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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis von in biologischen oder chemischen Proben vorliegenden Substanzen, welche jeweils bei Reaktion mit einem Reagenz ein optisch erfassbares Signal liefern, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bzw. 4.
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Untersuchungen biologischer und chemischer Proben sind immer häufiger nötig. Dabei müssen oft ganze Testserien bearbeitet werden, die natürlich möglichst effizient durchgeführt werden sollen. Hierzu gehören beispielsweise die sogenannten ELISA-Tests (”ELISA” = ”Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay”), die aus der klinischen Diagnostik und der Live-Science-Forschung nicht mehr wegzudenken sind.
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Aus der
DE 10 2008 022 835 B3 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung als Analysegerät zum Untersuchen von biologischen oder chemischen Proben, welche jeweils bei Reaktion mit einem Reagenz einen Farbumschlag und/oder eine Fluoreszenz erfahren, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bzw. 4 bekannt, womit auch ELISA-Tests ausgeführt werden können. Dabei wird ein Probenträger (wie z. B. eine Mikrotiterplatte) verwendet, der eine Vielzahl – jedenfalls mehr als zwei – von Behältern zur Aufnahme von Proben aufweist. Die Behälter werden auch als Vertiefungen, Kavitäten oder Wells, gelegentlich auch als Töpfchen, bezeichnet. Dem Analysegerät nachgeschaltet ist eine Auswerteeinrichtung beispielsweise in Form von mit einem Computer verbundenen, nicht zum Analysegerät gehörigen Fotometern vorgesehen, womit die Proben untersucht bzw. analysiert oder ausgewertet werden können. Unter Farbumschlag ist übrigens auch jedwede Farbänderung zu verstehen.
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Da für die Fotometer je nach Art der zu untersuchenden Proben bzw. der zu erwartenden Reaktionen, Farbumschläge und/oder Fluoreszenzen unterschiedliche (Farb-)Filter etc. eingesetzt werden müssen, verzögert sich die Auswertung durch die separaten Messungen mit den verschiedenen Filtern, und der Automatisierungsgrad wird beispielsweise wegen vorzunehmender Filterwechsel beeinträchtigt.
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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die genannten Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen und eine möglichst vollständige Automatisierung sowie größtmögliche Beschleunigung der auftretenden Prozesse, was sich auch auf die Auswertung erstrecken soll, zu ermöglichen.
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Diese Aufgabe wird mit einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bzw. einem Verfahren gemäß Anspruch 4, einem Computerprogrammprodukt bzw. Computerprogramm gemäß Anspruch 9 sowie einem Datenträger gemäß Anspruch 10 mit einem darauf gespeicherten Computerprogrammprodukt gelöst. vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum Nachweis von in biologischen oder chemischen Proben vorliegenden Substanzen, welche jeweils bei Reaktion mit einem Reagenz – das vorzugsweise als Flüssigkeit vorliegt – ein optisch erfassbares Signal liefern, weist einen Probenträger wie beispielsweise eine Mikrotiterplatte auf, in dem mindestens zwei Behälter wie z. B. Näpfchen, Wells, Kavitäten, Vertiefungen, Töpfchen etc. vorgesehen sind, um darin Proben aufnehmen zu können. Die genaue Form dieser Behälter kann großen Variationen unterliegen und spielt für die vorliegende Erfindung keine entscheidende Rolle. In der Praxis sind meist nicht nur zwei, sondern eine Vielzahl von derartigen Behältern vorgesehen, die typischerweise standardisierte ”Footprints” bzw. Anordnungsmuster aufweisen, was jedoch ebenfalls nicht erfindungswesentlich ist. Außerdem weist die erfindungsgemäße Vorrichtung für die Auswertung (anstatt von nachgeschalteten Fotometern wie bei der
DE 10 2008 022 835 B3 ) eine Kamera auf, die beispielsweise eine CCD-Kamera sein kann und vorzugsweise eine elektronische Matrix-Kamera wie z. B. eine CMOS-Kamera ist, und die hinsichtlich Brennweite und Schärfe bzw. Entfernungseinstellung so aufgebaut bzw. eingestellt ist, dass sie mindestens zwei Behälter in nur einem (einzigen) Bild abbilden kann. Es ist hier zu betonen, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist, dass die Kamera nur ein einzelnes Bild aufnimmt, sondern dass sie selbstverständlich auch mehrere Bilder zur nachfolgenden Auswertung aufnehmen kann. Ferner umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Auswerteeinrichtung zum Auswerten der Proben anhand des aufgenommenen Bildes, womit die in dem Bild enthaltenen Signale analysiert werden können.
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Der große Vorteil bei dieser erfindungsgemäßen Lösung besteht darin, dass nur ein einziger Schritt des Aufnehmens eines Bildes bzw. nur eines einzigen Bildes zur Erfassung der jeweiligen Spektren bzw. Signale von mehreren Reagenzien erforderlich ist, und dass außerdem nur ein Schritt des Auswertens des betreffenden Bildes – mit mehreren Spektren – durchgeführt werden muss. Durch die gleichzeitige Aufnahme und nachfolgend – ggf. unter Zwischenspeicherung des Bildes – (zumindest fast) gleichzeitige bzw. gemeinsame Auswertung mehrerer Spektren bzw. Signale, besonders optisch detektierbarer Signale, kann ein hoher Durchsatz an Proben und damit eine hohe Bearbeitungsgeschwindigkeit erzielt werden. Da keine Filterwechsel oder ähnliches erforderlich sind, wird ferner ein hoher Automatisierungsgrad erzielt. Darüber hinaus können durch den Einsatz der Kamera völlig unterschiedliche Reaktionstests, wie beispielsweise Aufnahme bzw. Analyse von Fluoreszenzen sowie unterschiedlichste Farbreaktionen, bei den verschiedenen Reagenzien in einem Behälter eines Probenträgers durchgeführt und ausgewertet werden. Mit der entsprechenden Software lassen sich diese Reaktionstests dann in einem einzigen Schritt (und in einer einzigen Vorrichtung) durchführen.
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Es ist bevorzugt, dass die Kamera nicht nur einen Teil der Behälter des Probenträgers, sondern alle Behälter in einem einzigen Bild aufnehmen kann. Hierdurch werden eine noch größere Effizienz und Bearbeitungsgeschwindigkeit sowie ein noch besserer Automatisierungsgrad ermöglicht.
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Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung können sich in einem einzigen Behälter – aber auch in mehreren oder sogar allen Behältern – mehrere verschiedene Reagenzien befinden. So können beispielsweise in einem Behälter unterschiedliche Reagenzien wie Antigene/Antikörper zugegeben sein und verschiedenste Signale wie z. B. Fluoreszenzen oder Farbumschläge liefern, die mit der Kamera in einem einzigen Bild oder wahlweise in mehreren Bildern aufzunehmen und danach mittels geeigneter Software auszuwerten sind. Auf diese Weise können aus einer minimalen Menge an Probe – wozu beispielsweise Blut, Serum und Zellflüssigkeit zählen – verschiedene messbare nebeneinander ablaufende Reaktionen erfasst erhalten werden. Dadurch kann die Ausbeute pro Serummenge erhöht bzw. die benötigte Serummenge deutlich reduziert werden, um eine Vielzahl von unterschiedlichen Mess- bzw. Diagnosewerten zu erhalten.
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Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweis von in biologischen oder chemischen Proben vorliegenden Substanzen, welche jeweils bei Reaktion mit einem Reagenz ein optisch erfassbares Signal liefern, umfasst folgende Schritte: Zunächst werden mindestens zwei (verschiedene) Reagenzien in mindestens zwei Behälter gegeben, wonach Probe zugegeben wird. Dann wird ein Bild durch eine Kamera (bevorzugt ist eine CMOS-Kamera) derart aufgenommen, dass auf dem Bild die mindestens zwei Proben bzw. deren Behälter abgebildet sind. Anschließend wird das Bild durch Analysieren der sich nach Zugabe der Reagenzien ergebenden Signale in dem Bild ausgewertet, was üblicherweise durch eine entsprechende Software mittels eines Computers geschieht. Dieses Verfahren bietet die gleichen Vorteile, wie sie bereits in Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung beschrieben wurden. Dies gilt jeweils auch für bevorzugte Ausführungsformen der Verfahren.
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Vorzugsweise werden zumindest zu einem Teil der Behälter jeweils mindestens zwei Reagenzien zugegeben, wonach die Behälter in dem Bild abgebildet und dann in einem gemeinsamen, d. h. in vielen Fällen einzigen, Verfahrensschritt ausgewertet werden.
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Des Weiteren ist es von Vorteil, wenn alle Proben in dem Probenträger in einem einzigen Bild abgebildet und in einem gemeinsamen Verfahrensschritt ausgewertet werden.
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Üblicherweise und mit Vorteil erfolgt das Auswerten durch Vergleichen des jeweiligen Spektrums mit einem vorgegebenen Wert bzw. Referenzspektrum, vorzugsweise durch Vergleichen mit mehreren vorgegebenen Werten bzw. Referenzspektren. Das Referenzspektrum bzw. die Referenzspektren werden aus einer bzw. mehreren Referenz- oder Nullproben erhalten, die in einem bzw. mehreren Behältern aufgenommen sind.
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In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird die Intensität des bzw. der erfassten Signale mit der Intensität von Signalen verglichen, die mittels bekannter Mengen der zu bestimmenden Substanz erzeugt wurde. Durch Zuordnen der Signalintensität ist auch eine quantitative Bestimmung der Menge der in der Probe vorliegenden Substanz möglich.
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In einer zweckmäßigen Ausführung der Erfindung wird das Vorliegen von Substanzen in der jeweiligen Probe mittels klassischen immunologischen Verfahren wie z. B. Elisa durchgeführt. Dabei eignet sich die erfindungsgemäße Vorgehensweise auch zur gleichzeitigen Bestimmung und zum Nachweis verschiedener Klassen von Antikörpern bzw. Immunglobulin wie IgA, IgM, IgG etc. Hierzu wird nach dem Binden der jeweiligen Immunglobuline an ein immobilisiertes Antigen der Behälter mit mindestens einem markierten Antikörper versetzt, der spezifisch mit einer der Immunglobin-Unterklassen bindet. Wird eine Mischung von unterschiedlich markierten Antikörpern verwendet, die jeweils für eine andere Subklasse spezifisch sind, so kann mittels einer einzigen Aufnahme das Auftreten dieser Immunglobuline nebeneinander nachgewiesen werden und so eine Subklassendifferenzierung von Immunglobulin erfolgen.
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Selbstverständlich sind verschiedenste Konfigurationen der Anordnung der Reagenzien in einem Behälter möglich. So bietet es sich beispielsweise an, die unterschiedlichen Reagenzien in Form einer quadratischen oder rechteckigen Matrix (oder einem Großteil davon) in dem Behälter anzuordnen, sofern die Anzahl der zu platzierenden Reagenzien dies ermöglicht. Alternativ kann die Anordnung der Reagenzien so vorgenommen werden, dass bei gegebener Anzahl an Reagenzien der Abstand der einzelnen Reagenzien voneinander maximiert wird. Es ist auch möglich, verschiedene Reagenzien auf einem geordneten Muster wie z. B. konzentrischen Kreisen oder aber willkürlich auf dem Boden des Behälters aufzubringen, wo sie fixiert bleiben, und anschließend eine Probe wie z. B. Blut bzw. Serum in den Behälter einzubringen.
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Erfindungsgemäß werden ferner ein Computerprogrammprodukt bzw. Computerprogramm für eine vorgenannte Auswerteeinrichtung, ein Datenträger mit einem darauf gespeicherten Computerprogrammprodukt sowie die Verwendung einer Kamera zum Nachweis von in biologischen oder chemischen Proben vorliegenden Substanzen, welche jeweils bei Reaktion mit einem Reagenz ein optisch erfassbares Signal liefern, als zur vorliegenden Erfindung gehörig angesehen.
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Sofern von ”Zugeben von Reagenzien zu einer Probe in einem Behälter” die Rede ist, soll darunter auch das Zugeben einer Probe zu einem in einem Behälter befindlichen Reagenz verstanden werden, da es in erster Linie auf die Tatsache des Zusammenbringens von Probe und Reagenz ankommt und nicht die Reihenfolge.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung und/oder das erfindungsgemäße Verfahren können/kann eingesetzt werden, um vor einer Bildaufnahme eines oder mehrerer Behälter, in der/denen eine oder mehrere Proben angeordnet ist/sind, das Volumen der Probe oder der Proben zu kontrollieren. Die Bildaufnahme kann erfindungsgemäß dadurch erfolgen, dass die Kamera vor der Aufnahme des Bildes von dem oder den Behältern weg, beispielsweise um im Wesentlichen 90 Grad, in Richtung einer Grenzlinie zwischen der in dem Behälter oder in den Behältern anzuordnenden Probe und einem ersten Fluid, die in einer Pipette angeordnet sind, gedreht oder geschwenkt wird. Alternativ kann die Bildaufnahme erfindungsgemäß dadurch erfolgen, dass die Kamera vor der Aufnahme des Bildes von dem oder den Behältern weg, beispielsweise um im Wesentlichen 90 Grad, in Richtung eines ersten Abschnitts einer ersten Pipette und eines zweiten Abschnittes einer zweiten Pipette, die zusammen auf einem mit der Kamera aufgenommenen Bild abgebildet sind, gedreht oder geschwenkt wird.
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Vor der Aufnahme des Bildes von dem oder den Behältern kann die Kamera also zur Aufnahme eines weiteren Bildes derart gedreht oder geschwenkt werden, dass auf dem weiteren Bild eine Grenzlinie zwischen der Probe und einem ersten Fluid, die in einer Pipette angeordnet sind, oder der erste Abschnitt der ersten Pipette und der zweite Abschnitt der zweiten Pipette zusammen abbildbar ist/sind.
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In einer Ausführungsform ist die Kamera zur Aufnahme des Bildes von der Pipette oder den Pipetten vertikal auf die Pipette(n) und nach dieser Bildaufnahme horizontal auf einen oder mehrere unterhalb der Kamera angeordnete Behälter gerichtet. Entsprechende Vorrichtungen und Verfahren zur Bildaufnahme und Auswertung eines aufgenommenen Bildes von einer Grenzlinie zwischen einer Probe und einem ersten Fluid, die in einer Pipette angeordnet sind, oder eines ersten Abschnitts einer ersten Pipette und eines zweiten Abschnittes einer zweiten Pipette, die zusammen auf einem mit der Kamera aufgenommenen Bild abgebildet sind, bei denen die erfindungsgemäße Vorrichtung und/oder das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können, sind in den parallelen deutschen Patentanmeldungen der Anmelderin der vorliegenden Anmeldung mit dem Aktenzeichen DE 10 2011 ... mit dem internen Aktenzeichen AES 80204 und DE 10 2011 ... mit dem internen Aktenzeichen AES 80207 beschrieben, die jeweils durch Bezugnahme als Offenbarung in die vorliegende Anmeldung mit aufgenommen werden.
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Weitere Vorteile, Merkmale und Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten, jedoch nicht beschränkenden Ausführungsformen der Erfindung anhand der schematischen und nicht maßstabsgetreuen Zeichnungen. Es zeigen:
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1 in stark schematisierter Darstellung eine Seitenansicht einer ersten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, und
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2 in Draufsicht eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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1 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung 10 zum Untersuchen von biologischen oder chemischen Proben, welche jeweils bei Reaktion mit einem Reagenz einen Farbumschlag und/oder eine Fluoreszenz erfahren bzw. zeigen oder verursachen. In einem Probenträger 20 sind mehrere Behälter 22 vorgesehen, in denen Proben 9 bzw. Reagenzien wie Antikörper und/oder Antigene eingebracht sind oder in die Proben 9 bzw. Reagenzien eingebracht werden können. Um die Proben 9 beispielsweise auf das Vorhandensein bestimmter Antigene oder Antikörper zu testen, werden mittels Pipetten 28 entsprechende Reagenzien 8, die hier schematisch als fallende Tröpfchen dargestellt sind, in die Behälter 22 zu den Proben 9 gegeben, worauf die Proben 9 mit korrespondierenden optischen Signalen wie Farbreaktionen, Fluoreszenzen etc. reagieren können. Für eine gute Ausleuchtung sind Lampen 50 vorgesehen, von denen bei dieser Ausführungsform zwei exemplarisch dargestellt sind.
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Um eine effiziente, schnelle und automatisierte Auswertung der Reaktionen der Proben 9 mit den Reagenzien 8 vornehmen zu können, ist erfindungsgemäß eine Kamera 30 vorgesehen, wofür sich insbesondere eine CMOS-Kamera eignet, die so angeordnet ist, dass sie den gesamten Probenträger 20 mit allen Behältern 22 aufnimmt, also ein Bild 32 davon anfertigt. Selbstverständlich kann alternativ nur ein Teil der Behälter 22 aufgenommen und ausgewertet werden, wenn dies gewünscht ist. Dies bedeutet insbesondere, dass das Objektiv 31 der Kamera 30 eine geeignete Brennweite aufweist und eine korrekte Entfernungseinstellung ermöglicht.
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Des von der Kamera 30 aufgenommene Bild 32 wird einem als Auswerteeinrichtung dienenden Computer 40 zugeführt, der die in dem Bild 32 enthaltenen Signale 34 auf einem Monitor 42 darstellt. Der Computer kann in üblicher Weise über eine Tastatur 44 und/oder eine Maus 46 gesteuert werden. Mittels einer geeigneten, auf dem Computer 40 lauffähigen, Software bzw. einem Computerprogramm 90, welches z. B. auf einer CD 80 als Datenträger gespeichert sein kann, werden dann die Farbspektren ausgewertet, indem sie mit entsprechenden Referenzspektren und/oder Referenzwerten verglichen werden. Erfindungsgemäß kann dabei die Auswertung aller Spektren gleichzeitig (oder zumindest fast gleichzeitig) vorgenommen werden. Jeder Probe 9 bzw. jedem Behälter 22 wird dabei automatisch – z. B. unter Verwendung von Strichcodes – das entsprechende Spektrum 34 zugeordnet und beispielsweise angegeben, welcher Antikörper bzw. welches Antigen nachgewiesen wurde. Es versteht sich von selbst, dass die Proben 9 jeweils identisch sein und jeweils unterschiedliche Reagenzien 8 zugegeben werden können; alternativ können sich die Proben 9 voneinander unterscheiden und beispielsweise mit einem einzigen Reagenz 8 oder einer Serie von unterschiedlichen Reagenzien 8 beaufschlagt werden. Auch eine Kombination dieser Vorgehensweisen ist möglich.
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Eine besonders ressourcensparende zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, in die Probe(n) 9 in einem Behälter 22 – oder in mehreren oder sogar allen Behältern 22 – zwei oder mehr Reagenzien 8 einzubringen und die resultierenden Reaktionen gleichzeitig nebeneinander zu erfassen und ggf. elektronisch zu speichern. Die Auswertung dieser Signale mittels einer Datenbank kann ebenfalls gleichzeitig oder auch zu einem beliebigen Zeitpunkt später erfolgen.
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In beispielhafter Weise ist in 2 in Draufsicht ein Ausschnitt eines Probenträgers 20 mit mehreren Behältern 22 dargestellt, die jeweils mit der gleichen Probe 9 beaufschlagt worden sind. In den in 2 links oben dargestellten Behälter sind zuvor ein erstes Reagenz 8a und ein zweites Reagenz 8b auf dem Boden des Behälters 22 aufgebracht worden, wo sie immobilisiert bleiben, während sich im rechts daneben dargestellten Behälter 22 ein drittes Reagenz 8c, ein viertes Reagenz 8d sowie ein fünftes Reagenz 8e befinden. Die drei Reagenzien 8c–8e sind in beispielhafter Weise gemäß Darstellung in 2 in einer Reihe angeordnet.
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Alternativ kann auch zuerst die Probe 9 (oder mehrere verschiedene Proben) in Behälter 22 eingebracht und anschließend Reagenzien zugegeben werden.
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In analoger Weise kann jeder einzelne oder eine gewünschte Anzahl der Behälter 22 mehrfach – also mit verschiedenen – Reagenzien 8 belegt werden. Nach dem Erstellen eines Bilds 32 dieser Behälter 22 mit den Proben 9 und den Reagenzien 8a-8e kann dann die Auswertung anhand der aufgetretenen Farbspektren gemeinsam in schon beschriebener Weise erfolgen.
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Damit können schon kleinste Mengen an Probenflüssigkeit auf viele verschiedene Reaktionen untersucht werden. Dadurch können aus einer minimalen Menge an Probenflüssigkeit – wie beispielsweise Blut, Serum und Zellflüssigkeit – bereits unterschiedliche messbare Reaktionen erhalten werden, wodurch die Ausbeute pro Probenmenge erhöht und somit die benötigte Probenmenge deutlich reduziert werden kann, um eine Vielzahl von unterschiedlichen Mess- bzw. Diagnosewerten zu erhalten. Es ist klar, dass diese Methode ihre Grenzen in der optischen Auflösung der Kamera 30 bzw. deren Objektiv 31 und/oder der angeschlossenen Bildverarbeitung sowie der Diffusion und evtl. sogar Vermischung der Reagenzien 8 in den einzelnen Behältern 22 findet.
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Hinsichtlich der Auswertung ist zu erwähnen, dass zur Quantifizierung an einigen auch als Dots bezeichneten Stellen – vorzugsweise an einer Reihe bzw. Spalte oder einer Zeile – Referenzen angeordnet werden, um mittels einer Verdünnungsreihe einen Standard zu bilden.
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Es ist festzuhalten, dass die unter Bezug auf die dargestellten Ausführungsformen der Vorrichtung und des Verfahrens beschriebenen Merkmale der Erfindung, wie beispielsweise Ausführung und Gestalt der Behälter, der Kamera etc., auch bei anderen Ausführungsformen vorhanden sein können, außer wenn es anders angegeben ist oder sich aus technischen Gründen von selbst verbietet. Außerdem ist klar, dass Vorteile und Merkmale, die im Hinblick auf das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben wurden, auch für entsprechende Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung gelten und umgekehrt.
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Bezugszeichenliste
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- 8
- Reagenz
- 8a
- erstes Reagenz
- 8b
- zweites Reagenz
- 8c
- drittes Reagenz
- 8d
- viertes Reagenz
- 8e
- fünftes Reagenz
- 9
- Probe
- 10
- Vorrichtung
- 20
- Probenträger
- 22
- Behälter
- 28
- Pipette
- 30
- Kamera
- 31
- Objektiv
- 32
- Bild
- 34
- Farbspektrum
- 40
- Auswerteeinrichtung/Computer
- 42
- Monitor
- 44
- Tastatur
- 46
- Maus
- 50
- Lampe
- 80
- Datenträger/CD
- 90
- Computerprogramm
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102008022835 B3 [0003, 0007]
