JPH01112147A - 核酸の塩基配列決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、サンガーの方法によって核酸の塩基配列を決
定する過程で、核酸断片を蛍光物質や燐光物質などの標
識色素でラベルし、塩基配列の読取りをその標識色素か
らの発光を利用して分光学的方法により行なう方法に関
するものである。

（従来の技術） ゲル電気泳動によって展開した核酸断片のバンドの蛍光
式読取り方式としてはオンライン方式とオフライン方式
の２通りが考えられる。オンライン方式では核酸断片を
泳動ゲル中に電気泳動させながら、泳動レーン上のある
一点の蛍光の時間変化を読み取り、オフライン方式では
別途泳動させた泳動ゲルを泳動終了後に読取り専用装置
に装着して泳動パターンを読み取る。

サンガー法（ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡＪ誌、第７４巻、第５４６３ページ（１９７７
年）参照）では試料は末端塩基がそれぞれＡ（アデニン
）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）又はＣ（シトシン）
のいずれかである４種類の核酸断片試料で１組の試料と
なる。

最も簡単に蛍光測定を実現する方法は、第４図に示され
る装置を用いるものである（　ｒＨｉｇｈＴｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　Ｊ誌、１９８６年１２月号、第４９ページの
装置もこの範ちゅうに属する）。

第４図において、２はポリアクリルアミドにてなる泳動
ゲルであり、その両端が電極槽４，６に浸されている。

電極槽４，６には電解液が収容されている。電極槽４，
６の間には泳動電源８によって泳動電圧が印加される。

泳動ゲル２の一端には試料を注入するためのスロット１
０が設けられており、このスロット１０に末端塩基別の
試料が注入され、泳動電源８からの泳動電圧によって試
料が泳動ゲル２中を矢印１２方向に電気泳動し展開され
ていく。

１４は励起光光源としてのレーザであり、励起光はハー
フミラ−又はダイクロイックミラー１６で反射され、対
物レンズ１８を経て泳動ゲル２に照射される。泳動ゲル
２中を泳動してきた試料には蛍光色素が標識として結合
されており、その蛍光色素からの蛍光は再び対物レンズ
１８で集光され、ハーフミラ−又はダイクロイックミラ
ー１６を透過して蛍光選択用干渉フィルタ２０を通り、
光電子増倍管２２に受光され検出される。

他の方法では、放射性物質で標識化した核酸断片を電気
泳動し、その電気泳動ゲルの下端から核酸断片を順次核
酸吸着性の膜に吸着して写し取ってい＜　（ｒＴｈｅ　
ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌＪ誌、第３巻、第１２号、２９
０５〜２９０９ページ（１９８４年）参照）。

（発明が解決しようとする問題点） 蛍光色素で標識化された核酸断片を電気泳動させ光学的
に検出する方法では、励起光がゲルの支持体、ゲル又は
水などによって散乱し、また、使用される蛍光色素の蛍
光が弱いこともあって一般に検出のＳ／Ｎ比が低いとい
う問題がある。

また、その方法では強い蛍光を出す蛍光色素があったと
しても、蛍光色素の分子量や電気的性質などが電気泳動
の挙動に関与するので、蛍光色素の選択の幅が狭いとい
う問題もある。

電気泳動で展開された核酸断片を核酸吸着性の膜に吸着
させて写し取る方法を記載した上記の文献には、標識化
のために蛍光色素を使用することを示唆する記述がなさ
れているが、核酸吸着性の膜に吸着させた核酸断片にど
のようにして蛍光色素を結合させるかについては述べら
れていない。

本発明は塩基配列の決定に非放射性検出方法を用いるも
のであり、電気泳動により展開された核酸断片を電気泳
動ゲルの一端から核酸吸着性の膜に吸着させて写し取り
、その吸着された核酸断片を蛍光色素などの色素で標識
化することによって光学的に検出することのできる方法
を提供することを目的とするものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明では、オリゴヌクレオチドプライマーの５′末端
にビオチンを結合させて鎖伸張反応を行ない、得られた
一群の核酸断片を電気泳動により展開し、展開した核酸
断片を電気泳動ゲルの先端から核酸吸着性の膜に順次吸
着させ、その核酸吸着性の膜に吸着された核酸断片のビ
チオンを標識色素−アビジン複合体と反応させて核酸断
片を標識化し、その標識色素を光学的に検出して核酸の
塩基配列を決定する。

（作用） 核酸の鎖伸長反応では５′末端から３′末端の方向に向
って１個ずつのヌクレオチドを加えながら鎖を伸してい
く。任意の長さの位置で鎖伸長反応が停止された一群の
核酸断片の５′末端にはビオチンが結合している。電気
泳動では５′末端にビオチンが結合した状態の核酸断片
が展開し、核酸吸着性の膜に吸着されて写し取られた核
酸断片のビオチンが標識色素−アビジン複合体と反応し
て標識色素によって標識化された核酸断片が得られる。

標識色素は電気泳動が終了した後に結合するので、分子
量や電気的性質に関係なく、蛍光などの量子収率の高い
ものを選択することができる。

（実施例） 第１図は一群の核酸断片を電気泳動させ、核酸吸着膜に
吸着させて写し取った後、蛍光色素で標識化するまでの
装置を表わし、第２図は標識化された核酸断片を検出す
る検出部を表わしている。

第１図において、２４は平板状の電気泳動ゲルであり、
例えばポリアクリルアミドゲルを使用することかできる
。電気泳動ゲル２４は支持板２６゜２８によって挟まれ
、電気泳動ゲル２４の下端部は支持板２６．２８から突
出している。電気泳動ゲル２４の上端と下端はそれぞれ
電解液３ｏ、３２に浸され、両電解液３０．３２の間に
泳動電圧が印加されるようになっている。

核酸断片試料はゲル２４の上端部に末端塩基別に置かれ
、下方に向って展開される。図はゲル２４を垂直方向に
切断した状態を表わしており、試料は末端塩基の異なる
ものが紙面垂直方向に配列される。

試料はオリゴヌクレオチドプライマーの５′末端にビオ
チンを結合させて相補鎖伸張反応を行なって得られた一
群の核酸断片であり、サンガー法によって調整されたも
のである。オリゴヌクレオチドプライマーにビオチンを
結合させて標識化する方法は三好らの方法（特開昭５９
−１４８７９８号公報参照）に準じて行なう。

下部の電解液３２中には細いメツシュのナイロンネット
で支持された核酸吸着性の膜３４が電気泳動ゲル２４の
下端と密着し、この膜３４は電気泳動速度に対して適当
な速度で順次矢印方向に送られることにより、電気泳動
ゲル２４中の核酸断片の展開パータンが膜３４上に吸着
されて写し取られていく。膜３４としては例えばイオン
交換膜であるＮ　Ａ　４５　（Ｓｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆
　５ｈｕｌ１社の製品）などを用いることができる。

膜３４は核酸断片を写し取った後、溶液３６に浸される
。溶液３６は蛍光色素Ｂ−ファイコエリスリン（Ｂ　−
Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　）とアビジンが結合した
Ｂ−ファイコエリスリン−アビジン複合体溶液である。

溶液３６中で核酸断片の５′末端に結合しているビオチ
ンとアビジンが結合してビオチン−アビジン複合体を形
成し、結果として核酸の５′末端が蛍光色素Ｂ−ファイ
コエリスリンで標識化される。

溶液３６を通った膜３４は、続いて洗浄溶液３８中に浸
される。洗浄溶液３８では膜３４に非特異的に吸着した
Ｂ−ファイコエリスリン−アビジン複合体が膜３４から
除去される。

このようにして膜３４に吸着され、蛍光色素で標識化さ
れた核酸断片が膜３４とともに第２図に示される検出部
へ導かれる。

第２図において、膜３４はＸ方向に送られていく。４０
は膜３４に吸着されて写し取られた核酸断片であり、蛍
光色素によって標識化されている。

４２は蛍光色素を励起する励起光４８を発生する光源で
あり、励起光４８は回転鏡４４及び平面鏡４６を経て膜
３４上に照射される。回転鏡４４を矢印４５方向に回転
させることによって、励起光４８は膜３４上でＹ方向（
膜３４の移動方向Ｘと直交する方向）に走査される。

５０は光ファイバ束であり、その一端は膜３４に対向し
てＹ方向に膜３４の幅にわたって一次元方向に並べられ
ており、その他端は束ねられ、フィルタ５２を介して光
電子増倍管５４と対向している。励起光４８によって励
起された核酸断片４０の蛍光色素からの蛍光及び励起光
の散乱光はＹ方向に並べられた光ファイバ束５０の一端
に入射し、光ファイバ束５０を通ってフィルタ５２から
光電子増倍管５４に入射し検出される。光電子増倍管５
４の検出信号は信号処理部５６で処理されて蛍光強度が
算出され、マイクロコンピュータ５８に導かれて塩基配
列が決定される。

蛍光色素Ｂ−ファイコエリスリンの吸収スペクトルは第
３図に記号６０で示されるものであり、蛍光スペクトル
は記号６２で示されるものである。

したがって、この蛍光色素を励起するには光源４２とし
て低圧水銀灯の５４６．１　ｎｍ又はアルゴンレーザの
５１４．５　ｎｍなどの光を用いるのが適当である。フ
ィルタ５２としては励起光成分を除去するために短波長
側をカットするフィルタ又は蛍光のみを通す干渉フィル
タを使用する。

第２図に示されるように膜３４に写し取られた核酸断片
は電気泳動によって電気泳動ゲル２４の下端から溶出す
る順に吸着されて写し取られており、４種類の末端塩基
Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ別に列状に並んでいる。膜３４がＸ方向
に連続的に移動させられ、励起光４８をＹ方向に走査す
ることによって膜３４上に展開した二次元的な泳動パタ
ーンを得ることができ、これにより核酸の塩基配列が決
定される。

標識色素としては蛍光色素を使用するのが一般的である
が、燐光色素を使用することも可能である。

（発明の効果） 本発明の方法では、オリゴヌクレオチドプライマーの５
′末端にビオチンを結合させて鎖伸張反応を行ない、得
られた一群の核酸断片を電気泳動により展開し、展開し
た核酸断片を電気泳動ゲルの先端から核酸吸着性の膜に
順次吸着させ、その核酸吸着性の膜に吸着された核酸断
片のビチオンを標識色素−アビジン複合体と反応させて
核酸断片を標識化し、その標識色素を光学的に検出して
核酸の塩基配列を決定するので、強い蛍光を発生するＢ
−ファイコエリスリンのような高分子量の物質でも標識
色素として用いることができる。Ｂ−ファイコエリスリ
ンは量子収率が０．９８と高く、塩基配列決定の標識色
素として一般に使用されるフルオレッセインの約３０倍
の蛍光強度を得ることかできる。Ｂ−ファイコエリスリ
ンは分子量が約２４万であるので、従来の方法のように
電気泳動前の核酸断片に標識として結合させておくと電
気泳動に支障が生じるので、Ｂ−ファイコエリスリンを
従来の方法に適用することはできない。

このように、本発明では色素による標識化を電気泳動後
に行なうことにより、強い発光性の色素による標識化と
検出が可能になる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を適用する装置の泳動部と標識化部を示
す正面図、第２図は同装置の検出部を示す斜視図、第３
図はＢ−ファイコエリスリンの吸収と蛍光のスペクトル
を示す図、第４図は従来の塩基配列決定方法の装置を示
す斜視図である。 ２４・・・・・・電気泳動ゲル、 ３４・・・・・・核酸吸着性の膜、 ３６・・・・・・Ｂ−ファイコエリスリン−アジピン複
合体溶液、 ３８・・・・・・洗浄溶液。 ４０・・・・・・写し取られた核酸断片、４８・・・・
・・励起光、 ５４・・・・・・光電子増倍管。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）オリゴヌクレオチドプライマーの５′末端にビオ
   チンを結合させて鎖伸張反応を行ない、得られた一群の
   核酸断片を電気泳動により展開し、展開した核酸断片を
   電気泳動ゲルの先端から核酸吸着性の膜に順次吸着させ
   、その核酸吸着性の膜に吸着された核酸断片のビチオン
   を標識色素−アビジン複合体と反応させて核酸断片を標
   識化し、その標識色素を光学的に検出して核酸の塩基配
   列を決定する方法。
2. （２）標識色素として蛍光色素であるＢ−ファイコエリ
   スリンを用いる特許請求の範囲第１項に記載の方法。