DE112015005826T5 - Mehrfarbige-fluoreszenz-analysevorrichtung - Google Patents

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Abstract

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung bereitzustellen, die in der Lage ist, die von mehreren Typen von Fluorophoren mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen emittierte Fluoreszenz schnell und zuverlässig zu identifizieren. Eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 gemäß der vorliegenden Erfindung dient dem Detektieren der von mehreren Typen in einer Probe s enthaltener Fluorophoren infolge der Bestrahlung mit Anregungslicht emittierten Fluoreszenz und ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine optische Bestrahlungseinheit 520 zum Bestrahlen einer Probe s mit von einer Lichtquelle 510 emittierten Licht als Anregungslicht, eine Fluoreszenzkondensationseinheit 530 mit einem Fluoreszenzfilter 531, das von der Probe s emittiertes Licht durchlässt und Licht von Transmissionswellenlängenbändern, die von den Anregungswellenlängenbändern verschieden sind, durchlässt, und einen zweidimensionalen Detektor 554, der mehrere Typen von Transmissionsfiltern 556 zum Durchlassen vorgeschriebener Lichtwellenlängen aufweist und die Intensität des Lichts der vorgeschriebenen Wellenlänge für jedes Transmissionsfilter 556 detektiert, aufweist, und dadurch gekennzeichnet, dass das von wenigstens zwei Fluorophoren von den mehreren Typen von Fluorophoren emittierte Licht gleichzeitig detektiert wird und die Fluorophorentypen anhand der detektierten Lichtintensitäten identifiziert werden.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung.
  • Technischer Hintergrund
  • Bei biologischen Tests ist beispielsweise eine Analysevorrichtung bekannt, bei der eine große Anzahl winziger DNA-Fragmente, die mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, gemeinsam mit Anregungslicht bestrahlt wird, die von den fluoreszierenden Farbstoffen emittierte Fluoreszenz detektiert wird und eine Basensequenz jedes DNA-Fragments entschlüsselt wird (siehe beispielsweise NPL 1).
  • Bei der vorstehend beschriebenen Analysevorrichtung werden die DNA-Fragmente mit einer hohen Dichte in einem als Durchflusszelle bezeichneten Reaktionsgefäß angeordnet und werden Basen, die zu den Basen von DNA-Fragmenten der vier Basentypen komplementär sind, die mit unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) in das DNA-Fragment aufgenommen und werden die Basen durch Identifizieren der fluoreszierenden Farbstoffe durch Bestrahlung mit Anregungslicht spezifiziert. Durch Wiederholen dieses Vorgangs wird die Basensequenz entschlüsselt.
  • Zusätzlich wurde diesbezüglich ein Verfahren zum Erhalten von Sequenzinformationen für jedes DNA-Fragment durch Ausführen einer PCR an Mikroteilchen unter Verwendung der Mikroteilchen (DNA-Kügelchen) als DNA-Fragmente tragende Träger, Streuen und Fixieren der Mikroteilchen auf einem Glassubstrat und Ausführen einer enzymatischen Reaktion (Ligation) auf dem Glassubstrat, Aufnehmen eines Substrats, dem fluoreszierende Farbstoffe hinzugefügt wurden, und Detektieren der Fluoreszenz offenbart (siehe beispielsweise NPL 2).
  • Bei solchen Analysevorrichtungen wird erwartet, dass die Geschwindigkeit für die Entschlüsselung der Basensequenz dadurch verbessert werden kann, dass eine große Anzahl von DNA-Fragmenten parallel analysiert werden kann.
  • Zitatliste
  • Patentliteratur
    • NPL 1: D. R. Bentley u. a., Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry, Nature 456, 53–59, (2008)
    • NPL 2: Science 2005, Band 309, S. 1728–1732
  • Kurzfassung der Erfindung
  • Technisches Problem
  • In einem Fall, in dem eine Fluoreszenzanalyse an einer Probe ausgeführt wird, die verschiedene fluoreszierende Farbstoffe enthält, wie durch die vorstehend beschriebene Entschlüsselung der DNA-Basensequenz typisiert ist, ist bei einer Analysevorrichtung aus dem Stand der Technik jedoch, weil die Analyse ausgeführt wird, während für jeden zu messenden fluoreszierenden Farbstoff Filter gewechselt werden, welche von den fluoreszierenden Farbstoffen emittierte Fluoreszenz durchlassen, Zeit für das Wechseln erforderlich, so dass die Analyse Zeit in Anspruch nimmt und sich nicht sagen lässt, dass der gegenwärtige Bedarf an einer Beschleunigung der Analyse erfüllt wird.
  • Die vorliegende Erfindung wurde unter den vorstehend beschriebenen Umständen gemacht, und eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung bereitzustellen, die in der Lage ist, die von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen emittierte Fluoreszenz schnell und zuverlässig zu identifizieren.
  • Lösung des Problems
  • Die vorliegende Erfindung betrifft:
    • (1) eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung zum Detektieren der von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen, die in einer Probe enthalten sind, durch Bestrahlung mit Anregungslicht emittierten Fluoreszenz, wobei die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung Folgendes aufweist: eine Lichtquelle zur Anregung, eine optische Bestrahlungseinheit mit einem Anregungsfilter, das Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlässt und die Probe mit von der Lichtquelle emittiertem Licht, das vom Anregungsfilter als Anregungslicht durchgelassen wird, bestrahlt, eine Fluoreszenzkondensationseinheit mit einem Fluoreszenzfilter, das zumindest einen Teil der von der Probe durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierten Fluoreszenz durchlässt und Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern, welche das Anregungswellenlängenband nicht einschließen, durchlässt, und einen zweidimensionalen Detektor mit mehreren Typen von Transmissionsfiltern, welche Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge von dem vom Fluoreszenzfilter durchgelassenen Licht durchlassen, welcher die Intensität des von jedem der Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts für jedes Transmissionsfilter detektiert, wobei von wenigstens zwei Typen fluoreszierender Farbstoffe von den mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe emittiertes Licht unter Verwendung des zweidimensionalen Detektors gleichzeitig detektiert wird und die Typen der fluoreszierenden Farbstoffe anhand der Intensitäten des detektierten Lichts identifiziert werden,
    • (2) die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach (1), wobei es vier Typen von Transmissionsfiltern gibt,
    • (3) die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach (1), wobei es zwei Typen von Transmissionsfiltern gibt,
    • (4) eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung zum Detektieren der von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen, die in einer Probe enthalten sind, durch Bestrahlung mit Anregungslicht emittierten Fluoreszenz, wobei die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung Folgendes aufweist: eine Lichtquelle zur Anregung, eine optische Bestrahlungseinheit mit mehreren Anregungsfiltern, die Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlassen und wechselbar sind und die Probe mit von der Lichtquelle emittiertem Licht als Anregungslicht, das vom Anregungsfilter durchgelassen wird, bestrahlen, eine Fluoreszenzkondensationseinheit mit einem Fluoreszenzfilter, das zumindest einen Teil der von der Probe durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierten Fluoreszenz durchlässt und Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern, welche das Anregungswellenlängenband nicht einschließen, durchlässt, und einen zweidimensionalen Detektor mit mehreren Typen von Transmissionsfiltern, welche Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge von dem vom Fluoreszenzfilter durchgelassenen Licht durchlassen, welcher die Intensität des von jedem der Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts für jedes Transmissionsfilter detektiert, wobei von wenigstens zwei Typen fluoreszierender Farbstoffe von den mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe emittiertes Licht unter Verwendung des zweidimensionalen Detektors gleichzeitig detektiert wird und die Typen der fluoreszierenden Farbstoffe anhand der Intensitäten des detektierten Lichts identifiziert werden,
    • (5) die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach (4), wobei es vier Typen von Transmissionsfiltern gibt,
    • (6) die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach (4), wobei es zwei Typen von Transmissionsfiltern gibt,
    • (7) eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung zum Detektieren der von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen, die in einer Probe enthalten sind, durch Bestrahlung mit Anregungslicht emittierten Fluoreszenz, wobei die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung Folgendes aufweist: mehrere Lichtquellen zur Anregung, eine optische Bestrahlungseinheit mit einem Anregungsfilter, das für jede der Lichtquellen bereitgestellt ist, um Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchzulassen, welche die Probe mit von der Lichtquelle emittiertem Licht, das vom Anregungsfilter durchgelassen wurde, als Anregungslicht bestrahlt, eine Fluoreszenzkondensationseinheit mit einem Fluoreszenzfilter, das zumindest einen Teil der von der Probe durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierten Fluoreszenz durchlässt und Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern, welche das Anregungswellenlängenband nicht einschließen, durchlässt, und einen zweidimensionalen Detektor mit mehreren Typen von Transmissionsfiltern, welche Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge von dem vom Fluoreszenzfilter durchgelassenen Licht durchlassen, welcher die Intensität des von jedem der Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts für jedes Transmissionsfilter detektiert, wobei eine der mehreren Lichtquellen eingeschaltet wird, um gleichzeitig von wenigstens zwei Typen fluoreszierender Farbstoffe von den mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe emittiertes Licht unter Verwendung des zweidimensionalen Detektors zu detektieren, und wobei die Typen der fluoreszierenden Farbstoffe anhand Intensitäten des detektierten Lichts identifiziert werden,
    • (8) die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach (7), wobei es vier Typen von Transmissionsfiltern gibt,
    • (9) die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach (7), wobei es zwei Typen von Transmissionsfiltern gibt,
    • (10) eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung zum Detektieren der von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen, die in einer Probe enthalten sind, durch Bestrahlung mit Anregungslicht emittierten Fluoreszenz, wobei die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung Folgendes aufweist: eine Lichtquelle zur Anregung, eine optische Bestrahlungseinheit mit einem Anregungsfilter, das Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlässt und die Probe mit von der Lichtquelle emittiertem Licht, das vom Anregungsfilter als Anregungslicht durchgelassen wird, bestrahlt, eine Fluoreszenzkondensationseinheit mit einem Fluoreszenzfilter, das zumindest einen Teil der von der Probe durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierten Fluoreszenz durchlässt und Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern, welche das Anregungswellenlängenband nicht einschließen, durchlässt, eine Zerlegungseinheit, welche das vom Fluoreszenzfilter durchgelassene Licht mit einem vorgegebenen Verhältnis für jede Wellenlänge in zwei Anteile zerlegt, einen ersten zweidimensionalen Detektor mit mehreren Typen erster Transmissionsfilter, welche Licht mit einem vorgegebenen Wellenlängenbereich von einem der beiden von der Zerlegungseinheit zerlegten Lichtanteile durchlässt und die Intensität des von jedem der ersten Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts für jedes der ersten Transmissionsfilter detektiert, und einen zweiten zweidimensionalen Detektor mit mehreren Typen zweiter Transmissionsfilter, welche Licht mit einem vorgegebenen Wellenlängenbereich von dem anderen der beiden von der Zerlegungseinheit zerlegten Lichtanteile durchlässt und die Intensität des von jedem der zweiten Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts für jedes der zweiten Transmissionsfilter detektiert, wobei von wenigstens zwei Typen fluoreszierender Farbstoffe von den mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe emittiertes Licht unter Verwendung des ersten und des zweiten zweidimensionalen Detektors gleichzeitig detektiert wird und die Typen der fluoreszierenden Farbstoffe anhand der Intensitäten des detektierten Lichts identifiziert werden,
    • (11) eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach (10), wobei es vier Typen erster bzw. zweiter Transmissionsfilter gibt,
    • (12) eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach (10), wobei es zwei Typen erster bzw. zweiter Transmissionsfilter gibt,
    • (13) eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach (10) bis (12), wobei die Zerlegungseinheit einen dichroitischen Spiegel aufweist, der einen Teil des vom Fluoreszenzfilter durchgelassenen Lichts durchlässt und den restlichen Teil reflektiert, wobei sich der Durchlassgrad des vom dichroitischen Spiegel durchgelassenen Lichts in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich im Wesentlichen von 0% bis 100% ändert,
    • (14) eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach einem von (1) bis (13), wobei das auf die Probe einzustrahlende Anregungslicht wenigstens zwei Anregungswellenlängenbänder aufweist,
    • (15) eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach einem von (1) bis (14), wobei das auf die Probe einzustrahlende Anregungslicht wenigstens drei Anregungswellenlängenbänder aufweist, und
    • (16) eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach einem von (1) bis (15), welche ferner eine Datenverarbeitungseinheit umfasst, welche zwei oder mehr Typen fluoreszierender Farbstoffe anhand der Intensität des vom zweidimensionalen Detektor detektierten Lichts identifiziert.
  • Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung kann eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung bereitstellen, welche von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen emittierte Fluoreszenz schnell und zuverlässig identifizieren kann. Daher kann die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung geeignet für eine Fluoreszenzanalyse sich auf einen lebenden Körper beziehender Substanzen in der Art von DNA und RNA, die mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, verwendet werden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnung
  • Es zeigen:
  • 1 eine schematische perspektivische Ansicht einer Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
  • 2 eine schematische perspektivische Einzelteilansicht eines Beispiels einer Durchflusszelle in der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung aus 1,
  • 3 eine schematische perspektivische Ansicht eines Beispiels einer Transporteinheit in der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung aus 1,
  • 4 eine schematische perspektivische Ansicht eines Beispiels einer Flüssigkeitszufuhreinheit in der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung aus 1,
  • 5 eine schematische Vorderansicht eines Beispiels einer optischen Einheit in der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung aus 1,
  • 6 eine schematische Ansicht einer Anordnung von Transmissionsfiltern eines zweidimensionalen Detektors in der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung aus 1,
  • 7A eine schematische Ansicht eines Beispiels von Wellenlängencharakteristiken in der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung aus 1, wobei (a) eine Wellenlängencharakteristik (Ausbreitungsrate) auf eine Probe einzustrahlenden Anregungslichts zeigt, (b) ein Absorptionsspektrum jedes fluoreszierenden Farbstoffs zeigt, (c) ein Absorptionsspektrum jedes fluoreszierenden Farbstoffs bei Bestrahlung mit Anregungslicht zeigt und (d) ein Fluoreszenzspektrum jedes fluoreszierenden Farbstoffs zeigt,
  • 7B eine schematische Ansicht eines Beispiels von Wellenlängencharakteristiken der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung aus 1, wobei (e) eine Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) eines dichroitischen Spiegels und eines Fluoreszenzfilters zeigt, (f) ein Fluoreszenzspektrum jedes fluoreszierenden Farbstoffs nach Durchgang durch das Fluoreszenzfilter zeigt, (g) eine Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) jedes von verschiedenen Transmissionsfiltern zeigt und (h) ein Intensitätsverhältnis jedes fluoreszierenden Farbstoffs jedes Transmissionsfilters zeigt,
  • 8 eine schematische Ansicht eines Beispiels eines auf einem zweidimensionalen Bildsensor der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung aus 1 erzeugten Bilds von DNA-Kügelchen,
  • 9 eine schematische Ansicht von Wellenlängencharakteristiken in einer Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei (a) eine Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) eines Transmissionsfilters zeigt und (b) ein Intensitätsverhältnis jedes fluoreszierenden Farbstoffs für jedes Transmissionsfilter zeigt,
  • 10 eine schematische Ansicht eines Beispiels eines auf einem zweidimensionalen Bildsensor erzeugten Bilds von DNA-Kügelchen gemäß der zweiten Ausführungsform,
  • 11 eine schematische Vorderansicht eines Beispiels einer optischen Einheit einer Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
  • 12 eine schematische Ansicht von Wellenlängencharakteristiken der Mehrfarbige Fluoreszenz-Analysevorrichtung aus 11, wobei (a1) eine Wellenlängencharakteristik (Ausbreitungsrate) zeigt, die durch Überlagern eines ersten Anregungsfilters und eines dichroitischen Spiegels erhalten wird, (a2) eine Wellenlängencharakteristik (Ausbreitungsrate) zeigt, die durch Überlagern eines zweiten Anregungsfilters und eines dichroitischen Spiegels erhalten wird, (b) eine Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) zeigt, die durch Überlagern eines dichroitischen Spiegels und eines Fluoreszenzfilters erhalten wird, (c1) ein Intensitätsverhältnis jedes fluoreszierenden Farbstoffs für jedes Transmissionsfilter bei Verwendung des ersten Anregungsfilters zeigt und (c2) ein Intensitätsverhältnis jedes fluoreszierenden Farbstoffs für jedes Transmissionsfilter bei Verwendung des zweiten Anregungsfilters zeigt,
  • 13 eine schematische Vorderansicht eines Beispiels einer optischen Einheit in einer Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
  • 14 eine schematische Vorderansicht eines Beispiels einer optischen Einheit in einer Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung gemäß einer fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
  • 15 eine schematische Ansicht von Wellenlängencharakteristiken gemäß der fünften Ausführungsform, wobei (a) eine durch Überlagern eines Anregungsfilters und eines dichroitischen Spiegels erhaltene Wellenlängencharakteristik (Ausbreitungsrate) zeigt und (b) eine Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) einer Zerlegungseinheit zeigt, und
  • 16 ein Flussdiagramm eines Beispiels einer Basensequenzbestimmungsprozedur unter Verwendung der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung aus 1.
  • Beschreibung von Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung ist eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung zum Detektieren der von mehreren Typen von fluoreszierenden Farbstoffen emittierten Fluoreszenz mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen, die in einer Probe enthalten sind, durch Bestrahlung mit Anregungslicht und Identifizieren des Typs fluoreszierender Farbstoffe anhand Lichtintensitäten, die durch einen später beschriebenen zweidimensionalen Detektor detektiert werden.
  • Nachstehend wird die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die Zeichnung beschrieben, die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die in der Zeichnung beschriebenen Ausführungsformen beschränkt. Zusätzlich wird bei allen nachstehend beschriebenen Ausführungsformen ein Beispiel beschrieben, bei dem eine Probe aus Mikroteilchen (nachstehend als ”DNA-Kügelchen” bezeichnet) besteht, welche zu analysierende amplifizierte Klon-DNA-Fragmente tragen, und eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung zum Entschlüsseln einer Basensequenz der DNA-Fragmente (DNA-Sequenzer zum Identifizieren der jeweiligen Basen A (Adenin), G (Guanin), C (Cytosin) und T (Thymin)) verwendet wird.
  • Zusätzlich sind vier Typen fluoreszierender Farbstoffe (erster bis vierter fluoreszierender Farbstoff) zum Identifizieren der jeweiligen vorstehend erwähnten Basen nicht besonders beschränkt, solange die Basen identifiziert werden können. Bei der ersten bis fünften Ausführungsform der vorliegenden Patentschrift werden als die vier Typen fluoreszierender Farbstoffe ein erster fluoreszierender Farbstoff (maximale Absorptionswellenlänge: 490 nm, maximale Fluoreszenzwellenlänge: 515 nm), ein zweiter fluoreszierender Farbstoff (maximale Absorptionswellenlänge: 555 nm, maximale Fluoreszenzwellenlänge: 565 nm), ein dritter fluoreszierender Farbstoff (maximale Absorptionswellenlänge: 595 nm, maximale Fluoreszenzwellenlänge: 615 nm) und ein vierter fluoreszierender Farbstoff (maximale Absorptionswellenlänge: 650 nm, maximale Fluoreszenzwellenlänge: 665 nm) verwendet.
  • Bei der zweiten bis fünften Ausführungsform gleichen eine Durchflusszelle, ein Reagensbehälter, eine Transporteinheit, eine Flüssigkeitszufuhreinheit und eine Datenverarbeitungseinheit jenen einer nachstehend beschriebenen ersten Ausführungsform, so dass in den Ausführungsformen zwei bis fünf auf die detaillierte Beschreibung davon verzichtet wird.
  • [Erste Ausführungsform]
  • 1 ist eine schematische perspektivische Ansicht einer Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Wie in 1 dargestellt ist, ist die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 schematisch so ausgelegt, dass sie eine Durchflusszelle 100, einen Reagensbehälter 200, eine Transporteinheit 300, eine Flüssigkeitszufuhreinheit 400, eine optische Einheit 501 und eine Datenverarbeitungseinheit 600 aufweist.
  • Wie in 2 dargestellt ist, ist die Durchflusszelle 100 mit einem oberen Substrat 101, einem unteren Substrat 103 und einem Innenschichtabschnitt 102, der zwischen dem oberen Substrat 101 und dem unteren Substrat 103 angeordnet ist, versehen.
  • Das obere Substrat 101 ist ein lichtdurchlässiges Substrat, das eine Oberflächenbehandlung zur Adsorption von DNA-Kügelchen an seiner Innenplattenfläche aufweist. Hier bezeichnet das lichtdurchlässige Substrat ein Substrat, das die Eigenschaft aufweist, Anregungslicht und Licht in der Art von den DNA-Kügelchen emittierter Fluoreszenz durchlassen zu können. Im Allgemeinen hat die Fluoreszenz, die von fluoreszierenden Farbstoffen emittiert wird, die in Substanzen aufgenommen sind, welche sich auf lebende Körper beziehen, wie DNA oder RNA, einen großen Anteil sichtbaren Lichts. Falls die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 für sich auf lebende Körper beziehende Substanzen verwendet wird, ist es daher bevorzugt, wenn das obere Substrat 101 für sichtbares Licht durchlässig ist. Beispiele des Materials des oberen Substrats 101 können Glas, Acrylharz, Polycycloolefinharz und dergleichen sein. Zusätzlich ist das obere Substrat 101 mit einer Injektionsöffnung 104 zum Injizieren eines Reagens oder dergleichen und einer Auslassöffnung 105 zum Ausstoßen eines verwendeten Reagens oder dergleichen versehen.
  • Der Reagensbehälter 200 ist eine Einheit zum Aufnehmen von Reagenzien und dergleichen, die in einem DNA-Sequenzer verwendet werden. Im Reagensbehälter 200 werden gewöhnlich mehrere Speicherbehälter 201 bereitgestellt, und Reagenzien und dergleichen werden in jedem Speicherbehälter 201 gespeichert.
  • Die Transporteinheit 300 ist eine Einheit, welche die Durchflusszelle 100 transportiert. Wie in 3 dargestellt ist, weist die Transporteinheit 300 ein Linearstellglied 301, das in X-Achsenrichtung beweglich ist, ein Linearstellglied 302, das mit dem Linearstellglied 301 verbunden ist und in der zur X-Achsenrichtung senkrechten Y-Achsenrichtung beweglich ist, und einen Durchflusszellen-Befestigungssockel 303, der mit dem Linearstellglied 301 verbunden ist, auf. Der Durchflusszellen-Befestigungssockel 303 ist mit einem Mittel (nicht dargestellt) zum Befestigen der Durchflusszelle 100 versehen. Zusätzlich ist der Durchflusszellen-Befestigungssockel 303 mit einem Temperatursteuermittel (nicht dargestellt) zum Steuern der Temperatur der Durchflusszelle 100 versehen.
  • Die Flüssigkeitszufuhreinheit 400 führt der Durchflusszelle 100 Reagenzien und dergleichen zu. Wie in 4 dargestellt ist, weist die Flüssigkeitszufuhreinheit 400 ein Linearstellglied 401, das in X-Achsenrichtung in der horizontalen Ebene beweglich ist, ein Linearstellglied 402, das mit dem Linearstellglied 401 verbunden ist und in Y-Achsenrichtung in der zur X-Achsenrichtung senkrechten horizontalen Ebene beweglich ist, ein Linearstellglied 403, das mit dem Linearstellglied 401 verbunden ist und in vertikaler Richtung (Z-Achsenrichtung) beweglich ist, eine Abgabedüse 405 und einen Gleiter 404, der die Abgabedüse 405 und das Linearstellglied 403 verbindet, auf.
  • Die Abgabedüse 405 ist ein röhrenförmiges Element. Die Abgabedüse 405 ist durch eine Leitung (nicht dargestellt) mit einer Spritze verbunden. Die Abgabedüse 405 kann durch Antreiben der vorstehend beschriebenen Linearstellglieder 401, 402 und 403 dreidimensional bewegt werden, so dass das Reagens durch Manipulieren eines Kolbens (nicht dargestellt) der Spritze aus dem Speicherbehälter 201 herausgesaugt und durch die Injektionsöffnung 104 (siehe 2) in die Durchflusszelle 100 injiziert (zugeführt) werden kann.
  • Die optische Einheit 501 bestrahlt eine Probe, die einen fluoreszierenden Farbstoff enthält, mit Anregungslicht und detektiert die Fluoreszenz durch Ausführen einer Spektroskopie am erhaltenen Licht. Wie in 5 dargestellt ist, weist die optische Einheit 501 eine Lichtquelle 510, eine optische Bestrahlungseinheit 520, eine Fluoreszenzkondensationseinheit 530 und eine zweidimensionale Detektionseinheit 550 auf.
  • Die Lichtquelle 510 ist eine Anregungslichtquelle. Die Lichtquelle 510 emittiert Licht, das zur Erzeugung von Anregungslicht verwendet wird. Die Lichtquelle 510 ist vorzugsweise eine Weißlichtquelle. Dadurch kann zuverlässig Anregungslicht mit einem gewünschten Wellenlängenband über den gesamten sichtbaren Lichtbereich erhalten werden. Die Lichtquelle 510 ist vorzugsweise eine Xenon-Kurzbogenlampe oder eine weiße LED-Lampe. Weil eine solche Lichtquelle über den sichtbaren Lichtbereich ein gutes kontinuierliches Spektrum aufweist, ist sie zur Erzeugung von Licht in mehreren Anregungswellenlängenbändern geeignet.
  • Die optische Bestrahlungseinheit 520 weist ein Anregungsfilter auf, das Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlässt und die Probe s mit dem von der Lichtquelle emittierten Licht durch das Anregungsfilter als Anregungslicht bestrahlt. Die optische Bestrahlungseinheit 520 weist eine Kollimationslinse 523, ein Anregungsfilter 524, einen dichroitischen Spiegel 540 und eine Objektivlinse 527 auf.
  • Die Kollimationslinse 523 stellt das von der Lichtquelle 510 emittierte Licht ein, um kollimiertes Licht (paralleles Licht) zu erhalten. Das Anregungsfilter 524 lässt Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern von dem von der Lichtquelle 510 emittierten Licht durch. Als Anregungsfilter 524 ist in Hinblick auf eine zuverlässige Identifikation des Transmissionswellenlängenbereichs ein durch Bilden eines dielektrischen Mehrschichtfilms auf einem lichtdurchlässigen Glas erhaltenes Anregungsfilter bevorzugt. Der dichroitische Spiegel 540 reflektiert Anregungslicht und lässt Fluoreszenz durch. Der dichroitische Spiegel 540 weist ein lichtdurchlässiges Substrat in der Art von Glas und einen wellenlängenselektiven Durchlassfilm, der auf dem Substrat ausgebildet ist, auf, wobei dieser ein dielektrischer Mehrschichtfilm ist, der Licht in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich reflektiert und Licht in einem anderen Wellenlängenbereich durchlässt. Die Objektivlinse 527 kondensiert das vom Anregungsfilter 524 durchgelassene Anregungslicht an der Messstelle der Probe s.
  • Zusätzlich zeigt 7A(a) Wellenlängencharakteristiken (Ausbreitungsrate) des unter Verblendung des Anregungsfilters 524 und des dichroitischen Spiegels 540 auf die Probe s einzustrahlenden Anregungslichts.
  • Die Fluoreszenzkondensationseinheit 530 weist ein Fluoreszenzfilter auf, das zumindest einen Teil der von der Probe durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierten Fluoreszenz durchlässt und das Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern durchlässt, die das Anregungswellenlängenband nicht einschließen. Die Fluoreszenzkondensationseinheit 530 weist eine Objektivlinse 527 und ein Fluoreszenzfilter 531 auf.
  • Die Objektivlinse 527 kondensiert das von der Probe s emittierte Licht. Weil die Objektivlinse 527 in der optischen Bestrahlungseinheit 520 und die Objektivlinse 527 in der Fluoreszenzkondensationseinheit 530 zusätzlich so ausgelegt werden können, dass sie den vorstehend beschriebenen dichroitischen Spiegel 540 gemeinsam verwenden, sind die optische Bestrahlungseinheit 520 und die Fluoreszenzkondensationseinheit 530 gemäß der Ausführungsform so ausgelegt, dass sie dieselbe Objektivlinse verwenden.
  • Das Fluoreszenzfilter 531 lässt zumindest einen Teil der von der Probe s emittierten Fluoreszenz durch und lässt Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern, die das Anregungswellenlängenband nicht enthalten, durch. Insbesondere wird das Transmissionswellenlängenband des Fluoreszenzfilters 531 auf ein solches Wellenlängenband gelegt, bei dem das reflektierte Licht des Anregungslichts nicht durchgelassen wird. Das von der Probe s emittierte Licht umfasst die vom fluoreszierenden Farbstoff, der in der Probe s enthalten ist, durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierte Fluoreszenz und das von der Probe s reflektierte Anregungslicht. Daher wird das Fluoreszenzfilter 531 verwendet, um das reflektierte Anregungslicht zu entfernen, so dass die vom fluoreszierenden Farbstoff emittierte schwache Fluoreszenz im reflektierten Anregungslicht nicht untergeht, das eine erheblich höhere Intensität aufweist als die Fluoreszenz, so dass die Fluoreszenz zuverlässig detektiert werden kann. Als Fluoreszenzfilter 531 ist in Hinblick auf eine zuverlässige Identifikation des Transmissionswellenlängenbereichs ein durch Bilden eines dielektrischen Mehrschichtfilms auf einem lichtdurchlässigen Glas erhaltenes Fluoreszenzfilter bevorzugt. Das durch die Transmission des Fluoreszenzfilters 531 nach Entfernen des Anregungslichts erhaltene Licht wird zur später beschriebenen zweidimensionalen Detektionseinheit 550 durchgelassen.
  • Die zweidimensionale Detektionseinheit 550 detektiert die von der Probe s emittierte Fluoreszenz. Die zweidimensionale Detektionseinheit 550 weist eine Tubuslinse 552 und einen zweidimensionalen Detektor 554 auf.
  • Die Tubuslinse 552 kondensiert das vom Fluoreszenzfilter 531 durchgelassene Licht und erzeugt ein Bild des kondensierten Lichts auf einem zweidimensionalen Bildsensor (nicht dargestellt) des zweidimensionalen Detektors 554, wie später beschrieben wird.
  • Der zweidimensionale Detektor 554 weist mehrere Typen von Transmissionsfiltern auf, die Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge von dem vom Fluoreszenzfilter durchgelassenen Licht durchlassen, und er detektiert die Intensität des von jedem Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts. Der zweidimensionale Detektor 554 ist eine Einzelplattenkamera, die das vom Fluoreszenzfilter 531 durchgelassene Licht in mehrere verschiedene Wellenlängenbänder unterteilt. Der zweidimensionale Detektor 554 weist mehrere Typen von Transmissionsfiltern 556 und einen zweidimensionalen Bildsensor auf.
  • Jedes der Transmissionsfilter 556 lässt Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge von dem vom Fluoreszenzfilter 531 durchgelassenen Licht durch. Gemäß der Ausführungsform gibt es drei Typen von Transmissionsfiltern 556 mit vier verschiedenen Transmissionswellenlängenbändern. Wie in 6 dargestellt ist, umfassen die vorstehend erwähnten vier Transmissionsfiltertypen ein R-Filter (Filter, das hauptsächlich Licht im roten Bereich durchlässt) 556a, ein G-Filter (Filter, das hauptsächlich Licht im grünen Bereich durchlässt) 556b, ein B-Filter (Filter, das hauptsächlich Licht im blauen Bereich durchlässt) 556c und ein IR-Filter (Filter, das hauptsächlich Licht im nahen Infrarotbereich durchlässt) 556d. Die vier Transmissionsfiltertypen werden angeordnet, indem ein R-Filter 556a, ein G-Filter 556b, ein B-Filter 556c und ein IR-Filter 556d nacheinander einzeln als eine Einheit in einem Block angeordnet werden und die Einheit in Ebenenrichtung wiederholt wird. Zusätzlich ist jedes Transmissionsfilter 556 in Hinblick auf die Verbesserung der räumlichen Auflösung mit jedem Detektionselement (Element zum Messen der Intensität des einfallenden Lichts, nicht dargestellt) des später beschriebenen zweidimensionalen Bildsensors versehen, um jedem Detektionselement zu entsprechen.
  • Der zweidimensionale Bildsensor detektiert die Intensität des vom Transmissionsfilter 556 durchgelassenen Lichts mit einer vorgegebenen Wellenlänge für jedes Transmissionsfilter 556. Im zweidimensionalen Bildsensor ist eine große Anzahl von Detektionselementen in einem Gittermuster angeordnet und wird die Lichtintensität für jedes Detektionselement detektiert. Als zweidimensionaler Bildsensor kann beispielsweise eine monochrome CCD, ein CMOS-Sensor oder dergleichen verwendet werden.
  • Bei einer solchen optischen Einheit 501 wird das von der Lichtquelle 510 emittierte Licht durch die Kollimationslinse 523 kondensiert. Das Licht in einem spezifischen Wellenlängenband vom kollimierten Licht wird vom Anregungsfilter 524 als Anregungslicht durchgelassen. Ferner wird das Licht in einem spezifischen Wellenlängenband vom durch das Anregungsfilter 524 durchgelassenen Anregungslicht vom dichroitischen Spiegel 540 reflektiert und von der Objektivlinse 527 im Bereich kondensiert, in dem die DAN-Kügelchen (Probe s) erfasst werden. Hier umfasst das Wellenlängenband, das vom Anregungsfilter 524 durchgelassen und vom dichroitischen Spiegel 540 reflektiert wird, mehrere Wellenlängenbänder, die erforderlich sind, um alle der mehreren im DNA-Fragment enthaltenen Typen fluoreszierender Farbstoffe anzuregen.
  • Die von mehreren Typen von fluoreszierenden Farbstoffen, die angeregt werden, indem die Probe s mit dem Anregungslicht bestrahlt wird, emittierte Fluoreszenz wird von der Objektivlinse 527 kondensiert, durchläuft den dichroitischen Spiegel 540, der Licht in einem spezifischen Wellenlängenband durchlässt, und das Fluoreszenzfilter 531, das Licht in einem vorgegebenen Wellenlängenband durchlässt, und erzeugt durch die Tubuslinse 552 ein Bild auf dem zweidimensionalen Bildsensor des zweidimensionalen Detektors 554. Die bildgebende Fluoreszenz wird durch verschiedene Transmissionsfilter 556 spektroskopisch zerlegt, und die Intensität des spektroskopisch zerlegten Lichts wird durch ein für jedes Transmissionsfilter 556 bereitgestelltes Detektionselement gemessen. Zusätzlich umfasst das vom dichroitischen Spiegel 540 und vom Fluoreszenzfilter 531 durchgelassene Wellenlängenband alle oder einige der Wellenlängenbänder der von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe, die im DNA-Fragment enthalten sind, emittierten Fluoreszenz.
  • Die Datenverarbeitungseinheit 600 ist mit einer Datenverarbeitungseinheit (nicht dargestellt) versehen, die zwei oder mehr Typen fluoreszierender Farbstoffe anhand der Intensität des vom zweidimensionalen Detektor 554 detektierten Lichts identifiziert. Die Datenverarbeitungseinheit 600 erfasst die detektierte Fluoreszenz als zweidimensionale Bilddaten und analysiert die zweidimensionalen Bilddaten, um die in jeder Probe s enthaltenen fluoreszierenden Farbstoffe zu identifizieren. Als Datenverarbeitungseinheit 600 kann beispielsweise ein Personalcomputer oder dergleichen, der in der Lage ist, die zweidimensionalen Bilddaten zu analysieren, verwendet werden.
  • Weil die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 die Datenverarbeitungseinheit aufweist, ist es dadurch möglich, die zweidimensionalen Bilddaten der detektierten Fluoreszenz zu analysieren und die in der Probe s enthaltenen fluoreszierenden Farbstoffe zu identifizieren.
  • Als nächstes wird gemäß der ersten Ausführungsform ein Verfahren zum Identifizieren der in der Probe s enthaltenen fluoreszierenden Farbstoffe beschrieben. Zusätzlich wird in der folgenden Beschreibung aus Gründen der Zweckmäßigkeit angenommen, dass Charakteristiken (beispielsweise Charakteristiken des Spektrums der Lichtquelle 510, die spektrale Empfindlichkeit jedes Detektionselements im zweidimensionalen Detektor 554 und dergleichen) außer jenen der optischen Elemente in einem zu detektierenden Wellenlängenbereich einheitlich sind.
  • Von der Lichtquelle 510 emittiertes Weißlicht wird als Anregungslicht durch die Kollimationslinse 523, das Anregungsfilter 524, den dichroitischen Spiegel 540 und die Objektivlinse 527 auf die Probe s (DNA-Kügelchen) eingestrahlt. Die Wellenlängencharakteristik (Ausbreitungsrate) des eingestrahlten Anregungslichts wird erhalten, indem eine Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) des Anregungsfilters 524 mit einer Wellenlängencharakteristik (Reflexionsgrad) des dichroitischen Spiegels 540 multipliziert wird, und sie wird beispielsweise wie in 7A(a) dargestellt ausgedrückt.
  • Hier ist ein normiertes Absorptionsspektrum der vier Typen fluoreszierender Farbstoffe (fluoreszierende Farbstoffe eins bis vier), das zu detektieren ist, die in 7A(b) dargestellte Charakteristik. Daher wird zum Anregen aller fluoreszierenden Farbstoffe Anregungslicht, das zumindest einen Teil des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Farbstoffe aufweist, von der optischen Bestrahlungseinheit 520 für jeden der vier Typen fluoreszierender Farbstoffe auf die Probe s eingestrahlt.
  • Das normierte Absorptionsspektrum, das von jedem fluoreszierenden Farbstoff, der in der Probe s enthalten ist, durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht erhalten wird, wird zur in 7A(c) dargestellten Charakteristik. Das in 7A(c) dargestellte Absorptionsspektrum wird durch Überlagern des in 7A(a) dargestellten Ausbreitungsrate und des in 7A(b) dargestellten Absorptionsspektrums erhalten. Zusätzlich kann die von jedem fluoreszierenden Farbstoff absorbierte Energiemenge des Anregungslichts anhand eines durch Integrieren einer in 7A(c) dargestellten Absorptionsspektrumsgraphik über die Wellenlänge erhaltenen Werts (von der Graphik umgebener Bereich) geschätzt werden.
  • Hier wird das von den vorstehend erwähnten vier Typen fluoreszierender Farbstoffe emittierte normierte Fluoreszenzspektrum zur in 7A(d) dargestellten Kennlinie.
  • Das von der Probe s emittierte Licht fällt durch die Objektivlinse 527, den dichroitischen Spiegel 540, das Fluoreszenzfilter 531 und die Tubuslinse 552 auf den zweidimensionalen Detektor 554. Das von der Probe s emittierte Licht umfasst durch Reflexion des Anregungslichts durch die Probe s erhaltenes reflektiertes Licht (nachstehend auch einfach als ”reflektiertes Licht” bezeichnet) oder dergleichen zusätzlich zur vom fluoreszierenden Farbstoff emittierten Fluoreszenz. Weil das reflektierte Licht verglichen mit der vorstehend beschriebenen Fluoreszenz eine sehr hohe Intensität aufweist, wird es vor dem Einfall auf die zweidimensionale Detektionseinheit 550 entfernt, so dass die Detektion der Fluoreszenz durch die zweidimensionale Detektionseinheit 550 nicht gestört wird.
  • Hier zeigt 7B(e) die durch Überlagern der Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) des dichroitischen Spiegels 540 und der Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) des Fluoreszenzfilters 531 erhaltene Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit). Die Transmissionswellenlängencharakteristik der Fluoreszenzkondensationseinheit 530 ist entgegengesetzt zur in 7A(a) dargestellten Wellenlängencharakteristik des Anregungslichts der optischen Bestrahlungseinheit 520. Insbesondere ist in einem Wellenlängenband, in dem die Ausbreitungsrate des Anregungslichts in der optischen Bestrahlungseinheit 520 etwa 100% beträgt, die Durchlässigkeit der Fluoreszenzkondensationseinheit 530 als etwa 0% ausgelegt. Daher kann das reflektierte Licht aus dem von der Probe s emittierten Licht entfernt werden, so dass verhindert werden kann, dass das reflektierte Licht in die zweidimensionale Detektionseinheit 550 aufgenommen wird, so dass die Fluoreszenz zuverlässig identifiziert werden kann.
  • 7B(f) zeigt eine Überlagerung des in 7A(d) dargestellten Fluoreszenzspektrums und der in 7B(e) dargestellten Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit). Das in 7B(f) dargestellte normierte Fluoreszenzspektrum zeigt im Wesentlichen das Fluoreszenzspektrum jedes fluoreszierenden Farbstoffs, das die zweidimensionale Detektionseinheit 550 nach dem Durchlaufen der Fluoreszenzkondensationseinheit 530 erreicht. Wie in 7B(f) dargestellt ist, weist das Licht, das die zweidimensionale Detektionseinheit 550 erreicht, fast kein in 7A(c) dargestelltes Anregungslicht auf.
  • Das durch die Fluoreszenzkondensationseinheit 530 hindurchlaufende Licht tritt in die zweidimensionale Detektionseinheit 550 ein und wird durch das Transmissionsfilter 556 spektroskopisch zerlegt, und die Intensität nach der Spektroskopie wird durch den zweidimensionalen Bildsensor gemessen. 7B(g) zeigt eine Transmissionscharakteristik für jeden der vier Typen von Transmissionsfiltern (R-Filter 556a, G-Filter 556b, B-Filter 556c und IR-Filter 556d).
  • Weil gemäß der Ausführungsform die vorstehend beschriebenen vier Typen von Transmissionsfiltern 556 bereitgestellt sind, werden die vier Typen der von den jeweiligen fluoreszierenden Farbstoffen emittierten Fluoreszenz durch die vorstehend erwähnten vier Typen von Transmissionsfiltern 556 jeweils spektroskopisch zerlegt, und die jeweiligen Intensitäten des spektroskopisch zerlegten Lichts werden durch das Detektionselement gleichzeitig gemessen. In der Datenverarbeitungseinheit werden die vier Typen fluoreszierender Farbstoffe anhand der vorstehend gemessenen Fluoreszenz gleichzeitig identifiziert. Auf diese Weise können, weil vier Typen von Transmissionsfiltern 556 vorhanden sind, die Typen der fluoreszierenden Farbstoffe anhand des Verhältnisses zwischen den unter Verwendung der vier Typen von Transmissionsfiltern 556 detektierten Lichtintensitäten zuverlässig identifiziert werden.
  • Hier werden die Intensitätsverhältnisse der von den jeweiligen fluoreszierenden Farbstoffen emittierten und durch die jeweiligen Detektionselemente detektierten Fluoreszenz als Schätzwerte in einer Tabelle in 7B(h) dargestellt. Jeder Wert wird anhand eines Integralwerts des durch Überlagern des in 7B(f) dargestellten Fluoreszenzspektrums und der Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) jedes der verschiedenen Transmissionsfilter, wie in 7B(g) dargestellt, erhaltenen Spektrums berechnet. Wenngleich zusätzlich die Komponente des G-Filters 556b im Licht vom ersten und vom zweiten fluoreszierenden Farbstoff am stärksten detektiert wird, können die fluoreszierenden Farbstoffe bestimmt werden, weil die Intensitätsverhältnisse der Komponenten im B-Filter 556c und im R-Filter 556a voneinander verschieden sind. Wenngleich zusätzlich die Komponente des R-Filters 556a im Licht vom dritten und vom vierten fluoreszierenden Farbstoff am stärksten detektiert wird, können die fluoreszierenden Farbstoffe bestimmt werden, weil das Intensitätsverhältnis im IR-Filter 556d verschieden ist.
  • Hier wurde zum Erklären des Inhalts der vorliegenden Erfindung ein Beispiel beschrieben, bei dem spezifische fluoreszierende Farbstoffe oder dergleichen verwendet werden. Allerdings können durch Optimieren von Eigenschaften der fluoreszierenden Farbstoffe und der zu verwendenden optischen Elemente bevorzugtere Bedingungen erhalten werden. Beispielsweise hat die von DNA-Kügelchen (Probe s) emittierte Fluoreszenz eine räumliche Intensitätsverteilung. Daher kann die Abbildungsvergrößerung erhöht werden (zum Erhöhen der Größe eines Bilds der DNA-Kügelchen auf dem zweidimensionalen Bildsensor verglichen mit der Größe des Detektionselements), so dass ihr Einfluss auf ein vernachlässigbares Niveau verringert werden kann.
  • 8 ist ein schematisches Diagramm eines Beispiels eines Bilds i1 eines auf dem zweidimensionalen Bildsensor der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 aus 1 gebildeten DNA-Kügelchens. Die Figur zeigt ein Beispiel, bei dem die Abbildungsvergrößerung der optischen Einheit 501 etwa 20 ist, die Größe des Detektionselements des zweidimensionalen Bildsensors 3 μm beträgt und der Projektionsdurchmesser der DNA-Kügelchen 0,9 μm beträgt (in der Figur wird der Einfluss von Aberrationen und der Abbildungsfähigkeit des optischen Systems und dergleichen jedoch nicht berücksichtigt). Bei diesem Beispiel wird das Bild i1 der DNA-Kügelchen im Bereich von 6×6 Pixeln auf den zweidimensionalen Bildsensor projiziert. Bei der Messung der Fluoreszenz wird ein Bereich A, der das R-, G-, B- und IR-Transmissionsfilter 556 in der Nähe des Zentrums dieses Bereichs aufweist, extrahiert. Falls dabei die räumliche Verteilung der Fluoreszenzintensität im Bereich A verglichen mit dem Intensitätsverhältnis klein genug ist, kann der fluoreszierende Farbstoff anhand des durch jedes Detektionselement innerhalb des Bereichs A erhaltenen Intensitätsverhältnisses identifiziert werden. Bei diesem Beispiel, wie in 7B(h) dargestellt ist, beträgt die Differenz der Intensitätsverhältnisse zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen für die jeweiligen Detektionselemente etwa einige 10%, sodass, falls die räumliche Verteilung der Fluoreszenzintensität innerhalb von 10% die jeweiligen fluoreszierenden Farbstoffe identifiziert werden können.
  • Wie vorstehend beschrieben wurde, sind die optische Bestrahlungseinheit 520 mit dem Anregungsfilter 524, welches das Licht mit mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlässt, die Fluoreszenzkondensationseinheit 530 mit dem Fluoreszenzfilter 531, welches das Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern mit Ausnahme des Anregungswellenlängenbands durchlässt, und der zweidimensionale Detektor 554 mit mehreren Typen von Transmissionsfiltern, welche das Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge durchlassen, um die Intensitäten des von den jeweiligen Transmissionsfiltern durchgelassenen Lichts zu detektieren, bereitgestellt, und weil der zweidimensionale Detektor 554 verwendet wird, um gleichzeitig das von wenigstens zwei Typen fluoreszierender Farbstoffe von den mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe emittierte Licht zu detektieren, kann die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 die von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen emittierte Fluoreszenz schnell und zuverlässig identifizieren. Daher kann die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 geeignet für die Fluoreszenzanalyse für sich auf einen lebenden Körper beziehende Substanzen wie DNA und RNA, die mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, verwendet werden. Nachstehend wird ein Verfahren zur Analyse einer DNA-Basensequenz unter Verwendung der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 beschrieben.
  • Das Verfahren zur Analyse der DNA-Basensequenz unter Verwendung der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 ist nicht besonders beschränkt, es kann jedoch als Beispiel ein Verfahren zur Analyse einer DNA-Sequenz unter Verwendung eines schrittweisen Ligationsverfahrens (Sequenzierung durch Oligonukleotidligation und -detektion) angegeben werden. Beim schrittweisen Ligationsverfahren werden Sonden, die mit fluoreszierenden Farbstoffen fluoreszierend markiert sind, unter Verwendung einsträngiger an DNA-Kügelchen gebundener DNA in einer Durchflusszelle als Schablone sequenziell gebunden und wird die Sequenz in Einheiten von zwei Basen bestimmt.
  • Als enzymatische Reaktion durch eine Ligase werden fluoreszierende Farbstoffe enthaltende Oligonukleotide entsprechend einer Zielsequenz eines DNA-Fragments gebunden und wird eine Verlängerungsreaktion zugelassen. Nach Abschluss der Verlängerungsreaktion wird das Anregungslicht auf die fluoreszierenden Farbstoffe eingestrahlt, und die Fluoreszenz wird durch die optische Einheit 501 detektiert. Danach werden die fluoreszierenden Farbstoffe zerlegt, und die Verlängerungsreaktion wird weiter ablaufen gelassen, und es wird die der nächsten Sequenz entsprechende Fluoreszenz detektiert.
  • Durch Wiederholen der Verlängerungsreaktion, der Detektion der Fluoreszenz und des Zerlegens fluoreszierender Farbstoffe, wie vorstehend beschrieben, werden die den fluoreszierenden Farbstoffen entsprechenden Basen sequenziell bestimmt und schließlich als Basensequenz des DNA-Fragments entschlüsselt. Durch dieses Verfahren können die Basen einiger zehn bis einiger hundert bp in einem Zyklus entschlüsselt werden und können die Daten von einigen zehn Gb in einem Durchlauf analysiert werden. Bei einem solchen schrittweisen Ligationsverfahren können mehrere DNA-Fragmente in der Durchflusszelle 100 durch wiederholtes Hybridisieren fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide mit den fluoreszierenden Farbstoffen parallel sequenziert werden.
  • Als nächstes wird ein Zyklus der Basensequenzbestimmungsprozedur bei der Verlängerungsreaktion und dergleichen, wie vorstehend beschrieben, detailliert beschrieben. 16 ist ein Flussdiagramm, das ein Beispiel der Basensequenzbestimmungsprozedur unter Verwendung der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 aus 1 zeigt. Bei der Bestimmung der Basensequenz wird zuerst die Abgabedüse 405 der Flüssigkeitszufuhreinheit 400 in den Speicherbehälter 201 eingeführt, der im Reagensbehälter 200 installiert ist, und wird das Reagens im Speicherbehälter 201 angesogen (Schritt s1). Als nächstes werden die Flüssigkeitszufuhreinheit 400 und die Transporteinheit 300 angetrieben, um das Reagens in die Durchflusszelle 100 zu injizieren, wobei die Abgabedüse 405 mit der Injektionsöffnung 104 der Durchflusszelle 100 kommuniziert (Schritt s2).
  • Hier erfolgt die Reaktion in einem Fall, in dem eine Temperatursteuerung erforderlich ist, während die Temperatur mit einer Temperatursteuereinrichtung (nicht dargestellt) gesteuert wird, die in den Durchflusszellen-Befestigungssockel 303 der Transporteinheit 300 aufgenommen ist, wobei der Wartezustand beibehalten wird, bis die Reaktion abgeschlossen ist (Schritt s3). Falls mehrere Reaktionsschritte erforderlich sind, werden, nachdem die Reaktionsschritte wiederholt wurden, die fluoreszierenden Farbstoffe an das DNA-Fragment in der Durchflusszelle gebunden, sodass ein Zustand erhalten werden kann, in dem die Fluoreszenzdetektion möglich ist.
  • Als nächstes wird die Transporteinheit 300 angetrieben, um die Durchflusszelle 100 auf dem Durchflusszellen-Befestigungssockel 303 direkt unter die Objektivlinse 527 der optischen Einheit 501 zu bewegen, und wird die Fluoreszenzdetektion an der Probe s in der Durchflusszelle 100 ausgeführt (Schritt s4). Zusätzlich wird bei der Fluoreszenzdetektion, falls die Fläche des oberen Substrats 101, woran DNA-Fragmente befestigt sind, größer ist als die Fläche, die durch die optische Einheit 501 detektierbar ist, die Transporteinheit 300 angetrieben, um den Durchflusszellen-Befestigungssockel 303 in kleinen Schritten allmählich zubewegen, und wird die Fluoreszenzdetektion der Probe s durch zweidimensionales Abtasten innerhalb eines vorgegebenen Bereichs auf dem oberen Substrat 101 sequenziell ausgeführt. Als nächstes werden die zweidimensionalen Bilddaten der in der optischen Einheit 501 detektierten Fluoreszenz als ein elektrisches Signal zur Datenverarbeitungseinheit 600 übertragen und analysiert die Datenverarbeitungseinheit 600 die Daten, um die fluoreszierenden Farbstoffe zu identifizieren, so dass die Basen, die den identifizierten fluoreszierenden Farbstoffen entsprechen, bestimmt werden.
  • Auf diese Weise wird, nachdem die Fluoreszenzdetektion für einen Zyklus ausgeführt wurde, der nächste Zyklus ausgeführt, und indem dies wiederholt wird, werden die Basen, die den fluoreszierenden Farbstoffen entsprechen, sequenziell bestimmt und wird die Basensequenz des DNA-Fragments entschlüsselt.
  • [Zweite Ausführungsform]
  • Eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 12 gemäß einer zweiten Ausführungsform ist schematisch so ausgelegt, dass sie eine Durchflusszelle 100, einen Reagensbehälter 200, eine Transporteinheit 300, eine Flüssigkeitszufuhreinheit 400, eine optische Einheit 502 und eine Datenverarbeitungseinheit 600 aufweist. Die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 12 unterscheidet sich von jener gemäß der ersten Ausführungsform in Bezug auf die Typen des Transmissionsfilters 557 in der optischen Einheit 502. In der optischen Einheit 502 sind gleiche Komponenten mit den gleichen Bezugszahlen wie in der vorstehend beschriebenen Ausführungsform bezeichnet, und es wird daher auf ihre detaillierte Beschreibung verzichtet.
  • 9(a) zeigt schematisch eine Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) des Transmissionsfilters in der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Gemäß dieser Ausführungsform gibt es, wie in 9(a) dargestellt ist, zwei Typen von Transmissionsfiltern 557 (einer ist ein G'-Filter, und der andere ist ein R'-Filter (siehe 10)). Das G'-Filter hat einen Transmissionsbereich von etwa 450 nm bis 650 nm, und das R'-Filter hat einen Transmissionsbereich von etwa 575 nm bis 750 nm.
  • Hier wird das Intensitätsverhältnis zwischen den Fluoreszenzen, die von den jeweiligen fluoreszierenden Farbstoffen emittiert werden, welche durch die Detektionselemente entsprechend dem G'-Filter und dem R'-Filter detektiert werden, unter Verwendung des Integralwerts des durch Überlagern des Fluoreszenzspektrums aus 7A(d) und der Durchlässigkeit jedes der verschiedenen Transmissionsfilter 557, wie in 9(a) dargestellt, erhaltenen Spektrums berechnet. Das Ergebnis ist in 9(b) dargestellt. Wie in 9(b) dargestellt ist, können die fluoreszierenden Farbstoffe anhand des Verhältnisses identifiziert werden, weil das Verhältnis zwischen den vom G'-Filter und vom R'-Filter detektierten Signalintensitäten von den jeweiligen fluoreszierenden Farbstoffen abhängt.
  • 10 ist eine schematische Ansicht eines Beispiels eines auf dem zweidimensionalen Bildsensor gemäß der zweiten Ausführungsform erzeugten Bilds i2 der DNA-Kügelchen. Diese Figur zeigt ein Beispiel, bei dem die Abbildungsvergrößerung der optischen Einheit 502 etwa 13,3 beträgt, die Größe des Detektionselements des zweidimensionalen Bildsensors 3 μm beträgt und der Projektionsdurchmesser der DNA-Kügelchen 0,9 μm beträgt (in der Figur werden der Einfluss von Aberrationen und die Abbildungsfähigkeit des optischen Systems jedoch nicht berücksichtigt). In diesem Fall können die fluoreszierenden Farbstoffe wie beispielsweise in den folgenden Prozeduren (1) bis (3) gezeigt identifiziert werden.
    • (1) Ein Filter (G'-Filter oder R'-Filter) mit der höchsten Intensität wird aus dem Bereich extrahiert, worin die DNA-Kügelchen auf dem zweidimensionalen Bildsensor angezeigt werden. Beispielsweise wird in 10 ein G'-Filter 557a extrahiert.
    • (2) Entsprechend dem Durchschnitt der Intensitäten der verschiedenen Typen von Detektionselementen (R'-Filter 557b, 557c, 557d und 557e in 10) angrenzend an das im vorstehend beschriebenen Schritt (1) extrahierte Filter oder durch ein spezielles Näherungsberechnungsverfahren werden die Intensitäten der verschiedenen Typen von Detektionselementen (R'-Filtern) bei (1) geschätzt.
    • (3) Es werden die Verhältnisse zwischen den im vorstehend beschriebenen Schritt (2) erhaltenen Intensitäten verschiedener Typen von Detektionselementen (R'-Filter) und das Verhältnis des im vorstehend beschriebenen Schritt (1) extrahierten Filters (G'-Filter 557a) berechnet, und das erhaltene Verhältnis wird mit den Verhältnissen des G'-Filters und R'-Filters, wie in 9(b) gezeigt, verglichen, um die an die DNA-Kügelchen gebundenen fluoreszierenden Farbstoffe zu identifizieren.
  • Weil es zwei Typen von Transmissionsfiltern 557 gibt, kann auf diese Weise die Anzahl der Detektionselemente, die einem DNA-Kügelchen zuzuweisen sind, verglichen mit einem Fall verringert werden, in dem es die vorstehend beschriebenen vier Typen von Transmissionsfiltern 556 gibt. Daher kann die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 12 die detektionsfähige Fläche durch Verringern der Abbildungsvergrößerung sofort vergrößern und den Durchsatz der Entschlüsselung der Basensequenz durch Erhöhen der Anzahl der messbaren Proben s verbessern.
  • [Dritte Ausführungsform]
  • Eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 13 gemäß einer dritten Ausführungsform ist schematisch so ausgelegt, dass sie eine Durchflusszelle 100, einen Reagensbehälter 200, eine Transporteinheit 300, eine Flüssigkeitszufuhreinheit 400, eine optische Einheit 503 und eine Datenverarbeitungseinheit 600 aufweist. Die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 13 unterscheidet sich in Bezug auf das Anregungsfilter 525 und das Transmissionsfilter 557 in der optischen Einheit 503 von jener gemäß der ersten Ausführungsform. In der optischen Einheit 503 sind gleiche Komponenten mit den gleichen Bezugszahlen wie in den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen bezeichnet, und es wird daher auf ihre detaillierte Beschreibung verzichtet.
  • In der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 13 gemäß der Ausführungsform weist die optische Einheit 503 eine optische Bestrahlungseinheit auf, die mehrere umschaltbare Anregungsfilter aufweist, welche Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlassen und das von der Lichtquelle emittierte Licht zur Anregung der Probe durchlassen.
  • 11 ist eine schematische Vorderansicht eines Beispiels der optischen Einheit der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung gemäß der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Bei der in 11 dargestellten Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 13 weist das Anregungsfilter 525 ein erstes Anregungsfilter 525a und ein zweites Anregungsfilter 525b auf.
  • Gemäß der Ausführungsform hat der dichroitische Spiegel 540 die Eigenschaft, alle oder einige der vom ersten Anregungsfilter 525a und vom zweiten Anregungsfilter 525b durchgelassenen Wellenlängenbänder zu reflektieren und alle oder einige der vom Fluoreszenzfilter 531 durchgelassenen Wellenlängenbänder durchzulassen.
  • Zusätzlich zeigt 12(a1) eine Wellenlängencharakteristik (Ausbreitungsrate) des auf die Probe s unter Verwendung des ersten Anregungsfilters 525a und des dichroitischen Spiegels 540 eingestrahlten Anregungslichts und zeigt 12(a2) eine Wellenlängencharakteristik (Ausbreitungsrate) des auf die Probe s unter Verwendung des Anregungsfilters 525b und des dichroitischen Spiegels 540 eingestrahlten zweiten Anregungslichts. Zusätzlich zeigt 12(b) eine durch Überlagern des dichroitischen Spiegels 540 und des Fluoreszenzfilters 531 erhaltene Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit).
  • Als nächstes wird gemäß der dritten Ausführungsform ein Verfahren zum Identifizieren der in der Probe s enthaltenen fluoreszierenden Farbstoffe beschrieben. In der folgenden Beschreibung wird angenommen, dass der dichroitische Spiegel 540 Licht in vom ersten und vom zweiten Anregungsfilter 525a und 525b durchgelassenen Wellenlängenbändern mit einer Effizienz von 100% durchlässt und Licht in einem vom Fluoreszenzfilter 531 durchgelassenen Wellenlängenband mit einer Wahrscheinlichkeit von 100% durchlässt. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit wird angenommen, dass die Charakteristiken (beispielsweise Charakteristiken eines Spektrums der Lichtquelle 510, die spektrale Empfindlichkeit jedes Detektionselements im zweidimensionalen Detektor 554 und dergleichen) mit Ausnahme jener der optischen Elemente in einem zu detektierenden Wellenlängenbereich einheitlich sind.
  • Zuerst werden, falls die Fluoreszenzmessung in einem Zustand ausgeführt wird, in dem das erste Anregungsfilter 525a in die optische Achse eingebracht ist, hauptsächlich der erste fluoreszierende Farbstoff und der dritte fluoreszierende Farbstoff angeregt und wird im zweidimensionalen Detektor 554 die Fluoreszenz von jedem der fluoreszierenden Farbstoffe mit dem in 12(c1) dargestellten Signalverhältnis (Intensitätsverhältnis) detektiert. Wenngleich der zweite fluoreszierende Farbstoff und der vierte fluoreszierende Farbstoff auch etwas Fluoreszenz emittieren, werden, weil die Fluoreszenzintensitäten schwach sind, diese aus den Analyseobjekten ausgeschlossen, indem die Filterfunktion auf der Grundlage der vom zweidimensionalen Bildsensor (Kamera) detektierten Signalintensitäten verwendet wird.
  • Als nächstes werden, falls die Fluoreszenzmessung in einem Zustand ausgeführt wird, in dem das zweite Anregungsfilter 525b in die optische Achse eingebracht ist, hauptsächlich der zweite fluoreszierende Farbstoff und der vierte fluoreszierende Farbstoff angeregt und wird im zweidimensionalen Detektor 554 die Fluoreszenz von jedem der fluoreszierenden Farbstoffe mit dem in 12(c2) dargestellten Signalverhältnis (Intensitätsverhältnis) detektiert. Wenngleich der erste fluoreszierende Farbstoff und der dritte fluoreszierende Farbstoff auch etwas Fluoreszenz emittieren, werden, weil die Fluoreszenzintensitäten schwach sind, diese aus den Analyseobjekten ausgeschlossen, indem die Filterfunktion auf der Grundlage der vom zweidimensionalen Bildsensor (Kamera) detektierten Signalintensitäten verwendet wird.
  • Dabei werden der erste fluoreszierende Farbstoff und der dritte fluoreszierende Farbstoff anhand der unter Verwendung des ersten Anregungsfilters 525a erhaltenen Intensitätsverhältnisse im G'-Filter und im R'-Filter identifiziert und werden gleichzeitig der erste und der dritte fluoreszierende Farbstoff identifiziert. Andererseits werden der zweite fluoreszierende Farbstoff und der vierte fluoreszierende Farbstoff anhand der unter Verwendung des zweiten Anregungsfilters 525b erhaltenen Intensitätsverhältnisse im G'-Filter und im R'-Filter (siehe 10) identifiziert und werden gleichzeitig der zweite und der vierte fluoreszierende Farbstoff identifiziert. Dadurch können die fluoreszierenden Farbstoffe eins bis vier in jeder Probe s identifiziert werden, so dass die Basensequenz des DNA-Fragments entschlüsselt werden kann.
  • Auf diese Weise kann, weil die optische Bestrahlungseinheit 521 mehrere umschaltbare Anregungsfilter 525 aufweist, die Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlassen, die Anzahl der gleichzeitig zu detektierenden fluoreszierenden Farbstoffe durch ein Anregungsfilter (sowohl das erste Anregungsfilter 525a als auch das zweite Anregungsfilter 525b) verringert werden, so dass die Farbtrennwirkung verbessert werden kann und die fluoreszierenden Farbstoffe zuverlässiger identifiziert werden können.
  • [Vierte Ausführungsform]
  • Eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 14 gemäß einer vierten Ausführungsform ist schematisch so ausgelegt, dass sie eine Durchflusszelle 100, einen Reagensbehälter 200, eine Transporteinheit 300, eine Flüssigkeitszufuhreinheit 400, eine optische Einheit 504 und eine Datenverarbeitungseinheit 600 aufweist. Die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 14 unterscheidet sich von jener gemäß der ersten Ausführungsform in Bezug auf die Lichtquelle und das Anregungsfilter in der optischen Einheit 504. In der optischen Einheit 504 sind gleiche Komponenten mit den gleichen Bezugszahlen wie in den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen bezeichnet, und es wird daher auf ihre detaillierte Beschreibung verzichtet.
  • Bei der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 14 gemäß der Ausführungsform weist die optische Einheit 504 mehrere Lichtquellen für die Anregung und eine optische Bestrahlungseinheit mit Anregungsfiltern, die für die jeweiligen Lichtquellen bereitgestellt sind und Licht mit mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlassen und die Probe mit Licht von den Lichtquellen, das von den Anregungsfiltern durchgelassen wurde, als Anregungslicht bestrahlen, auf.
  • 13 ist eine schematische Vorderansicht eines Beispiels einer optischen Einheit in der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 14 gemäß der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Bei der in 13 dargestellten Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 14 weist die optische Bestrahlungseinheit 522 eine erste Lichtquelle 510a, eine erste Kollimierlinse 523a, ein erstes Anregungsfilter 526a, eine zweite Lichtquelle 510b, eine zweite Kollimierlinse 523b, ein zweites Anregungsfilter 526b und einen dichroitischen Anregungsspiegel 528 auf.
  • Die erste und die zweite Lichtquelle 510a und 510b haben die gleiche Konfiguration wie die Lichtquelle 510 gemäß der ersten Ausführungsform. Zusätzlich haben die erste und die zweite Kollimierlinse 523a und 523b die gleiche Konfiguration wie die Kollimierlinse 523 gemäß der ersten Ausführungsform.
  • Das erste Anregungsfilter 526a lässt Licht in einem Wellenlängenband durch, welches den ersten und den dritten fluoreszierenden Farbstoff anregt. Das zweite Anregungsfilter 526b lässt Licht in einem Wellenlängenband durch, welches den zweiten und den vierten fluoreszierenden Farbstoff anregt. Das erste und das zweite Anregungsfilter 526a und 526b haben unterschiedliche Wellenlängencharakteristiken.
  • Der dichroitische Anregungsspiegel 528 lässt das vom ersten Anregungsfilter 526a durchgelassene Anregungslicht durch und reflektiert das vom zweiten Anregungsfilter 526b durchgelassene Anregungslicht. Durch den dichroitischen Anregungsspiegel 528 können die optische Achse des von der ersten Lichtquelle 510a emittieren Lichts und die optische Achse des von der zweiten Lichtquelle 510b emittieren Lichts übereinstimmen.
  • Zusätzlich ähneln die Wellenlängencharakteristiken (Ausbreitungsrate) des unter Verwendung der ersten Lichtquelle 510a und der zweiten Lichtquelle 510b auf die Probe s eingestrahlten Anregungslichts jenen in 12(a1) bzw. 12(a2).
  • Zusätzlich werden bei der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 14 gemäß der Ausführungsform die erste Lichtquelle 510a und die zweite Lichtquelle 510b alternierend eingeschaltet. Durch Einschaltender ersten Lichtquelle 510a werden der erste fluoreszierende Farbstoff und der dritte fluoreszierende Farbstoff gleichzeitig identifiziert, und durch Einschalten der zweiten Lichtquelle 510b werden der zweite fluoreszierende Farbstoff und der vierte fluoreszierende Farbstoff gleichzeitig identifiziert (die Identifikation des ersten und des dritten fluoreszierenden Farbstoffs und die Identifikation des zweiten und des vierten fluoreszierenden Farbstoffs geschehen getrennt).
  • Auf diese Weise werden mehrere Lichtquellen 510a und 510b für die Anregung und die optische Bestrahlungseinheit 522, die für jede Lichtquelle bereitgestellt ist und die Anregungsfilter 526a und 526b aufweist, welche Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlassen, bereitgestellt, so dass die fluoreszierenden Farbstoffe durch Verbessern der Farbtrennwirkung ähnlich wie bei der vorstehend beschriebenen dritten Ausführungsform zuverlässiger identifiziert werden können und es durch das Nichtvorhandensein eines mechanischen Wechselns der Anregungsfilter 526a und 526b möglich ist, durch mechanische Arbeitsvorgänge hervorgerufene Probleme in der Vorrichtung zu vermeiden, sodass erwartet wird, dass sich die Lebensdauer der Vorrichtung verlängert.
  • [Fünfte Ausführungsform]
  • Eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 15 gemäß einer fünften Ausführungsform ist schematisch so ausgelegt, dass sie eine Durchflusszelle 100, einen Reagensbehälter 200, eine Transporteinheit 300, eine Flüssigkeitszufuhreinheit 400, eine optische Einheit 505 und eine Datenverarbeitungseinheit 600 aufweist. Die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 15 unterscheidet sich in Bezug auf die Zerlegungseinheit und die zweidimensionale Detektionseinheit in der optischen Einheit 505 von jener der ersten Ausführungsform. Zusätzlich sind in der optischen Einheit 505 gleiche Komponenten mit den gleichen Bezugszahlen wie bei den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen bezeichnet und wird auf ihre detaillierte Beschreibung verzichtet.
  • 14 ist eine schematische Vorderansicht eines Beispiels der optischen Einheit in der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 15 gemäß der fünften Ausführungsform. Wie in 14 dargestellt ist, weist bei der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 15 die optische Einheit 505 eine Zerlegungseinheit 560 auf, welche das vom Fluoreszenzfilter 531 durchgelassene Licht für jede Wellenlänge mit einem vorgegebenen Verhältnis in zwei Anteile zerlegt. Insbesondere hat die Zerlegungseinheit 560 einen dichroitischen Spiegel, der einen Teil des vom Fluoreszenzfilter 531 durchgelassenen Lichts durchlässt und den restlichen Teil reflektiert. Gemäß der Ausführungsform ist der dichroitische Spiegel ein dichroitischer Zerlegungsspiegel 561. Der dichroitische Zerlegungsspiegel 561 hat die Eigenschaft, dass sich seine Durchlässigkeit (sein Reflexionsgrad) in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich im Wesentlichen von 0% bis 100% ändert.
  • 15(a) zeigt eine Wellenlängencharakteristik (Ausbreitungsrate) des unter Verwendung des Anregungsfilters 524 und des dichroitischen Spiegels 540 auf die Probe s eingestrahlten Anregungslichts. 15(b) ist eine schematische Ansicht einer Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) der Zerlegungseinheit 560. Die Wellenlängencharakteristik des dichroitischen Zerlegungsspiegels 561 ist in 15(b) durch eine unterbrochene Linie t2 angegeben und mit einer Wellenlängencharakteristik (Durchlässigkeit) verglichen, die durch Überlagern des dichroitischen Spiegels 540 und des Fluoreszenzfilters 531 erhalten wird, wie durch eine durchgezogene Linie t1 in 15(b) dargestellt ist.
  • Die durch die unterbrochene Linie t2 in 15(b) angegebene Wellenlängencharakteristik ist die Durchlässigkeit des dichroitischen Zerlegungsspiegels 561. Die Durchlässigkeit 0% bezeichnet einen Reflexionsgrad von 100%, und die Durchlässigkeit 100% bezeichnet einen Reflexionsgrad von 0%. Insbesondere haben die Durchlässigkeit und der Reflexionsgrad eine durch die folgende Formel (1) dargestellte Beziehung. Reflexionsgrad (%) = 100 – Durchlässigkeit (%) (1)
  • Daher wird bei einer Verwendung des dichroitischen Zerlegungsspiegels 561 mit der in 15(b) dargestellten Wellenlängencharakteristik die vom ersten und vom dritten fluoreszierenden Farbstoff emittierte Fluoreszenz hauptsächlich vom dichroitischen Zerlegungsspiegel 561 durchgelassen und von der ersten zweidimensionalen Detektionseinheit 551a detektiert und wird die vom zweiten und vierten fluoreszierenden Farbstoff emittierte Fluoreszenz hauptsächlich vom dichroitischen Zerlegungsspiegel 561 reflektiert und von der zweiten zweidimensionalen Detektionseinheit 551b detektiert.
  • Auf diese Weise ist die Zerlegungseinheit 560 der dichroitische Spiegel und ändert sich der Durchlassgrad des vom dichroitischen Spiegel durchgelassenen Lichts in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich im Wesentlichen von 0% bis 100%, so dass das vom Fluoreszenzfilter 531 durchgelassene Licht gleichmäßig zugeordnet werden kann, so dass die fluoreszierenden Farbstoffe zuverlässiger identifiziert werden können.
  • Zusätzlich weist, wie in 14 dargestellt ist, in der Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 15 die optische Einheit 505 die erste zweidimensionale Detektionseinheit 551a und die zweite zweidimensionale Detektionseinheit 551b auf. Die erste zweidimensionale Detektionseinheit 551a weist eine erste Tubuslinse 553a und einen ersten zweidimensionalen Detektor 559a auf, und die zweite zweidimensionale Detektionseinheit 551b weist eine zweite Tubuslinse 553b und einen zweiten zweidimensionalen Detektor 559b auf.
  • Die erste Tubuslinse 553a kondensiert das vom dichroitischen Zerlegungsspiegel 561 durchgelassene Licht und erzeugt ein Bild auf dem zweidimensionalen Bildsensor des ersten zweidimensionalen Detektors 559a, wie später beschrieben wird. Der erste zweidimensionale Detektor 559a weist mehrere Typen erster Transmissionsfilter auf, welche Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge von einem der beiden Strahlen, die von der Zerlegungseinheit 560 zerlegt wurden, durchlassen, und detektiert die Intensität des Lichts mit einer vorgegebenen Wellenlänge für jedes der ersten Transmissionsfilter. Dadurch werden die fluoreszierenden Farbstoffe gleichzeitig anhand der vom ersten und vom dritten fluoreszierenden Farbstoff emittierten Fluoreszenz identifiziert. Weil der erste zweidimensionale Detektor 559a zusätzlich jenem gemäß der vorstehend beschriebenen zweiten Ausführungsform ähnelt, wird auf die detaillierte Beschreibung davon verzichtet.
  • Die zweite Tubuslinse 553b kondensiert das vom dichroitischen Zerlegungsspiegel 561 reflektierte Licht und erzeugt ein Bild auf dem zweidimensionalen Bildsensor des zweiten zweidimensionalen Detektors 559b, wie später beschrieben wird. Der zweite zweidimensionale Detektor 559b weist mehrere Typen zweiter Transmissionsfilter auf, die Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge von einem der beiden Strahlen, die von der Zerlegungseinheit 560 zerlegt wurden, durchlassen, und detektiert die Intensität des Lichts mit einer vorgegebenen Wellenlänge für jedes der zweiten Transmissionsfilter. Dadurch werden die fluoreszierenden Farbstoffe gleichzeitig anhand der vom zweiten und vom vierten fluoreszierenden Farbstoff emittierten Fluoreszenz identifiziert. Weil der zweite zweidimensionale Detektor 559b zusätzlich jenem gemäß der vorstehend beschriebenen zweiten Ausführungsform ähnelt, wird auf die detaillierte Beschreibung davon verzichtet.
  • Auf diese Weise kann durch Bereitstellen der Zerlegungseinheit 560, welche das vom Fluoreszenzfilter 531 durchgelassene Licht für jede Wellenlänge mit jedem vorgegebenen Verhältnis in zwei Strahlen zerlegt, die Anzahl der Typen fluoreszierender Farbstoffe, die vom zweidimensionalen Detektor detektiert werden, verringert werden, so dass die Farbtrennwirkung verbessert werden kann und die fluoreszierenden Farbstoffe zuverlässiger identifiziert werden können.
  • Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Konfiguration der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern durch den Schutzumfang der Ansprüche definiert, und sie soll äquivalente Ausgestaltungen zu den Ansprüchen und alle Änderungen, die innerhalb des Schutzumfangs liegen, einschließen.
  • Beispielsweise ist bei den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen eins bis fünf jede Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung 11 bis 15 mit der Durchflusszelle 100, dem Reagensbehälter 200, der Transporteinheit 300, der Flüssigkeitszufuhreinheit 400, den optischen Einheiten 501 bis 505 und der Datenverarbeitungseinheit 600 versehen. Solange die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtungen 11 bis 15 jedoch Fluoreszenz detektieren können, die von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen, die in der Probe enthalten sind, durch Bestrahlung mit Anregungslicht emittiert wird, sind die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtungen nicht besonders beschränkt. Beispielsweise soll auch eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung, die nicht mit der Durchflusszelle 100, dem Reagensbehälter 200, der Transporteinheit 300, der Flüssigkeitszufuhreinheit 400 oder dergleichen versehen ist, als innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegend angesehen werden.
  • Zusätzlich ist gemäß der vorstehend beschriebenen Ausführungsform bei den Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtungen 11 bis 15 die Anzahl der Anregungswellenlängenbänder des auf die Probe s eingestrahlten Anregungslichts auf eine spezifische Anzahl gelegt. Allerdings kann eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung Anregungslicht in einer anderen als der spezifischen Anzahl von Anregungswellenlängenbändern einstrahlen, solange die Wirkung der vorliegenden Erfindung nicht behindert wird. Das auf die Probe s einzustrahlende Anregungslicht weist vorzugsweise wenigstens zwei Anregungswellenlängenbänder und bevorzugter wenigstens drei Anregungswellenlängenbänder auf. Daher kann die mehrfarbige Fluoreszenz gleichzeitig detektiert werden.
  • Gemäß den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen wird bei den Mehrfarbige-Fiuoreszenz-Analysevorrichtungen 11 bis 15 die Anzahl der Typen der Transmissionsfilter auf eine spezifische Anzahl gesetzt (beispielsweise sind gemäß der ersten Ausführungsform vier Typen von Transmissionsfiltern vorgesehen und sind gemäß der zweiten Ausführungsform zwei Typen von Transmissionsfiltern vorgesehen). Allerdings kann eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung auch mit einer anderen Anzahl von Typen von Transmissionsfiltern versehen werden als die spezifische Anzahl, solange die Wirkung der vorliegenden Erfindung nicht behindert wird. Daher kann ein Gleichgewicht zwischen einer sicheren Identifikation fluoreszierender Farbstoffe und der messbaren Anzahl von Proben (Durchsatz) pro Bestrahlung mit Anregungslicht geeignet ausgewählt werden.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die vorliegende Erfindung kann eine Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung bereitstellen, welche von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen emittierte Fluoreszenz schnell und zuverlässig identifizieren kann. Daher kann die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung geeignet für eine Fluoreszenzanalyse sich auf einen lebenden Körper beziehender Substanzen in der Art von DNA und RNA, die mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, verwendet werden.
  • Bezugszeichenliste
    • s
    Probe
    11 bis 15
    Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung
    100
    Durchflusszelle
    200
    Reagensbehälter
    300
    Transporteinheit
    400
    Flüssigkeitszufuhreinheit
    501 bis 505
    optische Einheit
    600
    Datenverarbeitungseinheit
    510
    Lichtquelle
    520 bis 522
    optische Bestrahlungseinheit
    524
    Anregungsfilter
    526a
    erstes Anregungsfilter
    526b
    zweites Anregungsfilter
    530
    Fluoreszenzkondensationseinheit
    531
    Fluoreszenzfilter
    540
    dichroitischer Spiegel
    550
    zweidimensionale Detektionseinheit
    554, 555
    zweidimensionaler Detektor
    556, 557
    Transmissionsfilter
    559a
    erster zweidimensionaler Detektor
    559b
    zweiter zweidimensionaler Detektor
    560
    Zerlegungseinheit

Claims (16)

  1. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung zum Detektieren der von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen, die in einer Probe enthalten sind, durch Bestrahlung mit Anregungslicht emittierten Fluoreszenz, wobei die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung Folgendes aufweist: eine Lichtquelle zur Anregung, eine optische Bestrahlungseinheit mit einem Anregungsfilter, das Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlässt und die Probe mit von der Lichtquelle emittiertem Licht, das vom Anregungsfilter als Anregungslicht durchgelassen wird, bestrahlt, eine Fluoreszenzkondensationseinheit mit einem Fluoreszenzfilter, das zumindest einen Teil der von der Probe durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierten Fluoreszenz durchlässt und Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern, welche das Anregungswellenlängenband nicht einschließen, durchlässt, und einen zweidimensionalen Detektor mit mehreren Typen von Transmissionsfiltern, welche Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge von dem vom Fluoreszenzfilter durchgelassenen Licht durchlassen, welcher die Intensität des von jedem der Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts für jedes Transmissionsfilter detektiert, wobei von wenigstens zwei Typen fluoreszierender Farbstoffe von den mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe emittiertes Licht unter Verwendung des zweidimensionalen Detektors gleichzeitig detektiert wird und die Typen der fluoreszierenden Farbstoffe anhand der Intensitäten des detektierten Lichts identifiziert werden.
  2. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach Anspruch 1, wobei es vier Typen von Transmissionsfiltern gibt.
  3. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach Anspruch 1, wobei es zwei Typen von Transmissionsfiltern gibt.
  4. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung zum Detektieren der von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen, die in einer Probe enthalten sind, durch Bestrahlung mit Anregungslicht emittierten Fluoreszenz, wobei die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung Folgendes aufweist: eine Lichtquelle zur Anregung, eine optische Bestrahlungseinheit mit mehreren Anregungsfiltern, die Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlassen und wechselbar sind und die Probe mit von der Lichtquelle emittiertem Licht als Anregungslicht, das vom Anregungsfilter durchgelassen wird, bestrahlen, eine Fluoreszenzkondensationseinheit mit einem Fluoreszenzfilter, das zumindest einen Teil der von der Probe durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierten Fluoreszenz durchlässt und Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern, welche das Anregungswellenlängenband nicht einschließen, durchlässt, und einen zweidimensionalen Detektor mit mehreren Typen von Transmissionsfiltern, welche Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge von dem vom Fluoreszenzfilter durchgelassenen Licht durchlassen, welcher die Intensität des von jedem der Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts für jedes Transmissionsfilter detektiert, wobei von wenigstens zwei Typen fluoreszierender Farbstoffe von den mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe emittiertes Licht unter Verwendung des zweidimensionalen Detektors gleichzeitig detektiert wird und die Typen der fluoreszierenden Farbstoffe anhand der Intensitäten des detektierten Lichts identifiziert werden.
  5. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach Anspruch 4, wobei es vier Typen von Transmissionsfiltern gibt.
  6. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach Anspruch 4, wobei es zwei Typen von Transmissionsfiltern gibt.
  7. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung zum Detektieren der von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen, die in einer Probe enthalten sind, durch Bestrahlung mit Anregungslicht emittierten Fluoreszenz, wobei die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung Folgendes aufweist: mehrere Lichtquellen zur Anregung, eine optische Bestrahlungseinheit mit einem Anregungsfilter, das für jede der Lichtquellen bereitgestellt ist, um Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchzulassen, welche die Probe mit von der Lichtquelle emittiertem Licht, das vom Anregungsfilter durchgelassen wurde, als Anregungslicht bestrahlt, eine Fluoreszenzkondensationseinheit mit einem Fluoreszenzfilter, das zumindest einen Teil der von der Probe durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierten Fluoreszenz durchlässt und Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern, welche das Anregungswellenlängenband nicht einschließen, durchlässt, und einen zweidimensionalen Detektor mit mehreren Typen von Transmissionsfiltern, welche Licht mit einer vorgegebenen Wellenlänge von dem vom Fluoreszenzfilter durchgelassenen Licht durchlassen, welcher die Intensität des von jedem der Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts für jedes Transmissionsfilter detektiert, wobei eine der mehreren Lichtquellen eingeschaltet wird, um gleichzeitig von wenigstens zwei Typen fluoreszierender Farbstoffe von den mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe emittiertes Licht unter Verwendung des zweidimensionalen Detektors zu detektieren, und wobei die Typen der fluoreszierenden Farbstoffe anhand Intensitäten des detektierten Lichts identifiziert werden.
  8. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach Anspruch 7, wobei es vier Typen von Transmissionsfiltern gibt.
  9. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach Anspruch 7, wobei es zwei Typen von Transmissionsfiltern gibt.
  10. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung zum Detektieren der von mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen, die in einer Probe enthalten sind, durch Bestrahlung mit Anregungslicht emittierten Fluoreszenz, wobei die Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung Folgendes aufweist: eine Lichtquelle zur Anregung, eine optische Bestrahlungseinheit mit einem Anregungsfilter, das Licht in mehreren verschiedenen Anregungswellenlängenbändern durchlässt und die Probe mit von der Lichtquelle emittiertem Licht, das vom Anregungsfilter als Anregungslicht durchgelassen wird, bestrahlt, eine Fluoreszenzkondensationseinheit mit einem Fluoreszenzfilter, das zumindest einen Teil der von der Probe durch Bestrahlung mit dem Anregungslicht emittierten Fluoreszenz durchlässt und Licht in mehreren Transmissionswellenlängenbändern, welche das Anregungswellenlängenband nicht einschließen, durchlässt, eine Zerlegungseinheit, welche das vom Fluoreszenzfilter durchgelassene Licht mit einem vorgegebenen Verhältnis für jede Wellenlänge in zwei Anteile zerlegt, einen ersten zweidimensionalen Detektor mit mehreren Typen erster Transmissionsfilter, welche Licht mit einem vorgegebenen Wellenlängenbereich von einem der beiden von der Zerlegungseinheit zerlegten Lichtanteile durchlässt und die Intensität des von jedem der ersten Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts für jedes der ersten Transmissionsfilter detektiert, und einen zweiten zweidimensionalen Detektor mit mehreren Typen zweiter Transmissionsfilter, welche Licht mit einem vorgegebenen Wellenlängenbereich von dem anderen der beiden von der Zerlegungseinheit zerlegten Lichtanteile durchlässt und die Intensität des von jedem der zweiten Transmissionsfilter durchgelassenen Lichts für jedes der zweiten Transmissionsfilter detektiert, wobei von wenigstens zwei Typen fluoreszierender Farbstoffe von den mehreren Typen fluoreszierender Farbstoffe emittiertes Licht unter Verwendung des ersten und des zweiten zweidimensionalen Detektors gleichzeitig detektiert wird und die Typen der fluoreszierenden Farbstoffe anhand der Intensitäten des detektierten Lichts identifiziert werden.
  11. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach Anspruch 10, wobei es vier Typen erster bzw. zweiter Transmissionsfilter gibt.
  12. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach Anspruch 10, wobei es zwei Typen erster bzw. zweiter Transmissionsfilter gibt.
  13. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach Anspruch 10 bis 12, wobei die Zerlegungseinheit einen dichroitischen Spiegel aufweist, der einen Teil des vom Fluoreszenzfilter durchgelassenen Lichts durchlässt und den restlichen Teil reflektiert, wobei sich der Durchlassgrad des vom dichroitischen Spiegel durchgelassenen Lichts in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich im Wesentlichen von 0% bis 100% ändert.
  14. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das auf die Probe einzustrahlende Anregungslicht wenigstens zwei Anregungswellenlängenbänder aufweist.
  15. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das auf die Probe einzustrahlende Anregungslicht wenigstens drei Anregungswellenlängenbänder aufweist.
  16. Mehrfarbige-Fluoreszenz-Analysevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, welche ferner eine Datenverarbeitungseinheit aufweist, welche zwei oder mehr Typen fluoreszierender Farbstoffe anhand der Intensität des vom zweidimensionalen Detektor detektierten Lichts identifiziert.
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