JPH08506419A

JPH08506419A - 多数の蛍光色素の定量像化のための装置

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Publication number: JPH08506419A
Application number: JP6517853A
Authority: JP
Inventors: アスルンド，ニルス・エル・デー; カールソン，クイュル・エス
Original assignee: アスルンド，ニルス・エル・デー; カールソン，クイュル・エス
Priority date: 1993-02-01
Filing date: 1994-02-01
Publication date: 1996-07-09
Also published as: DE69402958D1; DE69402958T2; ATE152519T1; EP0681695B1; WO1994018547A1; EP0681695A1; US5418371A

Abstract

(57)【要約】蛍光ターゲット（２６）の各々のために励起光の別々の時間変調されたビームを有する複数の蛍光色素のための定量蛍光測定器が提供される。各ビームは、１つ以上の検出器（１１４、１１６）および別々の固定増幅器（３０、３２）と同期される。蛍光色素は同時に励起され、組合わされた蛍光発光は、各蛍光色素に対応する成分に分割される。体積全体にわたる位置からの蛍光発光を励起しかつ検出するために共焦点走査手段（２４）が用いられる。各増幅器の位置で特定される出力は、発光を各蛍光色素に対応する成分に分割するコンピュータ（３４）にストアされる。位置で特定されるデータは、周波数領域法を用いて２つの蛍光色素の蛍光寿命像を同時に与えるように視覚的に表示されるか、またはさらに処理され得る。各検出器チャネルに複数の増幅器を設けることにより、即時のおよび遅延した蛍光が測定され得るように、各チャネルにおいて位相を区別することができるようになり、各検出器チャネルにおいて複数の蛍光色素を用いることができるようになる。

Description

【発明の詳細な説明】多数の蛍光色素の定量像化のための装置発明の分野この発明は、定量微小蛍光測定法に関し、より特定的には、蛍光色素が２つまたはそれ以上の波長での同時励起により量を測定される定量微小蛍光測定法のための装置に関する。背景技術生物学上重要な細胞内の構成要素のための蛍光表示色素の近年の開発は、損なわれていない細胞のこれらの構成要素の、時間に依存した分布に従うことを可能にしている。たとえば、米国特許第５，０４９，６７３号、４，８４９，３６２号および４，６０３，２０８号を参照する。単一波長の発光に応答して蛍光色素から発光された蛍光放射は、一般に波長の広帯域を含む。異なる蛍光色素からの発光のスペクトルは、一般にオーバラップするであろう。また、異なる波長の放射を用いて２つの蛍光色素の各々を励起すると、それらの発光スペクトルはなおもオーバラップするかもしれない。蛍光色素は２つ以上の波長で励起放射を吸収する。異なる蛍光色素の吸収スペクトルはオーバラップするかもしれない。その結果、ある蛍光色素を効果的に励起するように選択された波長の放射はまた、他の蛍光色素もある程度励起するであろう。他の蛍光色素の、これらの相互励起された発光スペクトルと、選択された波長により支配的に励起された蛍光色素の発光スペクトルとの間でスペクトルオーバラップが起こるかもしれない。要約すると、多数の蛍光色素を伴う多くの適用例において、それらの発光スペクトルが一般にオーバラップし、それらの吸収スペクトルもオーバラップするかもしれないという事実は、大きい問題である。個別の蛍光色素の定量測定を同時に行なうことは、困難であるか、または不可能である。したがって、過去において、同時の蛍光検出は、主に、発光のスペクトルオーバラップの波長領域が光フィルタ処理により抑制され得る場合に限られている。その場合、価値のある信号強度が失われて分離が達成される。１つの蛍光色素を異なる波長で励起することにより得られる１つの蛍光色素の異なる発光スペクトルは一般に、非常にオーバラップし、光フィルタ処理により分離されることができない。これらのスペクトルの相対的な強度は、吸収スペクトルの形に依存する。この形は、蛍光色素およびその環境についての価値のある情報を伝えることができる。したがって、蛍光色素の相互励起された発光および主な発光を別々に測定する必要があり、そのため吸収スペクトルの形についての情報を集める。２つの異なる蛍光色素が存在し、かつ２つの励起波長が同時に与えられる場合にこれを達成するためには、各蛍光色素からの個別の寄与が別々に測定されなければならない。これは、光フィルタ処理だけでは行なうことができない。蛍光色素が正弦的に変調された強度を有する光により励起されると、発光される蛍光色素もまた、正弦的に変調される。変調周波数は同じであるが、発光される蛍光色素の位相は、蛍光色素の励起された状態の寿命に関する量によりシフトされる。ミッチェル（Mitchell）への米国特許第４，９３７，４５７号は、多数の、調波的に関連する位相同期周波数で変調される励起の単一波長を用いて、用いられる変調周波数の全範囲に対し１つの蛍光色素のスペクトル応答および位相シフトを同時に測定する周波数範囲分光蛍光計を開示する。発生されるデータは、蛍光色素の蛍光寿命を測定するように用いられる。タカハシ他への米国特許第５，０３２，７１４号において、パルスレーザ励起のために発生される蛍光の寿命を測定するために、光波形測定装置が用いられる。少なくともその１つが発振される、異なる周波数の２つのレーザビームが用いられて、ビームの和周波数合成から選択される単一周波数パルスビームを発生する。出力ビームは、単一光子検出器またはストリークカメラをトリガするように用いられる、発振された入力ビームと同じ速度で発振される。それにより、検出器は励起しているビームに同期される。サンプルにおける多数の蛍光色素の識別および弁別は、ロケン（Loken）他への米国特許第５，０４７，３２１号に開示される。各成分は、検出器がセットされる、区別可能な特徴的なピーク発光波長を有していなければならない。蛍光色素は単一波長または多数の波長で励起されるかもしれないが、検出はピーク発光スペクトルがオーバラップしない領域で起こる。ガーデル（Gardell）他への米国特許第４，６２８，０２６号において、光の、２つの区別可能な波長による標本の逐次的なかつ交互のイラジエーションのための自動化されたシステムが開示される。このシステムは、２つの励起波長に応答して標本から逐次的に受けられる蛍光強度の指数に基づいて標本を分類する。スペクトルフィルタ処理または分離を用いる、単一波長により励起される多数の蛍光色素の同時の記録が、ロバートソン・ジュニア（Robertson，Jr．）他への米国特許第４，８３３，３３２号に開示される。オーバラップしている発光スペクトルを有する蛍光色素は、相補的な透過スペクトルを有する２つのスペクトルフィルタにより透過されるそれらの発光の比率により区別される。このシステムは、定量測定が可能ではない。１つのピーク発光波長だけで蛍光色素を測定する先行技術の装置は、各蛍光色素からの全発光を用いて多数の蛍光色素の量を同時に測定することができない。多数の蛍光色素を区別するようにスペクトル分離に依存するそれらの装置は、検出される組合わされた発光スペクトルから各蛍光色素の全寄与を分離することができない。信号検出のために固定増幅器を用いることが知られている。単一相固定増幅器ではなく二相固定増幅器を用いると、増幅器の同相および直角チャネルの出力から位相角の値が導出され得る。これは、たとえば細胞学においてシュタインカンプ（Steinkamp）およびクリスマン（Crissman）（１９９２年）により、異なる減衰時間を有する蛍光色素を区別するように用いられている。モーガン（Morgan ）他（１９９２年）により、この技術が、各画点で測定される減衰時間を表わす像を生じるように、共焦点走査型顕微鏡において用いられることもまた提案されている。すべての画素の減衰時間を同時に記録する非共焦点システムが、ラコウィクツ（LaKowicz）およびバーント（Berndt）（１９９１年）により実現されている。連続して流れる溶液における物体を調べるための、カーツ（Kurtz）（１９８７年）により報告されたシステムにおいて、１つの蛍光色素が２つの変調された励起波長を用いて励起される。２つの固定増幅器が、このシステムにおいて用いられ、１つの点で測定を行ない、何の像も生じない。異なる減衰時間を備えた蛍光色素を区別する別の方法は、短い光パルスの反復性ソースを用い、かつ時間と相関する単一光子計数を用いる。この技術もまた像化と組合わされている。この種類の非共焦点システムが、モーガンおよびマリ（ Murray）（１９９１年）により実現されている。時間ゲーティングを用いる共焦点システムが、バーマン（Buurman）他（１９９２年）により実現されている。蛍光寿命像化（ＦＬＩＭ）という用語は、ラコウィクツおよびバーント（１９９１年）を参照すると、減衰時間測定および像化の組合せを表わす技術に対して用いられる。目的は、より高い効率で多数の蛍光色素の量を同時に測定できる改良された微小蛍光測定器を提供することである。この発明の他の目的は、多数の蛍光色素の全発光、または恐らくは小さい部分を除き全発光スペクトルを同時に用いる改良された微小蛍光測定器を提供することである。さらに他の目的は、検出された組合わされた発光スペクトルから、オーバラップしている吸収スペクトルを有する蛍光色素からの個別の寄与を分離できる改良された微小蛍光測定器を提供することである。発明の概要上の目的は、２つまたはそれ以上の波長で１つの位置の複数個の蛍光ターゲットを同時に励起する微小蛍光測定器において達成されている。好ましい実施例において、各励起波長は、蛍光色素の１つを支配的に励起するように選択される。各波長の励起の強度は、別個の周波数で時間変調される。第１の実施例において、組合わされた励起に応答して発光される放射は、異なる波長帯域を表わすスペクトル部分に分けられる。光フィルタ処理および光ビーム分割がこの分離を達成するように用いられる。２つの検出器が、組合わされた発光の分離されたスペクトル部分を検出するように用いられる。対応する変調周波数に同期される周波数がロックされた増幅器が、各検出器に装着される。周波数がロックされた増幅器により行なわれる弁別は、光フィルタおよびビームスプリッタにより行なわれるスペクトル部分への分離と組合わされて、各々の別個の蛍光色素だけを表わしている寄与の抽出および測定を可能にする。これは、蛍光色素の発光スペクトルが非常にオーバラップするかもしれないという事実にもかかわらず、かつある蛍光色素を支配的に励起する波長が別の蛍光色素もある程度励起する場合に生じる、相互励起されたスペクトルが存在するかもしれないにもかかわらず、達成される。第１の実施例の変更例において、２つの単一相固定増幅器は、各検出器に装着される。２つの増幅器は、異なる周波数、すなわち２つの励起波長の各々で励起の強度を変調するように用いられる周波数と同期される。相互励起された寄与を含めて、構成された発光の個別の成分のすべてが抽出され、測定される。第１の実施例のさらに他の変更例において、各検出器に装着された２つの単一相増幅器が用いられ、２つの増幅器は同じ周波数に同調される。一方の検出器に装着された２つの増幅器は両方とも、１つの励起波長で励起の強度を変調するように用いられる周波数に同調され、他方の検出器に装着された２つの増幅器は両方とも、他の励起波長で励起の強度を変調するように用いられる周波数に同調される。各検出器に装着された２つの増幅器の位相位置は、９０°離れている。２つの増幅器は合わせて、インラインおよび直角チャネルを含む二相固定増幅器の機能を達成する。各二相増幅器からの２つの出力は、既知の技術を用いて、増幅器に与えられた信号の大きさおよび位相角を得るように処理される。好ましくはこれは、出力に装着されたデータ処理ユニットによりデジタルで行なわれる。その結果、検出器により受けられた変調された信号の振幅、および位相角が導出される。位相角は、相対的なスケールで、変調された励起の位相角と検出された発光の位相角との間のシフトを表わす。たとえば蛍光色素の環境のｐＨ値の変化に起因して変わるかもしれないように、蛍光色素の分子緩和時間が変わると、この位相シフトが変わる。その結果は、変調周波数が高い場合には本質的なものである。したがって、第１の実施例のこの変更例において、用いられる変調周波数は好ましくは、前に説明された変更例におけるより高い大きさの次数である。説明された変更例に従う装置は、２つの異なる蛍光色素の位相シフトを同時にかつ独立して与える。すべての実施例において、平面のスタックを画素ごとに走査するために、共焦点走査型光学素子を用いることができ、そのため体積測定データを異なる蛍光色素から同時にかつ独立して得ることができる。データをコンピュータにストアし、後に表示することができる。蛍光色素の異なる強度、または第１の実施例の変更例の１つにおいては蛍光色素の異なる減衰時間、を表わしている領域を区別するように、異なる色を用いることができる。後者の場合、ＦＬＩＭ像が得られる。その代わりに、異なる蛍光色素からの寄与を区別するように色を用いることができる。異なる角度からの投影発生、ズーミングなどの像処理技術を用いて、体積の三次元像を再生し、綿密に検査することができる。この発明の第２の実施例において、１つの検出器が用いられる。この実施例は、緩和時間の相対的な変化がごく僅かである場合に関連する。別個の固定増幅器は、各励起波長の変調周波数に同期される。第２の実施例の１つの変更例において、二相固定増幅器は、その波長により支配的に励起された蛍光色素のものに近い位相位置に同調される同相チャネルで用いられる。各増幅器の同相および直角出力を用いると、組合わされた発光スペクトルのすべての成分を分離することができる。発光スペクトルの位相角は、緩和時間が変わらないので一定であり、蛍光色素の１つだけが存在する領域において得られるデータから測定される。これらの領域は、標本全体からのデータセットの直接観察または分折により識別され得る。第２の実施例の説明された変更例は、このように、２つの単一相増幅器が各検出器に装着され、各検出器に装着された２つの増幅器が両方とも同じ周波数に同調される第１の実施例の変更例と同じである。第２の実施例の他の変更例において、各励起波長のために単一相固定増幅器が用いられる。増幅器の位相位置は、支配的に励起された蛍光色素により発光される蛍光の最大出力値を与える位置に同調される。単一相増幅器を用いると、支配的に励起された蛍光色素の各々に対応する発光スペクトルを弁別することができる。微小蛍光測定器の利点は、より高い効率で多数の蛍光色素の量が同時にかつ独立して測定されることである。他の利点は、異なる蛍光色素からの寄与が、それらの発光スペクトルがオーバラップするにもかかわらず、かつ相互励起されたスペクトルからの干渉にもかかわらず、情報がごく僅かに失われるだけで測定されることである。他の利点は、相互励起されたスペクトルを含めて、各蛍光色素からの寄与のすべてを同時に測定できることである。さらに他の利点は、異なる蛍光色素からの蛍光寿命像が同時に記録されることである。図面の簡単な説明図１は、この発明に従う２検出器定量微小蛍光測定器の概略ブロック図である。図２ａ−ｄは、組合わされた発光スペクトルの個別のスペクトル成分を示すプロットである。図３は、各検出器のための２つの固定増幅器を特徴とする図１の装置の第１の変更例の概略ブロック図である。図４は、位相弁別および周波数弁別のために構成された各検出器のための２つの固定増幅器を特徴とする図１の装置の第２の変更例の概略ブロック図である。図５は、この発明に従う単一検出器定量微小蛍光測定器の概略ブロック図である。図６ａ−ｄは、組合わされた発光スペクトルの個別のスペクトル成分を示すプロットである。図７ａ−ｂは、固定増幅器の各々の、２つの蛍光色素からの変調された蛍光発光と変調された励起波長との間の位相関係の概略的な表示である。図８は、二相固定増幅器１の出力の成分の位相角のベクトル図である。図９は、二相固定増幅器２の出力の成分の位相関係を示すベクトル図である。図１０は、単一相固定増幅器を用いるこの発明の第２の実施例の変更例の概略ブロック図である。好ましい実施例の詳細な説明図１を参照すると、２つの励起波長、２つの検出器、および２つの固定増幅器を用いる定量微小蛍光測定器の第１の実施例の概略ブロック図が示される。異なる波長の単色励起光は、１対の光源１２および１４により与えられる。好ましい実施例において、光源１２および１４は別個のダイオードレーザであるが、強度において時間変調されることができる電磁放射のいかなるソースも用いることができる。光源１２の強度は、正弦周波数ν₁で動作している変調器１６により制御される。同様の態様において、光源１４は、周波数ν₂で動作している第２の変調器１８により制御される。好ましい実施例において、光源１２および変調器１６の組合せは、連続ガスレーザ、後に続く、周波数ν₁で動作している電気光学変調器または音響光学変調器により代わりに実現され得る。同様に、光源１４および変調器１８の組合せは、連続ガスレーザ、後に続く、周波数ν₂で動作している電気光学変調器または音響光学変調器により実現され得る。好ましい実施例において、これらの変調器は、好ましい実施例の１つに従う位相シフト測定をカバーするように、最大５０Ｍｈｚの周波数で動作できるべきである。他の実施例における変調周波数の実際の値は、２．２および３．０Ｍｈｚである。光源１２および１４からの個別の光ビームは、ビームコンバイナ２０において組合わされる。組合わされたビームは、励起波長λ₁およびλ₂で光を透過するビームスプリッタ２２を通過する。スキャナ２４は、組合わされたビームをサンプル２６の位置に逐次的に送る。スキャナのサンプリング周波数の実際の値は１００ｋｈｚである。好ましい実施例において、スキャナ２４は、共焦点レーザ顕微鏡であるが、サンプル２６の別個の位置に励起を焦点調節し、かつそこから発光される放射を集めることができるいかなる装置も、用いることができる。サンプル２６は、多数の蛍光色素を含むいかなる光透過物体でもよい。そのような物体は、化合物または皿培養などを分けるために用いられる生物学上の細胞および二次元ゲルを含む。スキャナ２４の焦点での励起に応答して発光される組合わされた蛍光色素は、スキャナ２４により集められ、ダイクロイック素子を有するビームスプリッタ２２に送られ、次に別のビームスプリッタ１０２を通過され、これは、発光された蛍光色素を２つの検出器１１４および１１６に偏向させる。検出器１１４および１１６は各々、蛍光色素により発光される光子に応答して信号を発生するいかなる装置でもよい。光子を電気信号に変換する光増倍管は、そのような装置の例である。ビームスプリッタ１０２の半反射素子は、ダイクロイックミラーでもよく、ビーム分割およびスペクトル分離の両方を行なう。さらに光フィルタ１０４および１０６が用いられ得る。ビームスプリッタ１０２に含まれるダイクロイック素子もしくは光フィルタ１０４および１０６のいずれかにより、またはこれらの素子によりともに、行なわれる光フィルタ処理の結果は、集められた光を異なる波長帯域を表わしている２つの部分に分ける。これらの部分は、それぞれ検出器１１４および１１６に分布される。検出器１１４および１１６は、蛍光色素により発光される光子に応答して電気信号を発生するいかなる検出器でもよい。光子を電気信号に変換する光増倍管は、そのような装置の例である。検出器１１４および１１６により発生される信号は、１対の固定増幅器３０および３２に送られる。固定増幅器３０は、変調器１６により光源１２に課される変調周波数ν₁に同期される。同様に、固定増幅器３２も、変調器１８により光源１４に課される変調周波数ν₂に同期される。各固定増幅器の位相位置は、出力を最大にするように調整される。図２ａ−ｄを参照すると、曲線は、２つの波長による励起に応答して２つの蛍光色素により発光される組合わされた発光スペクトルの個別のスペクトル成分を示す。曲線は、一般に用いられる２つの蛍光色素、ＴＲＩＴＣ（テトラメチル・ローダミン・イソチオシアン酸塩）（蛍光色素Ａ）およびルシファ・イエロー（ Lucifer Yellow）（蛍光色素Ｂ）のスペクトルをほぼ示す。λ₁およびλ₂は、それぞれ蛍光色素ＡおよびＢの吸収スペクトル４２および４４を調べることにより選択される。λ₁は蛍光色素Ａを支配的に励起するように選択され、一方λ₂は蛍光色素Ｂを支配的に励起するように選択される。蛍光色素Ａは、λ₁に応答して蛍光発光スペクトル４６（Ｉ_A）を生じる。蛍光色素Ｂは、λ₂に応答して蛍光発光スペクトル５０（Ｉ_B）を生じ、λ₁に応答してより小さい蛍光発光スペクトル５２（Ｉ_b）を生じる。この後者の相互励起されたスペクトルは、吸収スペクトル４２および４４が波長λ₁でオーバラップすることから生じる。λ₁およびλ₂ による励起に応答して、組合わされた発光スペクトルは、図２ｄに示されるように、重ね合わされたスペクトル４６（Ｉ_A）、５０（Ｉ_B）および５２（Ｉ_b）からなる。寄与５０（Ｉ_B）は、周波数ν₂で変調される３つの発光だけからなる。検出器１１６（検出器２）に偏向される波長帯域６２（ｂ）は、寄与５０（Ｉ_B）のスペクトル範囲の主な部分を含むように選択される。このようにいかなる他の寄与からも全発光に分けられる寄与Ｉ_Bの測定された値は、次に固定増幅器３２の出力から得られる。寄与４６（Ｉ_A）および５２（Ｉ_b）は両方とも、周波数ν₁で変調される。検出器１１４（検出器１）に偏向される波長帯域６０（ａ）は、寄与５２（Ｉ_b）のスペクトル範囲を除外するが寄与４６（Ｉ_A）の主な部分を含むように選択される。このようにいかなる他の寄与からも全発光に分けられる寄与Ｉ_Aの測定された値は、次に固定増幅器３０から出力として得られる。固定増幅器３０および３２からの出力はコンピュータ３４に送られる。好ましい実施例において、コンピュータ３４は、デジタルコンピュータであり、増幅器３０および３２からの出力は、記憶の前に従来のアナログーデジタル変換器によりデジタル化される。サンプル２６の別個の位置の寄与Ｉ_AおよびＩ_Bを表わす入力は、特定の態様でコンピュータ３４の位置にストアされ、スクリーン上にデジタル像として表示され得る。蛍光色素Ａを表わしている像または蛍光色素Ｂを表わしている像は、別々に表示され得る。その代わりに、２つの蛍光色素を表わしている像は、たとえばそれらを互いに区別するように色を用いて、同時に表示され得る。コンピュータ３４はまた、２つの異なる蛍光色素によりマークをつけられる、細胞などの三次元の透明な体積を表わしている記録された像のスタックの投影像を駆動し、そのような投影像を同様の態様でスクリーン上に表示することができる。図１において、Ｉ_AおよびＩ_Bの測定された値を表わしているストアされたデータは、視覚化のためにデジタル像７２および７８にマッピングされる。図３を参照すると、２つの固定増幅器１２２および１２４が検出器１１４（検出器１）に設けられ、２つの固定増幅器１２６および１２８が検出器１１６（検出器２）に設けられている。固定増幅器１２２および１２６は変調器１６（変調器１）にロックされ、固定増幅器１２４および１２８は変調器１８（変調器２）にロックされる。各固定増幅器の位相位置は出力を最大にするように調整される。前のように、検出器１１６（検出器２）に偏向される波長帯域は、寄与５０（Ｉ_B）のスペクトル範囲の主な部分を含むように選択される。それはまた、相互励起された寄与５２（Ｉ_b）の主な部分も含む。寄与５０（Ｉ_B）は周波数ν₂で変調され、一方寄与５２（Ｉ_b）は周波数ν₁で変調される。固定増幅器１２６は周波数ν₁にロックされ、固定増幅器１２８は周波数ν₂にロックされる。次に寄与５０（Ｉ_B）の測定された値が、固定増幅器１２８からの出力として得られ、いずれの他の寄与からも分けられ、すなわち、両方とも周波数ν₁で変調される寄与５２（Ｉ_b）および寄与４６（Ｉ_A）から分けられる。同様に、寄与５２（Ｉ_b）の測定された値は、固定増幅器１２６から出力として得られ、周波数ν₂で変調される寄与５０（Ｉ_B）から分けられ、恐らくはいくらかの干渉を備えて、そのスペクトル範囲が本質的には検出器１１４（検出器１）に偏向された波長帯域にある寄与４６（Ｉ_A）から分けられる。この干渉が僅かなものでなければ、それは、以下で説明されるように補うことができる。検出器１１４（検出器１）に偏向された波長帯域は、周波数ν₁で変調される、寄与５２（Ｉ_b）のスペクトル範囲を除外するが寄与４６（Ｉ_A）の主な部分を含むように選択される。寄与４６（Ｉ_A）の測定された値は、周波数ν₁に同調される固定増幅器１２２からの出力として得られ、周波数ν₂で変調される寄与５０（Ｉ_B）を含めて、すべての他の寄与から分けられる。寄与４６（Ｉ_A）の測定された値は、検出器１１６（検出器２）に偏向されるその寄与の少ない部分を含まない。推定可能な量により、検出器１１４（検出器１）に偏向される測定された部分に比例する、この少ない部分がごく僅かなものでない場合、それは、検出器１１４（検出器１）から得られる寄与４６（Ｉ_A）の測定された部分の比率として直接に得ることができる。したがって、必要であれば、検出器１１６（検出器２）からの測定された値は、この比率を減じることにより、寄与４６（Ｉ_A）からの干渉のために修正することができる。この演算は、好ましくはコンピュータ３４により行なわれる。周波数ν₂に同調される固定増幅器１２４の目的は、波長λ₂により励起された蛍光色素Ａからの相互励起された寄与を表わしている可能な寄与Ｉ_aの測定された値である出力を与えることである。この寄与は、吸収スペクトル４２および４４が波長λ₂でもオーバラップする場合に発生する。簡単には、これは図４の場合ではない。発生すれば寄与Ｉ_aの主な部分は、検出器１１４に通過されたスペクトル範囲６０（ａ）内に位置する。固定増幅器１２２、１２４、１２６および１２８からの出力は、コンピュータ３４に送られる。サンプル２６の別個の位置のそれぞれ寄与Ｉ_A、Ｉ_a、Ｉ_bおよびＩ_Bを表わしているコンピュータ３４への入力は、特定の態様でコンピュータ３４の位置にストアされ、デジタル像としてスクリーン上に表示され得る。前の実施例の説明で説明されたように、それらは、別々にまたは組合わされて、体積からの投影像で表示され得る。さらに、蛍光色素ＡおよびＢの励起スペクトルの形についての情報をそれぞれ伝えているＩ_a／Ｉ_AまたはＩ_b／Ｉ_Bを表わしている指数像が示され得る。図３において、Ｉ_A、Ｉ_a、Ｉ_bおよびＩ_Bの測定された値を表わしているストアされたデータは、視覚化のためにデジタル像７２、７４、７６および７８にマッピングされる。図４には、図３に示した装置の変形例を示しており、ここでは、固定増幅器１２２および１２４がともに変調器１６に固定され、固定増幅器１２６および１２８がともに変調器１８に固定される。増幅器１２４の位相位置は増幅器１２２の位相位置に関して９０°シフトされており、増幅器１２８の位相位置は増幅器１２６の位相位置に関して９０°シフトされている。増幅器１２２および１２４は合わせて、インラインチャネルおよび矩象チャネルを有する二相固定増幅器を構成する。同様に、増幅器１２６および１２８もそのような増幅器を構成する。二相固定増幅器の出力Ｉ′およびＩ″は、極座標で、増幅器に与えられる信号の大きさおよび位相角を表わすベクトルのｘ成分およびｙ成分を構成する。二相固定増幅器の各々からこの大きさおよび位相角を得るための変換は、コンピュータ３４によって行なわれる。位相角は、二相固定増幅器を調整することによってなくすことができるオフセットに加えて、変調された励起の波形と検出された発光の波形との間の位相シフトを表わす。２．２Ｍｈｚおよび３．０Ｍｈｚの変調周波数を用い、通常標識に用いられる蛍光色素を用いれば、位相角のシフトは数度のオーダの非常に小さいシフトとなる。位相角のシフトは、標本の、ある位置から別の位置で実質的に変わることはない。したがって、出力を最大にするように固定増幅器の位相位置を調節することは、一般にあまり重要なことではない。上述の実施例において固定増幅器を用いる場合にこの種類の調整を行なわなければならない。上述のものよりもはるかに高い変調周波数を用いる場合、および／または減衰時間の長い蛍光色素を用いる場合、実質的な位相シフトが生じ得る。これは、本実施例に関して仮定した場合である。増幅器１２２および１２４の出力から、コンピュータ３４によって蛍光色素Ａの位相シフトφ_Aが得られ、増幅器１２６および１２８の出力から、コンピュータ３４によって蛍光色素Ｂの位相シフトφ_Bが得られる。増幅器１２２および１２４の出力からコンピュータによって得られる大きさは、本明細書中において図１に従った実施例で説明したものと同じ方法で総発光量への他の寄与から分離された、発光スペクトルＩ_Aの測定値である。同様に、増幅器１２６および１２８の出力からコンピュータによって得られる大きさは、発光スペクトルＩ_Bの測定値である。蛍光色素の位相シフトφは、ｔａｎφ＝２π ντの関係に従ってその蛍光色素の減衰時間τに直接関係し、ここで、νは変調周波数である。これにより、測定された位相シフトから、減衰時間を決定することができる。したがって、走査された像の各画素に関する減衰時間を計算し表示することができ、蛍光色素の強度像の他に、文献では代替的に「蛍光寿命像（Fluorescence Lifetime Image）」と呼ばれる減衰時間像も得られる。これは、２つの蛍光色素ＡおよびＢに対して同時にかつ独立して行なわれる。図４では、測定値Ｉ_A、φ_A、Ｉ_B、およびφ_Bを表わすストアされたデータがデジタル像７２、７３、７８および７９にそれぞれマップされ、視覚化される。図５を参照して、２つの励起波長と、１つの検出器と、２つの二相固定増幅器とを用いた定量微小蛍光測定器の第２の実施例を概略ブロック図で示している。２つの検出器を用いる実施例を示した図１と同様に、１対の光源１２および１４によって異なる波長の単色励起光が供給される。さらに、図１と同様に、光源１２の強度は正弦波周波数ν₁で動作する変調器１６によって制御され、光源１４は別の周波数ν₂で動作する第２の変調器１８によって制御される。好ましい実施例では、変調器１６および１８は、５０Ｍｈｚまでの周波数で動作する電気− 光学変調器または音響−光学変調器である。好ましくは微小蛍光測定器のサンプリング周波数の少なくとも２倍の周波数で動作することができるいかなる変調器を代用してもよい。図１の場合と同じ態様で、光源１２および１４からの個々の光ビームはビームコンバイナ２０で組合わされ、組合わされたビームは、励起波長λ₁およびλ₂の光を透過させるビームスプリッタ２２を通過し、スキャナ２４は組合わされたビームをサンプル２６内の位置に順に放射する。励起に応答してスキャナ２４の焦点に放射される組合わされた蛍光は、スキャナ２４によって集められ、ビームスプリッタ２２に向けられる。しかし、１つの検出器を用いる定量微小蛍光測定器を示す図５では、検出器２８が、図１に示される２つの検出器を用いた実施例において用いられる検出器１１４および１１６の代わりをする。第２のビームスプリッタ１０２もこの実施例では用いられていない。検出器２８はビームスプリッタ２２から偏向された発光された蛍光を集める。検出器２８によって生成された信号は、１対の固定増幅器３０および３２に送られる。固定増幅器３０は、変調器１６によって光源１２に与えられる変調周波数ν₁と同期される。同様に、固定増幅器３２は、変調器１８によって光源１４に与えられる変調周波数ν₂と同期される。好ましい実施例では、固定増幅器３０および３２は、互いに９０°離れている位相位置の記録された波形の振幅を表わす２つの出力を生成する二相固定増幅器である。固定増幅器３０および３２からの出力は、コンピュータ３４に送られる。コンピュータ３４は、サンプル２６の別々の位置の各々に対応する入力を、位置を特定する態様でストアし、各々の波長による各々の蛍光色素の励起に対応する個々のスペクトル成分を数学的に再構成する。図１の場合と同様に、好ましい実施例では、コンピュータ３４はデジタルコンピュータであり、増幅器３０および３２からの出力は、従来のアナログ／デジタル変換器によってデジタル化されてからストアされる。次に、図６ａ〜ｄを参照して、曲線は、２つの波長による励起に応答して２つの蛍光色素によって発光される組合わされた発光スペクトルの個々のスペクトル成分を示している。λ₁およびλ₂は、それぞれ、蛍光色素ＡおよびＢの吸収スペクトル１４２および１４４を調べることによって選択される。λ₁は蛍光色素Ａを主に励起するように選択され、λ₂は蛍光色素Ｂを主に励起するように選択される。蛍光色素Ａは、λ₁に応答して主な蛍光発光スペクトル１４６（Ｉ_A1）を生成し、λ₂に応答してより小さい相互励起された蛍光発光スペクトル１４８（Ｉ_A2）を生成する。このことは、吸収スペクトル１４２および１４４が重なっているために起こる。同様に、蛍光色素Ｂは、λ₂に応答して主な蛍光発光スペクトル１５０（Ｉ_B2）を生成し、λ₁に応答してより小さい相互励起された蛍光発光スペクトル１５２（Ｉ_B1）を生成する。波長λ₁での励起により、蛍光色素Ａの主応答１４６と蛍光色素Ｂの相互励起された応答１５２との和である組合わされた応答１５４（Ｉ_A1＋Ｉ_B1）が得られる。同様に、波長λ₂での励起により、蛍光色素Ｂの主応答１５０と蛍光色素Ａの相互励起された応答１４８とからなる組合わされた応答１５６（Ｉ_B2＋Ｉ_A2）が得られる。λ₁およびλ₂による励起に応答して得られる組合わされた発光スペクトル１４０は、発光スペクトル１４６、１４８、１５２、および１５０の和（Ｉ_A1＋Ｉ_A2＋Ｉ_B1＋Ｉ_B2）からなる。次に、図７ａ−ｂを参照して、変調された励起ビームの波形とそれに対応する発光された蛍光の波形との位相関係が示されている。励起波長λ₁を有するビームの強度変調は、正弦波形１６０で表わされる。蛍光色素Ａは、正弦的に変調された蛍光主信号１６２でλ₁に応答する。蛍光色素Ｂも、より小さい変調された蛍光相互励起信号１６４でλ₁に応答する。励起信号１６０と蛍光信号１６２および１６４との周波数は同じであり、λ₁の変調周波数ν₁と同期される固定増幅器３０によって捉えられる。しかし、発光された蛍光の波形の位相は励起波形の位相とは異なる。発光された蛍光の波形と励起波形との位相関係は、個々の蛍光色素の蛍光緩和時間と変調周波数とに依存する。固定増幅器３２は、λ₂の変調周波数ν₂と同期される。主にλ₂によって励起されると、蛍光色素Ｂは、変調された蛍光主信号１６８を発生し、蛍光色素Ａはより小さい変調された蛍光相互励起信号１７０を発生する。蛍光信号１６８および１７０は、励起１６６と同じ周波数を有し、固定増幅器３２によって捉えれる。しかし、発光された蛍光信号１６８および１７０の位相は、励起１６６の位相とは異なる。次に、図８および図９を参照して、固定増幅器３０および３２の同位相チャネルおよび矩象チャネルのベクトル成分および位相角がそれぞれ示されている。増幅器３０に関しては、同位相チャネルの出力は量Ｉ₁′で表わされ、矩象チャネルの出力は量Ｉ₁″で表わされる。増幅器３０への入力は、同位相チャネルに対する位相角がＶ₁である振幅Ｉ₁のベクトルで表わされる。これは、蛍光色素Ａに関しては角度Ｖ_A1の場合のＩ_A1で表わされ、蛍光色素Ｂに関しては角度Ｖ_B1の場合のＩ_B1で表わされる蛍光色素の各々に対応する信号のベクトルの和からなる。図９も図８と同様であり、図９では固定増幅器３２の成分の下つき文字１を下つき文字２で置換えている。以下に示す式は、増幅器３０および３２の出力を蛍光色素ＡおよびＢに関する成分ベクトルに変えるために、コンピュータ３４で用いられる。同位相チャネルの位相位置は、主に励起された蛍光色素からの出力が最大値となる位置に近くなるように合わされる。したがって、固定増幅器３０は主に蛍光色素Ａからの信号を検出するように調整され、固定増幅器３２は主に蛍光色素Ｂからの信号を検出するように調整される。角度Ｖ_A1およびＶ_A2を決定するためには、蛍光色素Ａが存在しかつ蛍光色素Ｂが存在しない領域からのデータを集める必要がある。これらの領域では、以下の式が成り立つ。これらの領域は、直接観察するか、または位置を特定してコンピュータ３４にデジタルでストアされる標本２６中の位置に対応するデータセットを調べることによって決定され得る。蛍光色素Ａが存在しかつ蛍光色素Ｂが存在しない領域は、Ｉ₂′／Ｉ₁′がこれらの領域で最小となることによって識別され得る。Ｖ_B1およびＶ_B2は、蛍光色素Ｂが存在しかつ蛍光色素Ａが存在しない領域から同様に決定され得る。それらの領域では、以下の式が成り立つ。蛍光色素Ｂが存在しかつ蛍光色素Ａが存在しないデータセットの領域は、Ｉ₁′ ／Ｉ₂′が最小となることによっては特徴づけられない。Ｖ_A1、Ｖ_B1、Ｖ_B2およびＶ_A2の値を決定すると、コンピュータ３４は、従来の数値法を用いて４つの未知数Ｉ_A1、Ｉ_A2、Ｉ_B1およびＩ_B2を有する４つの方程式（Ｅ１）を同時に解くことができる。好ましい実施例では、組合わされた発光スペクトル１４０の個々の成分を表わす得られた量Ｉ_A1、Ｉ_A2、Ｉ_B1、およびＩ_B2は、標本２６の走査された位置の各々に関して、コンピュータ３４のメモリにデジタルでストアされる。データは、成分Ｉ_A1、Ｉ_A1、Ｉ_A2、およびＩ_B1 にそれぞれ対応する図５に示される表示された像１７２、１７４、１７６および１７８としてコンピュータ３４によって出力されるか、またはさらなる処理のために用いられ得る。次に、図１０を参照して、単一相固定増幅器を用いる、本発明の第２の実施例の変形例を概略ブロック図で示している。標本２６が緩和時間の異なる２つの蛍光色素を含む場合、これらの蛍光色素によって発生される蛍光励起に対応する波形の位相は異なる。主に蛍光色素Ａからの発光を捉える固定増幅器３０の位相位置は、蛍光色素Ｂによって発生される波形からの寄与を相殺する位置に合わせられる。主に蛍光色素Ｂからの発光を捉える固定増幅器３２の位相位置は、蛍光色素Ａによって発生される波形からの寄与を相殺する位置に合わせられる。一方の蛍光色素が存在しかつ他方の蛍光色素が存在しない領域は、直接観察することによって決定される。単一相固定増幅器を用いる、本発明の第２の実施例の変形例では、基本的に、蛍光色素の各々に関して、相互励起された発光が主な発光と比例すると仮定する。しかし、本発明の第１の実施例に示した変形例ではそのような仮定は必要でない。固定増幅器３０および３２は、主に励起される蛍光色素からの最大の出力を与える位置に合わせられる。主な寄与に対する相互励起された寄与の比率は、１つの蛍光色素しか存在しない領域から得られる。そのような領域は、データセットを走査して商Ｉ₂／Ｉ₁およびＩ₁／Ｉ₂の最小値を得ることによって決定することができる。蛍光色素ＡおよびＢの緩和時間が異なる場合、コンピュータ３４は、組合わされた発光スペクトル１４０の個々の成分を表わす量Ｉ_A1およびＩ_B2を得ることしかできない。データは、蛍光色素ＡからのＩ_A1の表示された像１７２、および蛍光色素ＢからのＩ_B2 の表示された像１７４としてコンピュータ３４によって出力され得る。図２に示した例では、用いられる蛍光色素は、５１４ｎｍのＴＲＩＴＣ、および４５８ｎｍのルシファ・イエロー（Lucifer Yellow）である。これらの蛍光色素は、それぞれ約１ワットの出力パワーの２つのアルゴンレーザを用いて、それぞれ０．７ＭＨｚおよび０．９ＭＨｚで変調された。画素サンプリング速度は１００ＫＨｚであった。複数の蛍光色素の量を同時に測定する本発明の能力は、種々の応用に用いることができる。これらの応用には、ＤＮＡ配列の個々の塩基のような電気泳動で分離された、蛍光色素で標識された化合物の定量分析がある。さらに、損なわれていない細胞における蛍光色素で標識された化合物を伴う反応の力学にも用いることができる。たとえば、蛍光緩和時間が特定の値をとる領域は、記録された像から得ることができる。これにより、三次元の微細な構造を分析しその量を測定するための全く新しい道がひらけるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ， (72)発明者カールソン，クイュル・エススウェーデン、エス―186 42 バレンツナ、マルムボダベーゲン、17

Claims

【特許請求の範囲】１．複数の離散的な波長の電磁放射を用いた励起によって蛍光ターゲットの量を測定するための装置であって、連続する電磁放射の２つのビームを放射するための手段を含み、各ビームは離散的な波長を有し、前記ビームは蛍光ターゲットが存在する複数の位置の個々に走査するように放射して前記ターゲットの励起を引き起こし、前記ビームの各々に特定の時間変調された波形を与えるように、前記ビームの各々の強度を別々の変調周波数で変調するための手段と、前記励起に応答して前記ターゲットからの組合わされた蛍光発光を検出するための手段と、前記検出された組合わされた蛍光発光から、前記ターゲットの各々に対応する寄与を引き出し、それによって前記ターゲットの量を測定するための復調手段とをさらに含む、装置。２．前記ターゲットから組合わされた蛍光発光を検出するための前記手段は、２つの検出器を含む、請求項１に記載の装置。３．前記ターゲットから組合わされた蛍光発光を検出するための前記手段は、１つの検出器を含む、請求項１に記載の装置。４．複数の離散的な波長の電磁放射を用いた励起によって、平面において間隔をあけて分配される蛍光ターゲットの量を測定するための装置であって、異なる離散的な波長の２つの電磁放射ビームを、蛍光ターゲットが存在する平面上の複数の位置の個々に走査するように放射し、ターゲットの励起を引き起こすための手段と、前記ビームの各々に特定の時間変調された波形を与えるように、前記ビームの各々を別々の変調周波数で変調するための手段と、前記励起に応答して前記平面の位置に発光された放射を集めるための手段と、前記発光された放射のスペクトル部分を光学的に分離するための手段とを含み、前記スペクトル部分は少なくとも２つの異なる波長帯を示し、前記発光された放射の前記分離されたスペクトル部分の各々を示す放射を独立して検出するための手段と、複数の蛍光ターゲットからの組合わされた発光された放射の前記検出されたスペクトル部分の各々から、前記ターゲットの各々に対応する寄与を引き出し、それによって前記平面の各ターゲットの量を測定するための復調手段とをさらに含む、装置。５．前記ビームの各々は別々のダイオードレーザによって生成され、前記ダイオードレーザの各々の強度は別々の周波数で変調される、請求項４に記載の装置。６．前記ビームの各々を変調するための前記手段は、各ビームのために電気−光学変調器を含み、ビームの各々は別々の周波数で変調される、請求項４に記載の装置。７．前記ビームの各々を変調するための前記手段は、各ビームのために音響− 光学変調器を含み、ビームの各々は別々の周波数で変調される、請求項４に記載の装置。８．前記組合わされた発光のスペクトル部分を独立して検出するための前記手段は２つの検出器を含み、スペクトル部分を光学的に分離するための前記手段は、前記組合わされた蛍光発光のスペクトルで分離された部分を前記２つの検出器の各々に分配するように配置される光学フィルタを含む、請求項４に記載の装置。９．前記復調手段は前記２つの検出器の各々のために別々の復調手段を含み、前記復調手段は対応するビームの変調周波数と同じ周波数を有する信号に特定され、各復調手段の出力は変調された波形の特定の位相位置に特定される、請求項８に記載の装置。１０．前記復調手段は２つの検出器の各々のために単一相固定増幅器を含み、前記増幅器は対応するビームの変調周波数と同期される、請求項９に記載の装置。１１．前記単一相増幅器の各々の位相位置は、対応する蛍光ターゲットからの前記増幅器の出力を最大にする位置に合わせられる、請求項１０に記載の装置。１２．前記復調手段は前記２つの検出器の各々のために２つの単一相固定増幅器を含み、一方の単一相固定増幅器は前記励起ビームのうちの一方の変調周波数と同期され、他方の単一位相固定増幅器は前記励起ビームの他方の変調周波数と同期され、これにより、相互励起されるスペクトルが同時にかつ独立して測定される、請求項９に記載の装置。１３．前記復調手段は前記２つの検出器の各々のために二相固定増幅器を含み、これにより、２つの蛍光ターゲットの位相シフトが同時にかつ独立して測定される、請求項９に記載の装置。１４．前記平面の位置で発光された放射を集めるための前記手段は共焦点顕微鏡である、請求項４に記載の装置。１５．複数の離散的な波長の電磁放射を用いた励起によって、体積において空間的に分配される蛍光ターゲットの量を測定するための装置であって、異なる離散的な波長を有する電磁放射の２つのビームを、１つ以上の蛍光ターゲットが存在する体積測定サンプルの走査面上の複数の位置の個々に走査するように放射し、ターゲットの励起を引き起こすための手段と、前記ビームの各々に特定の時間変調された波形を与えるように、前記ビームの各々を別々の変調周波数で変調するための手段と、前記励起に応答して前記走査面の位置に発光された放射を集めるための共焦点手段と、前記発光された放射のスペクトル部分を光学的に分離するための手段とを含み、前記スペクトル部分は少なくとも２つの異なる波長帯を示し、前記発光された放射の前記分離されたスペクトル部分の各々を示す放射を独立して検出するための手段と、複数の蛍光ターゲットからの組合わされた発光された放射の前記検出されたスペクトル部分の各々から、前記ターゲットの各々に対応する寄与を引き出し、それによって前記走査面上の各ターゲットの量を測定するための復調手段と、前記走査面を前記体積測定サンプルの別の走査面に変えるための手段と、複数の走査面に関する、体積測定サンプルにおける蛍光ターゲットの定量化を表わすデータをストアするための手段とをさらに含む、装置。１６．前記ビームの各々は別々のダイオードレーザによって生成され、前記ダイオードレーザの各々は別々の周波数で変調される、請求項１５に記載の装置。１７．前記ビームの各々を変調するための前記手段は、各ビームのために電気 −光学変調器を含む、請求項１５に記載の装置。１８．前記ビームの各々を変調するための前記手段は、各ビームのために音響 −光学変調器を含む、請求項１５に記載の装置。１９．前記組合わされた発光のスペクトル部分を独立して検出するための前記手段は２つの検出器を含み、スペクトル部分を光学的に分離するための前記手段は前記組合わされた蛍光発光のスペクトルで分離された部分を前記２つの検出器の各々に分配するように配置される光学フィルタを含む、請求項１５に記載の装置。２０．前記復調手段は前記２つの検出器の各々のために別々の復調手段を含み、前記復調手段は、対応するビームの変調周波数と同じ周波数を有する信号に特定され、前記変調手段の各々の出力は変調された波形の特定の位相位置に特定される、請求項１９に記載の装置。２１．前記復調手段は、前記２つの検出器の各々のために単一相固定増幅器を含み、前記増幅器は対応するビームの変調周波数と同期される、請求項２０に記載の装置。２２．前記単一相増幅器の各々の位相位置は、対応する蛍光ターゲットからの前記増幅器の出力を最大にする位置に合わされる、請求項２１に記載の装置。２３．前記復調手段は、前記２つの検出器の各々のために２つの単一相固定増幅器を含み、前記単一相固定増幅器の一方は前記励起ビームのうちの一方の変調周波数と同期され、前記単一相固定増幅器の他方は前記励起ビームのうちの他方の変調周波数と同期され、これにより、相互励起されたスペクトルが同時にかつ独立して測定される、請求項２０に記載の装置。２４．前記復調手段は前記２つの検出器の各々のために二相固定増幅器を含み、それによって、２つの蛍光ターゲットの位相シフトが同時にかつ独立して測定される、請求項２０に記載の装置。