Spektralemissionsfilter kann ein Spektrum herstellen, das lokale Minima für Wellenlängen umfasst, bei denen das Anregungsspektrum lokale Maxima umfasst und umgekehrt. Mit anderen Worten kann das Spektrum, das durch Durchleiten einer Breitbandlichtquelle durch das Spektralemissionsfilter generiert wird, komplementär zum Anregungsspektrum sein.
  • Die wellenlängenabhängige Transmission des Spektralemissionsfilters für Wellenlängen lokaler Minima des Anregungsspektrums kann um mindestens einen Faktor 10, vorzugsweise mindestens einen Faktor 100, wie beispielsweise einen Faktor 500, höher sein als für Wellenlängen lokaler Maxima des Anregungsspektrums.
  • Die lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission des Spektralemissionsfilters können eine Transmissionsspektralbreite umfassen, wobei die Transmissionsspektralbreite der lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission des Spektralemissionsfilters mindestens gleich der Spektralbreite der lokalen Maxima des Anregungsspektrums sein kann.
  • Die Transmissionsspektralbreite der lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission des Spektralemissionsfilters kann um einen Faktor von mindestens 1,5, vorzugsweise um einen Faktor von mindestens 2 größer sein als die Spektralbreite der lokalen Maxima des Anregungsspektrums. Es versteht sich, dass dieser Faktor von der Form der jeweiligen Maxima und Minima abhängig sein kann. Wenn sich beispielsweise die Maxima und Minima einer rechteckigen Form annähern, kann ein Faktor von 1,5 ausreichend sein, während für eine Gaußsche Kurve ein höherer Faktor, z. B. ein Faktor 3, gewählt werden kann, um eine Überlappung der Enden zu vermeiden, die außerhalb des durch die FWHM definierten Bereichs liegen. Insgesamt kann die Überlappung der Maxima und Minima minimiert werden.
  • Das Filter kann ein passives Filter sein oder alternativ kann das Filter ein aktives Filter sein.
  • Der Schritt des Filterns mindestens eines Anteils der Emission der Probe kann durchgeführt werden, bevor mindestens ein Anteil der Emission der Probe detektiert wird.
  • Ferner kann der Schritt des Detektierens mindestens eines Anteils der Emission der Probe das Generieren von Erfassungsdaten umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen kann der Schritt des Filterns mindestens eines Anteils der Emission der Probe durchgeführt werden, nachdem mindestens ein Anteil der Emission der Probe detektiert wurde. Beispielsweise kann die Emission unter Verwendung eines Spektrometers detektiert werden, das einen ausreichend hohen Dynamikbereich umfasst, um Fluoreszenz und Streulicht von der Anregung zu detektieren. Das Emissionsfilter darf dann erst angewendet werden, nachdem das Signal detektiert ist, z. B. mittels eines Digitalfilters. Ferner kann das Spektralemissionsfilter ein Softwarefilter sein, das dazu konfiguriert ist, auf die Erfassungsdaten angewendet zu werden. Das heißt, die Filterung kann angewendet werden, indem die gemessenen Daten mit Software analysiert werden. Die Verwendung eines Softwarefilters kann vorteilhafterweise eine sehr hohe Flexibilität beim Einstellen der jeweiligen Filtereigenschaften ermöglichen und im Vergleich zu einem Filter mit begrenzter Transmission Verluste vor der Detektion verringern.
  • Der Schritt des Bereitstellens von Anregungsstrahlung kann das Verwenden mindestens einer Lichtquelle umfassen. Ferner kann die mindestens eine Lichtquelle ein Spektrum bereitstellen, das eine Mehrzahl von Maxima und eine Mehrzahl von Minima umfasst. Ferner kann die mindestens eine Lichtquelle eine Gasentladungslichtquelle, eine Plasma-Lichtquelle oder eine gepulste Lichtquelle sein.
    In einigen Ausführungsformen kann die mindestens eine Lichtquelle ein Breitbandspektrum bereitstellen. In solchen Ausführungsformen kann die mindestens eine Lichtquelle eines von einer Xenonbogenlichtquelle, einer thermischen Lichtquelle, einer Plasma-Lichtquelle oder einer LED sein.
  • Der Schritt des Bereitstellens von Anregungsstrahlung kann ferner das Verwenden einer Mehrzahl von Lichtquellen umfassen, wobei die Emission der Mehrzahl von Lichtquellen kombiniert werden kann, um eine einzige Emission bereitzustellen. Der Schritt des Kombinierens der Emission der Mehrzahl von Lichtquellen kann das Verwenden von mindestens einem dichroitischen Strahlteiler, einem optischen Gitter, einem Prisma, einem Spiegel und/oder einer Linsenanordnung umfassen.
  • Der Schritt des Bereitstellens von Anregungsstrahlung kann ferner das Verwenden eines des mindestens einen Spektralfilters (F(A)) als Anregungsfilter umfassen, wobei die Transmission des Anregungsfilters dazu konfiguriert sein kann, elektromagnetische Strahlung der mindestens einen Lichtquelle zu modifizieren, um das Anregungsspektrum bereitzustellen. Das heißt, die Emission einer Lichtquelle, die beispielsweise ein Weißlichtspektrum umfasst, kann durch ein Spektralfilter, d. h. das Anregungsfilter, geleitet werden, um das Anregungsspektrum bereitzustellen, das eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst. Mit anderen Worten kann die Anregungsstrahlung bereitgestellt werden, indem Licht einer Lichtquelle durch das Anregungsfilter geleitet wird.
  • Das Verfahren kann das Detektieren mindestens eines Anteils der Emission der Probe aus einer anderen Richtung als der Richtung umfassen, in der die Anregungsstrahlung bereitgestellt wird. In einigen Ausführungsformen kann die Richtung, in der die Anregungsstrahlung bereitgestellt wird, zumindest orthogonal zu der Richtung sein, in der mindestens ein Anteil der Emission detektiert wird.
  • Das Verfahren kann ferner das Sammeln mindestens eines Anteils der Emission der Probe umfassen, wobei der Schritt des Sammelns mindestens eines Anteils der Emission der Probe vor dem Schritt des Detektierens mindestens eines Anteils der Emission der Probe durchgeführt werden kann. Das heißt, mindestens ein Anteil der Emission kann unter Verwendung optischer Elemente, z. B. Linsen, und/oder optischer Fasern, gesammelt werden, um dann den Anteil der Emission zu filtern und/oder zu detektieren. Insbesondere kann das Sammeln mindestens eines Anteils der Emission durchgeführt werden, bevor mindestens ein Anteil der Emission gefiltert wird. Alternativ kann jedoch das Sammeln mindestens eines Anteils der Emission durchgeführt werden, nachdem mindestens ein Anteil der Emission gefiltert wurde.
  • Das Verfahren kann ferner das Sammeln mindestens eines Anteils der Emission der Probe aus einer anderen Richtung als der Richtung umfassen, in der die Anregungsstrahlung bereitgestellt wird. Ferner kann die Richtung, in der die Anregungsstrahlung bereitgestellt wird, orthogonal zu der Richtung sein, in der mindestens ein Anteil der Emission gesammelt wird.
  • Der Schritt des Detektierens mindestens eines Anteils der Emission der Probe kann die Verwendung eines Detektors umfassen, der zum Detektieren elektromagnetischer Strahlung konfiguriert ist.
  • Der Schritt des Erregens der Probe mit Anregungsstrahlung kann das Führen der Probe durch eine Messzelle umfassen, wobei die Probe der Anregungsstrahlung innerhalb der Messzelle ausgesetzt werden kann.
  • Das Anregungsspektrum kann eine kammartige Struktur umfassen. Das heißt, es kann gleichmäßig beabstandete Peaks über einen bestimmten Spektralbereich umfassen, ähnlich einem Frequenzkamm, der mit ultrakurzen Laserpulsen generiert wird. Mit anderen Worten kann es einem Frequenzkamm ähnlich sein. In ähnlicher Weise kann die wellenlängenabhängige Transmission des Filters eine kammartige Struktur umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen kann mindestens ein Anteil der vom Spektralfilter (P(λ)) zurückgewiesenen elektromagnetischen Strahlung als Referenzsignal verwendet werden. Ferner kann das Referenzsignal verwendet werden, um Intensitätsschwankungen der Anregungsstrahlung zu kompensieren. Das heißt, das Referenzsignal kann beispielsweise verwendet werden, um die gemessene Fluoreszenzintensität für Schwankungen der Anregungsintensität zu korrigieren und/oder um ein Rückkopplungssignal zum Stabilisieren der Lichtquelle bereitzustellen.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Spektralfilter, das dazu konfiguriert ist, eine wellenlängenabhängige Transmission für elektromagnetische Strahlung bereitzustellen, wobei die wellenlängenabhängige Transmission eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst, und wobei das Spektralfilter mindestens ein optisches Element umfasst, das für wellenlängenabhängige Transmission und/oder Reflexion elektromagnetischer Strahlung konfiguriert ist.
  • Das Spektralfilter kann dazu konfiguriert sein, eine wellenlängenabhängige Transmission für elektromagnetische Strahlung bereitzustellen, die eine Wellenlänge zwischen einer minimalen Wellenlänge (λmin) und einer maximalen Wellenlänge (λmax) umfasst.
  • Ferner kann die Transmission bei den lokalen Maxima mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 80 %, bevorzugter mindestens 90 % betragen. Zusätzlich oder alternativ kann die Transmission bei den lokalen Minima weniger als 1 %, vorzugsweise weniger als 0,1 %, bevorzugter weniger als 0,01 % betragen.
  • In einigen Ausführungsformen kann jedes lokale Maximum der Transmission um einen Faktor von mindestens 10, vorzugsweise um einen Faktor von mindestens 50, bevorzugter um einen Faktor von mindestens 100 höher als die benachbarten lokalen Minima sein.
  • Die Transmission kann mindestens 3, vorzugsweise mindestens 5, bevorzugter mindestens 10 lokale Maxima umfassen.
  • Eine Wellenlängendifferenz zwischen zwei benachbarten Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission kann kleiner als 50 nm, vorzugsweise kleiner als 30 nm, bevorzugter kleiner als 20 nm, wie beispielsweise kleiner als 10 nm, sein.
  • Zusätzlich oder alternativ ist eine Wellenlängendifferenz zwischen zwei benachbarten lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission kleiner als 50 nm, vorzugsweise kleiner als 30 nm, bevorzugter kleiner als 30 nm, wie beispielsweise 10 nm.
  • Die lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission können gleichmäßig beabstandet sein. In ähnlicher Weise können die lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission gleichmäßig beabstandet sein. In einigen Ausführungsformen können die lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission jedoch ungleichmäßig beabstandet sein. Ferner können in einigen Ausführungsformen die lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission ungleichmäßig beabstandet sein.
  • Ein Verhältnis zwischen der Transmission, die einem der lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission entspricht, und der Transmission, die dem höchsten Transmissionsmaximum des Anregungsspektrums entspricht, kann höchstens 1:10, vorzugsweise höchstens 1:5, bevorzugter höchstens 1:2 über die wellenlängenabhängige Transmission betragen. In einigen Ausführungsformen können alle lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission im Wesentlichen dieselbe Transmission umfassen.
  • Zusätzlich oder alternativ kann sich die Transmission der lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission um höchstens 90 % des höchsten Minimums, vorzugsweise höchstens 80 %, bevorzugter höchstens 50 % über die wellenlängenabhängige Transmission unterscheiden. In einigen Ausführungsformen können alle lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission im Wesentlichen dieselbe Transmission umfassen.
  • Die lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission können jeweils einem Peak in der wellenlängenabhängigen Transmission entsprechen. Ferner kann jeder Peak in der wellenlängenabhängigen Transmission eine Spektralbreite umfassen, und wobei die Spektralbreite kleiner als 30 nm, vorzugsweise kleiner als 20 nm, bevorzugter kleiner als 10 nm ist.
  • Weiterhin ist eine Wellenlängendifferenz zwischen benachbarten lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission mindestens gleich der maximalen Spektralbreite der Peaks, die den lokalen Maxima entsprechen, vorzugsweise mindestens dem Zweifachen der Spektralbreite der Peaks, die den lokalen Maxima entsprechen. Wiederum versteht es sich, dass die Wahl von der Form der jeweiligen Maxima und Minima abhängig sein kann.
    Das mindestens eine optische Element kann ein optisches Filter umfassen. Ferner kann das optische Filter ein Absorptionsfilter umfassen. Alternativ kann das optische Filter ein Interferenzfilter umfassen. Ferner kann das Interferenzfilter ein Fabry-Perot-Etalon sein.
  • In einigen Ausführungsformen kann das mindestens eine optische Element einen akustooptischen Modulator (AOM) umfassen. Zusätzlich oder alternativ kann das mindestens eine optische Element einen elektrooptischen Modulator (EOM) umfassen.
  • Das mindestens eine optische Element kann mindestens ein dispersives Element umfassen. Ferner kann das mindestens eine dispersive Element ein Prisma sein. Alternativ kann das mindestens eine dispersive Element ein optisches Gitter sein.
  • In einigen Ausführungsformen kann das optische Gitter ein aberrationskorrigiertes Flachfeldgitter sein. Ferner kann das Spektralfilter eine Mehrzahl von optischen Fasern umfassen, die in einer Linie in der Bildebene des Flachfeldgitters angeordnet sind, so dass jede Faser so konfiguriert ist, dass sie einen spektral unterschiedlichen Anteil des gebeugten Lichts sammelt. Ferner kann eine erste Teilmenge der optischen Fasern einem ersten Ausgang des Spektralfilters zugeordnet sein, und eine zweite Teilmenge der optischen Fasern kann einem zweiten Ausgang des Spektralfilters zugeordnet sein. Das heißt, das Licht einer ersten Teilmenge von Fasern kann an einem Ausgang des Spektralfilters bereitgestellt werden, z. B. kombiniert zu einem Strahl, und eine zweite Teilmenge von Fasern kann an einem anderen Ausgang des Spektralfilters bereitgestellt werden. Typischerweise kann jede Faser einem der Ausgänge zugeordnet sein.
  • Bei dem beanspruchten Spektralfilter umfasst das mindestens eine optische Element mindestens ein aberrationskorrigiertes Flachfeldgitter und das Spektralfilter umfasst eine Mehrzahl von optischen Fasern, die in einer Linie in der Bildebene des Flachfeldgitters angeordnet sind, sodass jede Faser so konfiguriert ist, dass sie einen spektral unterschiedlichen Anteil des gebeugten Lichts sammelt.
  • In einigen Ausführungsformen können die Fasern in der Linie in der Bildebene dem ersten und zweiten Ausgang auf alternative Weise zugeordnet werden. Das heißt, vorausgesetzt, dass die Fasern in aufsteigender Reihenfolge nummeriert sind, können alle geradzahligen Fasern einem Ausgang (z. B. dem ersten Ausgang) und alle ungeradzahligen, d. h. alle verbleibenden, Fasern dem anderen Ausgang (z. B. dem zweiten Ausgang) zugeordnet werden.
  • Der erste Ausgang des vorstehend beschriebenen faserbasierten Spektralfilters kann die gefilterte elektromagnetische Strahlung bereitstellen, und der zweite Ausgang kann ein Referenzsignal bereitstellen, das mindestens einen Anteil der zurückgewiesenen elektromagnetischen Strahlung umfasst. Das heißt, der erste Ausgang kann das gefilterte Signal bereitstellen, das entsprechend der wellenlängenabhängigen Transmission geändert wird, während der zweite Ausgang ein Referenzsignal bereitstellen kann, das mindestens einen Anteil des herausgefilterten Lichts umfasst, d. h. das von dem Filter zurückgewiesen und nicht in den ersten Ausgang geleitet wird.
  • In einigen Ausführungsformen kann das Spektralfilter ferner einen Modulator umfassen, der dazu konfiguriert ist, nur einen ausgewählten Anteil räumlich getrennter Lichtkomponenten durchzulassen und/oder zu reflektieren, wobei das Filter so konfiguriert sein kann, dass das Licht zweimal gebeugt und/oder gebrochen wird, so dass die Spektralkomponenten des Lichts räumlich getrennt sind. Anschließend kann das räumlich getrennte Licht zu dem Modulator geleitet werden, wobei unter Umständen nur ein Anteil der räumlich getrennten Komponenten des Lichts durchgelassen und/oder reflektiert wird, wobei der Anteil der spektral getrennten Komponenten des Lichts, die durchgelassen und/oder reflektiert werden, zweimal gebeugt und/oder gebrochen werden kann, so dass die verbleibenden Spektralkomponenten des Lichts wieder räumlich zu einem einzigen Strahl kombiniert werden können.
  • Das Spektralfilter kann 4 dispersive Elemente umfassen, wobei das Licht an jedem Element nur einmal gebeugt und/oder gebrochen werden kann. Alternativ kann das Spektralfilter 2 dispersive Elemente umfassen, wobei das Licht an jedem Element nur zweimal gebeugt und/oder gebrochen werden kann, wobei es an jedem Element unter Umständen einmal gebeugt und/oder gebrochen wird, bevor es zum Modulator geleitet wird, und einmal, nachdem es vom Modulator durchgelassen und/oder reflektiert wurde. In einigen Ausführungsformen umfasst das Spektralfilter, das einen Modulator umfasst, unter Umständen nur 1 dispersives Element.
  • Der Modulator kann so konfiguriert sein, dass er bewegt wird, um die wellenlängenabhängige Transmission des Filters zu modifizieren. Das heißt, durch Bewegen des Modulators in Bezug auf das gebeugte und/oder gebrochene Licht kann die wellenlängenabhängige Transmission des Filters vorteilhafterweise eingestellt werden, da andere Anteile der räumlich getrennten Komponenten des Lichts durchgelassen und/oder reflektiert werden können.
  • Der Modulator kann ferner mindestens eine Blende umfassen, die dazu konfiguriert ist, das untere und/oder obere Ende des Spektrums zu blockieren. Das heißt, die mindestens eine Blende kann verwendet werden, um das untere und/oder obere Ende des Spektrums (z. B. vollständig) zu blockieren. Mit anderen Worten kann die mindestens eine Blende zum Realisieren eines Kanten- oder Bandpassfilters verwendet werden. Ferner kann die mindestens eine Blende so konfiguriert sein, dass sie zum Feineinstellen des blockierten Anteils des Spektrums bewegt wird.
  • In einigen Ausführungsformen kann der Modulator dazu konfiguriert sein, um den nicht ausgewählten Anteil von räumlich getrennten Lichtkomponenten zu absorbieren. Das heißt, der Modulator kann nur einen ausgewählten Anteil räumlich getrennter Lichtkomponenten senden und/oder reflektieren, während nicht ausgewählte Lichtkomponenten vom Modulator absorbiert werden.
  • Somit ist unter Umständen eine Mehrzahl von Konfigurationen möglich: Der Modulator kann beispielsweise den gewünschten Anteil des Spektrums durchlassen (oder reflektieren), während verbleibende Komponenten vom Modulator absorbiert werden. Oder der Modulator kann zum Beispiel den ausgewählten (gewünschten) Anteil des Spektrums durchlassen und den nicht ausgewählten (unerwünschten) Anteil reflektieren oder umgekehrt. Eine solche Konfiguration kann vorteilhafterweise ein Referenzsignal bereitstellen, das beispielsweise zum Messen von Intensitätsschwankungen der Lichtquelle verwendet werden kann, was zum Korrigieren des gemessenen/detektierten Signals, z. B. für Hintergrundschwankungen, verwendet werden kann.
  • Die minimale Wellenlänge (λmin) kann kleiner als 250 nm sein, vorzugsweise kleiner als 220 nm, bevorzugter kleiner als 200 nm. Zusätzlich oder alternativ kann die maximale Wellenlänge (λmax) größer als 400 nm sein, vorzugsweise größer als 500 nm, bevorzugter größer als 600 nm. In einigen Ausführungsformen kann die maximale Wellenlänge (λmax) größer als 800 nm sein. Es versteht sich, dass die Wahl der maximalen (und minimalen) Wellenlänge im Allgemeinen von der Verwendung des Filters abhängig sein kann. Das heißt, die Anregung kann insgesamt eine höhere Energie (d. h. eine niedrigere Wellenlänge) im Vergleich zur Emission aufweisen. Somit kann für ein Anregungsfilter eine niedrigere minimale Wellenlänge im Vergleich zu einem Emissionsfilter wünschenswert sein, während für ein Emissionsfilter eine höhere maximale Wellenlänge im Vergleich zu einem Anregungsfilter wünschenswert sein kann.
  • Das mindestens eine Spektralfilter, das in dem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet wird, kann dem vorstehend beschriebenen Spektralfilter entsprechen.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Fluoreszenzmessanordnung zum Messen der Fluoreszenz einer Probe. Die Anordnung umfasst eine Messzelle, die dazu konfiguriert ist, die Probe aufzunehmen, eine Anregungsstrahlungsanordnung, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung dazu konfiguriert ist, eine Anregungsstrahlung bereitzustellen, wobei die Anregungsstrahlung ein Anregungsspektrum für die Messzelle von Intensität gegenüber Wellenlänge (l(λ)) umfasst, wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst, und einen Detektor, der dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil einer Emission der Probe zu detektieren und Detektionsdaten zu generieren.
  • Die Fluoreszenzmessanordnung kann dazu konfiguriert sein, das vorstehend beschriebene Verfahren durchzuführen.
  • Bei der beanspruchter Fluoreszenzmessanordnung umfasst die Anregungsstrahlungsanordnung eine Lichtquelle. Ferner kann die Anregungsanordnung ein Anregungsfilter umfassen, das dazu konfiguriert ist, die Emission der Lichtquelle zu filtern. Das Anregungsfilter kann ein Spektralfilter sein. Ferner kann das Anregungsfilter dazu konfiguriert sein, das Emissionsspektrum der Lichtquelle zu manipulieren, um das Anregungsspektrum bereitzustellen.
  • Das Anregungsfilter kann ein Spektralfilter sein, wie vorstehend beschrieben.
  • Die Lichtquelle kann ein Breitbandspektrum bereitstellen. Ferner kann die Lichtquelle eines von einer Gasentladungslichtquelle, einer thermischen Lichtquelle, einer Plasma-Lichtquelle oder einer LED sein.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Lichtquelle ein Spektrum bereitstellen, das eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst. In solchen Ausführungsformen kann die Lichtquelle eine Gasentladungslichtquelle, eine Plasmalichtquelle oder eine gepulste Lichtquelle sein. Beispielsweise kann die Fluoreszenzmessanordnung vorteilhafterweise eine Lichtquelle verwenden, die bereits ein geeignet strukturiertes Spektrum emittiert, und ein Emissionsfilter, das an diese Lichtquelle angepasst ist, d. h. das dazu angepasst ist, den Beitrag des von der Lichtquelle emittierten Lichts zur detektierten Emission erheblich zu reduzieren, z. B. kann das Emissionsfilter zu dem strukturierten Spektrum der Lichtquelle komplementär sein.
  • Im Allgemeinen kann die Lichtquelle elektromagnetische Strahlung im Bereich von 250 nm bis 400 nm, vorzugsweise 220 nm bis 600 nm, bevorzugter 200 nm bis 800 nm bereitstellen. Es versteht sich, dass eine Lichtquelle möglicherweise nicht bei jeder Wellenlänge innerhalb der vorstehend angegebenen Intervalle elektromagnetische Strahlung bereitstellt. Sie kann statt dessen elektromagnetische Strahlung bereitstellen, die den vorstehend angegebenen Bereich abdeckt, während sie möglicherweise eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst, wie vorstehend beschrieben. Beispielsweise stellt ein Frequenzkamm oder ein kammartiges Spektrum, das von einer Lichtquelle bereitgestellt wird, der/das Zähne umfasst, die sich von 250 nm bis 400 nm erstrecken, elektromagnetische Strahlung im Bereich von 250 nm bis 400 nm bereit.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Anregungsstrahlungsanordnung eine Mehrzahl von Lichtquellen umfassen, wobei die Emission der Mehrzahl von Lichtquellen kombiniert werden kann, um eine kombinierte Emission bereitzustellen. Ferner umfasst die Anregungsstrahlungsanordnung mindestens einen dichroitischen Strahlteiler, ein optisches Gitter und/oder eine Linsenanordnung, die dazu konfiguriert sind, die Emission der Mehrzahl von Lichtquellen zu kombinieren. Das Anregungsfilter kann dazu konfiguriert sein, die kombinierte Emission der Mehrzahl von Lichtquellen zu filtern.
  • Darüber hinaus kann mindestens eine Teilmenge oder die Gesamtheit der Mehrzahl von Lichtquellen eine Strahlung im Wesentlichen mit einer einzigen Wellenlänge bereitstellen. Mindestens eine der Mehrzahl von Lichtquellen kann ein Laser sein.
  • In einigen Ausführungsformen kann mindestens eine Teilmenge oder die gesamte Mehrzahl von Lichtquellen eine Strahlung mit einer Mehrzahl von Wellenlängen bereitstellen.
  • Die Anregungsstrahlungsanordnung kann eine Mehrzahl von Anregungsfiltern umfassen, wobei die Anregungsfilter so konfiguriert sein können, dass sie die Emission jeder der Mehrzahl von Lichtquellen filtern, bevor sie kombiniert werden, um die kombinierte Emission bereitzustellen. Die Mehrzahl von Anregungsfiltern können mindestens eines von einem Langpass-, einem Bandpass- und/oder einem Kurzpassfilter umfassen.
  • Die beanspruchte Fluoreszenzmessanordnung umfasst ein Emissionsfilter, das dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil der Emission der Probe zu filtern. Das Emissionsfilter kann ein Spektralfilter sein.
  • Das Emissionsfilter kann dazu konfiguriert sein, eine wellenlängenabhängige Transmission bereitzustellen. In einigen Ausführungsformen kann das Emissionsfilter ein Spektralfilter sein, wie vorstehend beschrieben.
  • Das Emissionsfilter kann dazu konfiguriert sein, Beiträge der Anregungsstrahlung zu dem mindestens einen Anteil der detektierten Emission zu unterdrücken. Ferner kann das Emissionsfilter dazu konfiguriert sein, die Beiträge der Anregungsstrahlung zu höchstens dem 10-fachen der Beiträge eines Probenhintergrunds zu unterdrücken, vorzugsweise in der gleichen Größenordnung wie die Beiträge des Probenhintergrunds. Es versteht sich, dass sich der Probenhintergrund auf Hintergrundgeräusche bezieht, die von der Probe stammen, beispielsweise Hintergrundfluoreszenz aufgrund unerwünschter Autofluoreszenz oder Streulicht von Partikeln in der Probe. Das heißt, Streulicht von Partikeln (oder Gasblasen) kann wie emittiertes Licht wirken und zu einem Probenhintergrund führen. Beispielsweise kann für Wellenlängen, bei denen das Anregungsfilter eine hohe Transmission aufweist, z. B. 80 %, und das Emissionsfilter eine niedrige Transmission aufweist, z. B. 2 %, Streulicht von Partikeln oder Gasblasen um Größenordnungen intensiver sein als die Fluoreszenzemission. Somit kann das Streulicht neben der starken Unterdrückung immer noch zu einem signifikanten Probenhintergrund führen. In ähnlicher Weise kann Streulicht auch zu Hintergrundsignalen in Bereichen führen, in denen das Anregungsfilter eine niedrige Transmission aufweist, z. B. 2 %, und das Emissionsfilter eine hohe Transmission aufweist, z. B. 80 %, obwohl solche Bereiche bei fehlender Fluoreszenz keine wesentliche Lichtmenge umfassen sollten - mit anderen Worten, sie sollten dunkel sein. Insgesamt kann Streulicht von Partikeln daher zu Peaks führen, die beispielsweise im Chromatografiekontext im Vergleich zu anderen Signalen im Chromatogramm typischerweise als kürzere Spikes (ähnlich den Signaturen von Luftblasen) auftreten.
  • Ganz allgemein können andere Rauschquellen berücksichtigt werden, indem die jeweiligen Beiträge vom gemessenen Signal subtrahiert werden. Beispielsweise kann der mittlere Beitrag der Dunkelströme eines Detektors durch regelmäßige Messung subtrahiert werden, und sogar eine konstante Fluoreszenz der Messzelle (d. h. Autofluoreszenz) kann subtrahiert werden, wenn die Probe den Detektor passiert und nicht immer in der Messkammer vorhanden ist, so dass der Hintergrund gemessen werden kann. Eine andere Möglichkeit, konstante Beiträge, z. B. Fraktionen, zu messen, besteht in der Verwendung von sogenannten „Blindläufen“, bei denen Fluide wie bei einem normalen Chromatografielauf durch das System geleitet werden, mit der Ausnahme, dass keine Probe eingeführt wird. Solche Blindläufe sind ein gängiges Werkzeug in der HPLC, um Zugang zu der Hintergrundemission der verwendeten Elutionsmittel und Ausrüstungen zu erhalten. Konstante Beiträge (z. B. Autofluoreszenz von der Messzelle oder dem Lösungsmittel) können jedoch synchron mit der Helligkeit und/oder Intensität der Lichtquelle schwanken, was zu einem erhöhten Rauschpegel führen kann, selbst wenn konstante Beiträge zum detektierten Signal abgezogen werden. Daher kann es in einigen Fällen vorteilhaft sein, Messungen eines Referenzsignals (siehe auch oben) einzubeziehen, die einen Hinweis auf die Helligkeit und/oder Intensität der Lichtquelle während der Messung und deren Schwankungen bereitstellen.
  • Die wellenlängenabhängige Transmission des Emissionsfilters kann dem Anregungsfilter im Wesentlichen entgegengesetzt sein. Das heißt, das Emissionsfilter stellt eine hohe Transmission bereit, während das Anregungsfilter eine niedrige Transmission bereitstellt und umgekehrt.
  • Der Detektor kann mindestens eine Fotovervielfacherröhre umfassen, die dazu konfiguriert ist, einfallendes Licht in einen Strom umzuwandeln. In einigen Ausführungsformen kann der Detektor eine Mehrzahl von Fotovervielfacherröhren umfassen.
  • Der Detektor kann mindestens eine Fotodiode umfassen, die dazu konfiguriert ist, einfallendes Licht in einen Strom umzuwandeln. In einigen Ausführungsformen kann der Detektor eine Mehrzahl von Fotodioden umfassen. Ferner kann der Detektor ein Dioden-Array umfassen. Die mindestens eine Fotodiode kann eine Avalanche-Fotodiode sein.
  • In einigen Ausführungsformen kann der Detektor einen Bildsensor umfassen. Der Bildsensor kann ein CCD-Sensor sein. Alternativ kann der Bildsensor ein aktiver Pixelsensor sein, wobei der aktive Pixelsensor ein CMOS-Sensor sein kann.
  • Der Detektor kann einen Verstärker umfassen. Das heißt, der Detektor kann beispielsweise eine Bildverstärkerröhre umfassen, die mit einem Bildsensor wie einem CCD-Sensor oder einem aktiven Pixelsensor kombiniert werden kann. Mit anderen Worten kann der Detektor eine verstärkte Kamera umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen kann der Detektor gekühlt werden. Das heißt, er kann beispielsweise elektrisch gekühlt oder thermisch an ein Reservoir mit flüssigem Stickstoff gekoppelt werden.
  • Bei der beanspruchten Fluoreszenzmessanordnung umfasst die Messzelle einen Lichtleiter, wobei der Lichtleiter ein Rohr ist, das eine Oberfläche umfasst, die dazu konfiguriert ist, eine interne Totalreflexion für Licht aus dem Rohrinneren heraus bereitzustellen. Der Lichtleiter kann eine Außenfläche umfassen, und wobei die Außenfläche die Oberfläche ist, die dazu konfiguriert ist, eine interne Totalreflexion bereitzustellen. Die Außenfläche kann senkrecht zur Strömungsrichtung innerhalb des Lichtleiters sein.
  • Alternativ kann der Lichtleiter eine Innenfläche umfassen, und wobei die Innenfläche die Oberfläche ist, die dazu konfiguriert ist, eine interne Totalreflexion bereitzustellen. Ferner kann die Innenfläche eine Beschichtung umfassen. Die Beschichtung kann beispielsweise eine Beschichtung mit niedrigem Brechungsindex sein, wie beispielsweise ein amorphes Fluorpolymer, z. B. Teflon AF.
  • Bei der beanspruchten Fluoreszenzmessanordnung umfasst der Lichtleiter eine Einlassöffnung und eine Auslassöffnung, wobei der Lichtleiter dazu konfiguriert ist, die Probe an der Einlassöffnung aufzunehmen und zur Auslassöffnung zu leiten.
  • Der Lichtleiter kann ferner so konfiguriert sein, dass er Anregungsstrahlung an der Außenfläche des Lichtleiters empfängt. Das heißt, der Lichtleiter kann so konfiguriert sein, dass Licht, das an der Außenfläche bereitgestellt wird, in den Lichtleiter geleitet werden kann, wo es beispielsweise mit der Probe interagieren kann.
  • Ferner kann die Messzelle einen Spiegel umfassen, der dazu konfiguriert ist, Licht, das die Einlassöffnung des Lichtleiters verlässt, zurück in den Lichtleiter zu reflektieren. Der Spiegel kann ein retroreflektierender Spiegel sein. Der Spiegel kann an der Einlassöffnung des Lichtleiters so angeordnet sein, dass er die Anweisung der Probe zum Lichtleiter durch die Einlassöffnung nicht behindert.
  • Die Messzelle kann dazu konfiguriert sein, mindestens 2,5 % der im Lichtleiter emittierten Fluoreszenz zur Auslassöffnung zu leiten, vorzugsweise mindestens 10 %, bevorzugter mindestens 50 %.
  • Die Messzelle kann eine optische Faser umfassen, die dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil des Lichts an der Auslassöffnung des Lichtleiters zu sammeln. Ferner kann die Faser so konfiguriert sein, dass sie mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 85 % des Lichts an der Auslassöffnung des Lichtleiters sammelt.
  • Die Messzelle kann mindestens ein optisches Element zur Verbesserung der Sammlung und/oder Detektion von Licht umfassen, das an der Auslassöffnung des Lichtleiters emittiert wird.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Außenfläche des Lichtleiters von der Lichtquelle umgeben sein. Ferner kann die Lichtquelle eine elektrodenlose Plasma-Lichtquelle sein, die einen Hohlraum umfasst, der das Plasma enthält, und wobei mindestens ein Anteil des Lichtleiters durch den Hohlraum der Lichtquelle verlaufen kann. Der Hohlraum kann eine zylindrische Form aufweisen, wobei der Lichtleiter zentral durch den Hohlraum verlaufen kann, so dass die Mittelachse des Lichtleiters mit der Mittelachse des Hohlraums zusammenfällt. Es versteht sich, dass die Mittelachse des zylindrisch geformten Hohlraums die Achse ist, die zwischen den zwei kreisförmigen Endflächen des Hohlraums verläuft. Ferner kann die Außenseite des Hohlraums mit einer reflektierenden Beschichtung beschichtet sein.
  • Die Fluoreszenzmessanordnung kann einen Einlass zum Aufnehmen einer Fluidprobe umfassen, wobei die Fluoreszenzmessanordnung dazu konfiguriert sein kann, die Fluidprobe vom Einlass zur Messzelle und von der Messzelle zu einem Auslass der Fluoreszenzmessanordnung zu leiten.
  • Die Messzelle kann für eine Durchflussrate mindestens im Bereich von 1 nl/min bis 1 ml/min, vorzugsweise 1 nl/min bis 5 ml/min, wie beispielsweise 1 nl/min bis 10 ml/min, konfiguriert sein. Das heißt, die Messzelle kann mit jeder Durchflussrate im entsprechenden Bereich verwendet werden.
  • Die Fluoreszenzmessanordnung kann dazu konfiguriert sein, die Fluoreszenz im Bereich von 300 nm bis 600 nm, vorzugsweise 220 nm bis 800 nm, zu messen. Die Fluoreszenzmessanordnung kann dazu konfiguriert sein, die Fluoreszenz bei Probenkonzentrationen bis zu 100 pg/ml, vorzugsweise 10 pg/ml, bevorzugter bis zu 2 pg/ml, zu messen.
  • Das Emissionsfilter kann ein Softwarefilter sein, das dazu konfiguriert ist, auf die Erfassungsdaten angewendet zu werden. Zusätzlich oder alternativ kann das Emissionsfilter mindestens ein optisches Element umfassen, das für eine wellenlängenabhängige Transmission und/oder Reflexion elektromagnetischer Strahlung konfiguriert ist.
  • Das vorstehend beschriebene Verfahren kann ferner das Verwenden einer Fluoreszenzmessanordnung wie vorstehend beschrieben umfassen.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein System zum Messen der Fluoreszenz einer Probe. Das System umfasst eine Pumpe zum Bereitstellen eines Fluidstroms, einen Probeninjektor zum Bereitstellen einer Fluidprobe, eine Trennsäule und einen Fluoreszenzdetektor zum Detektieren der Fluoreszenz von Bestandteilen der Probe.
  • Das System kann ein Flüssigchromatografiesystem sein. Das System kann ferner ein Hochleistungs-Flüssigchromatografiesystem sein.
  • Der Systemfluoreszenzdetektor ist eine Fluoreszenzmessanordnung, wie vorstehend beschrieben. Zusätzlich oder alternativ kann das System dazu konfiguriert sein, das vorstehend beschriebene Verfahren durchzuführen.
  • In einigen Ausführungsformen kann das System einen zweiten Detektor umfassen.
  • Dieses Dokument beschreibt eine Verwendung des vorstehend beschriebenen Spektralfilters, der Fluoreszenzmessanordnung und/oder des Systems zur Durchführung eines Verfahrens zum Messen der Fluoreszenz einer Probe wie vorstehend beschrieben. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Fluoreszenzmessanordnung, die eine Messzelle, die zur Aufnahme der Probe ausgelegt ist, eine Anregungsstrahlungsanordnung, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung dazu konfiguriert ist, der Messzelle eine Anregungsstrahlung bereitzustellen, wobei die Anregungsstrahlung ein Anregungsspektrum der Intensität gegenüber der Wellenlänge (I(λ)) umfasst, wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst, und einen Detektor, der dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil einer Emission der Probe zu detektieren und Erfassungsdaten zu generieren umfasst, zur Durchführung eines Verfahrens zum Messen der Fluoreszenz einer Probe in der Chromatographie wie vorstehend beschrieben.
  • Die Verwendung kann in einer von Chromatografie, Flüssigkeitschromatografie, Hochleistungs-Flüssigchromatografie oder Ultrahochleistungs-Flüssigchromatografie erfolgen.
  • Das heißt, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können Spektralfilter mit disjunktiver Transmission verwenden, um die Anregungsstrahlung bereitzustellen und die Emission zu filtern und daher quasi-breitbandige, disjunktive Anregungsstrahlung und detektierte Emission zu realisieren.
  • Ganz allgemein kann eine Anregungsstrahlung mit einem Spektrum l(λ) mit einer kammartigen Struktur zu der die Probe umfassenden Messzelle geleitet werden. Mindestens ein Anteil der Emission der Probe kann detektiert werden, nachdem sie durch ein Spektralfilter F(λ) mit einem Transmissionsprofil geleitet wurde, das jeden Beitrag der Anregungsstrahlung unterdrückt. Beispielsweise kann das Transmissionsprofil auch ein Kamm sein, mit demselben Abstand zwischen den einzelnen Peaks (auch „Zähnen“) des Kamms, jedoch um die Hälfte dieses Abstandes verschoben. Somit kann jede gestreute Anregungsstrahlung durch das Emissionsfilter unterdrückt werden.
  • Mit anderen Worten kann eine Lichtquelle ein Spektrum I(λ) mit einer kammartigen Struktur generieren, z. B. in Kombination mit einem Anregungsfilter. Es kann vorteilhaft sein, wenn an den Minima so wenig Intensität wie möglich vorhanden ist. Nach der Anregung der Probe detektiert ein Empfänger das von der Probe gestreute Licht, und die Empfindlichkeit des Empfängers kann auch eine spektrale Signatur F(λ) umfassen, so dass die Faltung I(λ)*F(λ) möglichst klein ist. F(λ) kann auch ein Kamm sein, dessen Peaks (auch „Finger“, „Zähne“) genau in den Spalten von I(λ) liegen. Idealerweise wird im Empfänger nur fluoreszierendes (oder Raman-)Licht detektiert. Es versteht sich, dass die Spektralstrukturen keine Kämme sein oder äquidistante Finger aufweisen müssen. Hier kann der „Empfänger“ beispielsweise eine Kombination aus Emissionsfilter und Detektor sein.
  • Ein Fluoreszenzdetektor gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine universelle Detektion unabhängig von den spektralen Eigenschaften der Probe ermöglichen, beispielsweise in Fällen, in denen die einzelnen spektralen Merkmale, z. B. Peaks, des Anregungsspektrums I(λ) und des Spektralfilters F(λ) so gewählt werden, dass sie schmaler als die Breite typischer Anregungs- und Emissions-Peaks sind, und sowohl I(λ) als auch F(λ) den relevanten Spektralbereich, z. B. das sichtbare Spektrum, abdecken. Daher können auch unerwartete Substanzen detektiert werden. In einigen Fällen kann die („weiße“) Lichtquelle auch besser genutzt werden. Darüber hinaus wird die optimale spektrale Bandbreite bei Anregung und Emission automatisch ausgewählt, indem der gesamte relevante Spektralbereich angeregt wird. Insgesamt können Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung daher ein weniger komplexes Messverfahren und einen allgemein einfacheren Betrieb ermöglichen.
  • Die Anzahl der optischen Komponenten kann erheblich geringer sein - insbesondere bei Verwendung der neuen „weißen“ LEDs in Anwendungen, bei denen keine tiefe UV-Strahlung erforderlich ist, oder bei Verwendung einer Lichtquelle, die bereits ein strukturiertes Spektrum emittiert.
  • Nachstehend wird auf Verfahrensausführungsformen Bezug genommen. Diese Ausführungsformen werden durch den Buchstaben „M“ mit nachfolgender Nummer abgekürzt. Wann immer in diesem Schriftstück auf „Verfahrensausführungsformen“ Bezug genommen wird, sind diese Ausführungsformen gemeint.
  • M1. Verfahren zum Messen der Fluoreszenz einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:
    • Bereitstellen von Anregungsstrahlung, umfassend ein Anregungsspektrum von Intensität gegenüber Wellenlänge (I(λ)), wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst;
    • Anregung der Probe mit der Anregungsstrahlung; und
    • Detektieren mindestens eines Anteils einer Emission der Probe.
  • M2. Verfahren gemäß der vorstehenden Ausführungsform, wobei das Spektrum (I(λ)) im Wesentlichen zeitunabhängig ist.
  • M3. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei lokale Maxima des Anregungsspektrums um mindestens einen Faktor 10, vorzugsweise mindestens einen Faktor 100, wie beispielsweise mindestens einen Faktor 1000, höher sind als die benachbarten lokalen Minima.
  • M4. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei jedes lokale Maximum um mindestens einen Faktor 5, vorzugsweise mindestens einen Faktor 10, wie beispielsweise einen Faktor 50, höher ist als jedes lokale Minimum.
  • M5. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei das Anregungsspektrum mindestens 3, vorzugsweise mindestens 5, bevorzugter mindestens 10 lokale Maxima umfasst.
  • M6. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei eine Wellenlängendifferenz zwischen zwei benachbarten lokalen Maxima im Anregungsspektrum kleiner als 50 nm, vorzugsweise kleiner als 30 nm, bevorzugter kleiner als 20 nm, wie beispielsweise 10 nm, ist.
  • M7. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei eine Wellenlängendifferenz zwischen zwei benachbarten lokalen Minima im Anregungsspektrum kleiner als 50 nm, vorzugsweise kleiner als 30 nm, bevorzugter kleiner als 20 nm, wie beispielsweise 10 nm, ist.
  • M8. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei die lokalen Maxima des Anregungsspektrums gleichmäßig beabstandet sind.
  • M9. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei die lokalen Minima des Anregungsspektrums gleichmäßig beabstandet sind.
  • M10. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen mit Ausnahme der Merkmale von M8, wobei die lokalen Maxima des Anregungsspektrums ungleichmäßig beabstandet sind.
  • M11. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen mit Ausnahme der Merkmale von M9, wobei die lokalen Minima des Anregungsspektrums ungleichmäßig beabstandet sind.
  • M12. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei ein Verhältnis zwischen der Intensität, die einem der lokalen Maxima des Anregungsspektrums entspricht, und der Intensität des höchsten Maximums des Anregungsspektrums höchstens 1:10, vorzugsweise höchstens 1:5, bevorzugter höchstens 1:2 über das Anregungsspektrum beträgt.
  • M13. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei alle lokalen Maxima des Anregungsspektrums im Wesentlichen die gleiche Intensität umfassen.
  • M14. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei sich die Intensität, die den lokalen Minima des Anregungsspektrums entspricht, um höchstens 25 % des höchsten Minimums, vorzugsweise höchstens 15 %, bevorzugter höchstens 10 % über das Anregungsspektrum unterscheidet.
  • M15. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei alle lokalen Minima des Anregungsspektrums im Wesentlichen die gleiche Intensität umfassen.
  • M16. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von Peaks umfasst, und wobei das Maximum eines Peaks einem lokalen Maximum entspricht.
  • M17. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei jeder Peak der Mehrzahl von Peaks eine Spektralbreite umfasst, und wobei die Spektralbreite jedes Peaks kleiner als 30 nm, vorzugsweise kleiner als 20 nm, bevorzugter kleiner als 10 nm ist.
  • M18. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei das Verfahren ferner das Verwenden mindestens eines Spektralfilters (F(A)) umfasst, das eine wellenlängenabhängige Transmission bereitstellt.
  • M19. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei die wellenlängenabhängige Transmission des Filters um einen Faktor von mindestens 10, vorzugsweise einen Faktor von mindestens 100, bevorzugter einen Faktor von mindestens 500 variiert.
  • M20. Verfahren gemäß einer der 2 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei die wellenlängenabhängige Transmission eine Mehrzahl von lokalen Transmissionsminima und lokalen Transmissionsmaxima umfasst.
  • M21. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei die lokalen Transmissionsmaxima jeweils einem Peak in der wellenlängenabhängigen Transmission entsprechen.
  • M22. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei jeder Peak in der wellenlängenabhängigen Transmission eine Spektralbreite umfasst, und wobei die Spektralbreite kleiner als 30 nm, vorzugsweise kleiner als 20 nm, bevorzugter kleiner als 10 nm ist.
  • M23. Verfahren gemäß einer der 3 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei benachbarte lokale Transmissionsmaxima der wellenlängenabhängigen Transmission um weniger als 50 nm, vorzugsweise weniger als 30 nm, bevorzugter weniger als 20 nm, wie 10 nm, voneinander entfernt sind.
  • M24. Verfahren gemäß einer der 4 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei benachbarte lokale Transmissionsminima der wellenlängenabhängigen Transmission um weniger als 50 nm, vorzugsweise weniger als 30 nm, bevorzugter weniger als 20 nm, wie beispielsweise 10 nm, voneinander entfernt sind.
  • M25. Verfahren gemäß einer der 5 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei die lokalen Transmissionsmaxima der wellenlängenabhängigen Transmission gleichmäßig beabstandet sind.
  • M26. Verfahren gemäß einer der 6 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei die lokalen Transmissionsminima der wellenlängenabhängigen Transmission gleichmäßig beabstandet sind.
  • M27. Verfahren gemäß einer der 7 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen mit Ausnahme der Merkmale von M25, wobei die lokalen Transmissionsmaxima der wellenlängenabhängigen Transmission ungleichmäßig beabstandet sind.
  • M28. Verfahren gemäß einer der 8 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen mit Ausnahme der Merkmale von M26, wobei die lokalen Transmissionsminima der wellenlängenabhängigen Transmission ungleichmäßig beabstandet sind.
  • M29. Verfahren gemäß einer der 9 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei ein Verhältnis zwischen der Transmission, die einem der lokalen Transmissionsmaxima der wellenlängenabhängigen Transmission entspricht, und der Transmission, die dem höchsten Maximum des Anregungsspektrums entspricht, höchstens 1:10, vorzugsweise höchstens 1:5, bevorzugter höchstens 1:2 über die wellenlängenabhängige Transmission beträgt.
  • M30. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei alle lokalen Transmissionsmaxima der wellenlängenabhängigen Transmission im Wesentlichen die gleiche Transmission umfassen.
  • M31. Verfahren gemäß einer der 11 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei sich die Transmission, die den lokalen Transmissionsminima der wellenlängenabhängigen Transmission entspricht, um höchstens 20 % des höchsten Minimums, vorzugsweise höchstens 10 %, bevorzugter höchstens 5 %, über das Anregungsspektrum unterscheidet.
  • M32. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei alle lokalen Transmissionsminima der wellenlängenabhängigen Transmission im Wesentlichen die gleiche Transmission umfassen.
  • M33. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen und mit den Merkmalen von M18, wobei das Verfahren ferner das Filtern mindestens eines Anteils der Emission der Probe unter Verwendung eines des mindestens einen Spektralfilters (F(λ)) als ein Spektralemissionsfilter umfasst, wobei die Transmission des Spektralemissionsfilters für Wellenlängen lokaler Minima des Anregungsspektrums höher ist als für Wellenlängen lokaler Maxima des Anregungsspektrums.
  • M34. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei die wellenlängenabhängige Transmission des Spektralemissionsfilters für Wellenlängen lokaler Minima des Anregungsspektrums um mindestens einen Faktor 10, vorzugsweise um mindestens einen Faktor 100, wie z. B. einen Faktor 500, höher ist als für Wellenlängen lokaler Maxima des Anregungsspektrums.
  • M35. Verfahren gemäß einer der 2 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen und mit den Merkmalen von M17, wobei die lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission des Spektralemissionsfilters eine Transmissionsspektralbreite umfassen, und wobei die Transmissionsspektralbreite der lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission des Spektralemissionsfilters mindestens gleich der Spektralbreite der lokalen Maxima des Anregungsspektrums ist.
  • M36. Verfahren gemäß der vorhergehenden Ausführungsform, wobei die Transmissionsspektralbreite der lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission des Spektralemissionsfilters um einen Faktor von mindestens 1,5, vorzugsweise um einen Faktor von mindestens 2, größer ist als die Spektralbreite der lokalen Maxima des Anregungsspektrums.
  • M37. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei das Filter ein passives Filter ist.
  • M38. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, ausgenommen der vorhergehende Ausführungsform, wobei das Filter ein aktives Filter ist.
  • M39. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen mit den Merkmalen von M33, wobei der Schritt des Filterns mindestens eines Anteils der Emission der Probe durchgeführt wird, bevor mindestens ein Anteil der Emission der Probe detektiert wird.
  • M40. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei der Schritt des Detektierens mindestens eines Anteils der Emission der Probe das Generieren von Erfassungsdaten umfasst.
  • M41. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen mit den Merkmalen von M33, wobei der Schritt des Filterns mindestens eines Anteils der Emission der Probe durchgeführt wird, nachdem mindestens ein Anteil der Emission der Probe detektiert wurde.
  • M42. Verfahren gemäß der vorhergehenden Ausführungsform und mit den Merkmalen der vorletzten Ausführungsform, wobei das Spektralemissionsfilter ein Softwarefilter ist, das dazu konfiguriert ist, auf die Erfassungsdaten angewendet zu werden.
  • M43. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei der Schritt des Bereitstellens von Anregungsstrahlung das Verwenden von mindestens einer Lichtquelle umfasst.
  • M44. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei die mindestens eine Lichtquelle ein Spektrum bereitstellt, das eine Mehrzahl von Maxima und eine Mehrzahl von Minima umfasst.
  • M45. Verfahren gemäß der vorhergehenden Ausführungsform, wobei die mindestens eine Lichtquelle eines von einer Gasentladungslichtquelle, einer Plasmalichtquelle oder einer gepulsten Lichtquelle ist.
  • M46. Verfahren gemäß einer der 3 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei die mindestens eine Lichtquelle ein Breitbandspektrum bereitstellt.
  • M47. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei die mindestens eine Lichtquelle eines von einer Xenonbogenlichtquelle, einer thermischen Lichtquelle, einer Plasma-Lichtquelle oder einer LED ist.
  • M48. Verfahren gemäß einer der 5 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei der Schritt des Bereitstellens von Anregungsstrahlung das Verwenden einer Mehrzahl von Lichtquellen umfasst, und wobei die Emission der Mehrzahl von Lichtquellen kombiniert wird, um eine einzige Emission bereitzustellen.
  • M49. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei der Schritt des Kombinierens der Emission der Mehrzahl von Lichtquellen das Verwenden von mindestens einem von einem dichroitischen Strahlteiler, einem optischen Gitter, einem Prisma, einem Spiegel und/oder einer Linsenanordnung umfasst.
  • M50. Verfahren gemäß einer der 7 vorhergehenden Verfahrensausführungsformen mit den Merkmalen von M18, wobei der Schritt des Bereitstellens von Anregungsstrahlung das Verwenden von einem des mindestens einen Spektralfilters (F(λ)) als Anregungsfilter umfasst, wobei die Transmission des Anregungsfilters dazu konfiguriert ist, die elektromagnetische Strahlung der mindestens einen Lichtquelle zu modifizieren, um das Anregungsspektrum bereitzustellen.
  • M51. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei das Verfahren das Detektieren mindestens eines Anteils der Emission der Probe aus einer anderen Richtung als der Richtung umfasst, in der die Anregungsstrahlung bereitgestellt wird.
  • M52. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei die Richtung, in der die Anregungsstrahlung bereitgestellt wird, orthogonal zu der Richtung ist, in der mindestens ein Anteil der Emission detektiert wird.
  • M53. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei das Verfahren ferner das Sammeln mindestens eines Anteils der Emission der Probe umfasst, wobei der Schritt des Sammelns mindestens eines Anteils der Emission der Probe vor dem Schritt des Detektierens von mindestens einem Anteil der Emission der Probe durchgeführt wird.
  • M54. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform und mit den Merkmalen von M33, wobei das Sammeln mindestens eines Anteils der Emission durchgeführt wird, bevor mindestens ein Anteil der Emission gefiltert wird.
  • M55. Verfahren gemäß einer der 2 vorhergehenden Ausführungsformen und mit den Merkmalen von M33, wobei das Sammeln mindestens eines Anteils der Emission nach dem Filtern mindestens eines Anteils der Emission durchgeführt wird.
  • M56. Verfahren gemäß einer der 3 vorhergehenden Ausführungsformen, wobei das Verfahren das Sammeln mindestens eines Anteils der Emission der Probe aus einer anderen Richtung als der Richtung umfasst, in der die Anregungsstrahlung bereitgestellt wird.
  • M57. Verfahren gemäß der vorhergehenden Ausführungsform, wobei die Richtung, in der die Anregungsstrahlung bereitgestellt wird, orthogonal zu der Richtung ist, in der mindestens ein Anteil der Emission gesammelt wird.
  • M58. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei der Schritt des Detektierens mindestens eines Anteils der Emission der Probe das Verwenden eines Detektors umfasst, der dazu konfiguriert ist, elektromagnetische Strahlung zu detektieren.
  • M59. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei der Schritt des Anregens der Probe mit Anregungsstrahlung das Leiten der Probe durch eine Messzelle umfasst, wobei die Probe der Anregungsstrahlung innerhalb der Messzelle ausgesetzt ist.
  • M60. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei das Anregungsspektrum eine kammartige Struktur umfasst.
  • M61. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen und mit den Merkmalen von M18, wobei die wellenlängenabhängige Transmission des Filters eine kammartige Struktur umfasst.
  • M62. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen und mit den Merkmalen von M18, wobei mindestens ein Anteil der vom Spektralfilter (F(A)) zurückgewiesenen elektromagnetischen Strahlung als Referenzsignal verwendet wird.
  • M63. Verfahren gemäß der vorhergehenden Verfahrensausführungsform, wobei das Referenzsignal verwendet wird, um Intensitätsschwankungen der Anregungsstrahlung zu kompensieren.
  • Nachstehend wird auf Filterausführungsformen Bezug genommen. Diese Ausführungsformen werden durch den Buchstaben „F“ mit nachfolgender Nummer abgekürzt. Wann immer in diesem Schriftstück auf „Filterausführungsformen“ Bezug genommen wird, sind diese Ausführungsformen gemeint.
  • F1. Spektralfilter, das dazu konfiguriert ist, eine wellenlängenabhängige Transmission für elektromagnetische Strahlung bereitzustellen, wobei die wellenlängenabhängige Transmission eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst, und wobei das Spektralfilter mindestens ein optisches Element umfasst, das für eine wellenlängenabhängige Transmission und/oder Reflexion elektromagnetischer Strahlung konfiguriert ist.
  • F2. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei das Spektralfilter dazu konfiguriert ist, eine wellenlängenabhängige Transmission für elektromagnetische Strahlung bereitzustellen, die eine Wellenlänge zwischen einer minimalen Wellenlänge (λmin) und einer maximalen Wellenlänge (λmax) umfasst.
  • F3. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei bei den lokalen Maxima die Transmission mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 80 %, bevorzugter mindestens 90 % beträgt.
  • F4. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei die Transmission bei den lokalen Minima weniger als 1 %, vorzugsweise weniger als 0,1 %, bevorzugter weniger als 0,01 % beträgt.
  • F5. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei jedes lokale Maximum der Transmission um mindestens einen Faktor 10, vorzugsweise um einen Faktor von mindestens 50, bevorzugter um einen Faktor von mindestens 100 höher ist als die benachbarten lokalen Minima.
  • F6. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei die Transmission mindestens 3, vorzugsweise mindestens 5, bevorzugter mindestens 10 lokale Maxima umfasst.
  • F7. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei eine Wellenlängendifferenz zwischen zwei benachbarten Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission kleiner als 50 nm, vorzugsweise kleiner als 30 nm, bevorzugter kleiner als 20 nm, wie beispielsweise kleiner als 10 nm, ist.
  • F8. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei eine Wellenlängendifferenz zwischen zwei benachbarten lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission kleiner als 50 nm, vorzugsweise kleiner als 30 nm, bevorzugter kleiner als 30 nm, wie beispielsweise 10 nm, ist.
  • F9. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei die lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission gleichmäßig beabstandet sind.
  • F10. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei die lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission gleichmäßig beabstandet sind.
  • F11. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, mit Ausnahme der Merkmale von F9, wobei die lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission ungleichmäßig beabstandet sind.
  • F12. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen mit Ausnahme der Merkmale von F10, wobei die lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission ungleichmäßig beabstandet sind.
  • F13. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei ein Verhältnis zwischen der Transmission, die einem der lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission entspricht, und der Transmission, die dem höchsten Transmissionsmaximum des Anregungsspektrums entspricht, höchstens 1:10, vorzugsweise höchstens 1:5, bevorzugter höchstens 1:2 über die wellenlängenabhängige Transmission beträgt.
  • F14. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei alle lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission im Wesentlichen die gleiche Transmission umfassen.
  • F15. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei sich die Transmission der lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission um höchstens 25 %, vorzugsweise höchstens 20 %, bevorzugter höchstens 10 % des höchsten Minimums über die wellenlängenabhängige Transmission unterscheidet.
  • F16. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei alle lokalen Minima der wellenlängenabhängigen Transmission im Wesentlichen die gleiche Transmission umfassen.
  • F17. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei die lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission jeweils einem Peak in der wellenlängenabhängigen Transmission entsprechen.
  • F18. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei jeder Peak in der wellenlängenabhängigen Transmission eine Spektralbreite umfasst, und wobei die Spektralbreite kleiner als 30 nm, vorzugsweise kleiner als 20 nm, bevorzugter kleiner als 10 nm ist.
  • F19. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei eine Wellenlängendifferenz zwischen benachbarten lokalen Maxima der wellenlängenabhängigen Transmission mindestens gleich der maximalen Spektralbreite der Peaks ist, die den lokalen Maxima entsprechen, vorzugsweise mindestens dem Zweifachen der Spektralbreite der Peaks, die den lokalen Maxima entsprechen.
  • F20. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei das mindestens eine optische Element ein optisches Filter umfasst.
  • F21. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei das optische Filter ein Absorptionsfilter umfasst.
  • F22. Spektralfilter gemäß der vorletzten Filterausführungsform, wobei das optische Filter ein Interferenzfilter umfasst.
  • F23. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei das Interferenzfilter ein Fabry-Perot-Etalon ist.
  • F24. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei das mindestens eine optische Element einen akustooptischen Modulator (AOM) umfasst.
  • F25. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei das mindestens eine optische Element einen elektrooptischen Modulator (EOM) umfasst.
  • F26. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei das mindestens eine optische Element mindestens ein dispersives Element umfasst.
  • F27. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei das mindestens eine dispersive Element ein Prisma ist.
  • F28. Spektralfilter gemäß der vorletzten Filterausführungsform, wobei das mindestens eine dispersive Element ein optisches Gitter ist.
  • F29. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei das optische Gitter ein aberrationskorrigiertes Flachfeldgitter ist.
  • F30. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei das Spektralfilter eine Mehrzahl von optischen Fasern umfasst, die in einer Linie in der Bildebene des Flachfeldgitters angeordnet sind, so dass jede Faser dazu konfiguriert ist, einen spektral unterschiedlichen Anteil des gebeugten Lichts zu sammeln.
  • F31. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei eine erste Teilmenge der optischen Fasern einem ersten Ausgang des Spektralfilters zugeordnet ist und eine zweite Teilmenge der optischen Fasern einem zweiten Ausgang des Spektralfilters zugeordnet ist.
  • Das heißt, das Licht einer ersten Teilmenge von Fasern kann an einem Ausgang des Spektralfilters bereitgestellt werden, z. B. kombiniert zu einem Strahl, und eine zweite Teilmenge von Fasern kann an einem anderen Ausgang des Spektralfilters bereitgestellt werden. Typischerweise kann jede Faser einem der Ausgänge zugeordnet sein.
  • F32. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei die Fasern in der Linie in der Bildebene abwechselnd dem ersten und dem zweiten Ausgang zugeordnet sind.
  • F33. Spektralfilter gemäß einer der 2 vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei der erste Ausgang des Spektralfilters die gefilterte elektromagnetische Strahlung bereitstellt und der zweite Ausgang ein Referenzsignal bereitstellt, das mindestens einen Anteil der zurückgewiesenen elektromagnetischen Strahlung umfasst.
  • F34. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen und mit den Merkmalen von F26, wobei das Spektralfilter ferner einen Modulator umfasst, der dazu konfiguriert ist, nur einen ausgewählten Anteil räumlich getrennter Lichtkomponenten durchzulassen und/oder zu reflektieren, und wobei das Filter so konfiguriert ist, dass:
    • das Licht zweimal gebeugt und/oder gebrochen wird, so dass die Spektralkomponenten des Lichts räumlich getrennt sind,
    • das räumlich getrennte Licht zum Modulator geleitet wird, wobei nur ein Anteil der räumlich getrennten Komponenten des Lichts durchgelassen und/oder reflektiert wird, und
    • wobei der Anteil der spektral getrennten Komponenten des Lichts, die durchgelassen und/oder reflektiert werden, zweimal gebeugt und/oder gebrochen wird, so dass die verbleibenden Spektralkomponenten des Lichts wieder räumlich zu einem einzigen Strahl kombiniert werden.
  • F35. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei das Spektralfilter 4 dispersive Elemente umfasst, und wobei das Licht an jedem Element nur einmal gebeugt und/oder gebrochen wird.
  • F36. Spektralfilter gemäß der vorletzten Filterausführungsform, wobei das Spektralfilter 2 dispersive Elemente umfasst, und wobei das Licht an jedem Element nur zweimal gebeugt und/oder gebrochen wird, wobei es an jedem Element einmal gebeugt und/oder gebrochen wird, bevor es zu dem Modulator geleitet wird, und einmal, nachdem es vom Modulator durchgelassen und/oder reflektiert wurde.
  • F37. Spektralfilter gemäß der Ausführungsform F34, wobei das Spektralfilter 1 dispersives Element umfasst.
  • F38. Spektralfilter gemäß einer der 4 vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei der Modulator dazu konfiguriert ist, bewegt zu werden, um die wellenlängenabhängige Transmission des Filters zu modifizieren.
  • F39. Spektralfilter gemäß einer der 5 vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei der Modulator ferner mindestens eine Blende umfasst, die dazu konfiguriert ist, das untere und/oder obere Ende des Spektrums zu blockieren.
  • F40. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei die mindestens eine Blende dazu konfiguriert ist, zum Abstimmen des Anteils des Spektrums, der blockiert ist, bewegt zu werden.
  • F41. Spektralfilter gemäß einer der 7 vorhergehenden Filterausführungsformen, wobei der Modulator dazu konfiguriert sein kann, den nicht ausgewählten Anteil räumlich getrennter Lichtkomponenten zu absorbieren.
  • F42. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen mit den Merkmalen der Ausführungsform F2, wobei die minimale Wellenlänge (λmin) kleiner als 250 nm, vorzugsweise kleiner als 220 nm, bevorzugter kleiner als 200 nm ist.
  • F43. Spektralfilter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen mit den Merkmalen der Ausführungsform F2, wobei die maximale Wellenlänge (λmax) mindestens 400 nm, vorzugsweise mindestens 500 nm, bevorzugter mindestens 600 nm beträgt.
  • F44. Spektralfilter gemäß der vorhergehenden Filterausführungsform, wobei die maximale Wellenlänge (λmax) mindestens 800 nm beträgt.
  • M64. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen und mit den Merkmalen von M18, wobei mindestens ein in dem Verfahren verwendetes Spektralfilter einer der vorhergehenden Filterausführungsformen entspricht.
  • Nachstehend wird auf Anordnungsausführungsformen Bezug genommen. Diese Ausführungsformen werden durch den Buchstaben „A“ mit nachfolgender Nummer abgekürzt. Wann immer in diesem Schriftstück auf „Anordnungsausführungsformen“ Bezug genommen wird, sind diese Ausführungsformen gemeint.
  • A1. Fluoreszenzmessanordnung zum Messen der Fluoreszenz einer Probe, wobei die Anordnung umfasst:
    • eine Messzelle, die so konfiguriert ist, dass sie die Probe enthält,
    • eine Anregungsstrahlungsanordnung, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung dazu konfiguriert ist, der Messzelle eine Anregungsstrahlung bereitzustellen, wobei die Anregungsstrahlung ein Anregungsspektrum der Intensität gegenüber der Wellenlänge (I(λ)) umfasst, wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst,
    • einen Detektor, der dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil einer Emission der Probe zu detektieren und Erfassungsdaten zu generieren.
  • A2. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei die Fluoreszenzmessanordnung dazu konfiguriert ist, ein Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen durchzuführen.
  • A3. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung eine Lichtquelle umfasst.
  • A4. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungausführungsform, wobei die Anregungsanordnung ferner ein Anregungsfilter umfasst, das dazu konfiguriert ist, die Emission der Lichtquelle zu filtern.
  • A5. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei das Anregungsfilter ein Spektralfilter ist.
  • A6. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 2 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei das Anregungsfilter dazu konfiguriert ist, das Emissionsspektrum der Lichtquelle zu manipulieren, um das Anregungsspektrum bereitzustellen.
  • A7. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 3 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei das Anregungsfilter ein Filter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen ist.
  • A8. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 5 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Lichtquelle ein Breitbandspektrum bereitstellt.
  • A9. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei die Lichtquelle eines von einer Gasentladungslichtquelle, einer thermischen Lichtquelle, einer Plasmalichtquelle oder einer LED ist.
  • A10. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 7 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Lichtquelle ein Spektrum bereitstellt, das eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst.
  • A11. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei die Lichtquelle eines von einer Gasentladungslichtquelle, einer Plasmalichtquelle oder einer gepulsten Lichtquelle ist.
  • A12. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen und mit den Merkmalen von A3, wobei die Lichtquelle elektromagnetische Strahlung im Bereich von 250 nm bis 400 nm, vorzugsweise 220 nm bis 600 nm, bevorzugter 200 nm bis 800 nm bereitstellt.
  • A13. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung eine Mehrzahl von Lichtquellen umfasst, wobei die Emission der Mehrzahl von Lichtquellen kombiniert wird, um eine kombinierte Emission bereitzustellen.
  • A14. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung mindestens eines von einem dichroitischen Strahlteiler, einem optischen Gitter und/oder einer Linsenanordnung umfasst, die konfiguriert sind, um die Emission der Mehrzahl von Lichtquellen zu kombinieren.
  • A15. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 2 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen und mit den Merkmalen von A4, wobei das Anregungsfilter dazu konfiguriert ist, die kombinierte Emission der Mehrzahl von Lichtquellen zu filtern.
  • A16. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 3 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei mindestens eine Teilmenge oder die gesamte Mehrzahl von Lichtquellen eine Strahlung im Wesentlichen mit einer einzigen Wellenlänge bereitstellt.
  • A17. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei mindestens eine der Mehrzahl von Lichtquellen ein Laser ist.
  • A18. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 5 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei mindestens eine Teilmenge oder die gesamte Mehrzahl von Lichtquellen eine Strahlung mit einer Mehrzahl von Wellenlängen bereitstellt.
  • A19. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen und mit den Merkmalen von A4 und A13, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung eine Mehrzahl von Anregungsfiltern umfasst, und wobei die Anregungsfilter konfiguriert sind, um die Emission jeder der Mehrzahl von Lichtquellen zu filtern, bevor sie kombiniert werden, um die kombinierte Emission bereitzustellen.
  • A20. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei die Mehrzahl von Anregungsfiltern mindestens eines von einem Langpass-, einem Bandpass- und/oder einem Kurzpassfilter umfasst.
  • A21. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Fluoreszenzmessanordnung ferner ein Emissionsfilter umfasst, das dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil der Emission der Probe zu filtern.
  • A22. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei das Emissionsfilter ein Spektralfilter ist.
  • A23. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 2 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei das Emissionsfilter dazu konfiguriert ist, eine wellenlängenabhängige Transmission bereitzustellen.
  • A24. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 3 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei das Emissionsfilter ein Filter gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen ist.
  • A25. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 4 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei das Emissionsfilter dazu konfiguriert ist, Beiträge der Anregungsstrahlung zu dem mindestens einen Anteil der detektierten Emission zu unterdrücken.
  • A26. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei das Emissionsfilter dazu konfiguriert ist, die Beiträge der Anregungsstrahlung auf höchstens das 10-fache der Beiträge eines Probenhintergrunds zu unterdrücken, vorzugsweise in der gleichen Größenordnung wie die Beiträge des Probenhintergrunds.
  • A27. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 6 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen und mit den Merkmalen von A4, wobei die wellenlängenabhängige Transmission des Emissionsfilters dem Anregungsfilter im Wesentlichen entgegengesetzt ist.
  • A28. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei der Detektor mindestens eine Fotovervielfacherröhre umfasst, die dazu konfiguriert ist, einfallendes Licht in einen Strom umzuwandeln.
  • A29. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei der Detektor eine Mehrzahl von Fotovervielfacherröhren umfasst.
  • A30. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei der Detektor mindestens eine Fotodiode umfasst, die dazu konfiguriert ist, einfallendes Licht in einen Strom umzuwandeln.
  • A31. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei der Detektor eine Mehrzahl von Fotodioden umfasst.
  • A32. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei der Detektor ein Dioden-Array umfasst.
  • A33. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 3 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die mindestens eine Fotodiode eine Avalanche-Fotodiode ist.
  • A34. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei der Detektor einen Bildsensor umfasst.
  • A35. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei der Bildsensor ein CCD-Sensor ist.
  • A36. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorletzten Anordnungsausführungsform, wobei der Bildsensor ein aktiver Pixelsensor ist.
  • A37. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei der aktive Pixelsensor ein CMOS-Sensor ist.
  • A38. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei der Detektor einen Verstärker umfasst.
  • A39. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei der Detektor gekühlt wird.
  • A40. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Messzelle einen Lichtleiter umfasst, wobei der Lichtleiter ein Rohr ist, das eine Oberfläche umfasst, die dazu konfiguriert ist, eine interne Totalreflexion für Licht aus dem Rohrinneren heraus bereitzustellen.
  • A41. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei der Lichtleiter eine Außenfläche umfasst, und wobei die Außenfläche die Oberfläche ist, die dazu konfiguriert ist, eine interne Totalreflexion bereitzustellen.
  • A42. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorletzten Anordnungsausführungsform, wobei der Lichtleiter eine Innenfläche umfasst, und wobei die Innenfläche die Oberfläche ist, die dazu konfiguriert ist, eine interne Totalreflexion bereitzustellen.
  • A43. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei die Innenfläche eine Beschichtung umfasst.
  • A44. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 4 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei der Lichtleiter eine Einlassöffnung und eine Auslassöffnung umfasst, und wobei der Lichtleiter so konfiguriert ist, dass er die Probe an der Einlassöffnung aufnimmt und sie zur Auslassöffnung leitet.
  • A45. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 5 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei der Lichtleiter so konfiguriert ist, dass er Anregungsstrahlung an der Außenfläche des Lichtleiters empfängt.
  • A46. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 6 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Messzelle einen Spiegel umfasst, der dazu konfiguriert ist, Licht, das die Einlassöffnung des Lichtleiters verlässt, zurück in den Lichtleiter zu reflektieren.
  • A47. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei der Spiegel ein retroreflektierender Spiegel ist.
  • A48. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 2 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei der Spiegel an der Einlassöffnung des Lichtleiters so angeordnet ist, dass er die Anweisung der Probe zum Lichtleiter durch die Einlassöffnung nicht behindert.
  • A49. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 9 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Messzelle dazu konfiguriert ist, mindestens 2,5 %, vorzugsweise mindestens 10 %, bevorzugter mindestens 50 % der im Lichtleiter emittierten Fluoreszenz zur Auslassöffnung zu leiten.
  • A50. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 10 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Messzelle eine optische Faser umfasst, die dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil des Lichts an der Auslassöffnung des Lichtleiters zu sammeln.
  • A51. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei die Faser so konfiguriert ist, dass sie mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 85 % des Lichts an der Auslassöffnung des Lichtleiters sammelt.
  • A52. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 12 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Messzelle mindestens ein optisches Element zum Verbessern der Sammlung und/oder Detektion von Licht umfasst, das an der Auslassöffnung des Lichtleiters emittiert wird.
  • A53. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen und mit den Merkmalen von A3 und A40, wobei die Außenfläche des Lichtleiters von der Lichtquelle umgeben ist.
  • A54. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei die Lichtquelle eine elektrodenlose Plasma-Lichtquelle ist, die einen Hohlraum umfasst, der das Plasma enthält, und wobei mindestens ein Anteil des Lichtleiters durch den Hohlraum der Lichtquelle verläuft.
  • A55. Fluoreszenzmessanordnung gemäß der vorhergehenden Anordnungsausführungsform, wobei der Hohlraum eine zylindrische Form aufweist, und wobei der Lichtleiter zentral durch den Hohlraum verläuft, so dass die Mittelachse des Lichtleiters mit der Mittelachse des Hohlraums zusammenfällt.
  • A56. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der 2 vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Außenseite des Hohlraums mit einer reflektierenden Beschichtung beschichtet ist.
  • A57. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Fluoreszenzmessanordnung einen Einlass zum Aufnehmen einer Fluidprobe umfasst, und wobei die Fluoreszenzmessanordnung dazu konfiguriert ist, die Fluidprobe vom Einlass zur Messzelle und von der Messzelle zu einem Auslass der Fluoreszenzmessanordnung zu leiten.
  • A58. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Messzelle für eine Durchflussrate mindestens im Bereich von 1 nl/min bis 1 ml/min, vorzugsweise 1 nl/min bis 5 ml/min, wie beispielsweise 1 nl/min bis 10 ml/min, konfiguriert ist.
  • A59. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Fluoreszenzmessanordnung dazu konfiguriert ist, die Fluoreszenz im Bereich von 300 nm bis 600 nm, vorzugsweise 220 nm bis 800 nm, zu messen.
  • A60. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen, wobei die Fluoreszenzmessanordnung dazu konfiguriert ist, die Fluoreszenz bei Probenkonzentrationen bis zu 100 pg/ml, vorzugsweise 10 pg/ml, bevorzugter bis zu 2 pg/ml, zu messen.
  • A61. Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen mit den Merkmalen von Ausführungsform A21, wobei das Emissionsfilter ein Softwarefilter ist, das dazu konfiguriert ist, auf die Detektionsdaten angewendet zu werden, und/oder wobei das Emissionsfilter mindestens ein optisches Element umfasst, das für wellenlängenabhängige Transmission und/oder Reflexion elektromagnetischer Strahlung konfiguriert ist.
  • M65. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen, wobei das Verfahren ferner das Verwenden eines Systems nach einer der vorstehenden Systemausführungsformen umfasst.
  • Nachstehend wird auf Systemausführungsformen Bezug genommen. Diese Ausführungsformen werden durch den Buchstaben „S“ mit nachfolgender Nummer abgekürzt. Wann immer in diesem Schriftstück auf „Systemausführungsformen“ Bezug genommen wird, sind diese Ausführungsformen gemeint.
  • S1. System zum Messen der Fluoreszenz einer Probe, wobei das System umfasst
    • eine Pumpe zum Bereitstellen eines Fluidstroms;
    • einen Probeninjektor zum Bereitstellen einer Fluidprobe;
    • eine Trennsäule; und
    • einen Fluoreszenzdetektor zum Detektieren der Fluoreszenz von Bestandteilen der Probe.
  • S2. System gemäß der vorstehenden Systemausführungsform, wobei das System ein Flüssigchromatografiesystem ist.
  • S3. System gemäß der vorstehenden Systemausführungsform, wobei das System ein Hochleistungs-Flüssigchromatografiesystem ist.
  • S4. System gemäß einer der vorhergehenden Systemausführungsformen, wobei der Systemfluoreszenzdetektor eine Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen ist.
  • S5. System gemäß einer der vorstehenden Systemausführungsformen, wobei das System dazu konfiguriert ist, das Verfahren gemäß einer der vorstehenden Verfahrensausführungsformen auszuführen.
  • S6. System gemäß einer der vorstehenden Systemausführungsformen, wobei das System einen zweiten Detektor umfasst.
  • Nachstehend wird auf Verwendungsausführungsformen Bezug genommen. Diese Ausführungsformen werden durch den Buchstaben „U“ mit nachfolgender Nummer abgekürzt. Wann immer in diesem Schriftstück auf „Verwendungsausführungsformen“ Bezug genommen wird, sind diese Ausführungsformen gemeint.
  • U1. Verwendung des Spektralfilters gemäß einer der vorhergehenden Filterausführungsformen, der Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer der vorhergehenden Anordnungsausführungsformen und/oder des Systems gemäß einer der vorhergehenden Systemausführungsformen zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einer der vorhergehenden Verfahrensausführungsformen.
  • U2. Verwendung gemäß der vorhergehenden Verwendungsausführungsform in der Chromatografie.
  • U3. Verwendung gemäß der vorhergehenden Verwendungsausführungsform in der Flüssigchromatografie.
  • U4. Verwendung gemäß der vorhergehenden Verwendungsausführungsform in der Hochleistungs-Flüssigchromatografie.
  • U5. Verwendung gemäß der vorhergehenden Verwendungsausführungsform in der Ultrahochleistungs-Flüssigchromatografie.
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die Begleitzeichnungen beschrieben. Diese Ausführungsformen sollten nur Beispiele für die vorliegende Erfindung geben, sie aber nicht einschränken.
    • 1 zeigt einen Fluoreszenzdetektor zur Erläuterung von Konzepten, die für Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung relevant sind;
    • 2 zeigt Spektren für eine typische Fluoreszenzmessung, die zur Erläuterung von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung relevant ist;
    • 3A zeigt eine Fluoreszenzmessanordnung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
    • 3B zeigt eine wellenlängenabhängige Transmission eines Anregungsfilters;
    • 3C zeigt die wellenlängenabhängige Transmission eines Anregungsfilters und eines komplementären Emissionsfilters;
    • 4 zeigt Spektren einer Fluoreszenzmessung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
    • 5 zeigt schematisch ein Fabry-Perot-Etalon-Filter;
    • 6 zeigt schematisch ein Spektralfilter, das einen AOM vereinheitlicht;
    • 7A zeigt schematisch ein Spektralfilter unter Verwendung dispersiver Elemente;
    • 7B zeigt eine Ausführungsform eines Spektralfilters unter Verwendung von Beugungsgittern;
    • 8 zeigt ein faserbasiertes Spektralfilter;
    • 9 zeigt schematisch eine Mehrzahl von Lichtquellen;
    • 10 zeigt ein Spektrum einer NOx-Lichtquelle;
    • 11 zeigt schematisch eine Messzelle unter Verwendung der internen Totalreflexion;
    • 12A zeigt schematisch einen Lichtdetektor, der einen Fotovervielfacher verwendet;
    • 12B zeigt schematisch einen Lichtdetektor, der eine Mehrzahl von Avalanche-Fotodioden (APDs) umfasst;
    • 12C zeigt schematisch einen Lichtdetektor, der einen Bildsensor umfasst;
    • 13A zeigt schematisch ein Filter, das dispersive Elemente verwendet, die zusätzliche Blenden umfassen;
    • 13B zeigt schematisch ein faserbasiertes Spektralfilter, das zusätzliche Blenden verwendet;
    • 14A zeigt eine Messzelle, die integral mit einer Lichtquelle kombiniert ist; und
    • 14B zeigt einen Querschnitt der Messzelle, die vollständig mit einer Lichtquelle kombiniert ist.
  • Es wird darauf hingewiesen, dass nicht alle Zeichnungen alle Bezugszeichen aufweisen. Stattdessen wurden in einigen Zeichnungen einige der Bezugszeichen aus Platzgründen und der Einfachheit der Darstellung halber weggelassen. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die Begleitzeichnungen beschrieben.
  • Es wird nun auf 1 Bezug genommen, die schematisch einen Fluoreszenzdetektor 1 zeigt, der auch als Fluoreszenzspektrometer 1 bezeichnet wird, wie er typischerweise in HPLC-Anwendungen zur Anwendung kommt. Der Fluoreszenzdetektor 1 umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle 11 (Lampe) zum Bereitstellen elektromagnetischer Strahlung, eine Messzelle 12, z. B. eine Durchflusszelle 12, und einen Detektor 13.
  • Die Anregungsstrahlung kann entweder direkt von der Lichtquelle 11 bereitgestellt werden oder die Strahlung der Lichtquelle 11 kann zuerst ein Anregungsfilter 14, z. B. ein Interferenzfilter 14 oder einen Monochromator 14, durchlaufen, um selektiv Anregungsstrahlung mit einer bestimmten Wellenlänge und Bandbreite bereitzustellen. Die Anregungsstrahlung kann zu der Probenzelle 12 geleitet werden, so dass die Probe mindestens einen Anteil der Anregungsstrahlung absorbieren kann. Bei der Absorption kann die Probe Fluoreszenz emittieren, wobei die Probe typischerweise ungerichtet in alle Richtungen emittiert. Das heißt, typischerweise kann die Probe eine gleichmäßig verteilte Emission bereitstellen.
  • Mindestens ein Anteil der Emission kann anschließend vom Detektor 13 gesammelt und/oder detektiert werden. Typischerweise wird die Emission erneut unter Verwendung eines Spektralemissionsfilters 15 gefiltert, das beispielsweise ein Interferenzfilter 15 oder ein Monochromator 15 sein kann. Somit detektiert der Detektor 13 unter Umständen nur Licht, das innerhalb eines ausgewählten Wellenlängenfensters emittiert wird, und beispielsweise kann Streulicht von der Anregungsstrahlung unterdrückt werden, da es typischerweise eine niedrigere Wellenlänge als die Emission der Probe umfasst.
  • Sowohl das Anregungs- als auch das Emissionsfilter können typischerweise motorgetriebene Gitter umfassen, um die Auswahl einer gewünschten Wellenlänge und/oder das Abtasten der Wellenlängen der Anregungsstrahlung und/oder der detektierten Emission zu ermöglichen. Insbesondere können die motorgetriebenen Gitter periodisch zwischen verschiedenen Wellenlängen umgeschaltet werden, um einen „Betrieb mit mehreren Wellenlängen“ zu ermöglichen.
  • Der Beitrag von Streulicht von der Anregungsstrahlung kann weiter verringert werden, indem die Komponenten des Fluoreszenzdetektors 1 so angeordnet werden, dass die Emission in einer Richtung gemessen wird, die sich von der Richtung der Anregungsstrahlung unterscheidet. Typischerweise wird ein Winkel von 90° zwischen der Richtung der Anregungsstrahlung und der Richtung gewählt, in der mindestens ein Anteil der Emission gesammelt und/oder detektiert wird.
  • Die typischerweise verwendete Messzelle 12 ist eine Durchfluss-Quarzglasküvette mit einer 90°-Geometrie, um das von der Anregung zur Emissionsseite durchgelassene Streulicht zu minimieren. Die Messzelle 12 kann bereits schwarze Glasteile enthalten, um einen Schlitz und/oder eine Streulichtfalle zu implementieren.
  • Der Detektor 13 ist typischerweise eine (Avalanche-)Fotodiode 13 (APD/PD) oder ein Fotovervielfacher 13 (PMT). In einigen Anwendungen kann der Detektor 13 jedoch auch ein Dioden-Array sein, das eine Mehrzahl von Fotodioden umfassen kann, die in einem linearen Array angeordnet sind, so dass der mindestens eine Anteil der Emission unter Verwendung eines dispersiven Elements wellenlängenaufgelöst detektiert werden kann, um die Wellenlängenkomponenten der Emission räumlich zu trennen, so dass unterschiedliche Fotodioden unterschiedliche Anteile des Spektrums messen können. Dies kann den Vorteil bieten, dass unter Umständen kein Spektralemissionsfilter 15 erforderlich ist oder dass es ausreichen kann, ein relativ breitbandiges Emissionsfilter 15 zu haben. Typischerweise kann die Empfindlichkeit eines solchen Dioden-Arrays jedoch geringer sein als bei einer einzigen PD oder PMT.
  • Weiterhin kann der Fluoreszenzdetektor 1 ein Kantenfilter (nicht dargestellt) umfassen, insbesondere ein Langpassfilter, z. B., um den Beitrag von Streulicht zur detektierten Emission zu unterdrücken, da die Anregungsstrahlung typischerweise eine niedrigere Wellenlänge als die Emission umfasst. Ferner können auch verschiedene Kantenfilter auf der Emissionsseite automatisiert auswählbar sein, um kürzere Wellenlängen zu unterdrücken, z. B. die Anregungsstrahlung und/oder die zweite Ordnung eines Monochromators, wenn sie zum Filtern der Anregung verwendet werden.
  • Der Fluoreszenzdetektor kann auch einen Referenzdetektor 16 umfassen, der dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil der Anregungsstrahlung zu detektieren, der nicht von der Probe absorbiert wurde. Das Referenzsignal oder die Referenzmessung des Referenzdetektors kann es beispielsweise ermöglichen, Schwankungen der Anregungsintensität zu kompensieren. Das heißt, das Referenzsignal kann beispielsweise verwendet werden, um die gemessene Fluoreszenzintensität für Schwankungen der Anregungsintensität zu korrigieren.
  • Mit anderen Worten können Fluoreszenzdetektoren 1 eine zusätzliche Möglichkeit bieten, die Anregungsintensität zu messen, um Schwankungen in der Anregungsstrahlung zu kompensieren, z. B. aufgrund von Schwankungen der verwendeten Lichtquelle. Diese Messung kann als Referenzmessung bezeichnet werden und die gemessene Fluoreszenzintensität kann beispielsweise durch die Referenzmessung dividiert werden, um ein Signal zu erhalten, das weiter verwendet werden kann.
  • Im Allgemeinen kann der Fluoreszenzdetektor weitere optische Elemente wie Linsen 17, 18 und/oder Spiegel 19 umfassen, um elektromagnetische Strahlung zu manipulieren, und insbesondere elektromagnetische Strahlung wie die Anregungsstrahlung oder zumindest einen Anteil der Emission zu fokussieren und zu leiten.
  • In Bezug auf 2 wird ein typisches Messverfahren für einen Fluoreszenzdetektor erörtert. 2 zeigt die Absorption (dicke durchgezogene Linie) und Fluoreszenz (kurze gestrichelte Linie) von Anthracen als Beispiel für eine Substanz, die unter Verwendung eines Fluoreszenzdetektors 1 detektiert werden kann. Die (theoretisch mögliche) Absorption reicht von unter 300 nm bis etwa 390 nm, während die (theoretisch mögliche) Fluoreszenz von 370 nm bis etwa 460 nm reicht. Sowohl das (theoretische) Absorptionsspektrum als auch das Fluoreszenzspektrum umfassen jeweils eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima. Es ist offensichtlich, dass die Wahl der Parameter (d. h. Strahlung, mit der die Wellenlänge zur Anregung und Detektion verwendet wird) im Allgemeinen einen signifikanten Einfluss auf die Empfindlichkeit der Messung haben kann.
  • Wenn beispielsweise die Anregungsstrahlung, auch als Anregung bezeichnet, bei einer Wellenlänge von etwa 340 nm (lange gestrichelte Linie) und mit einer Bandbreite von etwa 20 nm (FWHM) bereitgestellt wird und die Emission bei 425 nm (dünne durchgezogene Linie) gemessen wird, auch bei einer Bandbreite von etwa 20 nm (FWHM), können die Messergebnisse aufgrund nicht optimaler Auswahl von Parametern begrenzt sein.
  • Erstens wird in dem Beispiel die Emission nicht bei der optimalen Wellenlänge (oder Frequenz) gemessen, da die Fluoreszenzintensität um 400 nm signifikant höher ist; ähnlich hat die Anregungsstrahlung eine nicht-optimale Wellenlänge, da die Absorption um 355 nm am höchsten ist. Ferner sind die Bandbreiten sowohl der Anregungsstrahlung als auch der gemessenen Emission nicht optimal, d. h. zu klein. Somit werden in diesem Beispiel weder die volle Anregungseffizienz noch die volle Fluoreszenzintensität verwendet, Insbesondere könnte die Anregungseffizienz um mindestens den Faktor 3 oder mehr höher sein und für die gemessene Emission könnte mindestens der Faktor 4 möglich sein. Somit können die in diesem Beispiel gewählten Parameter für eine Spurenanalyse schlecht gewählt sein und die Empfindlichkeit könnte um mindestens eine Größenordnung größer sein, d. h. um einen Faktor von mindestens 10.
  • Typischerweise sind jedoch die Absorptions- und Fluoreszenzspektren einer zu untersuchenden Probe möglicherweise nicht bekannt, so dass zuerst sowohl die Wellenlänge der detektierten Emission als auch die Wellenlänge der Anregungsstrahlung abgetastet werden muss, um die erforderlichen Informationen zur Optimierung dieser Parameter zu erhalten. So kann beispielsweise die Wellenlänge der Anregungsstrahlung festgelegt werden und die Emissionswellenlänge, d. h. die Wellenlänge, bei der die Emission gemessen wird, kann periodisch und kontinuierlich im Lauf der Zeit abgestimmt werden. Ferner kann die Abstimmung der Wellenlänge auf Zeitskalen des Probenaustauschs in einer Durchflusszelle durchgeführt werden. Somit kann ein zeitabhängiges Fluoreszenzspektrum erhalten werden, womit das Bestimmen der optimalen Emissionswellenlänge ermöglicht werden kann. Anschließend kann die Emissionswellenlänge auf das Optimum festgelegt und die Wellenlänge der Anregungsstrahlung entsprechend abgestimmt werden. Auf diese Weise kann für jede Probenkomponente der optimale Wert für die Anregungsstrahlung bestimmt werden. Dies ist jedoch typischerweise ein zeitaufwändiger Prozess und die Abtastgeschwindigkeiten sind typischerweise begrenzt, was problematisch sein kann, da sich die Probe typischerweise nur kurz in der Messzelle befindet, wenn ein Chromatogramm erstellt wird.
  • Ferner ist bei den meisten Fluoreszenzdetektoren die Bandbreite der Anregungsstrahlung und/oder der gemessenen Emission möglicherweise nicht abstimmbar, z. B. auswählbar. Daher kann ein solcher Parameter typischerweise nicht optimiert werden.
  • Wenn ein Fluoreszenzdetektor betrieben wird, ohne die Wellenlängen abzutasten, kann er die Substanz möglicherweise nicht identifizieren, da viele Substanzen bei einem bestimmten Parametersatz von Wellenlänge und Bandbreite Fluoreszenz bereitstellen.
  • Darüber hinaus werden bestimmte Substanzen in einer Probe möglicherweise überhaupt nicht detektiert, da sie unter Umständen eine Anregungsstrahlung in einem Bereich außerhalb des gewählten Parametersatzes erfordern, beispielsweise bei niedrigeren Wellenlängen, z. B. bei Verwendung von LEDs als Lichtquelle. Somit können Substanzen, die ein Absorptionsspektrum außerhalb der bereitgestellten Anregungsstrahlung umfassen, unter Umständen keine Strahlung absorbieren und folglich „dunkel“ bleiben, d. h. nicht fluoreszieren. Solche Substanzen würden dann nicht detektiert.
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung versuchen, zumindest einige der vorstehend erörterten Mängel und Nachteile zu überwinden oder zumindest abzuschwächen.
  • Vereinfacht ausgedrückt besteht eine Idee von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darin, eine Anregungsstrahlung zu verwenden, die eine Mehrzahl von Anregungswellenlängen umfasst, und die Emission gleichzeitig bei einer Mehrzahl von Emissionswellenlängen weiter zu detektieren, wobei die Anregungswellenlängen sich von den Emissionswellenlängen unterscheiden.
  • Diese Idee wird unter Bezugnahme auf die 3A, 3B und 3C weiter erörtert. In 3A ist eine beispielhafte Fluoreszenzmessanordnung 2 dargestellt, wobei die Fluoreszenzmessanordnung im Allgemeinen eine Messzelle 23, eine Anregungsstrahlungsanordnung 20 und einen Detektor 24 umfasst. Die Fluoreszenzmessanordnung 2 kann auch einfach als Fluoreszenzdetektor 2 bezeichnet werden.
  • Der Fluoreszenzdetektor 2 kann beispielsweise eine Breitbandlichtquelle 21 umfassen, die dazu konfiguriert ist, elektromagnetische Strahlung bereitzustellen, die ein breites Spektrum umfasst, z. B. eine Weißlichtquelle 21. Die Emission der Weißlichtquelle 21 kann durch ein Spektralfilter 22, d. h. ein Anregungsfilter 22A, geleitet werden, um ein Spektrum bereitzustellen, das eine Mehrzahl von Anregungswellenlängen umfasst. Ein solches Spektralfilter 22 kann beispielsweise ein Interferenzfilter sein. Das heißt, die Anregungsstrahlungsanordnung 20 kann eine Lichtquelle 21 und ein Anregungsfilter 22A umfassen.
  • 3B zeigt schematisch ein beispielhaftes wellenlängenabhängiges Transmissionsprofil eines Spektralfilters 22 (durchgezogene Kurve), das Transmissionsspitzen mit einer maximalen Transmission von 80 % umfasst, die gleichmäßig mit einem „Abstand“ (d. h. einer Wellenlängendifferenz) von 30 nm beabstandet sind. Die Transmissionsspitzen können eine Bandbreite von ungefähr 10 nm umfassen. Weiterhin kann die wellenlängenabhängige Transmission weniger als 1 %, vorzugsweise weniger als 0,1 %, bevorzugter weniger als 0,01 % für Wellenlängen außerhalb der Transmissionsspitzen betragen.
  • Somit kann durch Leiten der elektromagnetischen Strahlung einer Breitbandlichtquelle 21 durch ein Anregungsfilter 22A eine Anregungsstrahlung erhalten werden, die ein Spektrum mit einer Mehrzahl von Anregungswellenlängen umfasst. Mit anderen Worten kann das Anregungsstrahlungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfassen. Die lokalen Maxima können jeweils einer Wellenlänge und einem Peak von endlicher Bandbreite zugeordnet sein. Beispielsweise kann die Anregungsstrahlung eine kammartige Struktur aufweisen, z. B. gleichmäßig beabstandete Peaks über einen bestimmten Spektralbereich.
  • Die Anregungsstrahlung kann anschließend zu einer Messzelle 23 (auch als Durchflusszelle 23 bezeichnet) geleitet werden, die einen Anteil des Probenfluids umfassen kann. Typischerweise kann das Probenfluid der Anregungsstrahlung ausgesetzt sein, während es durch die Messzelle 23 geleitet wird. Typischerweise kann die Probe ohne eine Vorzugsrichtung emittieren, d. h. ungefähr gleichmäßig in alle Richtungen. Mindestens ein Anteil der Probenemission kann gesammelt und/oder detektiert werden. Im Allgemeinen kann die Emission in einer Richtung gesammelt und/oder detektiert werden, die sich von der Richtung unterscheidet, in der die Anregungsstrahlung der Probe zugeführt wird. Dies kann vorteilhafterweise die Menge an gestreuter Anregungsstrahlung in dem gesammelten und/oder detektierten Anteil der Emission verringern.
  • Ferner kann ein zweites Spektralfilter 22 verwendet werden, um den mindestens einen Anteil der Emission der Probe zu filtern, d. h. ein Emissionsfilter 22B. Das Emissionsfilter 22B kann in ähnlicher Weise ein Transmissionsprofil umfassen, das eine Mehrzahl von Transmissionsspitzen umfasst, die gleichmäßig beabstandet und um etwa 30 nm voneinander entfernt sein können. Das heißt, auch das Transmissionsprofil kann beispielsweise einer kammartigen Struktur ähnlich sein. Die Transmissionsspitzen des Emissionsfilters 22B können jedoch relativ zu den Transmissionsspitzen des Anregungsfilters 22A verschoben sein, so dass die Transmission des Emissionsfilters 22B am höchsten ist, wenn die Transmission des Anregungsfilters 22A am niedrigsten ist und umgekehrt. Ein entsprechendes Transmissionsprofil ist in 3C (gepunktete Linie) im Vergleich zu der durchgezogenen Linie des Transmissionsprofils des Anregungsfilters 22A dargestellt.
  • Nicht alle Transmissionsspitzen umfassen notwendigerweise die gleiche maximale Transmission und/oder Bandbreite. Beispielsweise kann das Emissionsfilter 22A einen breiten Peak (oder sogar einen Bandpass) für Wellenlängen oberhalb der höchsten Wellenlängen umfassen, die von dem Anregungsfilter 22A bereitgestellt werden, und das Anregungsfilter 22A kann in ähnlicher Weise einen breiten Peak (oder Bandpass) für Wellenlängen unterhalb der niedrigsten Transmissionsspitze des Emissionsfilters 22B umfassen. Somit kann das Emissionsfilter 22A zu dem Anregungsfilter 22B komplementär sein. Mit anderen Worten kann es Wellenlängen unterdrücken, die von dem Anregungsfilter 22A durchgelassen werden, und Wellenlängen durchlassen, die von dem Emissionsfilter 22A unterdrückt werden.
  • Die Transmission an den lokalen Minima kann als Unterdrückung ε (als gestrichelte Linie angegeben) bezeichnet werden und kann kleiner als 1 %, vorzugsweise kleiner als 0,1 %, bevorzugter kleiner als 0,01 % sein.
  • Beim Durchlaufen des Emissionsfilters 22B kann das verbleibende Licht des mindestens einen Anteils der Emission der Probe in einem geeigneten Lichtdetektor 24, beispielsweise einer Avalanche-Fotodiode (APD) 24 oder einem Fotovervielfacher (PMT) 24, detektiert werden.
  • Es wird angemerkt, dass die Fluoreszenzmessanordnung 2 eine Lichtquelle 21 umfassen kann, die bereits ein strukturiertes Spektrum umfasst. Das heißt, das Spektrum der Lichtquelle 21 kann eine Mehrzahl von (idealerweise vereinzelten) Peaks bei verschiedenen Wellenlängen umfassen. Mit anderen Worten kann die Lichtquelle 21 eine Anregungsstrahlung bereitstellen, die eine Mehrzahl von lokalen Maxima und Minima umfasst, wobei die lokalen Maxima einem Peak endlicher Bandbreite zugeordnet werden können, und wobei die Peaks verschiedener lokaler Maxima z. B. durch mindestens einige wenige nm getrennt sind. Das heißt, die Emission in Bereichen zwischen zwei Peaks kann signifikant niedriger sein als bei den Peaks, z. B. um einen Faktor 10, vorzugsweise einen Faktor 100, bevorzugter einen Faktor 1000. In solchen Fällen benötigt der Fluoreszenzdetektor 2 unter Umständen kein Anregungsfilter 22A, da die Lichtquelle 21 selbst möglicherweise bereits die Anregungsstrahlung bereitstellt. Vorzugsweise können die Peaks benachbarter lokaler Maxima der Anregungsstrahlung ausreichend getrennt sein, so dass eine Transmissionsspitze des Emissionsfilters 22B dazwischen passen kann. Eine solche Lichtquelle kann auch eine Kombination einer Mehrzahl von Lichtquellen sein, die zu einem einzigen Strahl kombiniert sind, wobei beispielsweise jede Lichtquelle Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen bereitstellen kann. Somit kann in solchen Ausführungsformen die Anregungsstrahlungsanordnung 20 nur eine Lichtquelle 21 oder eine Mehrzahl von Lichtquellen und nicht notwendigerweise auch ein Anregungsfilter 22A umfassen. In einer Ausführungsform, die eine Mehrzahl von Lichtquellen umfasst, kann die Anregungsstrahlungsanordnung 20 in einigen Ausführungsformen auch eine Mehrzahl von Anregungsfiltern 22A umfassen.
  • Es versteht sich, dass die beschriebenen Spektralfilter 22A, 22B lediglich als Beispiel dienen und dass das Transmissionsprofil stark variieren kann. Beispielsweise sind unter Umständen die Transmissionsspitzen nicht gleichmäßig beabstandet, können variable Bandbreiten umfassen und/oder unterschiedliche maximale Transmissionen. Ferner sind das Anregungsfilter 22A und das Emissionsfilter 22B möglicherweise nicht immer streng komplementär und variieren beispielsweise hinsichtlich der Anzahl der Transmissionsspitzen.
  • Ein solcher Ansatz kann mehrere Vorteile aufweisen: Erstens wird die von der Probe gestreute Anregungsstrahlung vorteilhafterweise durch das Emissionsfilter 22B stark unterdrückt. Wenn die Probe fluoreszierende Moleküle umfasst, kann die Anregungsstrahlung im Allgemeinen eine Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums von Probenmolekülen umfassen, vorausgesetzt, die Anregungs-Peaks sind ausreichend nahe beieinander angeordnet. Mit anderen Worten umfasst die Anregungsstrahlung üblicherweise eine Wellenlänge, die von den Probenmolekülen absorbiert werden kann. In ähnlicher Weise kann, wenn die Probenmoleküle fluoreszieren, typischerweise zumindest ein Anteil der Fluoreszenz detektiert werden, vorausgesetzt, die Transmissionsspitzen des Emissionsfilters 22B sind ausreichend nahe beieinander angeordnet. Somit kann die Verwendung einer Anregungsstrahlung, die eine Mehrzahl von Wellenlängen umfasst, und das Detektieren der Emission bei einer Mehrzahl von Wellenlängen, die zu den Wellenlängen der Anregungsstrahlung komplementär sind, vorteilhafterweise ein Verfahren zum Messen der Fluoreszenz einer Probe bereitstellen, ohne dass die Anregungs- und Emissions-Wellenlängen abgetastet werden müssen. Ein solches Messverfahren kann besonders vorteilhaft für einen HPLC-Detektor sein, bei dem eine Probe typischerweise nur für einen kurzen, begrenzten Zeitraum in der Messzelle 23 vorhanden sein kann. Darüber hinaus kann ein solches Messverfahren vorteilhafterweise das Entdecken und/oder Identifizieren unerwarteter Substanzen, z. B. Verunreinigungen, ermöglichen, die in auf dem Fachgebiet bekannten Standardfluoreszenzdetektoren beispielsweise aufgrund mangelnder Übereinstimmung der gewählten Anregungs- und/oder Emissionswellenlängen unentdeckt bleiben können. Das Detektieren solcher unerwarteter Substanzen kann insbesondere für HPLC-Detektoren äußerst wünschenswert sein.
  • Mit anderen Worten, anstatt die Probe mit nur einer Wellenlänge anzuregen, kann eine große Anzahl von Anregungswellenlängen aus Weißlicht (z. B. mittels eines Interferenzfilters) generiert werden, um die Probe zu beleuchten. Mit einem zweiten komplementären Filter nach der Probe kann das direkt in der Probe gestreute Licht sehr stark unterdrückt werden. Es versteht sich, dass die allgemeine Konfiguration, wie sie in 1 dargestellt ist, weiterhin gelten kann, z. B. hinsichtlich der Ausrichtung der Durchflusszelle zum Reduzieren von gestreuter Anregungsstrahlung in dem detektierten Emissionsspektrum. Befinden sich nun fluoreszierende Moleküle in der Probe, können immer die richtigen Wellenlängen zur Anregung verwendet werden (für jeden Molekültyp) und Licht kann für jede Fluoreszenzwellenlänge am Ausgang des Filters ankommen, was beispielsweise mit einem Breitbanddetektor (z. B. PMT) detektiert wird. Ein solcher Fluoreszenzdetektor kann daher ein „universeller Fluoreszenzdetektor“ sein, der eine große Fraktion fluoreszierender Substanzen, (z. B. alle), unabhängig von den molekularen Eigenschaften, d. h. den Absorptions- und Emissionsspektren, detektieren kann.
  • Ein möglicher Vorteil der Verwendung einer Anregungsstrahlung mit einer Mehrzahl von Peaks, die um verschiedene Wellenlängen zentriert sind, und eines komplementären Emissionsfilters 22B wird unter Bezugnahme auf 4 erörtert. Wiederum zeigt 4 die Absorptionsspektren (dicke durchgezogene Kurve) und Fluoreszenzspektren (kurze gestrichelte Kurve) von Anthracen. Bei dieser beispielhaften Messung umfasst die Anregungsstrahlung (dünne durchgezogene Kurve) jedoch eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima. Darüber hinaus ist jedes lokale Maximum einer anderen Wellenlänge und einem Peak zugeordnet, der eine endliche Bandbreite umfasst. Mit anderen Worten umfasst die Anregungsstrahlung ein Spektrum, das eine Mehrzahl von Peaks umfasst, die jeweils einer anderen Wellenlänge zugeordnet sind und eine endliche Bandbreite umfassen.
  • Ferner zeigt 4 die gemessene Emission (lange gestrichelte Kurve), die wie vorstehend beschrieben gefiltert wird. Das heißt, die Emission wird hauptsächlich (vorzugsweise nur) bei Wellenlängen detektiert, die sich von den Wellenlängen unterscheiden, bei denen die Anregungsstrahlung lokale Maxima umfasst, d. h. innerhalb der durch die verwendete Lichtquelle und/oder die verwendeten Spektralfilter auferlegten Grenzen. Das heißt, im Allgemeinen wird die Emission um Wellenlängen herum detektiert, bei denen die Anregungsstrahlung ein lokales Minimum umfasst. Mit anderen Worten kann das Emissionsfilter 22B so gewählt werden, dass die wellenlängenabhängige Transmission zum Spektrum der Anregungsstrahlung komplementär ist.
  • Insbesondere können in dem in 4 dargestellten Beispiel die ersten 4 Peaks der Anregungsstrahlung im Wellenlängenbereich von 300 nm bis 380 nm zur Anregung des Moleküls beitragen, d. h. sie können zumindest teilweise vom Molekül absorbiert werden. Ferner kann die Emission durch das Emissionsfilter für 6 Durchlassbänder (Transmissionsspitzen) des Emissionsfilters 22B durchgelassen werden, und folglich kann emittiertes Licht zwischen 360 nm und 470 nm zur Detektion beitragen. Im Vergleich zu der in 3 dargestellten Situation kann somit die Anregungsstrahlung besser genutzt werden und es kann auch eine große Fraktion der Fluoreszenz detektiert werden.
  • Daher regt eine Fluoreszenzmessanordnung 2, die eine solche Anregungsstrahlung und ein Emissionsfilter 22B verwendet, in gewisser Weise gleichzeitig den gesamten Wellenlängenbereich an und misst ihn auch. Das heißt, Fluoreszenzemissionsspektren können normalerweise 40 bis 100 nm breit sein, so dass bei einem Abstand der Kammspitzen von beispielsweise 20 nm oder weniger immer Licht in mindestens einem der Peaks („Zähne“) vorhanden sein kann. Im Allgemeinen kann Licht in mehreren Peaks durchgelassen werden, solange der Abstand der lokalen Maxima bei der Anregung und der detektierten Emission ausreichend klein ist, so dass weder Anregungs- noch Emissionsspektrum vollständig in einen Spalt des jeweiligen Kamms fallen. Typischerweise kann der Kamm sehr eng gewählt werden. Gemäß einigen Ausführungsformen stehen lokale Maxima in der Anregungsstrahlung und der detektierten Emission „auf Spalt“ und eine Unterdrückung ε (siehe 3B und 3C) ist ausreichend gut, um den Streulichtpegel niedrig zu halten.
  • Aufgrund der kammartigen Struktur der Anregungsstrahlung und des detektierten Emissionsspektrums liegt mindestens ein Anteil der Anregungsstrahlung typischerweise innerhalb des Absorptionsspektrums des Anthracenmoleküls (und allgemeiner der Probenmoleküle), und in ähnlicher Weise kann ein Anteil des Fluoreszenzspektrums des Anthracenmoleküls (und allgemeiner der Probenmoleküle) sich mit dem detektierten Emissionsspektrum überlappen. Vorausgesetzt, die einzelnen Peaks der Anregungsstrahlung und die Transmission des Emissionsfilters 22B können eine kleine Bandbreite umfassen und in Bezug auf die Bandbreite der Absorption und Fluoreszenz der Probe eng beabstandet sein, so kann eine relativ hohe Empfindlichkeit für eine Mehrzahl von Probenmolekülen ohne die Notwendigkeit einer sorgfältigen, individuellen Kalibrierung der Wellenlängen der Anregung und der detektierten Emission erreicht werden.
  • Somit kann theoretisch ein Fluoreszenzdetektor, der Anregungsstrahlung verwendet, die ein kammartiges Spektrum umfasst, d. h. ein Spektrum, das eine Mehrzahl von schmalen, eng beabstandeten Peaks umfasst, und ein Emissionsfilter 22B, das ein Transmissionsprofil bereitstellt, das zu dem Spektrum der Anregungsstrahlung komplementär ist, Mittel bereitstellen, um alle fluoreszierenden Substanzen unabhängig von den molekularen Eigenschaften des Absorptions- und Emissions- (d. h. Fluoreszenz-)Spektrums zu detektieren. Mit anderen Worten kann ein solcher Fluoreszenzdetektor vorteilhafterweise Proben ohne vorherige Auswahl von Wellenlängen für die Anregungsstrahlung und/oder detektierte Emission detektieren, was vorteilhafterweise die Wahrscheinlichkeit des Fehlens einer Substanz in der Probe signifikant verringern (oder sogar verhindern) kann. Ein solcher Fluoreszenzdetektor 2 kann als universeller Fluoreszenzdetektor 2 bezeichnet werden.
    Insbesondere umfassen Absorptionsspektren und Fluoreszenzspektren relevanter fluoreszierender Moleküle in Lösungen im Allgemeinen unter Umständen keine schmalbandigen Merkmale, d. h. Maxima in Fluoreszenz- und Absorptionsspektren können immer mindestens 20 nm, meist mindestens 40 nm breit sein. Durch Auswahl eines Anregungsspektrums (und eines komplementären Emissionsfilters) mit einer kammartigen Struktur mit einem ausreichend engen Abstand, z. B. 10 nm, kann es ermöglicht werden, alle relevanten Moleküle zu detektieren. Beispielsweise kann man mit einem ausreichend kleinen Abstand (z. B. 10 nm) und mit Anregungszähnen bei 220-550 nm und Emissionszähnen von 225-545 nm und einem Emissionsband von 555-800 nm in der Lage sein, alle HPLC-relevanten Moleküle zu messen. Somit kann ein solcher universeller Fluoreszenzdetektor 2 das Messen von Spektren unabhängig von einer Wahl der Anregungs- und/oder Emissionswellenlänge ermöglichen und somit zusammen mit der Retentionszeit im Vergleich zu Kontrollsubstanzen und möglicherweise weiteren Informationen über potentielle Substanzen in der Probe das Identifizieren von Bestandteilen der Probe ermöglichen.
  • Im Folgenden werden vorteilhafte Ausführungsformen für das jeweilige Anregungsstrahlungsspektrum und die Emission formeller erörtert. Wie zuvor erwähnt, kann die Anregungsstrahlung I eine wellenlängenabhängige Intensität I=I(λ) umfassen. Mit anderen Worten kann die Anregungsstrahlung spektral moduliert werden, was auch als ein strukturiertes Spektrum umfassend bezeichnet werden kann. Die Modulation kann beispielsweise mit einem entsprechenden Anregungsfilter 22A oder beispielsweise durch Verwendung einer Lichtquelle 21 erreicht werden, die bereits eine spektral modulierte Anregungsstrahlung I(λ) bereitstellt. Die Emission kann unter Verwendung eines Emissionsfilters F 22B gefiltert werden, das ein wellenlängenabhängiges Transmissionsprofil F=F(λ) umfassen kann, wobei 0≤F(λ)≤1 für alle λ ist. Typischerweise kann F(λ) komplementär zu I(λ) sein. Es versteht sich, dass die spektrale Signatur der Anregungsstrahlung und/oder das Transmissionsprofil des Emissionsfilters 22B nicht auf eine reguläre kammartige Struktur beschränkt ist, sondern im Prinzip ein beliebiges Muster umfassen kann.
  • Es gibt drei Parameter, die zur Verbesserung der Leistung verwendet werden können.
  • Erstens kann die Menge an Streulicht von der Anregungsstrahlung im Emissionsspektrum minimiert werden. Das heißt, das Filter F(λ) 22B kann so ausgelegt sein, dass es die Wellenlängen der Emissionsstrahlung herausfiltert. Mathematisch kann diese Bedingung ausgedrückt werden, indem I(λ) und F(λ) so gewählt werden, dass sie das folgende Integral minimieren: ∫ λ m i n λ m a x F ( λ ) ∗ I ( λ ) d λ ,
    Figure DE102020131374B4_0001
    wobei das Intervall [λmin,λmax] dem relevanten Teil des Spektrums entspricht,das heißt, dem Teil des Spektrums, für den der Fluoreszenzdetektor 2 verwendet werden kann.
  • Weiterhin kann das Emissionsfilter F(A) 22B so viel Emissionslicht wie möglich durchlassen. Mit anderen Worten können die Bereiche des Spektrums, in denen Emissionslicht unnötig blockiert wird, d. h. Bereiche, in denen keine Anregungsstrahlung vorhanden ist, auf ein Minimum beschränkt werden. Wiederum kann diese Bedingung mathematisch formuliert werden und entspricht der Wahl von I(λ) und F(λ), so dass sie das folgende Integral maximieren: ∫ λ m i n λ m a x [ 1 − F ( λ ) ] ∗ I ( λ ) d λ .
    Figure DE102020131374B4_0002
  • Weiterhin kann die Überlappung der Anregungsstrahlung und der gefilterten Emission mit den Spektren der erwarteten Proben maximiert werden. Für ein Probenfluoreszenzspektrum kann die Wahrscheinlichkeit, Licht bei einer Anregungswellenlänge von λex zu absorbieren und anschließend Fluoreszenz bei einer Emissionswellenlänge λem zu emittieren, ausgedrückt werden als Pr(λex, λem). Somit kann der dritte Parameter mathematisch so formuliert werden, dass das folgende Integral maximiert wird: ∫ λ m i n λ m a x ∫ λ m i n λ m a x F ( λ e m ) ∗ P r ( λ e x , λ e m ) ∗ I ( λ e x ) d λ e x d λ e m .
    Figure DE102020131374B4_0003
  • Für eine gute Leistung können I(A) und F(A) so gewählt werden, dass alle vorstehenden Bedingungen optimiert sind. Es versteht sich, dass es einen Kompromiss geben kann. Das heißt, es kann technische Einschränkungen für die Anregungsstrahlung und das Emissionsfilter geben. Beispielsweise kann das Transmissionsfilter eine begrenzte maximale Transmission umfassen und auch die Bandbreite von Merkmalen in dem Emissionsfilter 22B oder die Anregungsstrahlung kann begrenzt sein; z. B. sind Transmissionsspitzen unter Umständen nicht willkürlich eng. Die Bewertung der vorstehenden Bedingungen kann jedoch ein Maß zum Identifizieren einer guten Wahl für die Kombination des Emissionsfilters 22B und des Anregungsstrahlungsspektrums bereitstellen, das beispielsweise auch mit Hilfe eines Spektralfilters 22 abgeleitet werden kann.
  • Im Folgenden werden verschiedene Implementierungen der Spektralfilter 22 (22A, 22B) erörtert. Es versteht sich, dass es zwar vorteilhaft sein kann, ähnliche Spektralfilter wie das Anregungsfilter 22A und das Emissionsfilter 22B zu verwenden, das Anregungsfilter 22A kann jedoch auch ein allgemein anderes Design als das Emissionsfilter 22B aufweisen.
  • Eine erste Möglichkeit, ein geeignet strukturiertes Spektrum aus einer Breitbandlichtquelle 21 bereitzustellen und/oder das Emissionsspektrum zu filtern, können optische Filter und insbesondere optische Interferenzfilter sein, die im Allgemeinen ein hohes Unterdrückungsverhältnis umfassen. Diese Filter umfassen typischerweise eine Mehrzahl von Schichten aus unterschiedlichen Materialien und basieren auf Interferenzeffekten zwischen einfallenden und reflektierten Wellen an deren Grenzen. Beispielsweise können solche Filter für Wellenlängen über 250 nm verwendet werden. Die Verwendung solcher Filter für solche Wellenlängen kann als Emissionsfilter 22B besonders geeignet sein, da Proben typischerweise bei Wellenlängen über 250 nm fluoreszieren. Filter, die auf solche Wellenlängen beschränkt sind, können jedoch in einigen Fällen die Verwendung als Anregungsfilter 22A einschränken, da einige Proben bei niedrigeren Wellenlängen absorbieren können. Bei Verwendung von Interferenzfiltern kann das einfallende Licht (d. h. elektromagnetische Strahlung) unter Verwendung von optischen Standardelementen kollimiert werden, um steile Kanten im Spektrum des durchgelassenen Lichts zu erzielen.
  • Eine weitere Option kann darin bestehen, einen Fabry-Perot-Etalon 221 zu verwenden, wie in 5 dargestellt (auch einfach als Etalon 221 bezeichnet), der als eine spezifische Form eines Interferenzfilters betrachtet werden kann. Ein solcher Etalon 221 umfasst typischerweise einen Hohlraum, der durch zwei teilweise reflektierende Oberflächen gebildet wird, wobei das Reflexionsvermögen der Oberflächen typischerweise sehr hoch ist, beispielsweise höher als 90 % oder sogar höher als 95 %, z. B. 99 %. Das in den Hohlraum eintretende Licht stört das bereits im Hohlraum vorhandene Licht, was zu konstruktiven Interferenzen führen kann, wenn das Licht im Hohlraum und das in den Hohlraum eintretende Licht phasengleich sind. Dies kann zu einer sogenannten resonanten Verstärkung des Lichts innerhalb des Hohlraums führen (auch als Resonator bezeichnet). Die Phase des Lichts innerhalb des Hohlraums nach einem vollständigen Roundtrip hängt von der Frequenz des Lichts sowie dem Abstand zwischen den beiden reflektierenden Oberflächen ab, d. h. der Länge des Hohlraums und der Lichtgeschwindigkeit innerhalb des Resonators. Somit kann die Resonanzbedingung für eine Mehrzahl von gleichmäßig beabstandeten Frequenzen realisiert werden, während die dazwischen liegenden Frequenzen keiner Resonanzverstärkung unterliegen. Der Abstand zwischen zwei benachbarten Frequenzen, für den die Resonanzbedingung erfüllt ist, wird als freier Spektralbereich bezeichnet.
  • Das nicht perfekte Reflexionsvermögen in Kombination mit der Resonanzverstärkung führt zu einem Spektrum gleichmäßig verteilter Peaks, die jeweils die gleiche Linienbreite umfassen können, was typischerweise vom Reflexionsvermögen der Oberflächen und der Länge des Hohlraums sowie der Geschwindigkeit des Lichts innerhalb des Resonators abhängig ist. Die beispielhafte Transmission eines Etalons 221 ist im rechten Anteil von 5 schematisch dargestellt und ist einer kammartigen Struktur ähnlich. Somit kann ein Etalon 221 ein Spektralfilter 22 bereitstellen, um beispielsweise ein Anregungsstrahlungsspektrum mit gleichmäßig beabstandeten Merkmalen gleicher Breite im Frequenzraum zu generieren. Mit anderen Worten kann ein Fabry-Perot-Etalon automatisch eine kammartige Struktur generieren und beispielsweise durch Ändern des Abstands (d. h. der Länge des Hohlraums) und/oder des Einfallswinkels zwei Filter erhalten, wobei die einzelnen Maxima („Finger“) „auf Spalt“ stehen, d. h. sich nicht überlappen. Ein solches Spektrum kann natürlich in eine Wellenlänge transformiert werden, wobei der freie Spektralbereich und die Linienbreite möglicherweise nicht mehr konstant sind, sondern von der Wellenlänge abhängig sind. Diese Abweichungen sind jedoch unter Umständen im Allgemeinen kein Problem für die Verwendung eines Etalons als Spektralfilter 22, z. B. Anregungsfilter 22A und/oder Emissionsfilter 22B, da äquidistante Merkmale keine Anforderung, sondern lediglich ein optionales Merkmal sind.
  • Da der freie Spektralbereich und die Linienbreite von der Länge des Hohlraums abhängig sind, können diese Parameter durch Ändern des Winkels, unter dem das Licht auf den Etalon 221 fällt, abgestimmt werden, was wiederum die Länge, die das Licht zwischen den beiden reflektierenden Oberflächen passieren wird, effektiv verändert. Somit kann ein einziger Etalon verwendet werden, um verschiedene kammartige Spektren durch sorgfältiges Einstellen des Einfallswinkels zu generieren.
  • Die stark reflektierenden Oberflächen können beispielsweise unter Verwendung hochreflektierender Beschichtungen realisiert werden, z. B. dünne Metallbeschichtungen, die für Wellenlängen von 200 nm und höher verfügbar sind (z. B. Graufilter für UV-Licht). Somit kann mittels eines Fabry-Perot-Etalons ein kammartiges Spektrum realisiert werden, das sehr eng beabstandete Peaks umfasst, z. B. mit einem Abstand von 1 nm oder weniger. Daher können diese Filter als Emissionsfilter 22B und/oder Anregungsfilter 22A verwendet werden, d. h. um Anregungsstrahlung mit einem strukturierten Spektrum von einer Breitbandlichtquelle bereitzustellen. Wiederum kann das Licht vor dem Filter kollimiert und möglicherweise nach dem Durchlaufen des Filters 22 fokussiert werden.
  • Ein weiteres Verfahren zum Bereitstellen eines Spektrums unterschiedlicher gewünschter Wellenlänge wird unter Bezugnahme auf 6 erörtert. In einigen Ausführungsformen kann ein akustooptischer Modulator (AOM) 222 dazu verwendet werden, Licht vorgegebener Wellenlängen aus einem kollimierten Lichtstrahl einer Breitbandlichtquelle 21 zu beugen. Das Prinzip ist in 6 dargestellt: Das Licht einer Breitbandlichtquelle 21 kann beispielsweise unter Verwendung einer Linse kollimiert und zu einem AOM 222 geleitet werden, wobei eine oder mehrere Radiofrequenzen angelegt werden, um Schallwellen zu generieren, was dazu führt, dass Licht bei vorgegebenen Wellenlängen (λ1 ,..., λn) gebeugt wird. Unerwünschte Strahlung wird unter Umständen nicht gebeugt werden und wird daher unter Umständen beispielsweise nicht für die weitere Verwendung in Betracht gezogen, d. h. sie kann nutzlos verlaufen. Mit anderen Worten kann ein AOM verwendet werden, um die gewünschte Wellenlänge aus einem kollimierten Strahl einer Breitbandlichtquelle zu beugen, während das nicht gebeugte Licht beispielsweise nutzlos verläuft. In einigen Ausführungsformen kann nicht gebeugtes Licht als Referenzsignal verwendet werden, was es ermöglichen kann, Schwankungen des von der Lichtquelle 21 bereitgestellten Lichts zu kompensieren.
  • Alternativ kann das nicht gebeugte Licht das strukturierte Spektrum bereitstellen. Das heißt, vorausgesetzt, die Beugungseffizienz ist ausreichend hoch, können unerwünschte Frequenzen so gebeugt werden, dass diese Frequenzkomponenten in dem nicht gebeugten Licht stark unterdrückt werden. Eine solche Anordnung kann vorteilhaft sein, da der Beugungswinkel von der Frequenz abhängig ist, so dass das gebeugte Licht in der Frequenz räumlich aufgelöst wird.
  • Somit können unter Verwendung eines AOM 222 die Wellenlängen dynamisch und online unter Verwendung der Hochfrequenz (oder einer Mischung von Hochfrequenzen) ausgewählt werden, die dem AOM 222 zugeführt werden, um Schallwellen zu generieren. Dies kann zur Auswahl einer einzigen Wellenlänge (eine Frequenz am Eingang des AOM 222), zum schnellen Umschalten/Abtasten (durch Anlegen einer sich ändernden Frequenz am Eingang des AOM 222) oder sogar für mehrere Wellenlängen gleichzeitig möglich sein, wenn gleichzeitig mehrere Schallwellen in den Kristall des AOM 222 gesendet werden.
  • Ein Vorteil der Verwendung eines AOM 222 zum Generieren der Anregungsstrahlung oder zum Filtern der Emission wäre, dass der Detektor 2 per Software zwischen „normalem“ und „universellem“ Modus umschaltbar wäre. Das heißt, er wendet entweder unter Umständen keine Filterung unter Verwendung des AOM 222 („normaler“ Modus) an oder er kann die erforderlichen Radiofrequenzen auf das AOM 222 anlegen, so dass es als Spektralfilter („universeller“ Modus) wirkt, wobei komplementäre Radiofrequenzen zum Generieren der Anregungsstrahlung und zum Filtern des Emissionsspektrums verwendet werden können, wenn AOMs als Anregungsfilter 22A und Emissionsfilter 22B verwendet werden.
  • In ähnlicher Weise kann ein elektrooptischer Modulator (EOM) verwendet werden, um einen Frequenzkamm zu generieren, z. B., indem er in einem Hohlraum angeordnet wird.
  • Ein weiterer Ansatz zum Filtern von Licht, d. h. elektromagnetischer Strahlung, kann darin bestehen, ein oder mehrere dispersive Elemente 223 zu verwenden (siehe z. B. 7A). Insbesondere kann das Licht einer Breitbandlichtquelle unter Verwendung von Gittern 223 oder Prismen 223 in ihre Spektralkomponenten aufgeteilt werden, und anschließend können geeignete Komponenten des geteilten Lichts mit einem „Modulator“ 224 ausgewählt werden, wie dies schematisch in 7A dargestellt ist. Ein solcher Modulator 224 kann beispielsweise einfach eine statisch strukturierte Schattenmaske 224 oder ein geeignet strukturierter Spiegel sein, kann aber auch eine aktive Komponente wie ein AOM oder schaltbare mikromechanische Spiegel, die softwaregesteuert sein können, oder eine Flüssigkristallanzeige (LCD) sein. Das heißt, Flüssigkristallzellen in einer LCD sind im Allgemeinen so ausgelegt, dass sie die Hintergrundbeleuchtung der Anzeige selektiv durchlassen oder blockieren, und können daher auf ähnliche Weise verwendet werden, um Licht selektiv zu blockieren oder durchzulassen. Mit anderen Worten kann eine LCD, d. h. eine zweidimensionale Anordnung von Flüssigkristallzellen, eine Schattenmaske bereitstellen, die unter Verwendung elektrischer Signale modifiziert werden kann. Sobald das Licht den Modulator 224 passiert hat und die gewünschten Komponenten ausgewählt wurden, kann der Strahl rekombiniert werden.
  • In der Praxis kann dies beispielsweise unter Verwendung von 4 Gittern 223 oder Prismen 223 erfolgen. Ein Beispiel unter Verwendung von Beugungsgittern 223 ist in 7B gezeigt. Das Licht einer Breitbandlichtquelle 21 kann unter Verwendung einer Linse 26 kollimiert werden, und der kollimierte Strahl kann zu einem ersten Gitter 223-1 geleitet werden, das das einfallende Licht aufgrund der wellenlängenabhängigen Beugung aufteilen kann. Das gebeugte Licht kann zu einem zweiten Gitter 223-2 geleitet werden, das so angeordnet sein kann, dass die einzelnen Spektralkomponenten erneut kollimiert werden. Nun kann ein Modulator 224, z. B. eine Schattenmaske 224, dazu verwendet werden, selektiv Licht verschiedener Wellenlängen zu blockieren und/oder durchzulassen. Anschließend kann das durchgelassene Licht in entgegengesetzter Richtung zu einer identischen Anordnung von zwei Gittern 223-3, 223-4 geleitet werden, um die verschiedenen Wellenlängen zu einem einzigen Strahl zu rekombinieren, der unter Verwendung einer Linse 26 weiter fokussiert werden kann.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Linse 26 so gewählt und/oder ausgerichtet sein, dass das Licht möglicherweise nicht vollständig kollimiert wird, sondern nach dem zweiten Gitter 223-2 leicht auf den Modulator 224 fokussiert wird. Während dies die Leistung der Gitter 223 beeinträchtigen kann, die am besten oder parallelem Licht arbeiten, kann es die Genauigkeit erhöhen, mit der einzelne Wellenlängen vom Modulator 224 selektiv blockiert oder durchgelassen werden können. Somit kann es einen Kompromiss zwischen der Leistung der Gitter 223 und dem Modulator 224 geben, wobei es vorteilhaft sein kann, die Leistung der Gitter geringfügig zu verringern, um die Selektivität des Modulators zu verbessern.
  • Grundsätzlich kann der gleiche Effekt erzielt werden, indem nur 2 Gitter 223 verwendet werden und ein reflektierender Modulator an der Position des Modulators 224 angeordnet wird, der das Licht selektiv zurückreflektiert, z. B. eine Kombination von einem Spiegel und einer Schattenmaske oder einem aktiven Element wie einer Mikrospiegelvorrichtung. Der Spiegel kann so ausgerichtet sein, dass das Licht in einem kleinen Winkel, vorzugsweise außerhalb der Ebene, reflektiert wird, wodurch der ausgehende Lichtstrahl vom einfallenden Licht getrennt werden kann. Das heißt, jedes der beiden Gitter beugt das Licht zweimal: einmal vor und einmal nach der teilweisen Reflexion durch den Spiegel. In ähnlicher Weise kann eine Ausführungsform, die nur ein Gitter 223 verwendet, in Kombination mit einer geeigneten Anordnung von Spiegeln oder anderen reflektierenden Elementen, wie Eckwürfeln, realisiert werden, so dass das Licht durch das einzige Gitter 223 viermal gebeugt werden kann, während nach zwei Reflexionen mindestens ein Anteil des Lichts durch einen Modulator 224, z. B. eine Schattenmaske, blockiert werden kann.
  • Wiederum versteht es sich, dass dasselbe unter Verwendung von Prismen anstelle von Gittern erreicht werden kann. Im Allgemeinen sind solche Anordnungen, wenn auch ohne den Modulator 224, beispielsweise als Impulskompressoren bekannt, um die Dauer ultrakurzer Laserpulse zu verkürzen.
  • Eine weitere Implementierung eines Spektralfilters wird unter Bezugnahme auf 8 erörtert. Diese Ausführungsform eines Spektralfilters kann ein Abbildungsgitter 223 verwenden. Das Licht einer breitbandigen, z. B. Weißlicht-Quelle 21 kann durch ein Abbildungsgitter 223 in seine Spektralkomponenten getrennt werden, wodurch die Spektralkomponenten auf eine Linie abgebildet werden können. Mit anderen Worten kann das Abbildungsgitter 223 im Allgemeinen die gleiche Funktionalität wie die Kombination der Linse 26 und des ersten 223-1 und zweiten Gitters 223-2 in der vorstehend unter Bezugnahme auf 7B erörterten Ausführungsform bereitstellen. Das Abbildungsgitter kann vorzugsweise ein holografisches, aberrationskorrigiertes Flachfeldgitter sein.
  • In der Abbildungsebene des Gitters kann eine Linie von optischen Fasern 225, z. B. Glasfasern, angeordnet sein, um die verschiedenen Spektralkomponenten des Lichts zu sammeln. Das heißt, das Abbildungsgitter kann die Spektralkomponenten auf eine Linie projizieren, und die Glasfasern 225 können auf dieser Linie in der Abbildungsebene platziert werden, um die verschiedenen Spektralkomponenten zu sammeln. Die Glasfasern 225 können dann abwechselnd einem von zwei Ausgängen O1 und O2 zugeordnet werden. Mit anderen Worten werden zwei benachbarte Fasern 225 unterschiedlichen Ausgängen zugeordnet. Somit kann das Licht einer ersten Teilmenge der Fasern 225-1 einem Ausgang O1 zugeordnet sein, und eine zweite Teilmenge der Fasern 255-1 kann einem zweiten Ausgang O2 zugeordnet sein. Daher wird an jedem Ausgang ein kammartiges Spektrum generiert. Somit können die Fasern eine Teilmenge des Spektrums auswählen und daher die Funktionalität eines Modulators 224 bereitstellen. Aufgrund des Designs kann ein solches Filter innerhalb dieser Spezifikation als faserbasiertes Filter 22 bezeichnet werden.
  • Ein solches faserbasiertes Spektralfilter 22 kann zum Generieren der Anregungsstrahlung verwendet werden, wobei beispielsweise der erste Ausgang O1 die Anregungsstrahlung bereitstellt und der andere Ausgang O2 als Referenzmessung verwendet werden kann. In ähnlicher Weise kann ein identisches faserbasiertes Filter 22 auch als Emissionsfilter 22B verwendet werden, wobei mindestens ein Anteil der Emission zum Gitter 223 geleitet wird, und wobei das Licht am zweiten Ausgang O2 in dem Detektor 25 detektiert werden kann und der erste Ausgang O1 gestreute Anregungsstrahlung und möglicherweise auch Fluoreszenz umfassen kann. Auf diese Weise kann jede Anregungsstrahlung im Emissionsfilter 22B stark unterdrückt werden.
  • Um eine gute Filterung durch das Gitter 223 zu erreichen, kann es vorteilhaft sein, wenn das Licht von einer kleinen, idealerweise punktförmigen Lichtquelle 21 stammt. Dies kann erreicht werden, indem entweder direkt eine geeignete Lichtquelle 21 verwendet wird oder beispielsweise Licht verwendet wird, das von einer Faser bereitgestellt wird.
  • Die Verwendung von Stufenindexfasern kann vorteilhaft sein, da sie automatisch einen bestimmten Sicherheitsabstand zwischen den „Zähnen“, d. h. den Peaks der Kämme, herstellen können, da die Fasern eine optisch inaktive Ummantelung aufweisen. Beispielsweise beträgt bei einer 400 µm-Faser der Abstand zwischen den aktiven Kernen zweier benachbarter Fasern mindestens 2*20 µm (Ummantelung) + 2*20 µm (Polyimidbeschichtung) = 80 µm. Dieser Sicherheitsabstand kann vorteilhafterweise ein „Übersprechen“ auch bei typischerweise unvermeidbaren Toleranzen verhindern. Das heißt, er kann verhindern, dass eine Wellenlänge von zwei benachbarten Fasern gesammelt wird.
  • Ein Gitter 223 kann typischerweise Licht in eine Mehrzahl von Größenordnungen beugen, was im Allgemeinen unerwünscht sein kann. Somit kann jedes Gitter 223 im Allgemeinen mit einem geeigneten Filter kombiniert werden, um unerwünschte Beugungsgrößenordnungen des Gitters 223 zu beseitigen. Solche Filter können beispielsweise zusätzliche absorbierende Komponenten, geklebte Komponenten aus verschiedenen Gläsern oder Interferenzschichten sein, die auf zusätzliche Elemente aufgebracht werden können oder beispielsweise im vorstehenden Beispiel direkt auf die Faserenden aufgetragen werden können. Insbesondere können solche Filter höherer Ordnung, beispielsweise Filter 2. Ordnung oder sogar Filter 3. Ordnung, unter Umständen nur auf entsprechenden Fasern selektiv angewendet werden. Das heißt, unterschiedliche Fasern können unterschiedliche Filter verwenden, um die jeweils höheren Ordnungen des Gitters zu blockieren. Beispielsweise kann eine Faser, die zum Sammeln von Licht bei 500 nm bestimmt ist, beispielsweise einen Filter verwenden, der Licht bei 250 nm zurückweist, während eine Faser, die zum Sammeln von Licht bei 600 nm bestimmt ist, einen Filter verwenden kann, um Licht bei 200 nm und 300 nm zu blockieren. Im Allgemeinen kann jeder Filter zwischen dem Gitter und dem jeweiligen Faserkern angeordnet sein. Alternativ kann ein Filter innerhalb der Faser realisiert werden.
  • Im Folgenden werden weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erörtert.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Emission beispielsweise unter Verwendung eines Spektrometers, z. B. eines Dioden-Arrays, detektiert werden, das ein Spektrum aufzeichnen kann. Dies kann es ermöglichen, das gesamte Spektrum aufzuzeichnen und den Filter nur auf die gemessenen Daten anzuwenden, vorausgesetzt, das Spektrometer umfasst einen ausreichend hohen Dynamikbereich, da Streulicht der Anregungsstrahlung zu signifikant höheren Signalen als der Fluoreszenz der Probe führen kann. Mit anderen Worten kann, vorausgesetzt, das Spektrometer umfasst einen ausreichend hohen Dynamikbereich, das Emissionsfilter erst angewendet werden, wenn das Signal detektiert ist. Das heißt, das Filter kann beispielsweise ein digitales Filter oder eine Filterung sein, die durch Analysieren der gemessenen Daten mit Software angewendet wird. Solche Filter können den Vorteil einer sehr hohen Flexibilität bieten und Verluste aufgrund der begrenzten Transmission eines Spektralfilters vor der Detektion reduzieren. Selbst wenn ein Spektrometer in Kombination mit einem Digital- oder Softwarefilter verwendet wird, kann es vorteilhaft sein, ferner ein Emissionsfilter vor dem Spektrometer zu verwenden, um zumindest einen Beitrag der gestreuten Anregungsstrahlung zu dem gemessenen Signal zu verringern. Das Spektrometer, z. B. ein Dioden-Array, kann auch in Kombination mit einem Emissionsfilter wie vorstehend beschrieben und ohne Anlegen einer weiteren Filterung nach der Detektion verwendet werden. In solchen Fällen kann die Auflösung des Dioden-Arrays auf den Abstand der Peaks des Kamms des Filters reduziert werden.
  • Weiterhin kann, wie bezüglich 9, die Lichtquelle 21 eine Mehrzahl von einzelnen Lichtquellen (21-1, 21-2, ..., 21-n), z. B. Laser, LEDs und/oder Spektrallampen umfassen, die eine oder mehrere Wellenlängen abdecken, deren Licht unter Verwendung eines Kombinierers 226 kombiniert werden kann, um die Anregungsstrahlung bereitzustellen, anstatt eine breitbandige Lichtquelle, z. B. eine Weißlichtquelle, zu filtern. Das Licht einzelner Lichtquellen (21-1, 21-2, ..., 21-n) kann beispielsweise unter Verwendung eines dichroitischen Strahlteilers, eines Gitters, einer Linsenanordnung usw. kombiniert werden. Auf diese Weise kann man eine Mehrzahl von Lichtquellen (21-1, 21-2, ..., 21-n) kombinieren, wobei einzelne Lichtquellen beispielsweise Licht mit einer einzigen Wellenlänge (mit einer bestimmten Spektralbreite) oder einer Mehrzahl von unterschiedlichen Wellenlängen (jeweils mit einer bestimmten Spektralbreite) bereitstellen können. Dieses Prinzip ist in 9 dargestellt. Insgesamt kann somit eine geeignet strukturierte Lichtquelle zum Beleuchten der Probe erhalten werden.
  • Weiterhin kann man eine einzige Lichtquelle 21 verwenden, die bereits ein geeignet strukturiertes Spektrum bereitstellt. Das heißt, die Lichtquelle 21 kann bereits ein Spektrum mit einer Mehrzahl von Peaks und Regionen mit signifikant niedrigeren, vorzugsweise vernachlässigbaren Beiträgen bereitstellen. Eine solche Lichtquelle könnte beispielsweise eine gepulste Lichtquelle sein, z. B. ein Kurzpulslaser, der ein Superkontinuum aufweisen kann, das direkt einen Frequenzkamm bereitstellt. Das heißt, die Fourier-Transformation der zeitabhängigen Intensität einer gepulsten Lichtquelle ist ein Frequenzkamm.
  • Alternativ kann eine Spektrallampe, z. B. eine Gasentladungslampe, verwendet werden. Eine solche Lampe kann ein Gas (z. B. Hg) oder ein Gemisch verschiedener Gase umfassen, um mehr Spektrallinien bereitzustellen. Im Allgemeinen kann eine Gasentladungslampe eine Kurzbogenlampe sein, z. B. eine Xenonbogenlampe oder eine Mischgaslampe. Ein Beispiel kann die NOx-Gasentladungslampe sein, z. B. von Heraeus Noblelight GmbH, Hanau, Deutschland, die ein Spektrum im Bereich von 200 nm bis 800 nm emittiert, das eine Mehrzahl von Spektrallinien umfasst. Der untere Bereich des Spektrums, d. h. 200 nm bis ungefähr 450 nm, ist in 10 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass das Spektrum einer solchen Lampe natürlich strukturiert ist, d. h., es umfasst eine Mehrzahl von getrennten Peaks und eine relativ geringe Intensität dazwischen. Somit kann eine solche Lichtquelle vorteilhafterweise die Anregungsstrahlung direkt bereitstellen, ohne dass eine weitere Filterung erforderlich ist. Die Emission kann jedoch in einigen Ausführungsformen mit einem Kantenfilter oder einem breiten Bandpassfilter weiter gefiltert werden, um nur einen Teil des Spektrums zu isolieren, z. B. Beiträge höherer Wellenlängen zu blockieren.
  • Es versteht sich, dass in einigen Fällen nur eine Teilmenge der verfügbaren Peaks in einem Spektrum einer Lichtquelle mittels Filterung ausgewählt werden kann. Das heißt, unter Umständen können nicht alle spektralen Merkmale (z. B. Peaks) eines (strukturierten) Spektrums einer Lichtquelle verwendet werden, sondern es kann eine Teilmenge ausgewählt werden.
  • Wie zuvor erwähnt, kann eine 90°-Anordnung verwendet werden, um die Menge an gestreuter Anregungsstrahlung in dem mindestens einen Anteil der Emission zu reduzieren, der detektiert werden kann. Das heißt, Anregungsstrahlung und Detektion/Sammlung von Probenemissionen können orthogonal zueinander ausgerichtet sein.
  • Die Sammlung der Probenemission, d. h. der Fluoreszenz, kann unter Verwendung einer auf Lichtleitern basierenden Messzelle 23 weiter verbessert werden (siehe 11). Eine solche Messzelle 23 kann einen Lichtleiter 227 mit einer Eingangsöffnung 2271 (auch Eingang 2271) und einer Ausgangsöffnung 2272 (auch Ausgang 2272) umfassen, wobei das Probenfluid durch den Lichtleiter 227 geleitet werden kann, indem das Probenfluid durch den Eingang 2271 eingeführt, durch den Lichtleiter 227 geleitet und aus dem Ausgang 2272 herausgeführt werden kann. Der Lichtleiter 227 kann eine interne Totalreflexion an den Innenflächen 2273 oder vorzugsweise an der Außenfläche 2274 des Lichtleiters 227 bereitstellen. Beispielsweise kann für einen Lichtleiter aus Glas, der von Luft umgeben ist, die Glas-Luft-Grenzfläche an der Außenfläche 2273 die Totalreflexion aufgrund der Differenz der jeweiligen Brechungsindizes bereitstellen. Weitere Details zum Lichtleiter 227 sind in US 2014/0266266 A1 enthalten. Ein Beispiel einer solchen Ausführungsform ist in 11 dargestellt, wobei die Messzelle 23 mit einem faserbasierten Filter kombiniert ist, wie vorstehend erörtert (vgl. 8).
  • Im Allgemeinen ist die interne Totalreflexion auf Licht beschränkt, das in einem Winkel oberhalb eines kritischen Winkels der reflektierenden Grenzfläche einfällt, z. B. der Glas-Luft-Grenze, wobei der kritische Winkel in Bezug auf die Linie senkrecht zur reflektierenden Grenzfläche definiert ist. Der kritische Winkel kann ausgedrückt werden als θ C = a r c s i n ( n 2 n 1 )
    Figure DE102020131374B4_0004
    wobei n1 der Brechungsindex des „internen“ Mediums ist, n2 der Brechungsindex des „externen“ Mediums und n2 ≤ n1 ist. Für eine Glas-Luft-Grenzfläche kann der kritische Winkel beispielsweise typischerweise θC ≈ 42° sein. Das heißt, Licht, das in einem kleineren Winkel einfällt, wird möglicherweise nicht reflektiert, sondern gebrochen.
  • Ein Beispiel einer solchen Ausführungsform ist in 11 dargestellt, wobei die Messzelle 23 mit einem faserbasierten Filter kombiniert ist, wie vorstehend erörtert (vgl. 8). Die Messzelle 23 umfasst einen Lichtleiter 227, d. h. ein Rohr mit Totalreflexion an der Innenfläche 2273 oder der Außenfläche 2274, durch das das Probenfluid geleitet wird (Probendurchfluss durch gepunktete Pfeile angegeben). Die Anregungsstrahlung wird von der Außenseite des Lichtleiters 227 senkrecht zur Strömungsrichtung des durch die Messzelle 23 fließenden Probenfluids, d. h. an der Außenfläche 2274 des Lichtleiters 227, bereitgestellt. In der dargestellten Ausführungsform wird die Anregungsstrahlung durch optische Fasern 225-1 bereitgestellt, die einem Ausgang eines faserbasierten Filters entsprechen, wie vorstehend erörtert. Die Anregungsstrahlung kann von der Probe (angezeigt durch einen Punkt) absorbiert werden, die durch die Messzelle 23 fließt, die anschließend Fluoreszenz in einer willkürlichen Richtung emittieren kann (angezeigt durch einen gestrichelten Pfeil). Aufgrund der internen Totalreflexion des Lichtleiters 227 kann die Fluoreszenzmenge, die den Lichtleiter 227 in Strömungsrichtung verlässt, d. h. von der Richtung vom Eingang 2271 zum Ausgang 2272 oder entgegengesetzt dazu, erhöht werden. Durch weiteres Einschließen eines retroreflektierenden Spiegels 228 an der Eingangsöffnung 2271 des Lichtleiters 227 kann die Fluoreszenzmenge, die zur Ausgangsöffnung 2272 des Lichtleiters 227 geleitet werden kann, noch weiter erhöht werden. Das heißt, während Fluoreszenzverluste aufgrund eines nicht perfekten Reflexionsvermögens des Spiegels 228 oder des Lichtleiters 227 und/oder Verluste an der Eingangsöffnung 2271 aufgrund des notwendigen Spalts zwischen dem Spiegel 228 und dem Lichtleiter 227 auftreten können, kann die gesamte an der Ausgangsöffnung 2272 gesammelte Fluoreszenzmenge erhöht sein. An der Ausgangsöffnung 2272 des Lichtleiters 227 kann die Fluoreszenz unter Verwendung einer geeigneten Optik und/oder einer optischen Faser 225 gesammelt werden. Somit kann die Verwendung eines Lichtleiters ermöglichen, mindestens 2,5 %, vorzugsweise mehr als 10 %, bevorzugter mehr als 50 % der Probenemission zur Ausgangsöffnung 2272 des Lichtleiters 227 zu leiten, wo sie gesammelt werden kann. Mit anderen Worten kann ein Lichtleiter beispielsweise eine numerische Blende (NA) von 0,22 oder mehr umfassen. Während typische Messzellen bei Verwendung eines Mikroskops höhere numerische Blenden bereitstellen können, z. B. 0,4 oder sogar höher, umfassen sie im Allgemeinen eine sehr kleine Wechselwirkungszone zwischen der Anregung und der Probe, was typischerweise zu einem sehr schwachen Signal führt. Im Gegensatz dazu kann der Lichtleiter vorteilhafterweise relativ lang sein, z. B. einige zehn Millimeter, wie beispielsweise 60 mm, was die Herstellung einer signifikant höheren Fluoreszenz ermöglicht, z. B. durch Verwendung einer größeren (und stärkeren) Anregungslichtquelle, die im Vergleich zu einer typischen Messzelle eine größere Interaktionszone ermöglichen kann.
  • Das erörterte Design kann aus einer Reihe von Gründen von Vorteil sein. Erstens kann eine signifikant höhere Fraktion der Fluoreszenz unter Verwendung des Lichtleiters 227 gesammelt und/oder detektiert werden, da die Fluoreszenz nahezu unabhängig von der Emissionsrichtung gesammelt werden kann. Das heißt, im Vergleich zu einer Standardmesszelle 23 kann eine signifikant größere Fraktion der Fluoreszenz gesammelt werden. Ferner kann die Emission leicht in eine Faser 225 eingekoppelt werden, was für die weitere Filterung vorteilhaft sein kann, da sie natürlich eine kleine Eingangslichtquelle für ein Filter 22 bereitstellt. Dies kann in Kombination mit der vorstehend erörterten faserbasierten Filterung besonders vorteilhaft sein, da sie von einer kleinen Eingangslichtquelle profitiert.
  • Insbesondere kann das faserbasierte Filter zusammen mit einer kleinen Eingangslichtquelle verwendet werden, die typischerweise unter Umständen nicht mit einer Standardmesszelle als Fluoreszenzquelle gegeben ist. In Ausführungsformen, in denen sowohl das Anregungsfilter 22A als auch das Emissionsfilter 22B wie vorstehend beschrieben faserbasiert sind, können die Fasern 225-1 des Anregungsfilters vorteilhafterweise verwendet werden, um den Lichtleiter 227 mit hoher Effizienz direkt von der Seite zu bestrahlen (vgl. 11). Die Fluoreszenz innerhalb des Lichtleiters 227 kann durch interne Totalreflexion (und den Spiegel 228 an der Eingangsöffnung 2271) geleitet und an der Ausgangsöffnung 2272 mit einer einzigen Faser 225, z. B. einer Glasfaser, gesammelt werden. Somit kann wieder eine einzige Faser (hohe Helligkeit in einem kleinen Querschnitt) für das zu untersuchende fluoreszierende Licht verfügbar sein, das in einem faserbasierten Emissionsfilter wie vorstehend beschrieben analysiert werden kann. Auf diese Weise stellt eine solche Messzelle 23 vorteilhafterweise eine kleine Eingangslichtquelle für ein faserbasiertes Emissionsfilter bereit, und ferner kann (im Vergleich zu klassischen Fluoreszenzzellen) ein großer Teil der Fluoreszenz gesammelt werden.
  • Für die Detektion können ähnliche Detektoren 24 wie für Standard-Fluoreszenzdetektoren 13 verwendet werden. Insbesondere können PMTs, APDs oder normale Fotodioden verwendet werden. Es können jedoch auch weitere geeignete optische Detektoren verwendet werden, z. B. verstärkte Kameras, zweidimensionale Dioden-Arrays, gekühlte Detektoren wie ein flüssigstickstoffgekühltes CCD oder sogar supraleitende Nanodraht-Einzelphotonendetektoren.
  • In Ausführungsformen, in denen das Emissionsfilter ein faserbasiertes Emissionsfilter ist, können alle Fasern eines Ausgangs (z. B. 02, 255-2) das Licht einfach zu einem einzigen PMT 24 leiten, wie in 12A dargestellt, oder alternativ kann der PMT durch eine Mehrzahl von kleinen APDs ersetzt werden, z. B. 24-1, ..., 24-4, die direkt an einzelne Fasern 255-2-1, ..., 255-2-4 gekoppelt sein können, wie in 12B schematisch dargestellt. Dieser Ansatz kann vorteilhafterweise eine grundlegende multispektrale Messung bereitstellen, da jede Faser 255 einen anderen Anteil des Spektrums trägt. Mit anderen Worten können mehrere kleine und kostengünstige APDs den PMT in 12A ersetzen, und da die Fasern direkt mit den APDs gekoppelt werden können, kann dieser Ansatz auch mehrere Messkanäle für eine rudimentäre multispektrale Messung bereitstellen, die der Anzahl von optischen Fasern entspricht, die zur Frequenzauswahl verwendet werden. Es versteht sich, dass dieser Ansatz nicht auf die Verwendung von APDs 24 beschränkt ist, sondern alternativ beispielsweise räumlich aufgelöste Mini-PMTs 24 verwenden kann, die den Vorteil einer höheren UV-Empfindlichkeit bieten können.
  • Ferner können die Fasern 255 alternativ mit einem Array-Detektor 24 gekoppelt sein, z. B. einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD), einem komplementären Metalloxid-Halbleiter (CMOS) oder einem N-Typ-Metalloxid-Halbleiter(NMOS)-Bildsensor 24 ohne weitere Optik, wie in 12C dargestellt. Eine solche Anordnung kann mehrere Kanäle bereitstellen und beispielsweise gleichzeitige Referenz- und Fluoreszenzmessungen ermöglichen, indem die Fasern der beiden Ausgänge (225-1-1, ..., 255-1-4, 255-2-1, ..., 255-2-4) des faserbasierten Emissionsfilters an das Array 24 gekoppelt werden. 12C zeigt eine Seitenperspektive eines Arrays 24 mit Fasern 255 des direkt verbundenen faserbasiertes Filters sowie eine Draufsicht (unten rechts) des Arrays mit den verbundenen Fasern 255. Wiederum kann es eine solche Anordnung ermöglichen, die Emission mit einer groben spektralen Auflösung und einer hohen Quanteneffizienz aufzuzeichnen. Es wird jedoch angemerkt, dass ein großer Dynamikbereich vorteilhaft sein kann, wenn Referenz- und Fluoreszenzmessung an einem einzigen Array 24 durchgeführt werden sollen.
  • Für Ausführungsformen des Spektralfilters 22, bei denen das Spektrum mit dispersiven Elementen 223 (Gitter, Prismen) geteilt und anschließend strukturiert wird, kann die Strukturierung, d. h. die Auswahl des gesperrten/durchgelassenen Spektrums, beispielsweise durch Verschieben der Schattenmaske 224 oder Verschieben der Fasern 225 (z. B. Faserhalter) feinabgestimmt werden. Weiterhin müssen die Auswahlstrukturen, z. B. Löcher in der Schattenmaske 224 oder den Fasern 225, nicht notwendigerweise gleich beabstandet sein. Wenn beispielsweise eine Lichtquelle 21 verwendet wird, die auf natürliche Weise ein strukturiertes Spektrum erzeugt, wie beispielsweise eine NOx-Lichtquelle, kann das Emissionsfilter 22B auf das Spektrum der NOx-Lichtquelle eingestellt werden, die eine Anregungsstrahlung mit einem Spektrum erzeugt, wobei individuelle Merkmale nicht gleichmäßig beabstandet sind und/oder keine identische Linienbreite umfassen.
  • Weiterhin kann mindestens eine zusätzliche bewegliche Blende 229 in die Ebene der Schattenmaske 224 oder vor die Fasereingänge im Fall eines faserbasierten Filters eingesetzt werden, die z. B. Licht an beiden Enden des Spektrums blockiert, wie in den 13A und 13B gezeigt, um einen Schlitz zu bilden, um nach Bedarf eine zusätzliche Einschränkung des Wellenlängenbereichs zur Optimierung des Streulichts vornehmen zu können. Dies kann es vorteilhafterweise ermöglichen, „Finger“ auf der Emissions- und/oder Anregungsseite zu unterdrücken (z. B. zu blockieren), wobei andernfalls beispielsweise ein hoher Hintergrund generiert werden kann, der von einem Raman-Signal oder unerwünschter Fluoreszenz herrührt. Mit anderen Worten kann mindestens eine zusätzliche Blende 229 verwendet werden, um beispielsweise Bandpass- oder Kantenfilter durch Blockieren der Emission für mindestens ein Ende des Spektrums zu realisieren. Eine solche Blende 229 entspricht einem Filterrad/Kantenfilter, das in Fluoreszenzdetektoren verwendet wird, wenn sie auf der Emissionsseite angewendet werden, und kann es beispielsweise ermöglichen, einen universellen Fluoreszenzdetektor in einen Standard-Fluoreszenzdetektor, d. h. einen Fluoreszenzdetektor mit spektral getrennten Anregungs- und Emissionsspektren umzuwandeln.
  • Im Folgenden wird eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter besonderer Bezugnahme auf 14A und 14B ausführlicher beschrieben. In dieser Ausführungsform kann eine Lichtquelle 21 auf Plasma- oder Gasbasis, wie die NOx-Lichtquelle, die ein geeignet strukturiertes Spektrum bereitstellt, mit einer Messzelle vom Lichtleitertyp kombiniert werden.
  • Eine Lichtquelle 21 auf Plasma- oder Gasbasis kann typischerweise einen kleinen Glashohlraum 211 umfassen, der mit Gas und möglicherweise weiteren Substanzen, z. B. Quecksilber, Natrium oder einem beliebigen Dampf, gefüllt ist, der eine Emission mit einem geeignet strukturierten Spektrum bereitstellt, und umfasst typischerweise ein Frontfenster, durch welches das Licht relativ diffus austritt. Solche Lichtquellen 21 können elektrodenlos betrieben werden, d. h. durch Anlegen von hochfrequenter Strahlung von außen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Lichtleiter 227 so installiert sein, dass er das Probenfluid durch den Hohlraum 211 der Lichtquelle 21 leitet. Mit anderen Worten kann die Außenfläche 2274 des Lichtleiters 277 von dem Gas oder Plasma der Lichtquelle 21 umgeben sein.
  • Eine beispielhafte Ausführungsform einer solchen Lichtquelle 21 mit einer integrierten Messzelle 23 wird unter Bezugnahme auf die 14A und 14B erörtert, wobei 14B eine Querschnittsansicht von 14A darstellt, die entlang der durch C1 angegebenen Ebene geschnitten ist. Ganz allgemein ist die Funktionalität ähnlich der Ausführungsform, die in Bezug auf 11 erörtert wurde. In der Ausführungsform der 14A, 14B umgibt die Lichtquelle 21 selbst mindestens einen Anteil des Lichtleiters 227. Beispielsweise kann der Hohlraum 211, der das Gas enthält (durch Punkte angegeben), eine im Allgemeinen zylindrische Form aufweisen, und der Lichtleiter 227 kann vorzugsweise in dem Gashohlraum 211 zentriert sein, so dass die Mittelachse des Lichtleiters 227 mit der Mittelachse des zylindrischen Hohlraums 211 zusammenfällt. Mit anderen Worten kann der Lichtleiter 227 zentral zwischen den beiden kreisförmigen Seiten des Hohlraums 211 verlaufen. Es versteht sich, dass der Hohlraum 211 auch eine andere Geometrie annehmen kann.
  • Somit kann das Probenfluid während des Betriebs in den Lichtleiter 227 an der Einlassöffnung 2271 durch den Hohlraum 211 der Plasma-Lichtquelle 21 und aus der Ausgangsöffnung 2272 auf der anderen Seite des Hohlraums 211 geleitet werden. Daher kann das Probenfluid gleichmäßig der von der Plasma-Lichtquelle 21 erzeugten Anregungsstrahlung ausgesetzt sein, da die Anregungsstrahlung durch die Rohrwand des Lichtleiters 227, das heißt innerhalb des Gashohlraums 211, in den Lichtleiter 21 eintreten kann. Die Emission der Probe, d. h. des fluoreszierenden Lichts, das innerhalb des Lichtleiters 227 generiert werden kann, kann mit einem sehr hohen Wirkungsgrad innerhalb des Lichtleiters 227, z. B. einer nummerischen Blende (NA) von mehr als 0,22, gesammelt werden und kann zu einer der beiden Öffnungen 2271, 2272 des Lichtleiters 227 geleitet werden, die auch den Einlass und Auslass für die Fluidprobe bereitstellen. An der Seite der Einlassöffnung, d. h. stromaufwärts der Messzelle, kann ein retroreflektierender Spiegel 228 installiert sein, so dass die Emission, die den Lichtleiter 227 an der Einlassöffnung 2271 verlässt, in den Lichtleiter 227 zurück reflektiert werden kann. Der Spiegel 228 kann auf eine Weise installiert werden, die das Einbringen der Probe in den Lichtleiter 227 nicht verhindert. Daher kann die Emission mit einem hohen Wirkungsgrad zur Auslassöffnung 2272 geleitet werden, wo sie vorzugsweise mit einem Lichtleiter wie einer Glasfaser 225 aufgenommen werden kann. Die Außenseite des Hohlraums 211 könnte ferner beschichtet sein mit einer reflektierenden Beschichtung 212, z. B. gespiegelt, um die diffuse Emission des Plasmas zu reflektieren und somit die Absorption im Lichtleiter 227 zu erhöhen.
  • Mit anderen Worten kann ein Lichtleiter 227 in den Hohlraum 211 einer Plasma- oder Gaslichtquelle 21 (z. B. NOx-Lichtquelle) eingesetzt werden, so dass er von dem umgebenden Plasma (oder Gas) umgeben ist (oder sich „darin“ befindet), und eine durch den Lichtleiter 227 geleitete Probe kann somit vorteilhafterweise von allen Seiten optimal beleuchtet werden.
  • Eine solche kombinierte Vorrichtung kann den Vorteil eines weniger komplexen Designs bieten, bei dem zwei Verschleißteile, die Lichtquelle 21 und die Messzelle 23, in einer einzigen Komponente kombiniert sind. Ferner kann es auch eine sehr effiziente Nutzung des ansonsten schwer zu verwendenden diffusen Lichts des HF-angeregten NOx-Plasmas durch die Reflexion an der Außenseite des Hohlraums 211 ermöglichen, und dadurch, dass sich der Lichtleiter 227 „innerhalb“ der Lichtquelle 21 befindet, z. B. durch den Hohlraum 211 verläuft.
  • Der Lichtleiter 227 ermöglicht im Allgemeinen eine ausgezeichnete Sammlung des fluoreszierenden Lichts innerhalb des Lichtleiters 227 und eine Führung durch interne Totalreflexion zu beiden Enden, d. h. den Öffnungen 2271, 2272 (z. B. Ausgängen), und somit kann die erhaltene Fluoreszenz ferner im Wesentlichen durch einen retroreflektierenden Spiegel 228 verdoppelt werden.
  • Darüber hinaus bietet das Design intrinsisch eine 90°-Anordnung. Mit anderen Worten gibt es keinen direkten Lichtweg der Emission der Lichtquelle 21 (z. B. NOx-Lichtquelle 21) zu den Öffnungen des Lichtleiters 2271, 2272 - mit Ausnahme der Streuung im Lichtleiter 227 (d. h. aufgrund von Verunreinigung im Lichtleiter).
  • Die Emission an der Ausgangsöffnung 2272 des Lichtleiters 227 kann beispielsweise mit einer Faser 225, z. B. einer Glasfaser, gesammelt werden (siehe die in 11 dargestellte Ausführungsform). Dies kann direkt mit dem faserbasierten Filter kompatibel sein (vgl. 8), wobei die Lichtleiter, z. B. die optischen Fasern 225, in der Brennebene des Gitters 223 vorzugsweise an Stellen angeordnet sein können, die für die entsprechende Lichtquelle 21 geeignet sind (z. B. NOx-Lampe). Das heißt, die optischen Fasern 225 können vorzugsweise in Bereichen geringer Emission (z. B. Spalten zwischen Maxima) und Maxima der Emission der Lichtquelle (z. B. NOx-Emission) zur Fluoreszenz- bzw. Referenzmessung angeordnet sein.
  • Insbesondere kann die Verwendung einer NOx-Lichtquelle 21 vorteilhaft sein, da sie eine sehr stabile Lichtquelle sein kann (um Größenordnungen stabiler als beispielsweise Xenonbogenlampen) und da, zusammen mit einer Referenzmessung, selbst bei vorhandener Raman- und Hintergrundfluoreszenz (aufgrund der Stabilität der Anregung kann es möglich sein, einen Hintergrund gut zu subtrahieren) sehr gute Empfindlichkeiten erzielt werden können.
  • Wann immer in dieser Spezifikation ein relativer Begriff wie „ungefähr“, „im Wesentlichen“ oder „ca.“ verwendet wird, sollte dieser Begriff auch so ausgelegt werden, dass er den genauen Begriff mit einschließt. Das heißt, z. B. „im Wesentlichen gerade“ sollte ebenfalls so ausgelegt werden, dass auch „(genau) gerade“ eingeschlossen ist.
  • Wenn Schritte im Vorstehenden oder auch in den angehängten Ansprüchen angeführt wurden, ist anzumerken, dass die Reihenfolge, in der die Schritte im Text angeführt werden, zufällig sein mag. Das heißt, wenn nicht anders spezifiziert oder wenn es für den Fachmann nicht klar ist, kann die Reihenfolge, in der die Schritte angeführt werden, beliebig sein. Das heißt, wenn das vorliegende Dokument angibt, dass z. B. ein Verfahren Schritte (A) und (B) umfasst, bedeutet dies nicht unbedingt, dass Schritt (A) Schritt (B) vorausgeht, sondern es ist ebenfalls möglich, dass Schritt (A) (zumindest teilweise) gleichzeitig mit Schritt (B) ausgeführt wird, oder dass Schritt (B) Schritt (A) vorausgeht. Wenn überdies ein Schritt (X) einem anderen Schritt (Z) vorausgehen soll, bedeutet dies nicht, dass zwischen Schritt (X) und (Z) kein Schritt ist. Das heißt, Schritt (X), der Schritt (Z) vorausgeht, schließt die Situation ein, dass Schritt (X) direkt vor Schritt (Z) ausgeführt wird, doch auch die Situation, dass (X) vor einem oder mehreren Schritten (Y1), ..., gefolgt von Schritt (Z), ausgeführt wird. Entsprechende Überlegungen gelten, wenn Ausdrücke wie „nach“ oder „vor“ angewandt werden.
  • Während in den vorstehenden Ausführungen eine bevorzugte Ausführungsform unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben wurde, wird der Fachmann verstehen, dass diese Ausführungsform nur zu Zwecken der Veranschaulichung bereitgestellt wurde und keineswegs als Einschränkung des Geltungsbereichs dieser Erfindung, die durch die Ansprüche definiert ist, ausgelegt werden sollte.

Claims (19)

  1. Verwendung einer Fluoreszenzmessanordnung, wobei die Anordnung umfasst: eine Messzelle, die zur Aufnahme der Probe ausgelegt ist, eine Anregungsstrahlungsanordnung, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung dazu konfiguriert ist, der Messzelle eine Anregungsstrahlung bereitzustellen, wobei die Anregungsstrahlung ein Anregungsspektrum der Intensität gegenüber der Wellenlänge (I(λ)) umfasst, wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst, und einen Detektor, der dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil einer Emission der Probe zu detektieren und Erfassungsdaten zu generieren; zur Durchführung eines Verfahrens zum Messen der Fluoreszenz einer Probe in der Chromatographie, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen von Anregungsstrahlung, umfassend ein Anregungsspektrum von Intensität gegenüber der Wellenlänge (I(λ)), wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst; Anregen der Probe mit der Anregungsstrahlung; Detektieren mindestens eines Anteils einer Emission der Probe; Verwenden mindestens eines Spektralfilters (F(λ)), das eine wellenlängenabhängige Transmission bereitstellt, wobei die wellenlängenabhängige Transmission eine Mehrzahl von lokalen Transmissionsminima und lokalen Transmissionsmaxima umfasst; und Filtern mindestens eines Anteils der Emission der Probe unter Verwendung eines des mindestens einen Spektralfilters (F(λ)) als Spektralemissionsfilter, wobei die Transmission des Spektralemissionsfilters für Wellenlängen lokaler Minima des Anregungsspektrums höher ist als für Wellenlängen lokaler Maxima des Anregungsspektrums.
  2. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei lokale Maxima des Anregungsspektrums um mindestens einen Faktor 10, vorzugsweise um mindestens einen Faktor 100 wie beispielsweise um mindestens einen Faktor 1000, höher sind als die benachbarten lokalen Minima.
  3. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Anregungsspektrum mindestens 3, vorzugsweise mindestens 5, bevorzugter mindestens 10 lokale Maxima umfasst.
  4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Wellenlängendifferenz zwischen zwei benachbarten lokalen Maxima im Anregungsspektrum kleiner als 50 nm ist, vorzugsweise kleiner als 30 nm, bevorzugter kleiner als 20 nm wie beispielsweise 10 nm.
  5. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von Peaks umfasst, wobei das Maximum eines Peaks einem lokalen Maximum entspricht; und wobei jeder Peak der Mehrzahl von Peaks eine Spektralbreite umfasst, und wobei die Spektralbreite jedes Peaks kleiner als 30 nm, vorzugsweise kleiner als 20 nm, bevorzugter kleiner als 10 nm ist.
  6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schritt des Detektierens mindestens eines Anteils der Emission der Probe das Generieren von Erfassungsdaten umfasst, und wobei das Spektralemissionsfilter ein Softwarefilter ist, das dazu konfiguriert ist, auf die Erfassungsdaten angewendet zu werden.
  7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Spektralfilter mindestens ein optisches Element umfasst, das für wellenlängenabhängige Transmission und/oder Reflexion elektromagnetischer Strahlung konfiguriert ist.
  8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schritt des Bereitstellens von Anregungsstrahlung das Verwenden von mindestens einer Lichtquelle umfasst; und wobei der Schritt des Bereitstellens von Anregungsstrahlung das Verwenden eines des mindestens einen Spektralfilters (F(λ)) als Anregungsfilter umfasst, wobei die Transmission des Anregungsfilters dazu konfiguriert ist, elektromagnetische Strahlung der mindestens einen Lichtquelle zu modifizieren, um das Anregungsspektrum bereitzustellen.
  9. Spektralfilter, das dazu konfiguriert ist, eine wellenlängenabhängige Transmission für elektromagnetische Strahlung bereitzustellen, wobei die wellenlängenabhängige Transmission eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst, und wobei das Spektralfilter mindestens ein optisches Element umfasst, das für eine wellenlängenabhängige Transmission und/oder Reflexion elektromagnetischer Strahlung konfiguriert ist; wobei das mindestens eine optische Element mindestens ein aberrationskorrigiertes Flachfeldgitter umfasst; und wobei das Spektralfilter eine Mehrzahl von optischen Fasern umfasst, die in einer Linie in der Bildebene des Flachfeldgitters angeordnet sind, so dass jede Faser so konfiguriert ist, dass sie einen spektral unterschiedlichen Anteil des gebeugten Lichts sammelt.
  10. Spektralfilter nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei eine erste Teilmenge der optischen Fasern einem ersten Ausgang des Spektralfilters zugeordnet ist und eine zweite Teilmenge der optischen Fasern einem zweiten Ausgang des Spektralfilters zugeordnet ist.
  11. Fluoreszenzmessanordnung zum Messen der Fluoreszenz einer Probe, wobei die Anordnung umfasst: eine Messzelle, die zur Aufnahme der Probe ausgelegt ist, eine Anregungsstrahlungsanordnung, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung dazu konfiguriert ist, der Messzelle eine Anregungsstrahlung bereitzustellen, wobei die Anregungsstrahlung ein Anregungsspektrum der Intensität gegenüber der Wellenlänge (I(λ)) umfasst, wobei das Anregungsspektrum eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst, einen Detektor, der dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil einer Emission der Probe zu detektieren und Erfassungsdaten zu generieren, und wobei die Anregungsstrahlungsanordnung eine Lichtquelle umfasst; wobei die Fluoreszenzmessanordnung ferner ein Emissionsfilter umfasst, wobei die Fluoreszenzmessanordnung dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil der Emission der Probe zu filtern, wobei die Messzelle einen Lichtleiter umfasst, wobei der Lichtleiter ein Rohr ist, das eine Oberfläche umfasst, die dazu konfiguriert ist, eine interne Totalreflexion für Licht aus dem Rohrinneren heraus bereitzustellen, wobei der Lichtleiter eine Einlassöffnung und eine Auslassöffnung umfasst, wobei der Lichtleiter so konfiguriert ist, dass er die Probe an der Einlassöffnung aufnimmt und zur Auslassöffnung leitet.
  12. Fluoreszenzmessanordnung nach Anspruch 11, wobei das Emissionsfilter ein Softwarefilter ist, das dazu konfiguriert ist, auf die Erfassungsdaten angewendet zu werden, und/oder wobei das Emissionsfilter mindestens ein optisches Element umfasst, das für wellenlängenabhängige Transmission und/oder Reflexion elektromagnetischer Strahlung konfiguriert ist.
  13. Fluoreszenzmessanordnung nach einem der Ansprüche 11 und 12, wobei die Anregungsstrahlungsanordnung ein Anregungsfilter umfasst, das dazu konfiguriert ist, die Emission der Lichtquelle zu filtern, wobei das Anregungsfilter dazu konfiguriert ist, das Emissionsspektrum der Lichtquelle zu manipulieren, um das Anregungsspektrum bereitzustellen.
  14. Fluoreszenzmessanordnung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Lichtquelle ein Spektrum bereitstellt, das eine Mehrzahl von lokalen Maxima und eine Mehrzahl von lokalen Minima umfasst.
  15. Fluoreszenzmessanordnung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Messzelle einen Spiegel umfasst, der dazu konfiguriert ist, Licht, das die Einlassöffnung des Lichtleiters verlässt, zurück in den Lichtleiter zu reflektieren.
  16. Fluoreszenzmessanordnung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die Messzelle eine optische Faser umfasst, die dazu konfiguriert ist, mindestens einen Anteil des Lichts an der Auslassöffnung des Lichtleiters zu sammeln.
  17. Fluoreszenzmessanordnung nach einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei die Außenfläche des Lichtleiters von der Lichtquelle umgeben ist.
  18. Fluoreszenzmessanordnung nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Lichtquelle eine elektrodenlose Plasma-Lichtquelle ist, die einen Hohlraum umfasst, der das Plasma enthält, und wobei mindestens ein Anteil des Lichtleiters durch den Hohlraum der Lichtquelle verläuft.
  19. System zum Messen der Fluoreszenz einer Probe, wobei das System umfasst: eine Pumpe zum Bereitstellen eines Fluidstroms; einen Probeninjektor zum Bereitstellen einer Fluidprobe; eine Trennsäule; und einen Fluoreszenzdetektor zum Detektieren der Fluoreszenz von Bestandteilen der Probe, wobei der Fluoreszenzdetektor eine Fluoreszenzmessanordnung nach einem der Ansprüche 11 bis 18 ist.
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