CN1854716B - 集成有可变换光源的电泳分离与分析装置及其使用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制作集成有可变换光源的电泳分析与分离装置的技术。该装置包括电泳槽、透光分析板、位于分析板两侧的窄谱或纯光谱光源。在系统中使用窄谱或纯光谱光源可以省掉滤色片而直获得较纯光源，使光源小型化并使之与电泳槽整合一体。利用该技术制作的装置的特别之处为集成光源发出的光以与透光分析板平行方向射入。光线在透光分析板中运行使其中的荧光物质发光，因而可以对荧光样品物质进行实时电泳分析与检测。装置中使用的光源可以变换，适用性强，因而可以用于各种荧光物质的电泳分离与分析。利用所制作的装置用于核酸分析时，可以不需要暗室、避免使用对环境与人体有害的荧光染色剂与紫外光，并使测定的灵敏度大大提高。

Description

集成有可变换光源的电泳分离与分析装置及其使用

技术领域

本发明涉及天然发荧光或与荧光标记物结合的带电荷物质的凝胶电泳分离与分析装置。具体而言，本发明涉及到一种高度集成的可以变换光源波长的多用途电泳分离与分析装置。

背景技术

荧光现象与荧光物质[1-4]；当某种波长的光线(入射光)照射到某些物质的时候，这些物质会发射出不同于入射光波长与强度的光(发射光)。当入射光停止照射时，被照射物质所发射的光线也随之消失。由被照射物质所发射的光线称为荧光。能够发射荧光的物质称为荧光物质。N.Monardes在1575年首次记录到荧光现象。他在一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，观察到极为可爱的天蓝色荧光。在17世纪，Boyle(1626-1691)和Newton(1624-1727)等著名科学家再次观察到荧光现象，并且给予更详细的描述。1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，并在1864年首次提出荧光作为一种分析手段。1867年，Goppelsrder)进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝一桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年，Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则，到19世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600种以上的荧光化合物。20世纪以来，更对荧光现象进行了更深入的研究。

荧光分析方法的发展与仪器应用的发展分不开。19世纪以前，荧光的观察靠肉眼进行，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度有限，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。近十几年来，在其它学科迅速发展的影响下，随着激光、微处理机和电子学的新成就以及新型荧光材料的发现于合成，大大促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的某些新方法、新技术的发展，并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及于工业、农业、医药卫生、环境保护、公安情报和科学研究等各个领域中。如今，荧光分析法已经发展成为一种重要且有效的光谱化学分析手段。

电泳与电泳原理[5，6]；带电的颗粒在电场作用下向着其电性相反的电极移动，称为电泳。荷电颗粒在电场中移动的现象最早由瑞典Uppsal大学物理化学系Svedberg教授观察到。1937年瑞典科学家Tiselius设计世界上第一台电泳仪-移界电泳法。但由于“移界电泳法”电泳时自由溶液受热后发生密度变化产生对流，分辨性不高且加上电泳仪器昂贵，没能推广。50年间，改进电泳仪及找寻滤纸、醋酸纤维生素薄膜、淀粉、琼胶糖等做为支持介质，电泳技术得到推广应用。60年间更找到聚丙烯酰胺凝胶为支持介质并发展了SDS-聚丙烯酰胺电泳、等电点电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单、操作方便、分辨率高等优点。电泳技术已成为生物化学、免疫学、分子生物学以及密切相关的医学、农、林、牧、鱼、制药等领域必备的分析手段。

任何物质由于本身的解离作用或表面上吸附其它带电质点，在电场中便会向一定的电极移动。带电颗粒可以是小的离子，也可以是生物大生子，蛋白质、核酸、病毒颗粒、细胞器等。不同的带电颗粒在同一电场的电泳移动速度不同。一般所带净电荷数越多，颗粒越小，越接近球形，则在电场中移动速度越快，反之则慢。此外，电泳速度还受到电场强度、溶液酸碱度、溶液的离子强度、温度以及电泳支持物的影响。

电泳分类；电泳种类很多，但基本原理相同。不同的电泳因不同的支持物或凝胶而有各自的特性。按分离原理分成区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚胶电泳。按有无固体支持物分成自由电泳、支持物电泳。按电泳槽的形式分成垂直的、水平的、柱状的、毛细管的等不同电泳型态。

凝胶电泳：在所有的电泳介质中，使用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶[5，6]为介质的凝胶电泳的最为普遍。

琼脂糖是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖凝胶的孔径较大、主要用于核酸或蛋白质等较大分子的电泳分离与分析，具有下列优点：(1)液体量大，可达98-99％，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对DNA、RNA与蛋白质的吸附极微。(2)琼脂糖作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。(3)电泳速度快。(4)透光性好，可以直接用紫外或其他光源作定量测定。(5)区带易染色，有利于制备。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N′甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。聚丙烯酰胺凝胶的孔径相对较小、主要用于蛋白质以及小分子物质的电泳分离与分析，具有下列优点：(1)聚丙烯酰胺凝胶没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用小，不易和样品相互作用。(2)由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分。一般说来，含丙烯酰胺7-7.5％的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物质，1万以下的则采用含丙烯酰胺15-30％的凝胶。(3)在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。(4)凝胶无色透明、透光性极好，易观察，可用检测仪直接测定。

凝胶电泳的应用：已经广泛用于对各种带电荷物质的分析。在实验中，研究者通过电泳操作可以将所分析的物质按分子量大小和所携带电荷的差异进行有效分离。对照分子量标准，所分析的分子量可以被准确的估测，并能够对多个样本同时进行分析，分离与纯化。

现有凝胶电泳装置与技术比较：凝胶电泳常用于对生物大分子如蛋白质、DNA和RNA的分析。常规DNA或RNA的凝胶电泳分析[6]见图1。由于DNA或RNA本身不能发荧光，具体操作时需先制作琼脂糖凝胶板，并在其中加入与DNA或RNA结合的荧光剂——溴化乙啶。将制好的凝胶板放于电泳槽中，加DNA或RNA样品后进行电泳。DNA或RNA在电泳过程中与溴化乙啶结合，但被染色的样品在可见光下不能显现。必须在暗室中经紫外光(入射光)激发后显现黄绿色的荧光带谱。荧光带谱可经适当的滤光板滤光后用光学或数码相机照相存档。尽管早已知道溴化乙啶为强致癌剂、紫外线对人体有害，但目前还没有其他更好的替代方法。在互联网搜索引擎搜索“凝胶电泳”一词，可以查找到许多生产、销售电泳槽、电泳仪、紫外光灯箱与成像或图像系统的国内外厂家。但几乎所有的装置与仪器均是按这种传统操作方法设计、生产的。

美国专利6512236公开了一种用可见蓝色光显现荧光材料的技术[7]，利用该技术制作的商品光源称为Dark Reader[8]。国内厂家生产的相似装置称为蓝盾系列可见光凝胶透射仪[9]。该技术利用蓝色滤光片将普通荧光灯的杂色光过滤得到蓝色光。蓝色光激活采用蓝光为入射光的荧光物质，荧光物质经另一片滤光板过滤后成为可为肉眼所观察或为相机记录。该装置代替传统的紫外线灯箱用于DNA或RNA电泳分析时可避免使用对人体有害的溴化乙啶和紫外线。但是该专利主要涉及的是蓝色可见光灯箱的制作。在电泳时色带是不可见的，需要将凝胶板转移到蓝色灯箱中观察后才能决定是否继续进行电泳或照相记录。该装置必须使用蓝色与黄棕色两种滤光板才能够对需要以蓝色光为入射光的荧光物质进行观察与记录，但不能显现以除蓝色光以外的光线为激发(入射)光的荧光材料。

对蛋白质的凝胶电泳分析通常采用垂直电泳分析装置(图2A)。当需要检查荧光蛋白质(蛋白质本身发荧光)或用荧光标记的的蛋白质或其它探针时，垂直电泳分析装置本身不能够显现这些荧光物质，常常需要其它昂贵检测装置(图2B)。因此，需要一种新型的电泳分析装置用于分析荧光蛋白质或基于荧光技术的免疫分析或分子生物学分析。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种可进行实时、连续监测的多用途凝胶电泳分析装置，该装置包括透光分析板和放置在该透光分析板两侧的窄谱或纯光谱光源，其中，该光源发射的光线以与凝胶板水平的角度射入。

在一优选实施例中，该装置还包括电泳电源、电泳分析槽。

在一优选的实施例中，使用半导体发光二极管作为光源，产生光谱纯度较高的光线。在另一优选实施例中，使用激光管产生窄谱或纯光谱光源。用窄谱或纯光谱光源代替传统光源可以不使用滤光片。这样的设计可以使荧光物质的激发光源的体积大大缩小，使其能够整合到分析系统中。窄谱或纯光谱光源为可以变换的光源。光源波长的选择可根据实际使用的荧光染料而定。

在一优选实施例中，所述透光分析板由透光材料制成，该透光材料可选自天然或人工合成的透光材料、凝胶或聚合物或透明液体。

在一优选实施例中，所述电泳分析槽选自水平分析电泳槽和垂直分析电泳槽。

在一优选实施例中，光源安装在凝胶板两侧，光线以与凝胶板平行的方向射入，激活其中的荧光物质。这样的设计有利于光线均匀分布于凝胶板，避免光线直对人眼与摄像装置，提高检测灵敏度并使激活的荧光肉眼可见。

在另一优选实施例中，本发明的凝胶电泳分析装置还包括照相系统。在电泳结束后即可对电泳结果进行拍照。

又一方面，本发明还提供一种实时、连续监测凝胶电泳的方法，该方法包括使用本发明提供的上述凝胶电泳分析装置，使用与加入的荧光染料相配合的纯光谱，以凝胶板水平的角度射入，该光激活该荧光染料，使样品显现出其在凝胶板中的位置，从而可对其进行实时、连续监测。

本发明方法还包括，在适当的时候，对满足要求的凝胶板进行拍照。拍照用的图像仪可与本发明的凝胶电泳分析装置组合成一系统，如本发明上述凝胶电泳分析系统。图像仪也可以是单独的一个部分，视具体情况而定。

在一优选实施例中，所述荧光材料选自天然荧光物质、用荧光材料标记或与荧光材料结合的物质。

采用本发明装置和方法进行DNA、RNA或蛋白质的电泳分析具有许多优点，包括：(1)由于装置自带光源，不需暗室。并可以在电泳过程中连续实时观察DNA、RNA或蛋白质电泳带谱。(2)由于光源可以变换，因而该系统可以与许多新型DNA和RNA荧光染料配对、在电泳中显现DNA或RNA，如使用美国Molecular Probes公司生产的SYBR Green I[10]，可以避免使用强致癌的溴化乙啶。(3)采用新型DNA和RNA荧光染料灵敏度较采用溴化乙啶的方法高5-10倍，达十毫微克(10ng)水平。(4)采用可见光光谱为激发光，可以消除紫外光对人体与样品的有害影响。(5)较传统电泳分析方法操作简便、费用低。

新装置从各个方面均明显优于现有的DNA与RNA凝胶电泳分析装置，表1列出更多项目的比较。

表1、传统电泳装置[6]与可变换光源电泳装置的比较

对比指标	传统分析装置	新型分析装置
			灵敏度	百毫微克水平(ng)	十毫微克水平(pg)
光源	紫外光	可见光
			DNA，RNA染色剂	强致癌的溴化乙啶	无明显致癌作用的SYBR Green
暗室	需要	不需要
			环境污染	有	无
DNA纯化	需另购成套试剂	直接进行
			样品实时监测	不能	能够
DNA，RNA损伤	严重	小或没有
			对人体损伤	严重	没有
人体防护装置	必需	不需
			凝胶板保存	1-2天	可达数月
凝胶板使用次数	一次性	反复多次
			染色带稳定性	差(电泳过程中色带逐渐变弱)	强(染色带稳定不变)

本发明涉及的电泳分析装置还很适合用于以下分析；(1)各种荧光蛋白(GFP)及其衍生物的分析。(2)基于荧光标记的抗原与抗体反应测定。(3)基于荧光标记的基因杂交反应测定。(4)以及DNA/RNA与蛋白质的相互反应测定。

此外，由于本发明涉及装置的光源可以很容易换成其它波长的光源，因而可以用于其它没有列出的物质的电泳分离与纯化。

附图说明

图1显示常用的DNA与RNA凝胶电泳分析示意图。图1中1表示电泳电源，2表示电泳槽，3表示紫外灯箱，4表示紫外光灯管，5表示数码相机或光学相机，6表示凝胶板，7表示滤光片。A表示在进行电泳和染色，但是看不到色带。B表示将凝胶板放到紫外灯箱中，在暗室中对其进行观察，以决定是进一步电泳还是进行照相记录。C表示进行照相记录。

图2显示常用测定荧光蛋白质或与荧光探针结合蛋白的分析示意图。图中A表示垂直电泳装置，B表示生物荧光测定仪或荧光扫描仪。在A中，1为电泳电源，2为荧光蛋白样品，3为电泳上槽，4为凝胶板，5为电泳下槽，6为电泳液，7表示蛋白质转印，8表示直接用仪器分析荧光蛋白样品，9表示经针对特定蛋白的荧光探针探查后用仪器分析。

图3显示了本发明一个具体的集成有半导体光源、光源可变换的凝胶电泳分析装置。其中虚线框1表示仪器箱，2表示数码相机，3表示光学塑料盖，4表示可以变换光源的多用途电泳槽。用此装置进行试验时，可用肉眼直接观察胶上的染色体DNA带，而且该观察可连续进行，入射光光源可以变换，并可进行原位照相记录。

图4显示了自带光源的电泳装置的组件与结构示意图。A示意已经装配好并正在进行电泳的装置。B显示揭开带滤光片的盖子后的装置内部带凝胶板的结构。C显示已经取出凝胶板但仍保留光源的结构。D显示取出凝胶板与光源板后的电泳槽。E为电泳电源。

图5显示水平凝胶电泳装置中光源与凝胶板的结构关系与入射角度示意图，其中1表示光源，2表示凝胶板，带双线的箭头表示入射光的入射方向。

图6显示带有可变换光源的垂直凝胶电泳装置的结构示意图。其中1为光源，2为凝胶板，3电泳下槽，4为电泳上槽，5为电泳缓冲液。带有双线的箭头表示入射光源的入射方向。

图7显示了美国专利512236中所涉及制作的蓝色可见光在DNA分析中的应用。图中显示，首先需要进行A常规方法电泳，然后染色，B将染好色的凝胶板转移到该技术涉及到的蓝色光可见光灯箱上，在暗室中对样品可以进行观察、分析，以决定是继续电泳还是进行C照相记录。图中1表示凝胶板染色，2表示荧光灯管，3表示蓝色可见光灯箱，4表示滤光片，5表示相机，6表示凝胶板。

图8显示本发明运用带有可变换光源的凝胶电泳装置进行DNA分析的实验结果图。该实验采用8个不同来源的DNA样品分别经核酸酶处理(A)或未经酶处理(B)。电泳时间45分钟，实验结果用数码照相机拍照记录。

图9显示了自带光源的电泳装置用于分离纯化DNA片段的示意图。A为凝胶板与纯化板对位后的俯视图。其中1为电泳分离后的DNA带，以带灰色的长方形表示，2与3分别表示凝胶板与分离板，a所示的虚线表示水平中线。B为凝胶板与纯化板水平中线的截面图、示意DNA带的纯化过程。其中，1示意装配对位的情况；欲回收的DNA带需与分离板中的开槽对齐，纯化孔的下开口有半透膜5封住不让DNA通过。2示意电洗脱过程，3示意DNA移动至纯化孔时停止电转运，4示意回收纯化的DNA样品。由于电泳装置带有光源，样品的回收情况能够进行实时观察。

具体实施方式

电泳槽：水平电泳槽及放置光源的部件可以参照图3至图4所列制作。电泳槽可以用透明或不透明材料制作，但要求绝缘并不渗漏。垂直电泳分析槽可以如图2所示制作垂直分析电泳槽。

光源插框：按照图5所示用塑料模具制作。光源插框需置于透光分析板的两侧。放置光源的部件的朝向分析板的一面必须是透明的。

透光分析板：分析板位于光源之间。分析板可以是天然透光材料如琼脂制作的凝胶或人工聚合透光材料的固体，半固体或液体材料。

光源：可换窄谱或纯光谱光源位于光源插件内。所发射的光线必须与以分析(凝胶)板平行的角度射入。光源波长的选择依所选择的荧光染料或荧光标记物而定。现在已有许多厂家生产荧光染料或荧光标记物。有关荧光染料与何种波长光源相配对可以从生产厂家提供的产品资料[10]或商品参考手册[3]中找到。本领域技术人员参考这些资料能够熟练掌握何种荧光染料与何种波长光源相配对的知识。表2归纳列出了部分常用的荧光蛋白质与荧光化合物的入射与发射光的光谱。

制作本装置需要采用窄谱或纯光谱光源。随着半导体技术与光学技术的发展，已经可以很容易通过发光二极管(LED)或激光技术获得较纯光谱光源。发光二极管技术现在已经能够生产从紫外到红外线所有光谱的产品[11]。因而很容易获得各种波长的LED。但LED或激光管的发光面积较小，需要制作并测试特定形状、发光角度与亮度的LED、并以一定距离成排装配，以期获得均匀的入射光线。

表2：部分常用的荧光化合物与荧光蛋白质的入射与发射光[3，10]

滤色片(板)：利用本发明涉及到的特殊设计，完全不需要使用滤色片或滤色板以获得特定的入射光光源，用肉眼即可以观察到荧光并对其进行照相记录。但在荧光样品与观察者或相机之间使用只让荧光(发射光)通过的滤色片或滤色板则可能提高灵敏度。滤色片可以是平板状的盖子，亦可以做成眼镜状，亦可以是置于相机的前面镜头状。滤色镜的颜色与滤光特性的选择依选用的荧光染料或荧光标记物的发射光波长而定。选用原则是阻断入射光通过但尽可能让荧光通过。

本发明不仅适用于核酸的电泳分析，只要是基于荧光标记与荧光反应都可以利用本发明提到的原则制作检测仪器。这里提到荧光标记与荧光反应包括天然发荧光物质，如各种荧光蛋白与各种衍生物，与人工合成的荧光化合物；如荧光素等。

运用本发明制作的水平凝胶电泳分析装置的一个例子见图3。图中的虚线部分表示仪器箱，箱内的上部为数码相机。当然也可使用光学相机替换该数码相机。数码相机的下面是一光学塑料盖，之下为带有可以变换光源的凝胶电泳分析装置。

图3至图5显示了本发明水平凝胶电泳分析装置的一个例子及其工作原理。图5其中E表示电泳电源，A表示带光源的凝胶电泳装置，B表示可将带滤色片的盖子揭开，C表示已移出凝胶的电泳槽，D表示已移出可变换光源的电泳槽。换言之，在具体操作时，电泳槽最先可以是以D所示的状态存在。技术人员可先安装上纯光谱光源，然后放上凝胶板；或者也可先制胶，再装上光源。然后加入电泳液、加样。之后覆盖带滤色片的盖子，最后接上电源进行电泳。

垂直凝胶电泳分析装置的工作原理与垂直凝胶电泳分析装置类似。图6显示带有可变换光源的垂直型凝胶电泳装置的装配示意图与光源的入射方向。

在电泳期间，由纯光谱光源发出的光线与凝胶板平行射入板中，并以凝胶板作为导光介质使光线在凝胶板中均匀分布。入射光在凝胶板中激活荧光物质即可显现样品在凝胶板中的位置。由此技术人员可实时、连续监测电泳的进展。合适的时候可停止电泳。需要的时候，可对该凝胶板进行拍照记录。

以下将对本发明的装置及其使用方法进行详细的描述。应理解，这些具体实施方式仅仅是阐述性的，并不应将其视为对本发明范围的限定。

实施例1：用于DNA的琼脂糖凝胶电泳分析

采用美国Molecular Probes公司出售的非致癌荧光染料SYBR Green I[10]进行DNA样品分析，操作步骤如下；

1.系统的光源采用490纳米的发光二极管光源。

2.按所分析分子的分子量大小制作不带任何DNA染色剂的琼脂糖凝胶板(传统方法中需要在凝胶板或缓冲液中放入致癌的溴化乙啶作为DNA染色剂)。所选琼脂糖凝胶板的浓度与欲分析DNA的分子量的关系可以从有关参考书籍中查到[12，13]，并是生物学领域的技术人员所熟知的。

3.将适当量的DNA与带有SYBR Green I荧光染色剂的上样液混合。

4.将电泳缓冲液加入电泳槽中。

5.将步骤3中混合液加入凝胶板的样品孔中。

6.将电泳槽与电泳仪连接。加样端为阴极端。按8-10伏/厘米长度进行电泳。

7.电泳过程中通过用肉眼或通过电泳盖中间的滤色板可以实时观察电泳进展状态。

8.样品电泳至所需距离时，记录实验结果。图8显示一典型DNA凝胶电泳分析结果。

实施例2：用于DNA的电泳分离与纯化(示意图见图9)

每一个从事基因克隆、基因表达的实验室都会从电泳分离的凝胶板中分离纯化DNA片段。从凝胶中分离纯化DNA片段一般都需要购买成套试剂，而且纯化效率低下。由于利用本发明制作的电泳装置是可以用肉眼或通过电泳盖的滤色板实时观察电泳进展状态。因而纯化DNA样品非常简单可靠。用带有490纳米的纯化装置分离纯化DNA样品的操作步骤如下：

1.系统的光源采用490纳米的发光二极管光源。

2.按照分子生物学的普遍原则用适当的限制性内切酶消化DNA样品[12，13]。

3.按照分子生物学领域内的普遍原则制作不带任何染色剂的琼脂糖凝胶板。

4.在消化后的样品中加入1/10量的上样液并混匀。上样液中含有DNA荧光染色SRBR Green I。

5.将混合好的上样液加入凝胶板的样品孔中。

6.加电泳缓冲液于电泳槽中并与电泳仪连接。加样端为阴极端。按8-10伏/厘米长度进行电泳。

7.用肉眼或通过电泳盖的滤色板实时观察电泳进展状态。

8.达到所要求的DNA分离效果时，停止电泳，将凝胶板转至分离板上。将需要回收的DNA带谱移动并与纯化板的开槽处对齐。

9.将纯化板的上方接负电极、下方接阳电极。以按4-6伏/厘米胶长度运行电泳分离。用肉眼或通过滤色板可以实时观察到电泳分离进展状态。

10.当带荧光DNA带的完全电泳进入分离孔后关掉电源。移开凝胶板、用移液器从分离孔中移取样品至小试管。

11.直接加入酶缓冲液与连接酶连接DNA片段与载体，或将样品用乙醇沉淀浓缩后再用连接酶连接。乙醇沉淀DNA的技术可以从有关参考书籍中查到[12，13]，并是生物学领域的技术人员所熟知的。

12.后续操作按照分子克隆的标准程序进行[12，14]。

实施例3：用于绿荧光蛋白405的电泳分析

绿荧光蛋白作为报告基因已经在现代生物技术中使用相当普遍。绿荧光蛋白的表达通常经用荧光显微镜分析确定。传统绿荧光蛋白的检测需要405纳米的入射光光源。由于一般的荧光显微镜中没有配置该入射光光源而无法观察到该型荧光蛋白的存在。然而，用本发明制作的电泳装置则很容易观察到。用带有可变换光源的电泳分析系统用于分析、检测传统绿荧光蛋白405的具体操作步骤如下；

1.将系统的入射光光源变换为波长为405纳米的光源。

2.按照细胞生物学的标准程序制作非变性的细胞融胞液。

3.制作1％的不带任何染色剂的琼脂糖凝胶板或10％聚丙稀酰胺凝胶板。

4.将适当量的细胞融胞液(一般10-25微克)加入凝胶板的样品孔中。

5.加电泳缓冲液于电泳槽中并与电泳仪连接。加样端为阴极端。按8-10伏/厘米长度进行电泳。

6.电泳过程中可以用肉眼或通过滤色板实时观察电泳进展状态。

样品电泳至所需距离时，用光学或数码相机记录实验结果。实验实施过程表明，采用本发明的装置和方法可连续、实时地对电泳情况进行观察，操作简便。

实施例4：由于分析DNA与蛋白质的结合反应

由于DNA与蛋白质或RNA与蛋白质的相互结合反应在调节细胞的生长、分化与细胞功能有非常重要的作用，因而在体外常用测定DNA/蛋白质或RNA/蛋白质的结合反应为目前生物研究的热点之一[15-17]。其测定原理为特异的DNA或RNA片段与蛋白质结合后其在聚丙稀酰胺凝胶中的迁移率将小于未结合的DNA片段，从而检测到活化的与DNA结合的蛋白调节因子。常用测定技术需要用放射性同位素显现与蛋白质结合的探针的存在，或用生物素或地高新标记DNA探针代替同位素法标记与蛋白质结合的探针。然而，用非同位素的方法需要一些后续的步骤才能够显现与蛋白质结合的探针的位置。这些后续的显现步骤费时而且昂贵。采用本发明涉及的垂直电泳装置(示意图见图6)结合使用荧光材料Cy5标记的探针，则可以在凝胶电泳分析的工程中对DNA/蛋白质的结合反应进行实时监测与直接测定，从而使测定大大简化，节省费用。其具体操作步骤如下；

1.自行制备或通过生物公司商业合成用荧光化合物Cy5标记的DNA探针。

2.将系统采用的入射光光源换成波长换为650纳米的光源。

3.按照分子生物学领域内的普遍原则制作不带任何染色剂的1.4-1.8％的琼脂糖凝胶板或5-6％的聚丙稀酰胺凝胶板[12，16]。

4.按照有关产品的说明书或教科书介绍的标准方法在试管中让细胞提取液与荧光探针进行结合反应[16]。

5.在反应管中加入1/10量的实验室普遍使用的DNA上样液并混匀。

6.将混合好的上样液加入凝胶板的样品孔中。

7.加电泳缓冲液于电泳槽中并与电泳仪连接。加样端为阴极端。按8-10伏/厘米胶长度进行电泳。

8.通过肉眼或通过电泳盖的滤色板实时观察电泳进展状态。

9.当样品电泳至所需距离时，用光学或数码相机记录实验结果。

实验实施过程表明，采用本发明的装置和方法可连续、实时地对电泳情况进行观察，操作简便。

参考资料

1.Bernard Valeur，“分子荧光：原理和应用”(Molecular Fluorescence：Principles and Applications)；Wiley-VCH；1 edition 2001。

2.Joseph R.Lakowicz，Richard B.Thompson(Editor，Advances inFluorescence Sensing Technology V“生物医学光学与图像学进展”(Progress inBiomedical Optics and Imaging，SPIE-International Society for Optical Engine2001。

3.Mary-Ann Mycek，Brian W.Pogue，“生物医学荧光手册”(Handbook ofBiomedical Fluorescence)，Marcel Dekker 2003。

4.Hassan M，Klaunberg BA，“体内荧光成像的生物医学应用”(Biomedicalapplications of fluorescence imaging in vivo).Comp Med.2004，54：635-44。

5.B.David Hames，B.D.Hames，D.Rickwood，“蛋白质凝胶电泳：实用技术入门”(Gel Electrophoresis of Proteins：A Practical Approach (PracticalApproach Series))Oxford University Press；第3版1998。

6.Robin Martin，“凝胶电泳——核酸：核酸”(Gel Electrophoresis-NucleicAcids：Nucleic Acids(Introduction to Biotechniques))，BIOS Scientific Publishers1996。

7.“使用可见光的荧光测定检测”(Fluorometric detection using visiblelight)，美国专利号6,512,236。

8.见网址http://www.clarechemical.com/transilluminator.htm。

9.见网址http://www.shinegene.org.cn/2004/ld 001.html。

10.“分子探针，荧光探针和标记技术指导手册”(Molecular Probes，TheHandbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)，第9版，Invitrogen 2003。

11.E.Fred Schubert，“发光二极管”(Light-Emitting Diodes)，CambridgeUniversity Press 2003。

12.卢圣栋 现代分子生物学实验技术 北京：中国协和医科大学出版社1999。

13.Frederick M.Ausubel，Roger Brent，Robert E.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl，“分子生物学简明教程”(ShortProtocols in Molecular Biology(Short Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols))；第5版，2002。

14.Joseph Sambrook，David W.Russell，Joe Sambrook，“分子克隆，实验室手册”(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3-Volume Set))，Cold SpringHarbor Laboratory Press；第3版，2001。

15.Cann JR，“蛋白质-DNA复合物迁移率变动实验的理论研究”(Theoretical studies on the mobility-shift assay of protein-DNA complexes)，Electrophoresis.1998，19：127-41。

16.Liu RY，Fan C，Garcia R，Jove R，Zuckerman KS，“JAK2/STAT5信号转导途径的异常活化与巨核细胞白血病细胞株的失控性生长有关”(Constitutiveactivation of the JAK2/STAT5 signal transduction pathway correlates with growthfactor independence of megakaryocytic leukemic cell lines)，Blood.1999，93：2369-79。

17.Jing D，Agnew J，Patton WF，Hendrickson J，Beechem JM.“双色法同时检测凝胶中的核酸与蛋白质的电泳迁移率变动实验”(A sensitive two-colorelectrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein ingels)，Proteomics.2003，3：1172-8。

Claims (10)

1.一种在电泳过程中连续实时观察DNA、RNA或蛋白质电泳带谱的电泳分析装置，其特征在于，该装置包括透光分析板和放置在该透光分析板两侧的窄谱或纯光谱光源，其中，该光源发射的光线以与凝胶板水平的角度射入，从而使得光线在凝胶板中均匀分布。

2.如权利要求1所述的电泳分析装置，其特征在于，使用发光二极管或激光管产生窄谱或纯光谱光源。

3.如权利要求1所述的电泳分析装置，其特征在于，所述窄谱或纯光谱光源为可以变换的光源。

4.如权利要求1所述的电泳分析装置，其特征在于，所述透光分析板由透光材料制成。

5.如权利要求4所述的电泳分析装置，其特征在于，所述透光材料选自天然或人工合成的透光材料、凝胶或聚合物或透明液体。

6.如权利要求1所述的电泳分析装置，其特征在于，所述装置还包括照相装置和滤光片。

7.如权利要求1所述的电泳分析装置，其特征在于，所述电泳分析槽选自水平分析电泳槽和垂直分析电泳槽。

8.一种实时、连续地监测凝胶电泳的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的电泳分析装置进行电泳，使用与加入的荧光染料相配合的纯光谱，以凝胶板水平的角度射入，该光激活该荧光染料，使样品显现出其在凝胶板中的位置，从而可对其进行实时、连续监测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光材料选自天然荧光物质、用荧光材料标记或与荧光材料结合的物质。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，该方法还包括对所得电泳结果进行拍照。

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