JPH0915171A - 蛍光結像システム及び蛍光結像方法 - Google Patents

蛍光結像システム及び蛍光結像方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 励起及び発光検出の波長の全体にわたり連続
的にチューニング可能な蛍光結像システム及び方法を提
供すること。 【解決手段】 光学システムはユーザが励起光源及び放
出検出システムの波長及び帯域を連続的にチューニング
することを可能にする。ピーキング機能は励起及び放出
検出を微細にチューニングすることにより検出された蛍
光信号を自動的にピーク化する。ルックアップテーブル
は特定の波長に対する蛍光信号が光学系列の波長依存性
に対して訂正されることを可能にする。システムの一実
施例においてはサンプルは１つより多い波長帯域におい
て同時に照射され、各波長帯域は独立にチューニング可
能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は概略的には蛍光結像
システム及び蛍光結像方法に関し、より特定的には、励
起(excitation)波長又は発光(emission)検出波長又は両
者を連続的にチューニング可能な蛍光結像のための方法
及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】バイオテクノロジーの分野においては、
センシティブで、非同位体のラベルとして通常は蛍光色
素(fluorescent dyes)が用いられている。これらのラベ
ルは、悪性腫瘍からＤＮＡシーケンス内の特定の染色体
までの範囲の様々な細胞構造を識別し配置するために用
いられる。一つの応用は、フルオレセンス・イン・シツ
(in situ)・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）であ
り、最初にＤＮＡプローブで特定の染色体領域に取りつ
き、次いで顕微鏡を用いてプローブを結像する。
【０００３】蛍光でラベル化されたサンプルを読み取る
ための様々な装置が設計されてきた。一般に、蛍光でラ
ベル化されたサンプルを読み及び又は結像するように設
計された装置は、一つ以上の励起波長で発光する少なく
とも一つの光源と一つ以上の蛍光波長を検出する手段を
必要とする。Proc. Natl. Acad. Sci. USA: Genetics,
89 (February 1992)に掲載のThomasTied et al.による
論文"Simultaneous Visualization of Seven Different
DNAProbes by In Situ Hybridization Using Combinat
orial Fluorescence and Digital Imaging Microscop
y,"において、著者は結合プローブ・ラベリングスキー
ムを記載している。この開示された技術は、所定数の蛍
光色素を用いて同時に検出される目標シーケンスの数を
増大させる。特に、著者はわずか３つの蛍光色素を用い
て７つのプローブまでを同時に分析することを開示して
いる。
【０００４】米国特許第5,290,419 号には、タイムシェ
アを基本として動作する２つ以上の励起光源によりサン
プルを照射する多色蛍光分光分析器が記載されている。
バンドパスフィルター、イメージ分割用プリズム、バン
ドカットオフフィルター、波長分散プリズム及びダイク
ロイックミラーが用いられて、特定の発光波長を選択的
に検出する。
【０００５】米国特許第5,213,673 号には、一つ以上の
光源によりサンプルを照射する多色電気泳動パターン読
み取り装置が記載されている。この光源は個別に使用さ
れるか又は単一の光源に結合される。サンプルの照射か
ら得られた蛍光を分離して複数の蛍光波長にするために
光学フィルターが使用されている。米国特許第5,190,63
2 号には、2 つ以上の蛍光物質を励起できる光の混合を
生成するために一つ以上の光源が使用される多色電気泳
動パターン読み取り装置が記載されている。波長により
蛍光を分離するために光学フィルターと回折格子の両方
が用いられている。
【０００６】米国特許第5,062,942号には、蛍光像が複
数の仮想的な像に分離される蛍光検出装置が記載されて
いる。仮想的な像を波長により分離するために、バンド
パスフィルターが使用されている。Gastrointestinal E
ndoscopy 36 (2) (1990) 105-111に掲載の、Cothren et
al.による論文"Gastrointestinal Tissue Diagnosis b
y Laser-Induced Fluorescence Spectroscopy at Endos
copy" において、著者は、生きている組織からオートフ
ルオレセンスを学習するために用いられる内視鏡システ
ムを記載している。励起光源は３７０ナノメータの波長
の単色である。照射された組織により発光された蛍光を
集光するために光学フィルターが使用される。発光スペ
クトルはゲートされた光学的マルチチャネル分析器に結
合された結像スペクトログラフを用いて集光される。類
似のオートフルオレセンスシステムが、Lasers in Medi
cal Science 2 (41) (1987) 41-49 に掲載のAnderson e
t al. による"Autofluorescence of Various Rodent Ti
ssue and Human Skin Tumour Samples" に記載されてい
る。
【０００７】上記の蛍光分光分析器は多くの実行上の不
利益をこうむる。例えば、システムのすべての励起波長
の選択は非常に限定されており、それらのいずれもユー
ザに如何なる特別の励起波長をも特定する能力を与えな
い。したがって、これらのシステムによりユーザが蛍光
ラベルの励起を最適化できるようにはならない。さら
に、従来技術のシステムは、興味ある波長の検出全体に
わたって連続的にチューニング可能であることとは反対
に、概して離散的な波長帯域における蛍光の検出をす
る。励起と発光の検出の波長を連続的に行う能力がない
と、ユーザは蛍光応答をピーク化することができない。
【０００８】従来技術の蛍光分光分析器において検出波
長の連続的なチューニング能力の欠如は、選択された蛍
光ラベルが外部環境の効果によってスペクトルのシフト
が生ずる場合に特に問題である。例えば、幾つかの蛍光
プローブは溶剤の極性に対して感度を表す。本明細書に
おける溶剤は様々なバイオモレキュラ構造（例えば、細
胞、膜、たんぱく質、その他）の内部領域を含む。この
現象は、大きい励起状態ダイポールモーメントを持つ蛍
光プローブにおいて一般に観察される。蛍光スペクトル
のシフトの他の一般に観察される原因は、多くの蛍光ラ
ベルのｐＨ感度である。一般に、ｐＨ感度はプローブの
π電子システムにおける再構成の結果である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】以上から、励起及び発
光検出の波長の全体にわたり連続的にチューニング可能
な蛍光分光分析器が望ましいことは明らかである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明はルックアップテ
ーブル及び／又は信号ピーキングシステムと結合した、
連続的にチューニング可能な蛍光検出装置を提供する。
その装置のチューニング能力は、照射サブアセンブリ及
び／又は発光検出サブアセンブリを連続波長内の任意の
波長にチューニングする能力にある。
【００１１】放射アセンプリのチューニング部と発光検
出部は、分散要素、フィルター、又は干渉計を利用し得
る。前者の例はプリズム及び格子である。後者の例は短
路フィルター、長路フィルター、ノッチフィルター、可
変フィルター、音響光学的フィルター、偏光フィルタ
ー、連続的にフィルムの厚さを変化させることに基づく
干渉型フィルター、チューニング可能液晶フィルターで
ある。干渉計の例はファブリペローエタロン及び一般の
パス干渉計である。
【００１２】本発明の一態様においては、ルックアップ
テーブルは、ユーザにより提供されたアプリケーション
データに基づいて、最適の放射波長、発光検出波長、及
び各々の関係付けられた帯域を決定する。アプリケーシ
ョンデータは、所期のサンプルのサポート又は分離マト
リックスと共に、使用されるべき色素(dye) ／ステイン
(stain) ／蛍光色素(fluorochrome)といった情報を含
む。本発明の他の態様においては、ルックアップテーブ
ルは装置内の要素の各々に依存する波長に関する情報を
含む。この情報を用いて、ユーザは装置内の任意の波長
変動を補償できる。
【００１３】多くの蛍光色素（fluorescent dyes) 、ス
テイン、及び蛍光色素に対して励起及び発光波長の両者
は周知であるが、様々な要因によりこれらの波長のスペ
クトルのシフトが生じる。本発明においては、ユーザは
放射サブアセンブリ及び／又は発光検出サブアセンブリ
をチューニングすることによりこれらのスペクトルのシ
フトを補償できる。
【００１４】本発明の好ましい態様による蛍光検出装置
は、およそ３００ナノメータからおよそ７００ナノメー
タの発光をするキセノンランプを使用する。波長の大き
い範囲をカバーするために、多数の光源が使用され得
る。分散要素と結合したフィルターホイ−ルを用いるこ
とにより、ユーザはサンプルに入射した放射線の波長を
光源の動作帯域内の任意の波長にチューニングできる。
スリットを用いて励起放射線の帯域を調整する。照射さ
れたサンプルから放出された蛍光は、フィルターホイー
ルとSAGNAC干渉計を備えたチューニング部を通過した後
にＣＣＤ検出器アレイ上に結像される。本態様において
は、ユーザはシステムの動作パラメータのすべてを手動
でセットできるか、又は特定の蛍光色素又はプローブに
基づいてシステムがパラメータを自動的にセットでき
る。初期動作パラメータを選択した後に、ユーザはシス
テムをこの形態で動作させるか、または励起源及び発光
検出システムの波長及び帯域を変化させることにより、
検出した蛍光信号をピーク化することができる。システ
ムをピーク化することは手動又は自動のいずれによって
も可能てある。異なる波長で検出された蛍光信号は、好
ましい形態における光学的系列の各要素の波長依存性に
対して自動的に訂正される。
【００１５】本発明の特徴及び利益は、本明細書の残り
の部分及び図面を参照するとよりよく理解できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】図１は本発明の一実施例の機能ブ
ロック図である。サンプル１は蛍光又は蛍光色素又はプ
ローブにより処理された様々な物質の任意の一つでよ
い。サンプル１はまた、オートフルオレセンスを表すサ
ンプルでもよい。光源２からの光はサンプル１を照射す
る前にチューニング部３及び集光光学系４を通過する。
好ましい実施例における光源２の波長領域は、およそ２
５０ナノメータ（即ち、紫外線放射）から２マイクロメ
ータ（即ち、赤外線）までである。サンプル１からの蛍
光は、イメージング（結像）光学系６及びチューニング
部７を通過した後に検出器５にイメージ化される。
【００１７】チューニング部３及び７の制御はユーザイ
ンタフェース８において開始される。例えば、ユーザは
マニュアル又は自動の制御を選択できる。マニュアルモ
ードにおいては、ユーザは装置の動作パラメータを定義
する。これらのパラメータは励起波長、検出波長、励起
及び検出の両者の帯域幅、及び出力データの形態を含
む。自動モードにおいては、ユーザは使用される蛍光プ
ローブを特定する。システムは、次いで、アプリケーシ
ョンテーブル１０を用いてその特定のプローブのための
適当なインストルメントパラメータを、コンピュータ９
を介して選択する。アプリケーションテーブル１０は、
各特定のプローブ又は色素のために最適の励起及び発光
波長を特定するルックアップテーブルを含んでいる。他
の自動モードにおいては、ユーザは、コンピュータがピ
ーキングアルゴリズム１１を用いてシステムをピーク化
することを可能にするある種のパラメータを選択する。
例えば、ユーザはユーザインタフェース８に励起及び発
光波長を入力する。システムは、システムの性能を最適
化するために、コントローラ１２を介してこれらのパラ
メータ及び帯域を微細チューニングする。
【００１８】好ましい実施例においては、検出器５から
の信号はＡＤ変換器１３によりディジタル信号に変換さ
れる。モニタ１４上にサンプルのイメージが再構成され
る。ユーザは表示すべきイメージのタイプをユーザイン
タフェース８を介して特定する。例えば、ユーザは多数
の異なる波長のプローブを単一のイメージに結合する復
号イメージを選択できる。ユーザはまた、特定のプロー
ブが特別の色に人工的に関係付けられている、使用され
るべき人工的なカラーシステムを特定することができ
る。他の人工的なカラーシステムにおいては、ユーザは
特定の発光強度のための特定の色を指定することができ
る。モニタ１４はまた、蛍光情報と結合した白色光又は
サンプル１の「真の」イメージの結合を表示することが
できる。モニタ１４は又、サンプル１の特定の点のため
の分光情報を表すことができる。このモードにおいて
は、励起及び発光検出波長は走査されてサンプルの分光
分析を可能にする。この走査モードにおいては、波長は
波長の範囲の全体にわたって変化できるか、システムが
特定の波長の集合にわたって走査できる。チューニング可能励起光源 図２は本発明の一実施例による励起光源の概略図であ
る。本実施例においては、キセノンのアークランプが光
源２０として用いられる。充満ガスを変化させることに
より、異なる波長帯域が可能であり、その材料はランプ
のエンベロープを備えている。集光器２１は光源２０の
出力を集光する反射要素である。興味ある波長帯域を大
まかに選択するためにフィルターホイール２２が使用さ
れ，励起光源を興味ある波長に微細にチューニングする
ために分散要素２３が用いられる。分散要素２３により
入射光が分散された後、サンプル１を照射する前に、可
変スリット２４及び集光光学系２５を通過する。サンプ
ル１に入射する放射の帯域は可変スリット２４における
ギャップ幅により制御される。要素２２−２４はステッ
プモータ（図示せず）により制御される。
【００１９】単一のキセノンランプにより達成できる波
長よりも広い波長を選択することが望ましい場合、多数
の光源が使用できる。図３及び４は２つの異なるマルチ
光源の形態を示している。図３において、波長λ1 で動
作するレーザ４１からの放射線と波長λ2 で動作するレ
ーザ４２からの放射線とは、光源２０からの広いスペク
トル放射線に結合される。各々の光源はビームスプリッ
タ４３を用いて結合される。この形態では、光源２０か
らの光は、エネルギースループットを最大にするため
に、コリメート光学系４４を介して送出される。図３に
おける光路は光ファイバ（図示せず）と置き換えること
が可能である。
【００２０】図４において、光源４１、４２及び２０か
らの放射線は図５に示す形態におけるように、単一のビ
ームに結合されない。この形態においては、ユーザ（又
は自動モードにおいてはシステム）が適当な波長又は波
長帯域を決定する。選択された光源からの光は光ファイ
バ５０又は単純な光学系の操作により分散要素２３に向
けられる。
【００２１】標準的なプリズムは変角の関数として非線
型であり、この結果むしろ複雑な光学装置の設計とな
る。分散要素２３としてプリズムを用いる場合、図５に
示すペリンブローカ(Pellin-Broca) プリズムのよう
な、一定変角の分散プリズムを用いることが好ましい。
このタイプのプリズムにおいては、ある単色光線はその
プリズムを通過して最初に入射角から９０°の変角で出
射する。他の全ての波長は異なる角度でそのプリズムか
ら出射するであろう。図５におけるイメージの平面に対
して垂直な軸に沿ってそのプリズムを回転させることに
より、入射光線は異なる入射角を有することになり、異
なる波長成分が９０°の変角でそのプリズムから出射す
ることになろう。このタイプのプリズムは、システムが
固定角度で動作でき波長はプリズムを回転させることに
よりチューニングできるので、明らかに装置の設計を簡
単化する。
【００２２】分散要素２３のために格子も又使用でき
る。図６は格子７０、折りたたみ鏡７１、入口及び出口
スリット７２、及び開口部７３を備える波長分散システ
ムの一形態を示す。波長は格子７０を回転させることに
よりチューニングされる。このシステムの帯域は格子の
溝の間隔、開口部の直径、及び開口部と格子との間の距
離の関数である。好ましい形態においては、興味ある波
長領域に依存して遠隔的に選択可能であり、従って装置
の動作帯域全体で充分な放射パワーを保証する多数の格
子が用いられる。
【００２３】励起光源をチューニングする他のアプロー
チは光学的フィルターを使用することである。図７にお
いて、フィルターホイール８０は短路エッジを有する一
連のフィルターを含み、フィルターホイール８１は長路
エッジを有する一連のフィルターを含む。従って、波長
及び帯域はフィルターの選択により決定される。例え
ば、４５０ｎｍの短いパスフィルターと４７０ｎｍの長
いパスフィルターを選択することにより、４６０ｎｍに
中心がある２０ｎｍの帯域が選択される。波長が連続的
にチューニング可能であることを保証するために、フィ
ルターホイール８０及び８１は特別のフィルターの選択
を可能にするように回転するだけではなく、軸８２のま
わりを回転させられる。これにより、フィルターは光学
軸８３に関して傾斜する。フィルターが軸から離れるよ
うに傾斜すると、それらの波長特性は徐々に変化する。
【００２４】波長をチューニングする他のアプローチは
可変フィルターを使用することである。環状の可変フィ
ルターは単に、フィルムの厚さが基板上の角度位置に関
してリニアに変化する干渉フィルターである。環状の可
変フィルターを用いる実施例はフィルターホイール８０
及び８１が環状可変フィルターで置き換えられているこ
とを除き、図７に示される形態に外観が似ている。各フ
ィルターホイール及び軸８２に沿った傾斜の位置に依存
して、任意の波長が選択できる。
【００２５】本発明の他の実施例においては、励起波長
をチューニングするためにファブリペローエタロンのチ
ューニング可能フィルターを用いることができる。この
実施例においては、概略的には、バンドパスフィルター
を用いて不要な波長の大部分を除去することが好まし
い。次いで微細チューニングがファブリペローシステム
を用いて行われる。このシステムの変形においては、フ
ァブリペローエタロンの干渉フィルターの中に強誘電性
液晶装置が挿入され得る。この設計では高スループット
とシステムの高速微細チューニングが可能である。
【００２６】本発明の他の実施例においては、サンプル
１は一つ以上の波長帯域で同時に照射され得る。これに
より、多数の蛍光プローブが同時に励起されることが可
能になる。各波長帯域の完全なチューニング可能性を獲
得するための好ましい形態が図８に示されている。アー
クランプ（光源）２０からの放射線は、ビームスプリッ
タ９０により、興味ある帯域の全体にわたってほぼ等し
い強度の２つのパス９１及び９２に分割される。パス９
１は、例えば一連のフィルターホイール９３といった波
長チューニング部を通過する。パス９２は、チューニン
グ用ミラー９５により偏向された後に同様の一連のフィ
ルターホイール９４を通過する。ミラー９６及びビーム
スプリッタ９７はパス９１と９２を同軸ビームに結合す
る。
【００２７】図８に示した形態に対する多数の変形が存
在する。第１に、アークランプ（光源）２０を２つより
多い光路に分割することが可能であり、それによりサン
プルを２つより多い異なる波長帯域により照射すること
が可能になる。第２に、これに代わる形態では、各々が
それ自体のチューニング部を有する多数の光源を用い
る。図８に示したシステムよりも複雑であるが、このア
プローチは各波長帯域内のより多くのエネルギーがサン
プルに入射することを可能にする。第３に、システムは
上記のチューニング部の任意のもので設計できる。第４
に、各チューニング部内に存在する個々の光路が単一の
パスに結合される必要はない。それらは、しかしなが
ら、サンプル１の同一部を照射しなければならない。第
１に、そのシステムは多数の光源を有し各光源のための
チューニング部が波長帯域の特定部のみをカバーするよ
うにすることにより単純化できる。例えば、システム
は、２５０から４００ナノメータ、４００から７００ナ
ノメータ、及び７００から２０００ナノソータをそれぞ
れカバーする３つの光源／チューニング部の組み合わせ
を持つことができる。さらに、単純なカットオフフィル
ターを用いて興味ある帯域の外の放射線を除去すること
によりチューニング部は単純化される。チューニング可能な発光検出 好ましい実施例においては、本発明の発光検出部により
ユーザは、蛍光の検出すべき波長と帯域の両者を選択で
きる。この特徴によりによりユーザは、多くの蛍光信号
を区別できるとともに、バックグラウンド照射のような
様々な光源から漏れてくるノイズや励起光源からの散乱
放射を除去できる。
【００２８】図９は検出システムの機能ブロック図を示
す。サンプル１０１からの蛍光は集光光学系１０２及び
帯域フィルターホイール１０３を通過する。帯域フィル
ターホイール１０３は不要な放射線の大部分を除去す
る。一実施例においては、帯域フィルターホイール１０
３は、各々がおよそ１００ナノメータの通過帯域を有す
る一連のフィルターから選ばれた一つのフィルターであ
る。帯域フィルターホイール１０３により不要な放射線
の大部分が除去された後に、放射線は検出器１０５に入
射する前に波長チューニング部１０４を通過する。発光
検出波長をチューニングする手段として、励起光源のた
めの波長チューニング方法の任意のものが適用可能であ
る。上記したものと類似の技術を用いて一つより多い波
長帯域における発光を同時に検出することも又可能であ
る。
【００２９】発光検出システムの一実施例を図１０に示
す。サンプル１０１からの蛍光は集光光学系１０２によ
り集光される。上記したように、不要な波長スペクトル
の大部分の除去のために帯域フィルターホイール１０３
が用いられる。システムを特定の波長にチューニングす
るために、ビームスプリッタ１０６とチューニング用ミ
ラー１０７を有するSAGNAC干渉計が用いられる。干渉計
の光路差を制御することにより波長の選択が行われる。
チューニング可能スリット１０８は帯域を制御する。光
学系１０９は選択された発光を検出器１０５上に集光す
る。
【００３０】図１０に示したように、ビームスプリッタ
１０６は入射光を２つの分離したビームに分割する。こ
れらのビームは検出器１０５のアレイにおいて干渉パタ
ーンを形成する。検出器１０５のアレイの各ピクセルに
おけるパターンの強度は光路の相違によって変化する。
光路の相違に対する強度を測定することにより、インタ
ーフェログラムが形成される。検出器１０５のアレイの
各々のピクセルにおける波長スペクトルを回復するため
に、各インターフェログラムのフーリエ変換が計算され
る。フーリエ変換はコンピュータ９を用いて計算され
る。
【００３１】図１１は図１０に示した干渉計に代えて本
発明により用いられることができる干渉計７００のモノ
リシックな形態を示す。このモノリシックな干渉計は、
振動、ミスアラインメント、及び熱効果に対して、他の
形態の干渉計よりも強い。この形態の干渉計はまた、非
常に大きい受入れ角度を有する。干渉計７００はビーム
スプリッタコーティング７０５の平面に沿って第２のガ
ラス片７０３に接着された第１のガラス片７０１を備え
ている。光はパス７０５に沿って干渉計に入射する。こ
の光線がビームスプリッタコーティング７０５に衝突す
ると、その光線は２つ光線に分割され、一つの光線はパ
ス７０９に沿い、他の光線はパス７１１に沿う。干渉計
ミラー（複数）７１３により反射された後、光線は距離
７１７だけ分離されたパス７１５に沿ってオプティック
を表す。検出器 本発明の一実施例においては、検出器１０５は電荷結合
装置（ＣＣＤ）アレイである。図１２は本実施例におい
てサンプル１が光源２０により照射され、この場合光源
の放射線はまず光学系２５により集光されていることを
示している。サンプル１からの発光は光学系１０９によ
り検出器１０５のアレイ上に集光され焦点化される。図
１２はシステムの波長のチューニング能力についてはて
にも示していない。本実施例においては、サンプルと検
出器１０５により検出された像との間に１対１の対応が
ある。こうしてサンプル１の第１の部分は第１のピクセ
ル上に結像され、サンプルの第２の部分は第２のピクセ
ル上に結像され、等となる。
【００３２】図１３は検出システムの他の実施例を示
す。この実施例においては、光学系１０９はサンプル１
の第１の部分からの発光を単一の検出器１０５上に焦点
化する。検出器１０５は、興味ある波長に対して感度が
あるＣＣＤ、光電子倍増管、又は他の任意の検出器でよ
い。焦点化用の光学系１０９又はサンプル１のいずれか
を走査することにより、サンプル１の異なる部分がシリ
アルに検出器１０５上に焦点化される。コンピュータ９
は次いで、モニタ１５上に表示できるサンプル１の像を
再構成する。
【００３３】図１４は検出システムの第３の実施例を示
す。この実施例においては、光源２０からの放射線は光
学系２５によってサンプル１の小部分の上に焦点化され
る。この部分の蛍光により放出された放射線は次いで光
学系１０９により捕獲されかつ検出器１０５上に焦点化
される。サンプル１はラスタ走査されて、全体の像がシ
リアルに捕獲され記録される。この実施例は、励起放射
線と発光した蛍光の両方が焦点化されるので、弱いプロ
ーブが用いられる場合に特に有益である。ルックアップテーブル ルックアップテーブル１０（図１）は多くの機能を提供
する。第１に、ルックアップテーブル１０はユーザに、
特定の実験的形態（即ち、特定のプローブ又は色素、特
定の分離マトリックス又はサンプルサポート、その他）
に対する最適システム動作パラメータ（即ち、励起及び
放出波長、励起及び放出帯域、その他）にかんして指示
することができる。第２に、ルックアップテーブル１０
はコンピュータ９との結合によりシステム内の変動を補
償するために用いることができる。例えば、ユーザはサ
ンプル内の２つの異なる蛍光物質の量を区別することを
要求する場合がある。ユーザはこれら２つの異なる物質
の相対的な強さにかんじゅんに依存するという誤りを犯
しがちである。これは、光源から検出器までの一連の光
学的要素の各々が波長依存性をある程度表しがちだから
である。この変化する情報のすべてはルックアップテー
ブルの中にプログラム化され得る。次いで、必要であれ
ば、システムはこれらの変化に対する最小イメージを自
動的に訂正する。ピーキング ピーキングアルゴリズム１１（図１）はコンピュータ９
と関係して動作して、システムの出力を最適化する。ピ
ーキングは本発明の一つの特徴であり、ユーザが、蛍光
スペクトルのシフトの結果得られる、ラベルの環境に関
する感度を補償することを可能にする。実際には、ユー
ザは励起及び放出検出波長と各々の帯域に対する初期設
定を選択するか、ユーザはシステムに選択された色素ま
たはプローブ（ルックアップテーブル１０に含まれる情
報に依存して）る基づいてこれらの設定を自動的に選択
させる。ユーザがユーザインタフェース８を通してその
信号がピークとなるべきであると選択すると、システム
はピーキングアルゴリズム１１を用いて自動的にその信
号をピークにする。好ましい実施例においては、ピーキ
ングアルゴリズム１１はフィードバックループの単純な
集合である。光源の波長、放出検出波長、及び光源と検
出システムの両者の帯域が初期設定値のまわりを変化し
ていく間、検出器１０５からの信号はモニタされる。こ
のピーキングプロセスは設定された回数だけ実行される
か、又は前回の設定において測定された信号対雑音比と
今回「ピークにされた」設定において測定されたものと
の差が、その差がある予め定められた値より小さくなる
と自動的に停止するプロセスとともにモニタされる。システム出力 好ましい実施例においては、ユーザは様々な出力形態か
ら選択できる。第１に、サンプルの像をモニタ１４上に
表示することができる。この像は、単一波長における蛍
光の測定、いくつかの波長において測定された発光の結
合、又は蛍光発光とサンプルの単一の「白色光」像との
結合の結果であり得る。第２に、サンプルの「有色」バ
ージョンが生成できる。このバージョンにおいては、ユ
ーザは各放出波長に対する特定の色を指定できる。これ
は、２つの異なるフローブが極めて接近しており、ユー
ザが２つの間を容易に区別できる場合に特に有用であ
る。第３に、サンプルの分光写真分析をモニタ１４上で
又は分離したプロッタ／プリンタ上で生成し提供するこ
とができる。この分光写真分析は、サンプル全体に対し
て、又はサンプルの小部分に対して行うことができる。
第４に、システムはユーザに、信号収集中に通常収集さ
れる任意の情報を提供できる。例えば、システムは、プ
ローブの集合に対する自動的に選択された初期設定値
を、同じプローブのためのピークにされた値とともに、
ユーザに示すことができる。第５に、前回の測定結果が
システムのメモリから削除されていないと仮定して、現
在の測定からの結果は前回の測定からの結果と比較され
ることができる。フルオレセンス・イン・シツ・ハイブリダイゼーション
に対する道具の応用 フルオレセンス・イン・シツ・ハイブリダイゼーション
（ＦＩＳＨ）は中期染色体及び間期核におけるＤＮＡ系
列を視覚化するための重要な技術となってきた。この方
法は今や遺伝子の位置測定の研究のために研究所におい
て日常的に使用されている。例えば、ＦＩＳＨは遺伝子
を特定の染色体領域にマップしたり、クローンを染色体
に沿って配列してクローンの類似物を生成又は確証する
ために用いられる。より最近では、ＦＩＳＨは様々な染
色体異常を検出するために、医療現場に応用されて来て
いる。
【００３４】ＦＩＳＨにおける最近の努力はプローブ技
術の開発に集中している。現在、プローブは、テレオミ
ア(teleomeres)、又は単一コピー遺伝子といった、様々
な染色体領域に利用可能である。これらのプローブは、
分子細胞遺伝学において大きな有用性を有し、一例とし
ては、染色体を列挙する研究において、染色体の動原体
(centromere)において、繰り返すDNA から得られる動原
体用の特定プローブの使用である。しばしばこれらの繰
り返すシーケンスは特定の染色体に特有であり、従っ
て、一つの細胞に含まれる所与の染色体の多数のコピー
を決定するために使用される。さらに、染色体ペイント
と称するプローブのクラスが最近入手可能になった。こ
のタイプのプローブは、所与の染色体の全長に対して多
少とも均一に掛け合わせる（hybridize)ので、染色体の
構造を決定するために非常に有用である。細胞の染色体
の補体(complements) 、転座(translocations)といった
構造的異常を決定し、マーカ染色体のオリジンを同定す
るために、ペイントが用いられる。
【００３５】ＦＩＳＨにおいてＤＮＡプローブをラベル
するために、ビオチン又はジゴキシゲニンのようなハプ
テンが酵素反応を用いてＤＮＡに取り込まれる間接的方
法を含む、多数の方法が利用可能である。中期染色体の
広がり又は間核にハイブリダイゼーションを続けること
により、蛍光ラベルが免疫学的方法の使用によってハイ
ブリッドに取り付けられる。より最近では、蛍光色素が
プローブ内に直接取り込まれて中間ステップの使用なし
で検出される。標準ＦＩＳＨ色素はフルオレセン、ロー
ダミン、テキサスレッド、及びカスケードブルーを含
む。異なるプローブに異なるハプテン又は蛍光色素をラ
ベルすることによりマルチプローブＦＩＳＨ分析が達成
できる。
【００３６】ＦＩＳＨのための有用な色素の数は比較的
限定されている。賞与の実験においてイメージ化できる
プローブの数を増やすために、結合的な蛍光のアフロー
チが開発されてきた。結合的アプローチにおいては、蛍
光レポータグループが単独で又は結合して用いられる。
下記の表は３つの蛍光レポータＡ、Ｂ、及びＣが７個ま
でのプローブに対して如何に使用できるかを示してい
る。検出可能なプローブの数は４つのフルオロフォア(f
luorophores)に対しては１５個まで、５個の色素では２
６個まで増加できる。
【００３７】
【表１】
【００３８】図１５はＦＩＳＨ分析に適切な本発明の実
施例における光学系列の一つの態様を示す。本実施例に
おいては、励起光は連続的にチューニング可能ではな
く、励起光は選択された蛍光色素をとをじに励起するた
めに必要な離散的な波長帯域にフィルタされる。光源２
０１から発光された光はまず光学的な広帯域のフィルタ
ー２０３を通過する。フィルター２０３は不要な放射線
の大きい帯域を除去するために用いられる。例えば、蛍
光色素が赤外線（ＩＲ）放射によっては励起されないと
仮定して、ＩＲ放射を除去するためにフィルター２０３
が用いられる。この光は次いで、主に必要な励起波長を
通過させるフィルター２０４を通過する。この光は次
に、不要な波長を通過させている間に選択された蛍光色
素を励起するのに必要な波長を反射するビームスプリッ
タ２０５に入射する。反射した放射線はついで光路２０
７に沿って通過し、集光光学系２０９を通って、サンプ
ル２１１に入射する。この入射光は様々なプローブ上の
蛍光色素を発光させ、発光された蛍光がパス２１３に続
く。また、パス２１３に続くのはサンプル２１１により
散乱された光である。発光された蛍光を正確に測定する
ために、散乱された放射線は除去されなければならな
い。サンプル２１１を離れてパス２１３に続く光はビー
ムスプリッタ２０５に入射する。ビームスプリッタ２０
５の反射コーティングは、選択された蛍光色素の励起に
必要な波長を反射し、他の全ての放射線を通過させるよ
うに設計されているので、ビームスプリッタ２０５は発
光された蛍光を通過させている間、散乱光をパス２１３
から離れるように反射することにより除去する。発光さ
れた蛍光はさらにフィルター２１５を用いてフィルタリ
ングされる。この時点で、光はスペクトル分析に使うこ
とができる。発光された蛍光が適切にフィルターされた
後、発光された蛍光シペクトルの間をスペクトル的に区
別するための、分散要素、フィルター、及び干渉系の技
術を含む、前述した技術の任意のものを用いることがで
きる。
【００３９】前述したように、様々な従って形式が本発
明とともに使用できる。ＦＩＳＨ分析のために、同定さ
れたプローブは個々に見ることも、全ての同定プローブ
を同時に見ることを含めて様々な組み合わせで見ること
もできる。従って、少なくとも５つの異なる色素が用い
られる場合、同定された各染色体を伴うＦＩＳＨ核型を
つくることができる。多くのプローブは多数の色素（即
ち、単一のプローブ内の色素の組み合わせ）を含むの
で、提供される像を単純化するためにシュードーカラー
リングを用いることができる。このスキームにおいて
は、各プローブは容易に区別可能な色を割り当てられて
いる。例えば、７つのプローブを形成するために３つの
色素が用いられる場合、プローブのうちの４つは色素の
いくつかの組み合わせによって形成される。多数の色素
を有するものを含む各プローブに個々の色素をを割り当
てることにより、ユーザに提供される像は極めて単純で
直接的なものとなる。像を強調し且つ強度のプロフィー
ル（例えば、異なる測定強度に割り当てられた異なる
色）を提供するために、コンピュータも又使用できる。
【００４０】図１６及び１７は７個の異なる蛍光色素の
それぞれに対する正規化された蛍光励起及び発光スペク
トルである。前述したように、サンプルからの励起光の
強度のレイリー散乱の故に、好ましいアプローチは、発
光波長帯域の選択された領域においては高いスループッ
トを示しながら、励起波長を充分にブロックできるフィ
ルターを設計することである。そのようなフィルター
は、励起と発光の波長の間でスペクトルのシフトがある
ので可能である。しかしながら、蛍光色素の数、従って
可能なプローブの数が増大すると、そのようなフィルタ
ーを設計することの困難性もまた増大する。
【００４１】図１８は図１５における励起フィルター２
０５として使用可能な４つの異なる励起フィルターを示
すグラフである。好ましくは、これら４０のフィルター
は単一のサブストレートに適用して、それにより少なく
とも４つの異なる色素の同時励起を可能にする。図１６
−１８を比較すると、フィルター１００２により伝達さ
れる波長の帯域は、ＤＡＰＩの発光スペクトルに重大な
干渉をすることなくＤＡＰＩを励起するために使用でき
ることを示している。同様に、フィルター１００４がＦ
ＩＴＣとともに使用できる。フィルター１００６はＣｙ
３とＣｙ３＋＋＋の両者を励起するために使用される
が、そのフィルター１００６はＣｒ３の発光スペクトル
と一致していることに着目される。従ってフィルター１
００６はＣｙ３＋＋＋と共にのみの使用である。フィル
ター１００８はＣｙ５又はＣｙ５＋＋＋と共に使用され
ることができるが、Ｃｙ５＋＋＋と共に使用するのが最
も適している。
【００４２】図１９は図１５に示したビームスプリッタ
フィルター２０５及び発光フィルター２１５としての使
用に適切な２つのフィルターの伝達曲線のグラフであ
る。曲線１１０１はビームスプリッタである。この曲線
を図１８に示した励起フィルターと比較すると、このフ
ィルターは図１７に示した蛍光発光帯域を通過させるが
曲線１００２、１００４、１００６、及び１００８を通
過した波長帯域を反射することを示している。発光フィ
ルター曲線１１０３は極めて狭い通過帯域を有する。従
ってこのフィルターはＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３＋
＋、及びＣｙ５＋＋を通過させる。
【００４３】図２０は本発明の他の実施例を示す。この
システムはエピ蛍光／位相顕微鏡１２０１、励起源サブ
システム１２０３、スペクトル分析システム１２０５、
及び自動焦点、高速メタフェーズ発見システム１２０７
を備えている。サブシステム１２０１は可視光源１２０
９、光焦点化光学系１２１１、及び結像光学系１２１３
を含んでいる。サンプル１２１５は、モータ駆動される
ステージ１２１９に搭載されているスライド１２１７上
に含まれる。サブシステム１２０３からの励起光をサン
プル１２１５上に導入するために、ビームスプリッタ１
２２１が用いられる。この実施例においては、光源１２
２２からの光は、例えばプリズムのような分散要素１２
２３を用いて分散される。光が分散された後、スリット
プレート１２２４を用いてフィルタリングされる。スリ
ットプレート１２２４上のスリットと興味ある波長との
一致はサンプル１２１５を照射したときにシステムを通
過する波長を決定する。プレート１２２４上のスタット
の幅は帯域を決定する。ビームスプリッタ１２２１も又
は、興味ある帯域のみを反射することにより励起光源の
光をフィルタリングするために使用できる。励起プロー
ブからの蛍光は干渉系１２２５と冷却ＣＣＤかめら１２
２７を備えるスペクトル分析システムの中に入る。必要
であれば、干渉計１２２５に入る前に、蛍光スペクトル
はさらなるスペクトルフィルタリングのために追加のフ
ィルター（図示せず）を通過させられることができる。
ＣＣＤカメラ１２２７からのデータはしょたのためにコ
ンピュータ１２２９に送られる。必要であれば、興味あ
る領域を発見し、自動的に像を焦点化するためにサブシ
ステム１２０９を用いることができる。サブシステム１
２０９は半導体レーザ１２３１とＣＣＤカメラ１２３３
を用いて焦点を決定する。レーザ１２３１からの光はフ
リップミラー１２３７を用いて光路１２３５に沿って送
られる。反射レーザ光はビームスプリッタ１２３９を介
してＣＣＤカメラ１２３３に入る。カメラ１２３３から
の出力はステージ１２１９とともにコンピュータ１２２
９により使用されてスライドの像を焦点化する。この同
じシステムは又興味ある可能性のある領域の発見のため
にも使用され得る。
【００４４】当業者に理解されるように、本発明はその
本質的特徴から逸脱することなく他の形態で実施するこ
とができる。例えば、フィルターホイールは励起又は発
光検出チューニング部内に含ませる必要はない。したが
って、本発明の好ましい実施例の開示は励磁であり、本
発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例の機能ブロック図である。
【図２】好ましい励起光源の概略図である。
【図３】マルチ光源形態の一実施例を示す図である。
【図４】マルチ光源形態の第２の実施例を示す図であ
る。
【図５】ペリンブロカプリズムを示す図である。
【図６】格子を用いた波長分散システムを示す図であ
る。
【図７】波長のチューニングを可能にするための二重フ
ィルターホイールアプローチを示す図である。
【図８】サンプルを１つより大きい波長帯域で同時に照
射できる励起光源の一実施例を示す図である。
【図９】検出システムの機能ブロック図である。
【図１０】検出システムの好ましい実施例を示す図であ
る。
【図１１】モノリシックな干渉計を示す図である。
【図１２】検出システムの一実施例の機能ブロック図で
ある。
【図１３】検出システムの他の実施例を示す図である。
【図１４】検出システムの第３の実施例を示す図であ
る。
【図１５】ＦＩＳＨ分析に適切な本発明の実施例におけ
る光学的系列の一態様を示す図である。
【図１６】７つの異なる蛍光色素に対する正規化された
蛍光励起スペクトルのグラフ図である。
【図１７】図１６に示した７つの蛍光色素に対する正規
化された蛍光発光スペクトルのグラフ図である。
【図１８】４つの異なる励起フィルターを示すグラフで
ある。
【図１９】ビームスプリッタフィルター及び発光フィル
ターとしての使用に適切な２つのフィルターの伝達曲線
のグラフ図である。
【図２０】エピ蛍光／位相顕微鏡と、励起光源サブシス
テムと、スペクトル分散システムと、オートフォーカス
で高速メタフェーズファインディングシステムを備えた
本発明の他の実施例を示す図である。
【符号の説明】
１、１０１…サンプル ２…光源（第１波長領域励起源） ３…チューニング部（第１の波長セレクタ） ４…集光光学系（フォーカシング部） ５…検出器 ６…イメージング光学系 ７…チューニング部（第２の波長セレクタ） ８…ユーザインターフェース ９…コンピュータ（データプロセッサ） １０…アプリケーションテーブル（ルックアップテーブ
ル） １１…ピーキングアルゴリズム １２…コントローラ １０３…フィルター（フィルタリング要素）

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ユーザがアプリケーションパラメータの
    集合を特定できるようにするインターフェースと、 前記アプリケーションパラメータの集合に基づいて結像
    システム動作パラメータの集合を指定するルックアップ
    テーブルと、 第１の波長領域にわたって放射線を放出する励起源と、 前記第１の波長領域から第１の主要波長を選択する第１
    の波長セレクタと、 前記第１の主要波長の放射線をサンプル上に焦点化し
    て、前記サンプルが第２の波長領域内の少なくとも一つ
    の波長で蛍光を発するようにする、フォーカシングシス
    テムと、 前記第２の波長領域からの第２の主要波長を連続的にチ
    ューニング可能な方法で選択する第２の波長セレクタ
    と、 前記第２の波長領域に渡って蛍光を検出可能で、前記蛍
    光の強度に依存する出力信号を生成する検出器と、 前記出力信号に応答する出力装置とを備えた、蛍光結像
    システム。
  2. 【請求項２】 データプロセッサをさらに備え、前記デ
    ータプロセッサは、前記第１及び第２の波長セレクタを
    制御することにより前記第１及び第２の主要波長を変化
    させている間、前記出力信号をモニタするものであり、
    前記データプロセッサは前記出力信号に基づいて新たな
    第１の主要波長と新たな第２の主要波長を指定するもの
    であり、前記データプロセッサは前記第１及び第２の波
    長セレクタに第１の主要波長帯域と第２の主要波長帯域
    を選択させるものである、請求項１記載の蛍光結像シス
    テム。
  3. 【請求項３】 前記第１及び第２の波長セレクタは、プ
    リズム，回折格子、短路及び長路フィルター、可変フィ
    ルター、音響光学的フィルター、偏光依存型フィルタ
    ー、連続的にフィルムの厚さを変化させることに基づく
    干渉型フィルター、ファブリーペローエタロンチューニ
    ング可能フィルター、チューニング可能液晶フィルタ
    ー、共通パス干渉計、ＳＡＧＮＡＣ干渉計、及びモノリ
    シック干渉計からなるグループから選択されたものであ
    る、請求項１記載の蛍光結像システム。
  4. 【請求項４】 前記サンプルと前記第２の波長セレクタ
    との間に挿入されたフィルタリング要素をさらに備え、
    前記フィルタリング要素は、帯域フィルター、ノッチフ
    ィルター、及び偏光依存型フィルターからなるグループ
    から選択されたものである、請求項１記載の蛍光結像シ
    ステム。
  5. 【請求項５】 さらにデータプロセッサを備え、前記デ
    ータプロセッサは前記出力信号のフーリエ変換を決定
    し、前記出力装置は前記フーリエ変換に応答するもので
    ある、請求項１記載の蛍光結像システム。
  6. 【請求項６】 ダイタイプ、蛍光色素タイプ、ステイン
    タイプ、サンプルタイプ、及び分離マトリクスからなる
    グループから選択されたアプリケーションパラメータの
    集合をルックアップテーブルに入力し、 第１の連続波長範囲内の任意の波長である第１の主要波
    長、第２の連続波長範囲内の任意の波長である第２の主
    要波長、前記第１の主要波長に関連付けられた第１の帯
    域、及び前記第２の主要波長に関連付けられた第２の帯
    域からなるグループから選択された動作パラメータを前
    記ルックアップテーブルから受け取り、 前記第１の連続波長範囲にわたって放射線を放出する励
    起源を活性化し、 前記第１の主要波長を選択し、 前記第１の帯域を選択し、 前記第２の波長を選択し、 前記第２の帯域を選択し、 前記第２の主要波長における蛍光発光を含む前記第１の
    主要波長の放射線でサンプルを放射をし、 前記蛍光発光を検出器アレイ上に焦点化し、 前記蛍光発光から前記サンプルと１体１対応を有する前
    記サンプルの像を形成することを備える、蛍光像アナラ
    イザによる蛍光サンプルの結像方法。
  7. 【請求項７】 少なくとも一つのラベル化された染色体
    領域を含むサンプルを保持するステージと、 前記ラベル化された染色体領域を励起して、第２の波長
    帯域内で蛍光を発光せさせるのに必要な第１の波長帯域
    内で前記サンプルを放射線により照射するための光源
    と、 前記波長を前記第２の波長帯域内でスペクトル的に解像
    するスペクトルディスクリミネータと、 前記解像された波長内で前記蛍光を検出し、前記検出し
    た蛍光の強度に依存する複数の出力信号を生成する検出
    器と、 前記出力信号から前記ラベル化された染色体領域の像を
    構成するイメージャーとを備えた、ラベル化された染色
    体領域の結像装置。
  8. 【請求項８】 前記光源と前記サンプルとの間に挿入さ
    れ、前記第１の波長帯域内の放射線のみを前記サンプル
    に照射させるフィルターと、 データプロセッサとを更に備え、前記スペクトルディス
    クリミネータは干渉計であり、インターフェログラムが
    前記干渉計と前記データプロセッサによるフーリエ変換
    とにより生成されて前記ラベル化された染色体領域の各
    々のスペクトルシグネチャーを再生し、前記データプロ
    セッサは前記ラベルを同定するために前記スペクトルシ
    グネチャーを所定のスペクトルシグネチャーのライブラ
    リと比較するようにした請求項７記載の装置。
  9. 【請求項９】 複数のラベル化された染色体領域の同時
    結像方法であって、 光源によりサンプルを照射し、この場合、前記サンプル
    は前記ラベル化された染色体領域の少なくとも２つを含
    み、前記ラベル化された染色体領域のラベルは互いに区
    別可能であり、前記照射は前記ラベル化された染色体領
    域の各々のラベルを同時に励起し、前記励起されたラベ
    ルは各区別可能なラベルに対する波長帯域を含むある波
    長グループ内で蛍光を発するようにする段階と、 前記波長グループ内の前記波長をスペクトル的に解像す
    る段階と、 前記解像された波長内の前記蛍光を検出器により検出
    し、前記検出器は前記検出された蛍光の強度に依存する
    複数の出力信号を生成するようにする段階と、 前記ラベル化された染色体領域の像を前記出力信号から
    構成する段階とを備えた、複数のラベル化された染色体
    領域の同時結像方法。
  10. 【請求項１０】 前記光源をフィルタリングして、前記
    ラベルを励起するために適切な放射線のみで前記サンプ
    ルを照射する段階と、 前記サンプルが前記光源により照射された後に、前記サ
    ンプルにより放出された放射線をフィルタリングして、
    前記波長グループ内の放射線のみを通過させる段階と、 前記サンプルのインターフェログラムを、スペクトル的
    解像段階を実行する干渉計を用いて生成する段階と、 前記インターフェログラムをフーリエ変換する段階と、 前記サンプルに含まれる各ラベルに対してスペクトルシ
    グネチャーを決定する段階と、 各ラベルを同定するために各スペクトルシグネチャーを
    所定のスペクトルシグネチャーのライブラリと比較する
    段階とを備えた請求項１１記載の方法。
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