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Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen und ein Verfahren zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen im Cluster-Schema, indem man eine chemische Reaktion einer DNA-Probe mit einem Reagenz auf einem Substrat hervorruft und die DNA-Probe auf der Basis von Fluoreszenzbildern, die von der DNA-Probe emittiert werden, analysiert.
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Stand der Technik
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Eine Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen (DNA-Sequenziergerät) im Cluster-Schema führt wiederholt auf einem Substrat eine komplementäre DNA-Verlängerungsreaktion an einer amplifizierten Proben-DNA durch. Die zu verlängernde DNA wird mit vier Fluoreszenzkörpern mit unterschiedlichen lichtemittierenden Banden modifiziert, so dass die Sequenzen davon erkannt werden können. Ein Substrat wird mit Anregungslicht für jede Verlängerungsreaktion bestrahlt und ein Bild des von der verlängerten komplementären DNA emittierten Fluoreszenzlichts wird von einer Kamera mit einem Bildsensor, zum Beispiel einem CCD-Sensor oder einem C-MOS-Sensor, der daran angebracht ist, aufgenommen. Ein Typ des Fluoreszenzkörpers wird auf der Grundlage einer Farbe des Bilds bestimmt und eine Sequenz der Proben-DNA wird bestimmt.
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Da vier Typen von Fluoreszenzkörpern entsprechend den Typen von Basen (Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin) in DNA vorliegen, werden typischerweise vier Bilder mit vier Farben, nämlich Rot, Gelb, Grün und Blau, in einem einzelnen Betrachtungsfeld (als Panel bezeichnet) des Substrats aufgenommen. Ferner sind unter Rot, Gelb, Grün und Blau lediglich vier Banden mit unterschiedlichen Wellenlängen zu verstehen, die nicht notwendigerweise dem Farbempfinden des Menschen entsprechen. Der Vorgang der Bewegung des Substrats nach Abbildung eines Panels und der Abbildung des nächsten Panels wird wiederholt. Die Anzahl der abzubildenden Panels für eine Probe beträgt mehrere hundert bis mehrere tausend Panels. Der Vorgang wird so oft wiederholt, wie es der Basenlänge (mehrere Hundert) in der zu analysierenden DNA entspricht. Daher beträgt die Gesamtzahl von aufzunehmenden Bildern mehrere Hunderttausend bis mehrere Millionen für eine Probe. Die Informationen, wie die Sequenz und die Intensität von Farben des emittierten Fluoreszenzlichts, werden aus den aufgenommenen Bilddaten extrahiert und eine DNA-Sequenz wird bestimmt.
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Gemäß dem ältesten Verfahren zum Aufnehmen von Bildern der vier Farben für ein Panel werden vier Filter mit verschiedenen Durchlässigkeitsbereichen mechanisch geschaltet und die Bilder werden nacheinander von einem einzelnen Bildsensor aufgenommen, wie in PTL 1 beschrieben ist. Das Schema wird als ein Filterrad-Schema bezeichnet. Dieses Schema wird auch in einem Fluoreszenzmikroskop für allgemeine Zwecke eingesetzt und stellt ein vielseitiges Verfahren dar. Da jedoch die Bilder nacheinander aufgenommen werden und die für das mechanische Schalten der Filter erforderliche Zeitspanne (die Belichtungszeit für ein Bild beträgt etwa 0,1 Sekunden und die für das mechanische Schalten der Filter erforderliche Zeitspanne liegt in der gleichen Größenordnung, selbst wenn das Schalten so rasch wie möglich durchgeführt wird) nicht vernachlässigt werden kann, ergibt sich eine lange Zeitspanne für die Abbildung eines Panels. Infolgedessen liegt die gesamte Abbildungszeit im Bereich von mehreren Tagen bis zu einer Woche, und zwar im Fall einer Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen im Cluster-Schema, wobei eine beträchtlich große Anzahl an Panels aufgenommen wird. Dies stellt einen der wichtigsten Gründe der Zunahme der Analysendauer aufgrund der für die Abbildung erforderlichen Zeitspanne dar. Außerdem wird durch den mechanischen Hochgeschwindigkeitsvorgang die Wärmentwicklung erhöht und es kommt leicht zu Fehlfunktionen.
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Da Fluoreszenzkörper mit verschiedenen lichtemittierenden Banden typischerweise unterschiedliche Anregungswellenlängenbanden aufweisen, wird eine weiße Lichtquelle als Anregungslichtquelle verwendet, ein Filter auf der Anregungsseite wird gleichzeitig mit dem Umschalten der Nachweiswellenlängenbande umgeschaltet und ein nachzuweisender Fluoreszenzkörper wird in wirksamer Weise beim Filterrad-Schema angeregt. Dabei ergeben sich vier Anregungswellenlängenbanden, entsprechend der Anzahl der erfassten Wellenlängenbanden. Es ist zwar im Allgemeinen schwierig, sämtliche vier Fluoreszenzkörper mit einer einzigen Wellenlängenbande anzuregen, es ist aber möglich, zwei Fluoreszenzkörper in wirksamer Weise mit einer einzigen Wellenlängenbande anzuregen, da die Anregungswellenlängenbande einen begrenzten Bereich aufweist und Fluoreszenzkörper mit ähnlichen lichtemittierenden Wellenlängen überlappende Anregungsbanden aufweisen. Daher ist es möglich, in wirksamer Weise sämtliche vier Fluoreszenzkörper mit zwei Wellenlängenbanden anzuregen.
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Gemäß NPL 1 werden vier Fluoreszenzkörper gleichzeitig mit zwei Lasern mit verschiedenen Wellenlängen angeregt. Die in NPL 1 beschriebene Vorrichtung teilt von einer DNA emittiertes Licht mit drei dichroitischen Spiegeln in vier Wellenlängenbanden auf und erhält unter Verwendung von vier Bildsensoren gleichzeitig vier Bilder. Da ferner die in NPL 1 beschriebene Vorrichtung kein mechanisches Schalten von Filtern vorsieht und gleichzeitig die vier Bilder aufnimmt, kann die Vorrichtung die einem Panel entsprechenden Bilder in einer Zeitspanne aufnehmen, die 1/4 oder weniger der Zeitspanne von PTL 1 entspricht. Jedoch erfordert die Verwendung von vier Bildsensoren eine groß bemessene und teuere Vorrichtung im Vergleich zu dem in PTL 1 beschriebenen Schema.
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Literaturverzeichnis
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Patentliteratur
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- PTL 1: US 2011/0236964 A1
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Nichtpatentliteratur
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- NPL 1: Haga T, Sonehara T, Sakai T, Anazawa T, Fujita T, Takahashi S, ”Simultaneous four-color imaging of single molecule fluorophores using dichroic mirrors and for charge-coupled devices”, Rev Sci Instrum. 2011 Feb; 82(2):023701. doi:10.1063/1.3524570.
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Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
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Eine Aufgabe der Erfindung ist es, eine Technik zur Abbildung eines Panels innerhalb einer im Vergleich zum Filterrad-Verfahren kürzeren Zeitspanne bereitzustellen, ohne dass es zu erheblichen Steigerungen in Bezug auf Kosten und Größe kommt.
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Lösung der Aufgabe
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Die Erfinder haben festgestellt, dass sich die vorerwähnte Aufgabe lösen lässt, indem man abwechselnd eine Probe mit zwei Lichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängen bestrahlt; eine Nucleinsäure in der Probe mit zwei Typen von Fluoreszenzfarbstoffen, die Licht mit Bandbreiten zwischen den Wellenlängen der Lichtquellen emittieren, und zwei Typen von fluoreszierenden Farbstoffen, die Licht in längeren Wellenlängenbanden als die beiden Lichtquellen emittieren, modifiziert; bewirkt, dass fluoreszierendes Licht von der Nucleinsäure durch einen dichroitischen Spiegel aufgespalten wird, der eine Übergangswellenlänge von Transmission zu Reflexion in zwei Positionen aufweist, nämlich zwischen den lichtemittierenden Banden von zwei Typen von kurzwelligen fluoreszierenden Farbstoffen und zwischen lichtemittierenden Banden von zwei Typen von langwelligen fluoreszierenden Farbstoffen; und das aufgespaltene Licht durch zwei Detektoren erfasst.
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Zur Lösung der vorerwähnten Aufgabe werden beispielsweise die in den Patentansprüchen beschriebenen Konfigurationen herangezogen. Obgleich die Anmeldung eine Mehrzahl von Möglichkeiten zur Lösung der Aufgabe umfasst, wird nachstehend ein Beispiel hierfür beschrieben. Es wird eine Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen beschrieben, die Folgendes umfasst: zwei Lichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängen; zwei Detektoren; und ein optisches System zur Bestrahlung einer Probe mit Licht von zwei Lichtquellen und Leiten von Fluoreszenzlicht von einer Nucleinsäure in der Probe zu den zwei Detektoren, wobei die beiden Lichtquellen abwechselnd die Probe belichten und die Nucleinsäure in der Probe mit zwei Typen von Fluoreszenzfarbstoffen, die Licht mit Bandbreiten zwischen den Wellenlängen der beiden Lichtquellen emittieren, und zwei Typen von fluoreszierenden Farbstoffen, die Licht mit im Vergleich zu den Banden der beiden Lichtquellen längeren Wellenlängenbanden emittieren, modifizieren, wobei das optische System mit einem dichroitischen Spiegel versehen ist, um zu bewirken, dass Fluoreszenzlicht von der Nucleinsäure in der Probe aufgespalten wird, und das aufgespaltene Licht den beiden Detektoren zugeführt wird, wobei der dichroitische Spiegel eine Übergangswellenlänge von Transmission zu Reflexion in zwei Positionen aufweist, nämlich zwischen lichtemittierenden Banden von zwei Typen von kurzwelligen fluoreszierenden Farbstoffen und zwischen lichtemittierenden Banden von zwei Typen von langwelligen fluoreszierenden Farbstoffen.
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Gemäß einem weiteren Beispiel wird ein Verfahren zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen bereitgestellt, das folgende Stufen umfasst: abwechselndes Belichten einer Probe mit Licht von zwei Lichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängen und Modifizieren einer Nucleinsäure in der Probe mit zwei Typen von fluoreszierenden Farbstoffen, die Licht mit Bandbreiten zwischen den Wellenlängen der beiden Lichtquellen emittieren, und zwei Typen von fluoreszierenden Farbstoffen, die Licht mit längeren Wellenlängenbanden, verglichen mit den zwei Lichtquellen, emittieren; Bewirken, dass Fluoreszenzlicht von der Nucleinsäure in der Probe durch einen dichroitischen Spiegel aufgespalten wird und das aufgespaltene Licht zwei Detektoren zugeführt wird, wobei der dichroitische Spiegel eine Übergangswellenlänge von Transmission zu Reflexion in zwei Positionen aufweist, nämlich zwischen lichtemittierenden Banden von zwei Typen von kurzwelligen fluoreszierenden Farbstoffen und zwischen lichtemittierenden Banden von zwei Typen von langwelligen fluoreszierenden Farbstoffen; und Aufnehmen jeweils mindestens eines Probenbilds durch beide Detektoren, während eine der beiden Lichtquellen die Probe belichtet.
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Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
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Erfindungsgemäß lässt sich eine hohe Zuverlässigkeit aufgrund der Tatsache erreichen, dass keine mechanisch beweglichen Teile vorhanden sind, und die Abbildungszeit wird auf die Hälfte oder weniger bis zu 1/3 verringert, verglichen mit dem Filterrad-Verfahren.
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Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen. Ferner ergeben sich Konfigurationen, Wirkungen und Ziele, die von den vorstehend beschriebenen Ausführungen abweichen, aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsformen.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen gemäß einer ersten Ausführungsform.
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2 ist eine schematische Darstellung der Anregungsspektren von vier Typen von fluoreszierenden Farbstoffen sowie von lichtemittierenden Spektren von Lichtquellen.
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3 ist ein Ablaufdiagramm zur Erläuterung eines Messvorgangs der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung.
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4 ist eine schematische Darstellung von lichtemittierenden Spektren der vier Typen von fluoreszierenden Farbstoffen sowie eines Transmissionsspektrums eines dichroitischen Spiegels.
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5 ist ein Ablaufdiagramm zur Erläuterung eines Messvorgangs einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung.
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6 ist eine schematische Darstellung von lichtemittierenden Spektren von vier Typen von fluoreszierenden Farbstoffen sowie eines Transmissionsspektrums eines dichroitischen Spiegels gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung.
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Beschreibung der Ausführungsformen
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Nachstehend findet sich eine Beschreibung von erfindungsgemäßen Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen. Obgleich die Zeichnungen spezielle Ausführungsformen, die auf dem erfindungsgemäßen Prinzip beruhen, zeigen, dienen sie nur einem besseren Verständnis der Erfindung und stellen in keiner Weise eine Beschränkung der Erfindung dar.
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1 ist eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen gemäß einer ersten Ausführungsform. Die Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen umfasst eine erste und eine zweite Halbleiterlichtquelle 1 und 2, die als zwei Lichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängen dienen, zwei Bildsensoren (Detektoren) 12 und 13 und ein optisches System, das zur Bestrahlung eines Probensubstrats 7 mit Licht aus der ersten und zweiten Halbleiterlichtquelle 1 und 2 sowie zum Lenken des fluoreszierenden Lichts von einer Nucleinsäure in einer Probe zu den beiden Bildsensoren 12 und 13 dient. Das optische System umfasst dichroitische Spiegel 3, 5 und 9, Bandfilter 4 und 8, eine Objektivlinse 6 und eine erste und eine zweite Kameralinse 10 und 11. Ferner umfasst die Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen einen Host-Controller 14, der zur Steuerung der entsprechenden Bauteile dient. Nachstehend findet sich eine Beschreibung der Betriebsweisen der jeweiligen Bauteile in der Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen.
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Von der ersten Halbleiterlichtquelle 1 und von der zweiten Halbleiterlichtquelle 2 emittiertes Licht wird von dem das Anregungslicht vereinigenden dichroitischen Spiegel 3 vereinigt. Für das vereinigte Licht werden Randbereiche der lichtemittierenden Spektren der Halbleiterlichtquellen innerhalb von lichtemittierenden Banden des Fluoreszenzfarbstoffes durch den Anregungsbandfilter 4 mit zwei Transmissionsbanden blockiert. Der Bandfilter 4 lässt Licht nur in der Peripherie der zentralen Wellenlängen der beiden Halbleiterlichtquellen 1 und 2 durch und blockiert Transmissionsbereiche des Bandfilters 8, wie nachstehend beschrieben wird. Dadurch wird Hintergrundlicht verringert und eine hochempfindliche Messung ermöglicht.
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Gemäß dieser Ausführungsform handelt es sich bei der ersten und bei der zweiten Halbleiterlichtquelle 1 und 2 um lichtemittierende Dioden (LED) mit zentralen Wellenlängen von 495 nm bzw. 640 nm. Die erste und zweite Halbleiterlichtquelle 1 und 2 weisen jeweils eingebaute Kollimatorlinsen auf und emittieren einen parallelen Lichtfluss. Als Lichtquellen können Halbleiterlaser mit im Wesentlichen gleichen Wellenlängen verwendet werden. Die Verwendung von lichtemittierenden Dioden (LED) oder von Halbleiterlasern bringt eine Erhöhung der Geschwindigkeit beim Schalten einer Lichtquelle, die angeschaltet wird, mit sich.
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Obgleich der Bandfilter 4 mit den beiden Transmissionsbanden in dieser Ausführungsform hinter dem dichroitischen Spiegel 3 installiert ist, ist es auch möglich, einen Bandfilter mit einer einzigen Transmissionsbande zwischen dem dichroitischen Spiegel 3 und der ersten Halbleiterlichtquelle 1 bzw. zwischen dem dichroitischen Spiegel 3 und der zweiten Halbleiterlichtquelle 2 vorzusehen, um zu bewirken, dass die Bandfilter stattdessen die Funktionen des Bandfilters 4 ausüben.
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Das durch den Bandfilter 4 durchgelassene Licht wird vom dichroitischen Spiegel 5 reflektiert, um es in Anregungslicht und Fluoreszenzlicht aufzuspalten. Es gelangt sodann in die Objektivlinse 6 und belichtet das Probensubstrat 7. Das Probensubstrat 7 befindet sich auf einem in der Zeichnung nicht dargestellten Objekttisch. Auf dem Probensubstrat 7 wird eine große Anzahl von Clustern von amplifizierter DNA gebildet und ein fluoreszierender Farbstoff, der die DNA modifiziert, wird angeregt und emittiert Fluoreszenzlicht.
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Das vom Probensubstrat 7 emittierte Fluoreszenzlicht wird von der Objektivlinse 6 gesammelt, durch den dichroitischen Spiegel 5 geleitet und sodann durch den Fluoreszenzlicht-Bandfilter 8 geführt. Der Bandfilter 8 blockiert in ausreichendem Maße die Anregungslichtkomponente. Der Bandfilter 8 ist so konfiguriert, dass er lichtemittierende Wellenlängen der beiden Halbleiterlichtquellen 1 und 2 blockiert und eine Wellenlängenbande zwischen den Wellenlängen der beiden Halbleiterlichtquellen 1 und 2 und eine Bande, die länger ist als die längere Wellenlänge der beiden Halbleiterlichtquellen 1 und 2, überträgt. Dadurch wird Hintergrundlicht verringert und eine Messung mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht.
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Das durch den Bandfilter 8 durchgelassene Fluoreszenzlicht wird durch den das Fluoreszenzlicht identifizierenden dichroitischen Spiegel 9 aufgeteilt. Ein Teil des Fluoreszenzlichts erzeugt durch die erste Kameralinse 10 ein Bild auf dem ersten Bildsensor 12, nachdem es den dichroitischen Spiegel 9 durchlaufen hat. Der andere Teil des Fluoreszenzlichts erzeugt durch die zweite Kameralinse 11 ein Bild auf dem zweiten Bildsensor 13, nachdem es vom dichroitischen Spiegel 9 reflektiert worden ist. Der Host-Controller 14 gibt ein Kontrollsignal zum Anschalten und Abschalten der ersten und zweiten Halbleiterlichtquelle 1 und 2 aus sowie ein Steuersignal zum Starten und Beenden der Bilderzeugung durch die Bildsensoren 12 und 13. Diese Steuersignale werden in die entsprechenden Steuerziele eingegeben.
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2 zeigt Anregungsspektren von vier Fluoreszenzkörpern, die die DNA modifizieren, sowie Wellenlängenbanden, die von der ersten und zweiten Halbleiterlichtquelle 1 und 2 gemäß dieser Ausführungsform ausgegeben werden. Die erste und zweite Halbleiterlichtquelle 1 und 2 belichten abwechselnd das Probensubstrat 7. Dabei wird die Nucleinsäure der Probe durch zwei Typen von fluoreszierendem Farbstoff (Blau und Grün), die Licht in Banden zwischen den Wellenlängen der beiden Halbleiterlichtquellen 1 und 2 emittieren, und durch zwei Typen von fluoreszierendem Farbstoff (Gelb und Rot), die Licht in Wellenlängenbanden emittieren, die länger sind als die Banden der beiden Halbleiterlichtquellen 1 und 2, modifiziert. 2 zeigt, dass blaue und grüne Fluoreszenzkörper vorzugsweise in einer Wellenlängenbande von 495 nm angeregt werden und gelbe und rote Fluoreszenzkörper vorzugsweise in einer Wellenlängenbande von 640 nm angeregt werden.
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3 ist ein Ablaufdiagramm der Abbildung von einem Panel gemäß dieser Ausführungsform. Zunächst wird der Objekttisch bewegt und das abzubildende Panel wird in Richtung zur Innenseite eines Betrachtungsfelds bewegt. Anschließend wird nur die zweite Halbleiterlichtquelle 2 eingeschaltet und der Bildsensor 12 und der Bildsensor 13 werden gleichzeitig für eine vorgegebene Zeitspanne belichtet. Die Belichtung der Bildsensoren 12 und 13 wird gleichzeitig mit dem Abschalten der zweiten Halbleiterlichtquelle 2 beendet, und zwei Bilddatensätze (als erstes Bildpaar bezeichnet), die von den beiden Bildsensoren 12 und 13 erhalten worden sind, werden dem Host-Controller 14 zugeführt.
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Anschließend wird nur die erste Halbleiterlichtquelle 1 eingeschaltet, der Bildsensor 12 und der Bildsensor 13 werden gleichzeitig erneut für eine vorgegebene Zeitspanne belichtet, und die erste Halbleiterlichtquelle 1 wird sodann abgeschaltet. Zwei Bilddatensätze (als zweites Bildpaar bezeichnet), die von den beiden Bildsensoren 12 und 13 erhalten worden sind, werden dem Host-Controller 14 zugeführt. Wie vorstehend ausgeführt, wird mindestens ein Proben-Bilddatensatz von jedem der beiden Bildsensoren 12 und 13 aufgenommen, während eine der (ersten und zweiten) Halbleiterlichtquellen 1 und 2 das Probensubstrat 7 belichten.
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Da Interline-CCDs bei dieser Ausführungsform als Bildsensoren 12 und 13 verwendet werden, erfolgen die Belichtung und die Übertragung parallel und die Belichtung des zweiten Bildpaares wird gleichzeitig mit dem Belichtungsende des ersten Bildpaars begonnen. Im Fall der Verwendung von Bildsensoren, die sich von Interline-CCDs unterscheiden, zum Beispiel von CMOS-Sensoren, wird eine Zeitsteuerung für die Bilddatenübertragung zwischen der ersten Belichtungszeit und der zweiten Belichtungszeit eingefügt. Da jedoch neuere CMOS-Sensoren die Datenübertragung mit sehr hoher Geschwindigkeit vornehmen, ist es möglich, die Zeitsteuerung für die Bilddatenübertragung im Wesentlichen zu ignorieren und somit im Wesentlichen das gleiche Ablaufdiagramm wie in 3 einzuhalten.
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4 zeigt Lichtemissionsspektren der vier Fluoreszenzkörper und ein Transmissionsspektrum des dichroitischen Spiegels 9. Ein Absorptionsverlust des dichroitischen Spiegels 9 kann vernachlässigt werden, und die Reflexionsrate kann als (1 – Durchlässigkeit) angesehen werden. Der dichroitische Spiegel 9 weist eine Übergangswellenlänge von Transmission zu Reflexion in zwei Positionen auf, nämlich zwischen den lichtemittierenden Banden der zwei Typen von kurzwelligen Fluoreszenzfarbstoffen (Blau und Grün) und zwischen den lichtemittierenden Banden der beiden Typen von langwelligen Fluoreszenzfarbstoffen (Gelb und Rot). Wie in 2 erläutert, werden dann, wenn nur die zweite Halbleiterlichtquelle 2 eingeschaltet ist, nur die gelben und roten Fluoreszenzkörper in erheblichem Maße angeregt und zur Emission von Licht veranlasst. Wie in 4 dargestellt, wird der Großteil des vom gelben Fluoreszenzkörper emittierten Lichts durch den dichroitischen Spiegel 9 reflektiert und vom Bildsensor 13 erfasst, und der Großteil des vom roten Fluoreszenzkörper emittierten Lichts wird durch den dichroitischen Spiegel 9 durchgelassen und vom Bildsensor 12 erfasst.
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Dagegen werden dann, wenn nur die erste Halbleiterlichtquelle 1 eingeschaltet ist, die blauen und grünen Fluoreszenzkörper in wesentlichem Umfang angeregt und zur Emission von Licht veranlasst. Wie in 4 dargestellt ist, wird der Großteil des vom blauen Fluoreszenzkörper emittierten Lichts durch den dichroitischen Spiegel 9 durchgelassen und vom Bildsensor 12 erfasst. Der Großteil des vom grünen Fluoreszenzkörper emittierten Lichts wird vom dichroitischen Spiegel 9 reflektiert und vom Bildsensor 13 erfasst.
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Es wird angenommen, dass ein Wert, der durch Subtraktion der Leuchtdichte des Hintergrunds von der Leuchtdichte eines lumineszierenden Punktes in einem Bild, das jedem einzelnen Cluster entspricht, als Signal bezeichnet wird. Vierdimensionale Vektoren (ein vom Bildsensor 12 erhaltenes Signal, wenn die erste Halbleiterlichtquelle 1 eingeschaltet ist, ein Signal, das vom Bildsensor 13 erhalten wird, wenn die erste Halbleiterlichtquelle 1 eingeschaltet ist, ein Signal, das vom Bildsensor 12 erhalten wird, wenn die zweite Halbleiterlichtquelle 2 eingeschaltet ist, und ein Signal, das vom Bildsensor 13 erhalten wird, wenn die zweite Halbleiterlichtquelle 2 eingeschaltet ist) werden als Signalvektoren bezeichnet. In dieser Ausführungsform werden die folgenden Signalvektoren, die den jeweiligen Fluoreszenzkörpern entsprechen, erhalten.
Blauer Signalvektor = (0,59, 1,31, 0,00, 0,00)
Grüner Signalvektor = (0,05, 0,44, 0,00, 0,00)
Gelber Signalvektor = (0,00, 0,00, 0,63, 0,35)
Roter Signalvektor = (0,00, 0,00, 0,16, 0,07)
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Die blauen und grünen Lichtemissionsspektren überlappen sich und die gelben und roten Lichtemissionsspektren überlappen sich ebenfalls. Infolgedessen schneiden sich die vier Signalvektoren nicht vollkommen orthogonal, sind aber in ausreichendem Maße unabhängig. Daher ist es möglich, Typen von Fluoreszenzkörpern mit hoher Präzision auf der Grundlage der Signalvektoren der Cluster zu bestimmen.
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Gemäß dem Stand der Technik gibt es beim Aufnehmen eines Vierfarbenbilds auf der Grundlage eines allgemeinen Filterradverfahrens vier Belichtungszeiten und es ergibt sich ein erheblicher Zeitaufwand aufgrund der Schaltzeiten für die Filter. Ferner besteht ein Problem dahingehend, dass die Geschwindigkeit der mechanischen Schaltvorgänge der Filter zunimmt und es zu einer zunehmenden Wärmeentwicklung als Reaktion auf die erforderliche, maximal mögliche Geschwindigkeitszunahme kommt. Gemäß dieser Ausführungsform ist es möglich, eine Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen bereitzustellen, die eine hohe Zuverlässigkeit aufgrund der Tatsache, dass keine beweglichen mechanischen Teile vorliegen, zulässt, wobei die Abbildungszeit auf die Hälfte oder weniger bis zu 1/3 verringert wird, wobei sich nur eine geringfügige Zunahme in Bezug auf Kosten und Größe im Vergleich zum Filterradverfahren ergibt.
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Da bei dieser Ausführungsform für ein Panel zwei Belichtungszeiten erforderlich sind, nimmt die Zeitspanne für ein Panel im Vergleich zur Situation bei NPL 1 zu. Jedoch verdoppelt sich diese Zeitspanne nicht, sondern beträgt etwa das 1,5-fache der Zeitspanne von NPL 1, wenn man die Bearbeitungszeit des Objekttisches berücksichtigt. Da dagegen die Anzahl der Bildsensoren von vier auf zwei verringert wird, kommt es in etwa zu einer Halbierung der Kosten für die Vorrichtung und auch die Größe der Vorrichtung lässt sich in erheblichem Maße verringern. Obgleich ein zusätzlicher Bildsensor im Vergleich zum Filterradverfahren erforderlich ist, verursacht dies nur einen geringfügigen Kostenanstieg, und die für ein Panel erforderliche Zeitspanne beträgt weniger als die Hälfte, da kein Filterrad-Rotationsmechanismus vorgesehen ist. Gemäß dieser Ausführungsform ist es möglich, das Leistungsvermögen stark zu verbessern, wobei nur ein geringfügiger Kostenanstieg im Vergleich zum Filterradverfahren gegeben ist. Somit ist es möglich, eine Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen zu bauen, die sich in Bezug auf Kosten und Zuverlässigkeit hervorragend verhält, was darauf zurückzuführen ist, dass kein Rotationsmechanismus mit hoher Geschwindigkeit vorgesehen ist, wie vorstehend erläutert wurde.
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5 ist ein Ablaufdiagramm der Abbildung eines Panels gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung. Der Aufbau der Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen ist der gleiche wie bei der ersten Ausführungsform.
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Es kann ein Fall auftreten, bei dem dann, wenn zwei Fluoreszenzkörper in einem Wellenlängenband angeregt werden, sich die Lichtemissionsintensitäten aufgrund eines unterschiedlichen Anregungswirkungsgrads erheblich unterscheiden. Für den Fall, dass die Anregung der Fluoreszenzkörper nacheinander in zeitlich getrennter Weise oder mit zwei unabhängigen Lichtquellen erfolgt, ist es möglich, die gleiche Intensität zu erhalten, indem man die Intensität der Lichtquellen einstellt oder indem man die Transmission des Anregungsfilters für die jeweiligen Fluoreszenzkörper einstellt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann jedoch diese Vorgehensweise nicht herangezogen werden. Daher wird in einem Fall, bei dem sich die Lichtemissionsintensitäten von zwei gleichzeitig angeregten Fluoreszenzkörpern erheblich voneinander unterscheiden und die Belichtungszeit der beiden Abbildungsvorrichtungen gleich ist, das S/N-Verhältnis von einem Fluoreszenzkörper geringer (versucht man, das S/N-Verhältnis des Fluoreszenzkörpers mit einer geringeren Lichtemissionsintensität zu erhöhen, wird das Signal vom Fluoreszenzkörper mit höherer Lichtemissionsintensität gesättigt).
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Gemäß dieser Ausführungsform unterscheiden sich die Belichtungszeiten der beiden Bildsensoren 12 und 13 voneinander, während eine der beiden Halbleiterlichtquellen 1 und 2 die Probe belichtet. Das Einstellen unterschiedlicher Belichtungszeiten für die beiden Bildsensoren 12 und 13 hat den Vorteil, dass sich beide Bilder mit einem zufriedenstellenden S/N-Verhältnis erhalten lassen, selbst wenn sich die Lichtemissionsintensitäten der Fluoreszenzkörper stark voneinander unterscheiden. Wie in 5 dargestellt ist, wird die Belichtung der beiden Bildsensoren 12 und 13 gleichzeitig gestartet und die Belichtungszeit des Bildsensors 12, bei dem die Belichtungszeit kürzer einzustellen ist, wird bei dieser Ausführungsform zuerst beendet. Jedoch ist die Erfindung nicht hierauf beschränkt. Die gleiche Wirkung kann in vollkommener Weise erreicht werden, indem man den Belichtungsbeginn für den Bildsensor 12, dessen Belichtungszeit kürzer einzustellen ist, verzögert.
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6 zeigt Lichtemissionsspektren von vier Fluoreszenzkörpern und ein Transmissionsspektrum des dichroitischen Spiegels 9 gemäß einer dritten Ausführungsform. Der Aufbau der Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen und die Fluoreszenzkörper dieser Ausführungsform sind die gleichen wie bei der ersten Ausführungsform. In Bezug auf das Transmissionsspektrum des dichroitischen Spiegels 9 sind Transmission und Reflexion im Vergleich zur ersten Ausführungsform umgekehrt. Auch im Fall einer derartigen Transmissionseigenschaft ist es möglich, das Fluoreszenzlicht von den beiden Fluoreszenzkörpern, die Licht gleichzeitig im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie bei der ersten Ausführungsform emittieren, getrennt zu erfassen.
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Im Wesentlichen erfolgt die Anregung und Lichtemission der gelben und roten Fluoreszenzkörper nur dann, wenn die zweite Halbleiterlichtquelle 2 eingeschaltet ist. Wie in 6 dargestellt, wird der Großteil des von den gelben Fluoreszenzkörpern emittierten Lichts durch den dichroitischen Spiegel 9 durchgelassen und vom Bildsensor 12 erfasst und der Großteil des von den roten Fluoreszenzkörpern emittierten Lichts wird vom dichroitischen Spiegel 9 reflektiert und vom Bildsensor 13 erfasst. Im Gegensatz dazu erfolgt die Anregung und Lichtemission der blauen und grünen Fluoreszenzkörper im Wesentlichen nur dann, wenn die erste Halbleiterlichtquelle 1 eingeschaltet ist. Wie in 6 dargestellt, wird der Großteil des vom blauen Fluoreszenzkörper emittierten Lichts vom dichroitischen Spiegel 9 reflektiert und vom Bildsensor 13 erfasst, während der Großteil des vom grünen Fluoreszenzkörper emittierten Lichts vom dichroitischen Spiegel 9 durchgelassen und vom Bildsensor 12 erfasst wird.
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Erfindungsgemäß ist es möglich, eine Vorrichtung zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen bereitzustellen, die aufgrund des Fehlens von sich mechanisch bewegenden Elementen eine hohe Zuverlässigkeit besitzt und bei der die Bilderzeugungszeit auf die Hälfte oder weniger bis 1/3 verringert ist, wobei nur geringfügige Steigerungen in Bezug auf Kosten und Größe im Vergleich zum Filterradverfahren hervorgerufen werden.
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Die Erfindung ist nicht auf die vorerwähnten Ausführungsformen beschränkt, vielmehr können verschiedene Modifikationen vorliegen. Beispielsweise wurden die vorerwähnten Ausführungsformen zur klaren Erläuterung der Erfindung ausführlich beschrieben und die Erfindung ist nicht notwendigerweise auf eine Struktur beschränkt, die mit sämtlichen vorerwähnten Konfigurationen bereitgestellt wird. Ferner kann ein Teil der Konfiguration einer Ausführungsform durch die Konfiguration einer anderen Ausführungsform ersetzt werden und die Konfiguration einer weiteren Ausführungsform kann einer bestimmten Konfiguration einer Ausführungsform hinzugefügt werden. Außerdem können Zusätze, Weglassungen und Ersatzmaßnahmen einer weiteren Konfiguration an einem Teil einer Konfiguration einer jeden Ausführungsform vorgenommen werden.
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Ein Teil oder die Gesamtheit der jeweiligen Konfigurationen, Funktionen, Verarbeitungseinheiten und dergleichen des Host-Controllers 14 können als Hardware realisiert werden, indem man einen Teil oder die Gesamtheit davon als eine integrierte Schaltung realisiert. Ferner können die entsprechenden Konfigurationen, Funktionen, Verarbeitungseinheiten und dergleichen des Host-Controllers 14 als Software realisiert werden, indem man einen Prozessor dazu veranlasst, ein Programm, das die entsprechenden Funktionen realisiert, zu interpretieren und auszuführen. Informationen, einschließlich Programme, Tabellen und Dateien, zur Realisation der entsprechenden Funktionen können in einer Speichervorrichtung, zum Beispiel einem Speicher, einer Festplatte oder einem Solid-State-Laufwerk (SSD), oder in einem Aufzeichnungsmedium, wie einer IC-Karte, einer SD-Karte oder einer DVD, gespeichert werden.
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Steuerleitungen und Informationsleitungen, die für die Erläuterung der vorerwähnten Ausführungsformen notwendig sind, wurden beschrieben, während nicht notwendigerweise sämtliche Steuerleitungen und Informationsleitungen des Produkts beschrieben wurden. Es kommt in Betracht, dass in der Praxis im Wesentlichen sämtliche Konfigurationen miteinander verbunden sind.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- erste Halbleiterlichtquelle
- 2
- zweite Halbleiterlichtquelle
- 3
- dichroitischer Spiegel zur Vereinigung von Anregungslicht
- 4
- Anregungslicht-Bandfilter
- 5
- dichroitischer Spiegel zur Trennung von Anregungslicht/Fluoreszenzlicht
- 6
- Objektivlinse
- 7
- Probensubstrat
- 8
- Fluoreszenzlicht-Bandfilter
- 9
- dichroitischer Spiegel zur Identifikation von Fluoreszenzfarbstoff
- 10
- erste Kameralinse
- 11
- zweite Kameralinse
- 12
- erster Bildsensor
- 13
- zweiter Bildsensor
- 14
- Host-Controller
