JPH0694617A - 光検出型電気泳動装置 - Google Patents

光検出型電気泳動装置

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JPH0694617A
JPH0694617A JP4094568A JP9456892A JPH0694617A JP H0694617 A JPH0694617 A JP H0694617A JP 4094568 A JP4094568 A JP 4094568A JP 9456892 A JP9456892 A JP 9456892A JP H0694617 A JPH0694617 A JP H0694617A
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隆 穴沢
Keiichi Nagai
啓一 永井
Hiroaki Machida
浩昭 町田
Naganori Nasu
永典 奈須
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    • G01N27/447Systems using electrophoresis
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は複数の蛍光体をDNAなどの標識体
として用いる多色蛍光検出型DNA検出システムに関
し、感度を低下させることなく多数の蛍光体からの発光
を区別して検出する、高感度、多波長分離計測手段を提
供する。 【構成】 本発明による装置においてレーザー1, 2、
光チョッパー7、ゲル電気泳動板3、マルチバンドパス
フィルター9、および二次元検出器10からなる。レーザ
ー1, 2で交互に励起して得られる蛍光線画像は、像分
割プリズムとマルチバンドパスフィルター9を用いて交
互に変化する2本の蛍光像として二次元検出され、四つ
の蛍光体に対応した四つの波長に分離され検出される。 【効果】 本発明では像分割プリズムとマルチバンドパ
スフィルターの使用により四種類以上の蛍光体を用いた
多色検出を高い検出感度で行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はDNAあるいはRNAな
どの電気泳動分離光検出装置に係り、特に複数の蛍光色
素で標識された試料からの波長の異なる蛍光を検出する
のに好適な光検出型電気泳動装置に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】遺伝子
診断や人ゲノム解析では多くの試料を同時に迅速に解析
することが必要である。従来、DNA等の塩基配列決定
をはじめとするDNAの検出には放射性元素でDNAを
標識し、DNA断片をその長さによりゲル電気泳動分離
したパターンを写真に転写し読み取るオートラジオグラ
フィが用いられていた。また、最近、DNA断片を蛍光
体で標識し、実時間検出する自動DNAシーケンサーが
開発されている (Nature、321、674(1986))。
【0003】これらシーケンサーでは、発光波長の異な
る複数の蛍光体を用いて、四種の塩基を識別したり、あ
るいは検出しようとするDNAの種類を区別することが
行われている。すなわち、複数の蛍光体からの信号を識
別する手法として、検出器の前に四種の蛍光体からの発
光を選択的に透過する四種のフィルターを具備した回転
フィルターを用いたシステムや像分割プリズム (特願平
01-090843)あるいは波長分散プリズム (特開平01-11644
1)を用いる方法が提案されている。
【0004】しかしながら、前者の回転フィルターを用
いる多色検出システムでは使用する蛍光体の数が多いほ
ど一つの蛍光体当りの計測時間が短くなり感度が低下し
てしまう問題があった。また、後者の像分割プリズムを
用いる従来の方法は一つのレーザーで励起し四種類程度
までの蛍光体の識別には都合が良いが、一つのレーザー
で効率良く励起できるのは二種の蛍光体であり、それ以
上の蛍光体を使用する時には励起光も複数必要となる。
その結果、複数の励起光を用いた場合、第二の励起光波
長と第一の励起光による蛍光波長帯が重なり不都合が生
じることが多かった。特に使用する蛍光体の数が多くな
ればなるほど励起光と発光波長が重なることが多くなる
という計測面での不都合があった。すなわち、これらの
複数の蛍光体で標識された試料からの波長の異なる蛍光
を検出する多色標識法は一般に感度が低いという難点が
ある。現在、かかる方法を用いた装置が米国ABI社か
ら市販されており、泳動路数は24である。この装置は10
ないし24時間かけて1回の測定が可能であり、一度に24
サンプルの測定をすることができるに止まる。
【0005】さらに、一種の蛍光体でDNAを標識し、
泳動路の違いにより末端塩基種を識別する方法も知られ
ている。しかしながら、この一種類の蛍光体標識を用い
る一色標識方式の装置では五〜六時間で一回の測定を行
い一度に8ないし10サンプルの測定ができるが、一日二
回測定したとして一日の測定サンプル数 (スループッ
ト) は16から20サンプルに止まる。
【0006】そこで、本発明は、測定感度を低下させる
ことなく、多数の蛍光体からの蛍光を区別して検出す
る、高感度、多波長分離計測手段の提供、より具体的に
は、遺伝子診断や人ゲノム解析を効率的に行なうことが
可能な高感度で、かつスループットの大きな多色標識検
出型実時間DNA検出装置の提供を目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者は以下に掲げる光検出型電気泳動装置を作
案した。 (1) 二以上の励起光で交互に被測定物を照射する励起
光源を有する照射部、被測定物が発した蛍光を励起光毎
に選別する波長選別部、並びに選別された蛍光を感知す
る光センサー及び光信号の出力機器を有する検出部によ
り構成され、波長選別部が照射部における励起光源の種
類を選別する動きと同期して動く散乱光除去フィルター
と波長選別手段を具備することを特徴とする光検出型電
気泳動装置、(2) 波長選別部に像分割プリズムと複数
のバンドパスフィルターを設けたことを特徴とする
(1) 記載の光検出型電気泳動装置、(3) 波長選別部に
波長分散プリズムを設けたことを特徴とする (1) 記載
の光検出型電気泳動装置、(4) 波長選別部に特定波長
帯の光を反射し、かつ他の波長の光を透過させる機構を
設けたことを特徴とする (1) 記載の光検出型電気泳動
装置、(5) 少なくとも複数の光ラインセンサあるいは
光エリアセンサを具備し、2種類以上の励起光で交互に
ゲルを照射する手段と複数の透過帯を持った2枚のフィ
ルターを具備することを特徴とする実時間光検出型ゲル
電気泳動装置。
【0008】これらの電気泳動装置は、いずれも励起光
を交互に照射し、これに同期させて散乱光除去フィルタ
ーを動作させて、波長分散能力を有する検出器が蛍光だ
けを受光できるように作案されたものであり、励起光を
時間的に交互に開閉することにより、最も相互干渉しや
すい隣接した励起光の散乱光による測定妨害を除去し、
波長分離検出を実現し得るものである。
【0009】次に本発明電気泳動装置における種々の要
素の作用を説明する。
【0010】
【作用】本発明電気泳動装置は多くの蛍光体についてそ
れぞれ最適のレーザーで励起できる利点がある。励起レ
ーザー光の波長が近い時には蛍光と励起光の一部が重な
り測定上支障がでてくるが、波長が近接し測定上干渉し
やすい励起光は時分割して相互干渉を除き、波長の離れ
ている励起光は同時に照射することにより、時分割のデ
ューティーサイクルは 1/2とすることができ感度を大き
く損なうことはない。さらに、波長選別は波長分散プリ
ズムあるいはシリンドリカルレンズとフィルター付像分
割プリズムを用いるので二次元検出器の受光量を損なう
こともない。この結果、複数の蛍光体をDNAなどの標
識体として用いる多色蛍光検出型DNA検出システムに
おいても受光量が大きく高感度を得ることができる。
【0011】
【実施例】本発明の実施例を図面を用いて説明する。
【0012】
【実施例1】図1は、本発明電気泳動装置の第一の実施
態様である。図1において、照射部は、レーザー光源
1, 2と回転シャッター7により構成される。かかるレ
ーザー光源の種類と数は検出を企図する核酸由来の蛍光
信号の数に応じて適宜選択される。すなわち検出対象と
なる核酸の種類が多種類であれば、それに応じてレーザ
ー光源の種類と数を選択し、単一の核酸であっても、塩
基種毎の蛍光信号を特定する場合には、当該塩基種に応
じてレーザー光源を選択する。またプローブ等に標識す
る蛍光色素は、上記レーザー光源の種類に応じて選択さ
れる。通常単一のレーザー光源に対して二つの蛍光色素
を組み合せることができる。すなわち、当該レーザー光
によって直接励起され蛍光を発する蛍光色素と、当該蛍
光によって励起され、一方の蛍光とは異なる波長の蛍光
を発する蛍光色素の組み合せが、それぞれの蛍光を明確
に特定できるという点において好ましい。なお、これら
の蛍光色素の標識プローブとするポリヌクレオチドへの
結合方法は特に限定されるものではない。例えば、アミ
ノ基導入試薬を用いて核酸塩基に直接蛍光体標識をする
方法や特開昭61-44353号開示の方法、すなわち、ポリヌ
クレオチドの蛍光体標識部位のリン酸結合を官能基を有
するホスホン酸結合に置き換え、この官能基を蛍光体結
合させることにより蛍光体標識を実現し、ポリヌクレオ
チドの任意の位置に標識物を導入する方法等を採用する
ことができる。
【0013】図1は、二つのレーザー光源で、DNA断
片を四種の蛍光色素で標識し検出する例について示して
いるが、かかる場合、例えば標識蛍光体としてFITC (Fl
uoresceineisothiocyanate、励起波長490nm、発光波長5
20nm)、ジクロルFITC (励起波長515nm、発光波長534n
m)、TRITC (Tetramethylrohdamine isothiocyamate、励
起波長550nm、発光波長578nm)、スルホローダミン101
(Texas RedTM(Molecular Probe社製):励起波長594n
m、発光波長615nm)を用いた。FITC、ジクロルFITCの励
起光源 (レーザー1) として例えばArイオンレーザー
(488nm)を用いるのが好ましく、 TRITC、スルホローダ
ミン101 の励起光源 (レーザー2) としてArイオンレー
ザー (515nm)、 YAGレーザー (532nm)、He−Ne (543nm)
レーザーなどを使用するのが好ましい。そして、2本の
レーザー1,2が回転シャッター7あるいは光スイッチ
により一定時間に交互に選択され、DNA断片が泳動す
る方向と直交する分離用ゲル4の側面から、2本のレー
ザー1,2は交互にゲル電気泳動板3の分離用ゲル4を
線状に照射する。レーザー1,2はそれぞれ、全反射ミ
ラー5、ダイクロイックミラー6により反射され、分離
用ゲル4を線状に照射する。なお回転シャッター7の切
り替え時間は概ね一秒毎程度である。
【0014】なお、四種類の蛍光体をDNAの四つの塩
基種 (A;アデニン、C;シトシン、G;グアニン、
T;チミン) に対応させる時は、レーザー1とレーザー
2の光軸は一致させ、分離用ゲル4中の同じ位置を線状
に照射させる必要があるが、四種類の蛍光体で分析すべ
き四種のDNAを識別する時には、レーザー1とレーザ
ー2の照射光軸は必ずしも一致させる必要はない。
【0015】また、図1において波長選別部は、回転色
ガラスフィルター8並びに、像二分割プリズム14及びマ
ルチバンドパスフィルター9より構成される像分割プリ
ズム付フィルターにより構成される。回転色ガラスフィ
ルター8は、レーザー照射部分から生ずる励起レーザー
光と同じ波長の散乱光を除去するために、特定波長のレ
ーザー光を除去する色ガラスフィルターを回転板に取付
けたもので、照射光として、レーザー1,2を交互に選
択するための回転シャッター7あるいは光スイッチの動
きに同期して回転する。すなわち、この回転色ガラスフ
ィルター8のあとでは各レーザーで励起されて発する発
光だけが通過して来ることになる。回転色ガラスフィル
ター8は、もちろん上下あるいは左右移動式の切り替え
フィルターであっても良い。また、二次元検出器の前面
に置かれ、蛍光像を二次元検出器面に集光するための結
像レンズ (図示せず) の前には、像二分割プリズム14
(1つのレーザーで三つの蛍光体を励起するときは像三
分割プリズム) が設置されている。図2 (a) に像二分
割プリズム14とマルチバンドパスフィルター9から構成
される像分割プリズム付フィルター一実施態様の断面図
を示す。像二分割プリズム14の二つの出射面には、マル
チバンドパスフィルター9が取り付けられている。かか
るマルチバンドパスフィルター9の構成として何を選択
するかは、用いるレーザー光源と蛍光色素の組み合せに
より決定される。本実施態様においては、例えばマルチ
バンドパスフィルター9は、バンドパスフィルター15
(透過帯535nm〜590nm)とバンド遮断フィルター16 (遮断
波長帯525nm〜600nm)によって構成することができる。
すなわち、バンドパスフィルター15は、ジクロルFITC及
びTRITCからの蛍光を通過させ、バンド遮断フィルター1
6は、FITC及びスルホローダミン101からの蛍光を通過さ
せる。図2 (b) に上記マルチバンドパスフィルター
9、すなわちバンドパスフィルター15とバンド遮断フィ
ルター16の透過スペクトルを示す。バンドパスフィルタ
ー15の透過スペクトル17の透過率が大なる透過帯の波長
領域では、バンド遮断フィルター16の透過スペクトル18
の透過率は実質的にゼロ (反射率 100%) であり、バン
ドパスフィルター15の透過スペクトルの透過率が実質的
にゼロである反射 (遮断) 帯の波長領域ではバンド遮断
フィルター16の透過率は大であり、バンド遮断フィルタ
ー16はバンドパスフィルターとして作用する。すなわ
ち、この二つのフィルター15(A) 、16(B) は、特定の
波長帯ではAが反射 (遮断) 、Bが透過フィルターとし
て作用し、別の波長帯ではBが反射 (遮断) 、Aが透過
フィルターとして作用する。二つのフィルター15(A)、
16(B) は、バンドパスフィルターとそれに相補的なバ
ンド反射フィルターとして作用する。レーザー1の照射
下ではFITCとジクロルFITCからの蛍光像が以下に述べる
検出部を介して区別して検出され、レーザー2の照射下
では、上記蛍光に代えてTRITCとスルホローダミン101か
らの蛍光像が区別して検出される。
【0016】なお、本実施例においては、散乱光を除去
するために回転フィルター8を設けたが、一方のレーザ
ーの散乱光を遮蔽する色ガラスフィルターと他方のレー
ザーの散乱光を除去する狭いバンド反射フィルターを重
ねた固体フィルターを散乱光除去手段として用いること
もできる。さらに当該検出部の受光容量を大きくするた
めにシリンドリカルレンズ (特願平1-154598) を別に設
けることもできる。
【0017】また、波長分散用具としてプリズムを用い
ることもできる。この場合νd値 (=(nd-1)/(nf-nc)
、nd、nf、ncは波長587.6nm、 481.6nm、および656.3n
m における屈折率) が小さく屈折率nd値の大きなSFガラ
スで作製したプリズムが好ましい。当該プリズムは、蛍
光像が結ばれる方向と異なる方向に波長分散させる方向
に設けられる。例えば後述する二次元検出器として光ラ
インセンサーを用いる場合には、通常、線状の蛍光像
(線像) と垂直方向に波長分散させるべく、当該プリズ
ムは、レーザーが線状に照射された部分にゲル電気泳動
板3に対して平行に設けられる。なお、かかる場合にお
いても回転色ガラスフィルター等の散乱光除去手段を用
いて、蛍光だけを二次元検出器で受光できるようにする
必要がある。
【0018】さらに、図1において、検出部は、選別し
た蛍光を感知する二次元検出器10、タイミング回路11、
データ処理器12、出力機器13により構成される。前記検
出部より区別された蛍光は、二次元検出器10の受光素子
を介して検出される。かかる二次元検出器の種類は、複
数の光ラインセンサであるか光エリアセンサであるかを
問わないが、本実施例の場合は取扱いが容易であるとい
う理由で光エリアセンサを用いるのが好ましい。そし
て、この二次元検出器10からの信号の読みだしはタイミ
ング回路11によって制御され、データ処理器12で処理さ
れ、出力機器13によって出力される。
【0019】
【実施例2】図3は、本発明電気泳動装置の第二の実施
態様である。かかる電気泳動装置は、八種類の蛍光物質
で標識された対象物を分離検出する光検出型電気泳動装
置である。図3において、照射部は、レーザー光源1,
2, 21, 22と回転シャッター7により構成される。当該
レーザー光源及びそれに対応する蛍光色素の選択の基準
は、実施例1において述べたと同様である。例えば、レ
ーザーとしてArイオンレーザー (488nm)1、green ・ He
−Neレーザー (543nm)2、yellow・He−Neレーザー(594
nm)21、及びred ・ He−Neレーザー (633nm)22を用い、
これらに対応する蛍光色素として、1に対しては、サク
シニルフルオロセイン(SF505:発光波長508nm) 及びジ
クロルFITC (発光波長535nm);2に対しては、 TRITC
(発光波長575nm) 及びスルホローダミン(Texas RedTM
異性体:発光波長596nm);21に対しては、スルホローダ
ミン101 (Texas RedTM:発光波長615nm)及びHR−II(ロ
ーダミン系色素,Molecular Probs, Inc.製:発光波長63
5nm);22に対しては、 Ultralite 660TM (Ultra,Diagno
stic,Inc.製:発光波長657nm)及び Ultralite 680TM (U
ltra,Diagnostic,Inc.製:発光波長682nm)等を挙げるこ
とができる。
【0020】そして、上記の場合、レーザー光源1由来
のレーザー光とレーザー光源2由来のレーザー光が、ま
たレーザー光源21由来のレーザー光とレーザー光源22由
来のレーザー光がそれぞれ同一光軸になるようにこれら
のレーザー光源を設ける。なお、かかる光軸同士の距離
は、標的標識物同士の電気泳動板3にはさまれた分離用
ゲル (図示せず) 上の距離に応じて適宜調節することが
できる。また、レーザー照射の方向は実施例1と同様で
ある。そして、レーザー1とレーザー21を同時に照射
し、一定時間後にレーザー2とレーザー22を同時に照射
する。かかる前者グループと後者グループのレーザー照
射は、回転シャッター7により一定時間毎に交互に照射
されるべく制御されるが、当該回転シャッター7の切り
替え時間は概ね一秒毎程度である。
【0021】また、図3において波長選別部は、移動式
切換色ガラスフィルター8'、像分割プリズム14、マル
チバンドパスフィルター9より構成される。より具体的
には、上記二つのグループのレーザー光により照射され
た部分から発した蛍光は、それぞれシリンドリカルレン
ズ (図示せず) を用いて上下方向に平行光線とした後、
移動式切換フィルターからなる散乱光除去フィルターで
ある、移動式色ガラスフィルター8' を通過する。この
フィルター8' は二つグループのレーザーの照射と同期
して実施例1と同様に二通りのフィルターに変化する
が、この各フィルターは二枚の色ガラスフィルターを上
下に継ぎ合わせたもので、フィルターの上部と下部に
は、それぞれ上部照射部からの光、及び下部照射部から
の光が入る。フィルター8' 通過後の光はシリンドリカ
ル凹レンズ (図示せず) を通過し、像分割プリズム14及
びマルチバンドパスフィルター9を通過したのち、結像
レンズ(図示せず) により検出部における二次元検出器1
0の受光素子上に四本の蛍光線像として集光され、実施
例1と同様にして、二次元検出器10の受光素子上に得ら
れた信号はレーザー照射光と同期して読み出される。
【0022】波長分散用具としてプリズムを用いること
もできることは、実施例1と同じである。マルチバンド
パスフィルター9を構成する二枚のバンドパスフィルタ
ーの特性は実施例1と同様に、パンドパスフィルターと
バンド遮断 (反射) フィルターの関係とほぼ同じであ
る。すなわち、上記に例示したレーザーと蛍光色素を用
いる場合、第一のフィルターは525nm〜580nm及び625nm
〜670nmに透過帯があり、第二のフィルターはこの領域
は反射して490nm〜520nm及び580nm〜620nmに透過帯のあ
るフィルターである。一定時間毎にレーザー照射光と同
期して四本の蛍光線像の信号を交互に読み出し、合計八
種の波長分散された蛍光線像情報を得ることができる。
なお、検出部の構成及び機能は実施例1と同様である。
【0023】
【実施例3】本発明による第三の実施態様であるダイク
ロイックミラーを用い4種類の蛍光標識を分離検出する
光検出型電気泳動装置の波長選別部の構成を図4に示
す。本実施例は四種類の蛍光標識を検出する例である
が、検出を企図する対象物とレーザー光源の種類と数に
応じて前記実施例1、2のごとく照射部を作案して、八
種類又はそれ以上の蛍光標識を検出することも可能であ
る。本実施例においては、像分割プリズムを用いる代わ
りにダイクロイックミラー26で反射された蛍光線像を二
次元検出器10の検出素子面上にダイクロイックミラー26
の透過光と別の位置に結像させる。レーザーが照射され
た部分19から発した蛍光をシリンドリカルレンズ28を用
いて上下方向に平行光線としたのち、切換フィルターか
らなる散乱光除去フィルターである、色ガラスフィルタ
ー (図示せず) を通過させたのち、一方の蛍光波長の光
を45°の角度で反射するダイクロイックミラー26で蛍光
を二方向に分ける。これにより、ダイクロイックミラー
26の反射光は全反射ミラー27及び焦点距離調整用レンズ
25を通り、結像レンズであるシリンドリカルレンズ24、
マルチバンドパスフィルター23、二次元検出器10に入り
検出される。ダイクロイックミラー26の透過光はそのま
ま、結像レンズであるシリンドリカルレンズ24に入る。
二次元検出器の検出素子面上には二本の蛍光線像が結像
され計測することができる。もちろん別々の二個のライ
ンセンサ上に結像させることもできる。
【0024】上記実施例に示した蛍光検出装置により、
従来の一色方式と比べても遜色のない感度で四種類以上
の蛍光物質を用いた実時間型DNA検出が可能となる。
また本発明蛍光検出装置においては泳動路類は32から40
確保でき、一回の測定に要する時間は従来通り五から六
時間なので一日のスループットとしては従来の24から最
大で160と七倍近い向上が実現した。
【0025】
【発明の効果】本発明蛍光検出装置によれば、非常に多
くの蛍光体を用いて標識したDNA等の断片群を実時間
で効率良く、かつ高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1に示した多種類の蛍光標識を分離検出
する光検出型電気泳動装置の構成を示す図。
【図2】(a) 像分割プリズム付フィルターの断面図、
(b) マルチバンドパスフィルターの透過スペクトルを
示す図。
【図3】実施例2に示した、八種類の蛍光標識を分離検
出する光検出型電気泳動装置の構成を示す図。
【図4】実施例3に示した、ダイクロイックミラーを用
い四種類の蛍光標識を分離検出する光検出型電気泳動装
置の構成を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 神原 秀記 東京都国分寺市東恋ケ窪1丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 穴沢 隆 東京都国分寺市東恋ケ窪1丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 永井 啓一 東京都国分寺市東恋ケ窪1丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 町田 浩昭 東京都千代田区大手町二丁目6番2号 日 立電子エンジニアリング株式会社内 (72)発明者 奈須 永典 神奈川県横浜市中区尾上町6丁目81番地 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会 社内

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 二以上の励起光で交互に被測定物を照射
    する励起光源を有する照射部、被測定物が発した蛍光を
    励起光毎に選別する波長選別部、並びに選別された蛍光
    を感知する光センサー及び光信号の出力機器を有する検
    出部により構成され、波長選別部が照射部における励起
    光源の種類を選別する動きと同期して動く散乱光除去フ
    ィルターと波長選別手段を具備することを特徴とする光
    検出型電気泳動装置。
  2. 【請求項2】 波長選別部に像分割プリズムと複数のバ
    ンドパスフィルターを設けたことを特徴とする請求項1
    記載の光検出型電気泳動装置。
  3. 【請求項3】 波長選別部に波長分散プリズムを設けた
    ことを特徴とする請求項1記載の光検出型電気泳動装
    置。
  4. 【請求項4】 波長選別部に特定波長帯の光を反射し、
    かつ他の波長の光を透過させる機構を設けたことを特徴
    とする請求項1記載の光検出型電気泳動装置。
  5. 【請求項5】 少なくとも複数の光ラインセンサあるい
    は光エリアセンサを具備し、2種類以上の励起光で交互
    にゲルを照射する手段と複数の透過帯を持った2枚のフ
    ィルターを具備することを特徴とする実時間光検出型ゲ
    ル電気泳動装置。
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