JPWO2015053144A1 - 核酸配列決定装置及び核酸配列決定方法 - Google Patents

Abstract

核酸配列決定装置は、波長の異なる２つの光源と、２つの検出器と、前記２つの光源からの光をサンプルに照射し、前記サンプルの核酸からの蛍光を前記２つの検出器へと導くための光学系と、を備える。前記光学系は、前記サンプルの前記核酸からの蛍光を分岐して、前記２つの検出器へと導くための二色鏡を備え、前記二色鏡は、透過から反射の遷移波長を、短波長蛍光色素２種の発光帯域の間と、長波長蛍光色素２種の発光帯域の間の２か所に有する。

Description

本発明は基板上における試薬とＤＮＡサンプルの化学反応と、ＤＮＡサンプルから放射された蛍光の像に基づきＤＮＡサンプルの解析を行うクラスタ方式の核酸配列決定装置及び核酸配列決定方法に関する。

クラスタ方式の核酸配列決定装置（ＤＮＡシーケンサ）では増幅されたサンプルＤＮＡに対して相補なＤＮＡの伸長反応を基板上で繰返す。伸長されるＤＮＡは、その配列がわかるように発光帯の異なる四種の蛍光体で修飾されている。伸長反応ごとに基板に励起光を照射し、伸長した相補ＤＮＡから放射される蛍光の像をＣＣＤセンサやＣ−ＭＯＳセンサといった撮像センサを搭載したカメラによって撮影する。像の色に基づいて蛍光体の種類を判定し、サンプルＤＮＡの配列が決定される。

蛍光体の種類はＤＮＡの塩基の種類（アデニン、グアニン、チミン、シトシン）に対応して四つなので、一般に基板の一視野（パネルと呼ぶ）において赤黄緑青の４色４枚の画像を撮影する。なお、赤、黄、緑、青は単に波長の異なる四つの帯域を意味し、人間の色彩感覚には必ずしも対応しない。１パネル撮影後に基板を移動させて次のパネルを撮影するという動作を繰り返す。１サンプルにつき撮影するパネルの数は数百パネル〜数千パネルである。これを、解析するＤＮＡの塩基長（数１００）の回数分繰り返す。従って、トータルで撮影する画像数は１サンプルに対し数十万〜数百万に及ぶ。これらの撮像された画像データから蛍光発光色の配列、強度等の情報を抽出し、ＤＮＡ配列を決定する。

１パネルに対する４色の画像を撮影する最もオーソドックスな方法は、特許文献１に記載されているように、透過領域の異なる４種のフィルタを機械的に切り替え、単一の撮像センサで逐次に画像を得ることである。本方式をフィルタホイール方式と呼ぶ。この方式は汎用の蛍光顕微鏡でも用いられ、汎用性の高い方法であるが、逐次で画像を得ること、フィルタを機械的に切り替える時間が無視できないことから（一枚あたりの露光時間は０．１秒程度、フィルタの機械的切替にかかる時間は、できる限り高速にしたとしても、同程度である）、１パネルあたりの撮像時間が長くなる。その結果、非常に多数のパネルの撮影を行うクラスタ方式の核酸配列決定装置においては、トータルの撮影時間が数日〜一週間に及び、撮影にかかる時間が分析時間を長くする最大の原因の一つとなっている。また、高速な機械的動作をするため、発熱が大きく、故障しやすい。

発光帯の異なる蛍光体は一般に励起波長帯もまた異なるので、フィルタホイール方式では、励起光源として白色光源を使用し、検出波長帯の切り替えと同時に励起側のフィルタを切り替え、検出しようとする蛍光体を効率良く励起する。この場合、励起する波長帯の数は検出する波長帯と同一の４である。単一の波長帯で四種の蛍光体すべてを効率良く励起することは一般に困難であるが、励起波長帯は有限の幅を持っており、発光波長が近い蛍光体は励起帯が重なるので、１つの波長帯で二種の蛍光体を効率良く励起することは可能である。従って、二つの波長帯で四種の蛍光体すべてを効率良く励起することが可能である。

非特許文献１では、波長の異なる二台のレーザで四種の蛍光体を同時に励起している。非特許文献１の装置では、３枚の２色鏡によりＤＮＡからの発光を四つの波長帯に分け、４個の撮像センサを用いて４色の画像を同時に得ている。また、非特許文献１の装置では、機械的フィルタ切替が無く、４枚の画像を同時に撮影するので、特許文献１の１／４以下の時間で１パネル分の画像を得ることができる。しかしながら、４個の撮像センサを用いるため、特許文献１の方式に比較して、装置が著しく大型で高額にならざるを得ない。

米国特許出願公開第２０１１／０２３６９６４号明細書

Haga T、 Sonehara T、 Sakai T、 Anazawa T、 Fujita T、 Takahashi S.、「Simultaneous four-color imaging of single molecule fluorophores using dichroic mirrors and four charge-coupled devices」、Rev Sci Instrum. 2011 Feb;82(2):023701. doi: 10.1063/1.3524570.

本発明は、コストとサイズを著しく増加させることなく、フィルタホイール方式よりも１パネルを短時間で撮影する技術を提供することを目的とする。

本発明者らは、波長の異なる二つの光源でサンプルを交互に照明し、サンプルの核酸を光源の波長の間の帯域で発光する蛍光色素２種と、いずれの光源よりも長波長域で発光する蛍光色素２種で修飾し、核酸からの蛍光を、透過から反射の遷移波長が短波長蛍光色素２種の発光帯域の間と、長波長蛍光色素２種の発光帯域の間の２か所に有する二色鏡で分岐して２つの検出器で検出することにより、上記課題が解決できることを見出した。

上記課題を解決する為に例えば特許請求の範囲に記載の構成を採用する。本願は上記課題を解決する手段を複数含んでいるがその一例をあげるならば、波長の異なる２つの光源と、２つの検出器と、前記２つの光源からの光をサンプルに照射し、前記サンプルの核酸からの蛍光を前記２つの検出器へと導くための光学系と、を備える核酸配列決定装置であって、前記２つの光源は、前記サンプルを交互に照明し、前記サンプルの前記核酸を前記２つの光源の波長の間の帯域で発光する蛍光色素２種と、前記２つの光源よりも長波長域で発光する蛍光色素２種で修飾し、前記光学系は、前記サンプルの前記核酸からの蛍光を分岐して、前記２つの検出器へと導くための二色鏡を備え、前記二色鏡は、透過から反射の遷移波長を、短波長蛍光色素２種の発光帯域の間と、長波長蛍光色素２種の発光帯域の間の２か所に有する、核酸配列決定装置が提供される。

また、他の例によれば、波長の異なる２つの光源からの光を、サンプルを交互に照明し、前記サンプルの核酸を前記２つの光源の波長の間の帯域で発光する蛍光色素２種と、前記２つの光源よりも長波長域で発光する蛍光色素２種で修飾するステップと、二色鏡によって、前記サンプルの前記核酸からの蛍光を分岐して、２つの検出器へと導くステップであって、前記二色鏡は、透過から反射の遷移波長を、短波長蛍光色素２種の発光帯域の間と、長波長蛍光色素２種の発光帯域の間の２か所に有する、ステップと、前記２つの光源の一方が前記サンプルを照明している間に、前記２つの検出器の両方で少なくとも１枚ずつの前記サンプルの画像を撮影するステップと、を備える核酸配列決定方法が提供される。

本発明によれば、フィルタホイール方式に比して、機械的可動部が無くて信頼性が高く、なおかつ撮影時間が半分以下〜１／３になる。

本発明に関連する更なる特徴は本明細書の記述添付図面から明らかになるものである。また上記した以外の課題構成及び効果は以下の実施例の説明により明らかにされる。

本発明の第一の実施例における核酸配列決定装置の概略構成図である。 ４種の蛍光色素の励起スペクトルと光源の発光スペクトルの模式図である。 本発明の第一の実施例における核酸配列決定装置の測定動作を示すタイミングチャートである。 ４種の蛍光色素の発光スペクトルと二色鏡の透過スペクトルの模式図である。 本発明の第二の実施例における核酸配列決定装置の測定動作を示すタイミングチャートである。 本発明の第三の実施例における４種の蛍光色素の発光スペクトルと二色鏡の透過スペクトルの模式図である。

以下添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。なお添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施例を示しているがこれらは本発明の理解のためのものであり決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。

図１は、第一の実施例における核酸配列決定装置の概略構成図である。核酸配列決定装置は、波長の異なる２つの光源である第一及び第二の半導体光源１，２と、２つの撮像センサ（検出器）１２、１３と、第一及び第二の半導体光源１，２からの光をサンプル基板７に照射し、サンプルの核酸からの蛍光を２つの撮像センサ１２、１３へと導くための光学系と、を備える。光学系は、二色鏡３、５、９と、バンドパスフィルタ４、８と、対物レンズ６と、第一及び第二のカメラレンズ１０，１１と、を備える。また、核酸配列決定装置は、各構成要素を制御するためのホストコントローラ１４を備える。以下で核酸配列決定装置の各構成要素の動作について説明する。

第一の半導体光源１と第二の半導体光源２から射出された光は、励起光合成用の二色鏡３で合成される。合成された光は、二つの透過帯を有する励起用のバンドパスフィルタ４によって、蛍光色素の発光帯にはみ出た半導体光源の発光スペクトルの裾野が遮断される。バンドパスフィルタ４は、２つの半導体光源１，２の中心波長周辺のみを透過させ、以下で説明するバンドパスフィルタ８の透過域を遮断するものである。これにより、背景光を低減して、高感度測定を可能にする。

本実施例においては、第一及び第二の半導体光源１，２は、それぞれ、中心波長が４９５ｎｍ及び６４０ｎｍの発光ダイオード（ＬＥＤ）である。第一及び第二の半導体光源１，２は、それぞれ、コリメートレンズを内蔵していて、平行光束を放射する。光源として、ほぼ同波長の半導体レーザを用いても良い。発光ダイオード（ＬＥＤ）あるいは半導体レーザを用いることにより、点灯する光源の切替が高速になる。

本実施例においては、二色鏡３の後に二つの透過帯を有するバンドパスフィルタ４を設置したが、二色鏡３と第一及び第二の半導体光源１，２との間に一つずつ、単一透過帯のバンドパスフィルタを設けて、二色鏡３の機能を代替することも可能である。

バンドパスフィルタ４の透過光は、励起光と蛍光とに分離するための二色鏡５で反射され、対物レンズ６に導入され、サンプル基板７を照明する。なお、サンプル基板７は、図示しないステージ上に配置されている。サンプル基板７上には増幅されたＤＮＡのクラスタが多数形成されており、各ＤＮＡを修飾した蛍光色素が励起され、蛍光を放射する。

サンプル基板７から放射された蛍光は、対物レンズ６で集光され、二色鏡５を透過し、蛍光用のバンドパスフィルタ８を透過する。バンドパスフィルタ８によって励起光成分は十分に遮断される。バンドパスフィルタ８は、２つの半導体光源１，２の発光波長を遮断し、かつ２つの半導体光源１，２の波長の間の波長域及び２つの半導体光源１，２における長波長光源よりも長波長域を透過するものである。これにより、背景光を低減して、高感度測定を可能にする。

バンドパスフィルタ８を透過した蛍光は、蛍光色素識別用の二色鏡９で分割される。蛍光の一部分は二色鏡９を透過後、第一のカメラレンズ１０によって第一の撮像センサ１２上に結像される。蛍光の他の部分は二色鏡９によって反射された後に、第二のカメラレンズ１１によって第二の撮像センサ１３上に結像される。ホストコントローラ１４は、第一及び第二の半導体光源１，２の点灯／消灯の制御信号と、撮像センサ１２及び１３の撮像開始／終了の制御信号を出力し、これらの制御信号が各制御対象へ入力される。

図２は本実施例における、ＤＮＡを修飾する四つの蛍光体の励起スペクトル及び第一及び第二の半導体光源１，２が出力する波長帯を示す。第一及び第二の半導体光源１，２によって、サンプル基板７が交互に照射される。ここで、サンプルの核酸が、２つの半導体光源１，２の波長の間の帯域で発光する蛍光色素２種（青と緑）と、２つの半導体光源１，２よりも長波長域で発光する蛍光色素２種（黄と赤）で修飾される。図２では、４９５ｎｍの波長帯で青と緑の蛍光体が好適に励起され、６４０ｎｍの波長帯で黄と赤の蛍光体が好適に励起されることが示されている。

図３は、本実施例における１パネルの撮影のタイミングチャートである。まずステージが動いて、撮影するパネルを観測視野内に移動させる。その後、第二の半導体光源２のみを点灯し、撮像センサ１２と撮像センサ１３を同時に所定の時間露光させる。第二の半導体光源２を消灯すると同時に撮像センサ１２，１３の露光を終了し、２台の撮像センサ１２、１３で得られた二枚の画像データ（第一の画像ペアと呼ぶ）をホストコントローラ１４に転送する。

次に、第一の半導体光源１のみを点灯させ、再び撮像センサ１２と撮像センサ１３を同時に所定の時間露光させ、その後、第一の半導体光源１を消灯する。２台の撮像センサ１２，１３で得られた二枚の画像データ（第二の画像ペアと呼ぶ）をホストコントローラ１４に転送する。このように、第一及び第二の半導体光源１，２の一方がサンプル基板７を照明中に、２つの撮像センサ１２，１３の両方で少なくとも１枚ずつのサンプルの画像データを撮影する。

本実施例では撮像センサ１２，１３としてインターラインＣＣＤを用いているので、露光と転送が並行して行われ、第一の画像ペアの露光終了と同時に第二の画像ペアの露光が開始される。インターラインＣＣＤ以外の撮像センサ、たとえばＣＭＯＳセンサを用いた場合は、第一の露光タイミングと第二の露光タイミングの間に画像データ転送のタイミングが挿入されるが、今日のＣＭＯＳセンサではデータ転送が極めて高速におこなわれるため、ほとんど画像データ転送のタイミングは無視でき、タイミングチャートは実質的に図３と同様である。

図４は、四つの蛍光体の発光スペクトルと、二色鏡９の透過スペクトルを示す。二色鏡９における吸収損失は無視できて、反射率＝（１−透過率）と見なすことができる。二色鏡９は、透過から反射の遷移波長を、短波長蛍光色素２種（青と緑）の発光帯域の間と、長波長蛍光色素２種（黄と赤）の発光帯域の間の２か所に有する。図２が示すように、第二の半導体光源２のみが点灯している時は、実質的に黄と赤の蛍光体のみが励起され、発光する。図４が示すように、黄の蛍光体の発光の大部分は二色鏡９で反射されて撮像センサ１３で検出され、赤の蛍光体の発光の大部分は二色鏡９を透過して撮像センサ１２で検出される。

一方、第一の半導体光源１のみが点灯している時は、実質的に青と緑の蛍光体のみが励起され、発光する。図４が示すように、青の蛍光体の発光の大部分は二色鏡９を透過して撮像センサ１２で検出され、緑の蛍光体の発光の大部分は二色鏡９で反射されて撮像センサ１３で検出される。

クラスタに対応した画像中の輝点の輝度から、背景の輝度を差し引いた値を信号と呼ぶことにする。四次元のベクトル（第一の半導体光源１の点灯時に撮像センサ１２で得られる信号、第一の半導体光源１の点灯時に撮像センサ１３で得られる信号、第二の半導体光源２の点灯時に撮像センサ１２で得られる信号、第二の半導体光源２の点灯時に撮像センサ１３で得られる信号）を信号ベクトルと呼ぶ。本実施例で得られる各蛍光体に対する信号ベクトルは下記のようになった。
青の信号ベクトル＝（０.５９、１.３１、０.００、０.００）
緑の信号ベクトル＝（０.０５、０.４４、０.００、０.００）
黄の信号ベクトル＝（０.００、０.００、０．６３、０．３５）
赤の信号ベクトル＝（０.００、０.００、０．１６、０．０７）

青と緑および黄と赤の発光スペクトルが重なっている結果、四つの信号ベクトルは完全に直交はしないが、十分に独立しており、クラスタの信号ベクトルを基に高い精度で蛍光体種を判定可能である。

従来では、一般的なフィルタホイール方式で四色の画像を撮影すると４回の露光タイミングがあり、またフィルタ切替の時間があるため時間がかかる。また、できる限り高速性を求めるとフィルタの機械的切替を高速にすることになり、発熱が増加するという課題もあった。本実施例によれば、フィルタホイール方式に比して、コストとサイズが若干増加するだけで、機械的可動部が無くて信頼性が高く、なおかつ撮影時間が半分以下〜１／３になる核酸配列決定装置を提供できる。

例えば、本実施例では、１パネルあたりで２回露光タイミングがあるので、１パネルあたりにかかる時間は非特許文献１より長くなるが、ステージの移動時間を考慮すると倍にはならず、１．５倍程度である。一方、撮像センサが４台から２台に減るので装置コストは約半分となり、装置サイズは著しく軽減される。また、フィルタホイール方式に比べると撮像センサが１つ余分に必要であるが、フィルタホイールの回転機構がなくなるのでコストの上昇は若干であり、１パネルあたりの時間は半分未満となる。このように、本実施例によれば、フィルタホイール方式に対して若干のコスト上昇で大幅なパフォーマンス向上ができ、コストパフォーマンスに優れ、かつ高速な回転機構がないので信頼性の高いシステムが構築できる。

図５は、本発明の第二の実施例における１パネルの撮影のタイミングチャートである。本実施例の核酸配列決定装置の構成は第一の実施例と同一である。

一つの波長域で二種の蛍光体を励起すると、励起効率が違うため発光強度が著しく違う場合がある。時分割もしくは二つの独立した光源で一種ずつ蛍光体を励起する場合は、光源の強度の調整もしくはそれぞれの蛍光体毎に励起フィルタの透過率を調整して強度を揃えることが可能であるが、本発明の方式ではこの方法をとることができない。したがって、もし同時に励起される二種蛍光体の発光強度が著しく違う場合、二つの撮像素子の露光時間が同一であると、一方の蛍光体のＳ／Ｎが低くなってしまう（発光強度の弱いほうのＳ／Ｎを上げようとすると、発光強度の強いほうの信号が飽和してしまう）。

本実施例では、２つの半導体光源１，２の一方がサンプルを照明している間の二つの撮像センサ１２，１３の露光時間が異なる。二つの撮像センサ１２，１３の間で異なる露光時間に設定することにより、発光強度が蛍光体間で大きく違う場合にも、両方の像を良好なＳ／Ｎで得られるという効果が有る。図５に示すように、本実施例では、二つの撮像センサ１２，１３で同時に露光を開始し、露光時間の短い撮像センサ１２の露光を先に終了させている。しかしながら、これに限定されず、露光時間の短い撮像センサ１２の露光開始を遅らせることでも全く同様の効果が得られる。

図６は本発明の第三の実施例における四つの蛍光体の発光スペクトルと、二色鏡９の透過スペクトルを示す。本実施例における核酸配列決定装置の構成及び蛍光体は第一の実施例のそれらと同一である。二色鏡９の透過スペクトルについては第一の実施例に対して透過と反射が反転している。このような透過特性でも第一の実施例とほぼ同様に同時に発光する二つの蛍光体の蛍光を分離して検出できる。

第二の半導体光源２のみが点灯している時は、実質的に黄と赤の蛍光体のみが励起され、発光する。図６が示すように、黄の蛍光体の発光の大部分は二色鏡９を透過して撮像センサ１２で検出され、赤の蛍光体の発光の大部分は二色鏡９で反射されて撮像センサ１３で検出される。一方、第一の半導体光源１のみが点灯している時は、実質的に青と緑の蛍光体のみが励起され、発光する。図６が示すように、青の蛍光体の発光の大部分は二色鏡９で反射されて撮像センサ１３で検出され、緑の蛍光体の発光の大部分は二色鏡９を透過して撮像センサ１２で検出される。

本発明によれば、フィルタホイール方式に比して、コストとサイズが若干増加するだけで、機械的可動部が無くて信頼性が高く、なおかつ撮影時間が半分以下〜１／３になる核酸配列決定装置を提供できる。

なお、本発明は上述した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上述した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることがあり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

また、ホストコントローラ１４の各構成、機能、処理部等は、それらの一部や全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。また、ホストコントローラ１４の各構成、機能、処理部等は、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリやハードディスク、ＳＳＤ（Solid State Drive）等の記憶装置、または、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に置くことができる。

また、上述の実施例において制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。実際には殆ど全ての構成が相互に接続されていると考えてもよい。

１ 第一の半導体光源
２ 第二の半導体光源
３ 励起光合成用二色鏡
４ 励起光用バンドパスフィルタ
５ 励起光／蛍光分離用二色鏡
６ 対物レンズ
７ サンプル基板
８ 蛍光用バンドパスフィルタ
９ 蛍光色素識別用二色鏡
１０ 第一のカメラレンズ
１１ 第二のカメラレンズ
１２ 第一の撮像センサ
１３ 第二の撮像センサ
１４ ホストコントローラ

Claims (8)

1. 波長の異なる２つの光源と、
   ２つの検出器と、
   前記２つの光源からの光をサンプルに照射し、前記サンプルの核酸からの蛍光を前記２つの検出器へと導くための光学系と、を備え、
   前記２つの光源は、前記サンプルを交互に照明し、前記サンプルの前記核酸を前記２つの光源の波長の間の帯域で発光する蛍光色素２種と、前記２つの光源よりも長波長域で発光する蛍光色素２種で修飾し、
   前記光学系は、前記サンプルの前記核酸からの蛍光を分岐して、前記２つの検出器へと導くための二色鏡を備え、前記二色鏡は、透過から反射の遷移波長を、短波長蛍光色素２種の発光帯域の間と、長波長蛍光色素２種の発光帯域の間の２か所に有することを特徴とする核酸配列決定装置。
2. 請求項１に記載の核酸配列決定装置において、
   前記光学系が、前記２つの光源の発光波長を遮断し、かつ前記２つの光源の波長の間の波長域及び前記２つの光源における長波長光源よりも長波長域を透過する第１のフィルタを備えることを特徴とする核酸配列決定装置。
3. 請求項２に記載の核酸配列決定装置において、
   前記光学系が、前記２つの光源の中心波長周辺のみを透過させ、前記第１のフィルタの透過域を遮断する第２のフィルタを備えることを特徴とする核酸配列決定装置。
4. 請求項１に記載の核酸配列決定装置において、
   前記２つの光源の一方が前記サンプルを照明している間に、前記２つの検出器の両方で少なくとも１枚ずつの前記サンプルの画像を撮影することを特徴とする核酸配列決定装置。
5. 請求項１に記載の核酸配列決定装置において、
   前記２つの光源は、発光ダイオードまたは半導体レーザであることを特徴とする核酸配列決定装置。
6. 請求項１に記載の核酸配列決定装置において、
   前記２つの光源の点灯及び前記２つの検出器における前記サンプルの画像の撮影を制御する制御装置を更に備えることを特徴とする核酸配列決定装置。
7. 波長の異なる２つの光源からの光を、サンプルを交互に照明し、前記サンプルの核酸を前記２つの光源の波長の間の帯域で発光する蛍光色素２種と、前記２つの光源よりも長波長域で発光する蛍光色素２種で修飾するステップと、
   二色鏡によって、前記サンプルの前記核酸からの蛍光を分岐して、２つの検出器へと導くステップであって、前記二色鏡は、透過から反射の遷移波長を、短波長蛍光色素２種の発光帯域の間と、長波長蛍光色素２種の発光帯域の間の２か所に有する、ステップと、
   前記２つの光源の一方が前記サンプルを照明している間に、前記２つの検出器の両方で少なくとも１枚ずつの前記サンプルの画像を撮影するステップと、
   を備える核酸配列決定方法。
8. 請求項７に記載の核酸配列決定方法において、
   前記撮影するステップでは、前記２つの光源の一方が前記サンプルを照明している間の前記２つの検出器の露光時間が異なることを特徴とする核酸配列決定方法。

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