JPH0382946A - 多色光検出型電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は多色光検出型電気泳動装置に関し、さらに詳し
くは、蛍光標識されたＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白などの分離
検出、特にＤＮＡシーケンサ−１遺伝子診断等に好適な
多色光検出型電気泳動装置に関する。

〔従来の技術〕

従来ＤＮＡ塩基配列決定は放射性同位元素標識によるオ
ートラジオグラフィーによりなされていた。しかし、最
近、蛍光標識を用い光学的に自動的にＤＮＡ断片を検出
して塩基配列を自動的に決定する手法が普及してきてい
る。この手法では末端塩基種の異なる４種のＤＮＡ断片
群を発光波長の異なる蛍光体で標識し、ゲル電気泳動に
よりＤＮＡ断片を分離する。泳動路上をレーザーで照射
し、発する蛍光を各発光波長を透過極大とする４種のバ
ンドパスフィルターを具備した検出器で受光する。この
検出器では回転板上に４種のバンドパスフィルターを装
備した光電子増倍管から戒り、これをレーザー光に同期
させて移動し複数泳動路からの蛍光を受光し、回転フィ
ルターにより波長選別して信号処理をしている。また、
泳動板をライン状にレーザーで照射し、線状の蛍光像を
プリズムで分光すると共に高感度二次元検出器を用いて
検出する方式なども提案されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

蛍光検出装置では高感度を達成する事が重要である。し
かし、従来装置ではこの点に十分の配慮がなされていな
かった。すなわち、回転フィルターを用い照射光と共に
検出器を掃引する計測系では１箇の測定点あたりの計測
時間の割合βは、測定領域の長さをｌ、照射レーザービ
ームの幅をｄとすると、β−−となる。通常ｄは０．２
〜０．３１ ｍｍ、ｊ！、ｐｌｏｏ恥なので、βゑ１０４となり、連
続光照射した場合に比べて非常に小さい発光量しか得ら
れす、高感度が得られない難点があった。

一方、ゲル板の側面からレーザー光を入射し、各測定点
を連続光照射し、得られる蛍光画像の発光点から発散す
る蛍光をプリズムで分光して二次元検出器で検出する方
式では受光量は大きく有利である。しかし、蛍光スペク
トルは幅が広く色素の発光波長は相互に２０ｎｍ程度し
か極大位置が離れていないため、上記方式では、蛍光画
像の発光点から広い立体角に発散する蛍光信号を十分分
離して検出できないという難点があった。

本発明の目的はこの難点を解消することにある。

（課題を解決するための手段〕 本発明者らは研究の結果、多色光検出型電気泳動装置に
おける蛍光画像の像分割および波長選別を行う素子の一
部をシリンドリカル凸レンズおよびシリンドリカル凹レ
ンズで構威し、前記蛍光画像から広い角度で発散する蛍
光をシリンドリカル凸レンズで集光し、シリンドリカル
凹レンズを経て受光面に結像させるようにすることによ
り、上記目的が良好に達成されることを見出し、この新
知見に基づいてさらに研究を重ねて本発明を完成するに
至った。

したがって、本発明の多色光検出型電気泳動装置は、少
なくとも、レーザー光源、ゲル電気泳動分離板、蛍光画
像の像分割および波長選別を行なう素子ならびに蛍光検
出器を具備する多色光検出型電気泳動装置において、前
記蛍光画像の像分割および波長選別を行なう素子として
、シリンドリカル凸レンズ、シリンドリカル凹レンズお
よびバンドパスフィルターを具備することを特徴とする
。

本発明の装置の実用的な構成としては、前記電気泳動分
離板への所要箇所へのレーザー照射が、前記電気泳動分
離板中のゲル板の側面から前記電気泳動分離板の平面に
貫通ずる方向のレーザー照射であり、レーザー照射によ
って得られる蛍光画像が前記ゲル板中のレーザー照射の
通路にそって発する線状の蛍光画像である。

像分割を行なう素子の具体的構成としては、例えば、バ
ンドパスフィルターが分割多面フィルタであり、これに
よって像分割が行われる構成とし、また、分割多面フィ
ルターがシリンドリカル凸レンズと結像レンズとの間に
設置されている構成とすることができる。そして前記分
割多面フィルターの各面の面積が、前記各面を通過する
蛍光の光量がほぼ均等になるような大きさとなっている
ことが望ましい。

像分割を行なう素子の別の例として、シリンドリカル凸
レンズが複数の分割されたシリンドリカル凸レンズから
なり、これによって像分割が行われる構成とすることも
できる。

さらに、レーザー照射による発光点以外の部分の発光に
よる測定の障害を回避するために、線状の蛍光画像の発
光点とシリンドリカル凸レンズの間に、前記発光点から
発する光のうち、所定角度以上に上下に発散する光を遮
断するスリットを、前記線状の蛍光画像と平行に設ける
ことが好ましい。そして、前記スリットの巾は、分割像
のみかけ上の物点位置の間隔よりも狭くすることが望ま
しい。

さらに、本発明の装置による多色蛍光検出に用いられる
蛍光色素としては、ＦｒＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
ｉｓｏｔｈｊｏｃｙａｎａｔｅＨ発光波長５１５ｎｍ）
、　ＮＢＤ−Ｆ　（４ｆｌｕｏｒｏ−７ｎ１ｔｒｏｂｅ
ｎｚｏｆｕｒａｚａｎ；発光波長５４０ｎｍ）　。

ＴＲＩＴＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ　ｒｈｏｄａｍｉ
ｎｅ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅＨ発光波長５７３
）およびＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ（発光波長６１０ｎｍ）な
どを利用できる。

多色標識に対応してバンドパスフィルタとしては、透過
帯の中心波長が上記発光波長に一致し、透過帯の巾が２
０〜４０ｒ＋ｍの多層膜誘電体フィルター等が用いられ
る。

前記蛍光検出器としては、通常、二次元蛍光検出器が用
いられる。

本発明の装置は、ＤＮＡ或いはＲＮＡの分離検出装置、
特にＤＮＡシーケンサ−１遺伝子診断装置等に用いるこ
とができる。

〔作　用〕

本発明の装置は、蛍光画像の像分割および波長選別を行
う素子の一部をシリンドリカル凸レンズおよびシリンド
リカル凹レンズで構成し、前記蛍光画像から広い角度で
発散する蛍光をシリンドリカル凸レンズで集光し、シリ
ンドリカル凹レンズを経て受光面に結像させるものであ
るから、蛍光画像の発光点から広い立体角に発散する蛍
光を広範囲に利用できるものである。そして、蛍光画像
の像分割および波長選別を行う素子によって複数に像分
割及び波長選別された蛍光は二次元検出器等の蛍光検出
器上の異なる位置に結像する。これら信号を処理するこ
とにより高感度で各ＤＮＡ断片の量等の測定をすること
ができる。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例を第１図により説明する。本実
施例では標識蛍光体としてＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ（発光波
長６０５ｎｍ）および３種のフタロシアニン系発光体（
発光波長６ＢＯｒ＋ｍ、　７０３ｎｍ、および７２５ｒ
＋ｍ）を使用した前者の励起には波長５４３ｎｍのＨｅ
−Ｎｅレーザー１を使用し、後３者の励起には波長６３
３ｎｍの１１６−Ｎｅレーザー２を使用した。両レーザ
ーから出た光はミラー３および４を用いて重畳された後
、レンズで絞られゲル泳動板５を側面から照射する。ゲ
ルの厚さは０．３　ｍｍで石英あるいはガラス板６によ
り保持されている。ゲル板の横幅は２００＋ｎｍである
が中央部１２０ｍｍの所を解析には使用した。照射部か
ら出た蛍光はスリットを通過した後シリンドリカルレン
ズ７を用いて縦方向（照射線と垂直方向）に発散する蛍
光成分を収束され平行光線となる。

シリンドリカル凸レンズにより縦方向の受光立体角は約
８倍とすることができるので、高感度が得られる。また
、スリットは間隔の大きさ５ｍｍのものを発光点から５
ｍｕ＋離して設置した。これは多量の標識ＤＮＡが泳動
してきた時、光照射部組外の所を通過中に散乱光により
ＤＮＡが蛍光を出し、０ 測定の障害となるのを防止するためである。この光を色
ガラスフィルターと全反射ミラーからなる散乱光除去フ
ィルター８を通過させて４種の蛍光体からの発光だけを
取り出す。蛍光は第２図に示したような同一平面にない
４つの出射面を持つ４分割フィルター９により空間的に
波長選別された光として出射する。多面角フィルターの
代わりに複数のシリントリルレンズを上下角度を変えて
並べても同様のＩａ能を持たすことができる。続くシリ
ンドリカル凹レンズ１０により縦方向の結像位置が横方
向と一致するよう方向補正を受けた後、結像レンズ１１
．フジ光量ＣＦ２５Ｌ　（ｆ　＝　２５肺、　　Ｆｏ、
８５）により二次元検出器上に像を結ぶ。４分割フィル
ターは第２図あるいは第３図に示したように出射面が４
分割され各面に透過波長帯の異なる透電体多層膜から成
るバンドパスフィルターが蒸着されている。本実施例で
はシリンドリカル凸レンズ７としてｆ＝２２ｍｍ、縦幅
２２ｍｍ、横幅１２０Ｗｆｌのものを用いているので平
行ビームの縦幅は２２ｍｍである。

縦方向酸分だけであるが、蛍光ビームはフィルタ１ −に垂直になっており、より精度の高いフィルター特性
が得られる。分割フィルターは縦３０＋ｎｕ＋、横３０
ｍｍ　（直径３０ｆｆＩｆｆｌの円形を用いても良い）
であるが、各フィルター面を通過する光量がほぼ等しく
なるように光が通過する部分の面積を調節している。

第３図に示したように各フィルタ一部の幅は上端から１
０ｍｍ、　　５　ｍｍ、　　５　ｍｍ、および１０ｍｍ
である。分割フィルターの各面が発光線に平行になるよ
うにフィルターは設置されている。各フィルター面は同
一平面にないので二次元検出器上には４木の蛍光線画像
が観測される。観測される線像の原点からのずれＸはフ
ィルターの出射面が入射面となす角θ、および物点から
の距離ｌに依存しており、屈折率ｎを用いてχ〜Ｉ！、
ｊａｎ（ｎ−１）θで近似できる。

図４に示したように各フィルター面を通過した光は１９
．２０．２Ｌ　および２２に物点があるように像を結ぶ
。実施例ではＩ！、　＝　１５０ｍｍ、　　θ−４°な
のでＸ−６恥が得られた。スリット３１の間隔は５ｍｍ
なので各フィルター面を通過した像およびその周辺のサ
テライト像が重なって測定の障害となることは２ ない。すなわち、フィルターの蛍光入射面と出射面の威
す角を上端から６°、２°、−２°、−６゜と選び物点
位置換算で６　ｍｍずつ離れた４本の線を観測している
。結像系の像倍率は１／８なのでこの像は受光素子Ｒ（
イメージ増幅器とＣＣＤを結合したもの；浜松ホトニク
ス社製）上で図１のモニター１６に示したように４本の
線として０．７ｎ＋ｍｌれて観測される。これは垂直チ
ャンネル約２５個分の分離に相当しており十分分離検出
できる。蒸着膜を形成するフィルター９の素材として波
長分散の少ないガラス（いわゆる大きいシロ値のガラス
）たとえばＢＫ−７などを用いた。波長分散が大きいと
観測される線幅が太くなって不都合である。

４木の線画像信号は検出回路１３、データ処理１４でそ
れぞれ試料からの塩基信号に変更処理されて出力される
。

〔発明の効果〕

本発明によればシリンドリカル凸レンズを使用し光量を
損うことなしに多色蛍光標識物からの発光の計測を行な
うことができる。各蛍光は精度の３ 高いバンドパスフィルターにより選別できるので高感度
で、しかも高精度で検出試料に対応した信号を得ること
ができる。また、回転フィルターなど稼働部分がないの
で動作上の不安もない。大きなバンドパスフィルターは
製作上困難を伴なうが、本発明では結像レンズ近傍に分
割フィルターを設置できるのでフィルターを小さくでき
る利点もある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のｌ実施例の概念図である。第２図は光
学系の断面図である。第３図は分割フィルターの平面お
よび側面図である。第４図は分割フィルターの結像特性
を示した模式図である。 １−　Ｈｅ−Ｎｅレーザ（５４３ｎｍ）　、２−　Ｈｅ
−Ｎｅレーザ（６３３ｎｍ）　、３・・・全反射ごラー
、４・・・５４３ｎｍ全透過、６３３ｎｍ・・・全反射
ミラー、５・・・ゲル板、６・・・ガラス板、７・・・
シリンドリカル凸レンズ、８・・・散乱光除去フィルタ
ー、９・・・分割フィルター、１０・・・シリンドリカ
ル凹レンズ、１１・・・結像レンズ（フジノンＣＦ２５
Ｌ）、Ｉ２・・・二次元検出器、１３・・・検出回路、
１４・・・デ４ 夕処理機、１５・・・出力機器、１６・・・テレビモニ
タ１７・・・モニターされた線蛍光画像、Ｉ８・・・発
光点、１９〜２２・・・分割フィルター通過光のみかけ
上の物点、２３〜２６・・・シリンドリカル凹レンズ通
過後の蛍光光路（物点１８から出た光と同し傾きとなる
）、２７〜３０・・・４分割されたフィルター面、３１
・・・スリット。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも、レーザー光源、ゲル電気泳動分離板、
   蛍光画像の像分割および波長選別を行なう素子ならびに
   蛍光検出器を具備する多色光検出型電気泳動装置におい
   て、前記蛍光画像の像分割および波長選別を行なう素子
   として、シリンドリカル凸レンズ、シリンドリカル凹レ
   ンズおよびバンドパスフィルターを具備することを特徴
   とする多色光検出型電気泳動装置。 ２、電気泳動分離板への所要箇所へのレーザー照射が、
   前記電気泳動分離板中のゲル板の側面から前記電気泳動
   分離板の平面に貫通する方向のレーザー照射であり、レ
   ーザー照射によって得られる蛍光画像が前記ゲル板中の
   レーザー照射の通路にそって発する線状の蛍光画像であ
   ることを特徴とする請求項１記載の多色光検出型電気泳
   動装置。 ３、バンドパスフィルターが分割多面フィルターであり
   、これによって像分割が行われることを特徴とする請求
   項１又は請求項２記載の多色光検出型電気泳動装置。 ４、分割多面フィルターがシリンドリカル凸レンズと結
   像レンズとの間に設置されていることを特徴とする請求
   項記載の多色光検出型電気泳動装置。 ５、分割多面フィルターの各面の面積が、前記各面を通
   過する蛍光の光量がほぼ均等になるような大きさとなっ
   ていることを特徴とする請求項３又は請求項４記載の多
   色光検出型電気泳動装置。 ６、シリンドリカル凸レンズが複数の分割されたシリン
   ドリカル凸レンズからなり、これによって像分割が行わ
   れることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の多色
   光検出型電気泳動装置。 ７、線状の蛍光画像の発光点とシリンドリカル凸レンズ
   の間に、前記発光点から発する光のうち、所定角度以上
   に上下に発散する光を遮断するスリットを、前記線状の
   蛍光画像と平行に設けた事を特徴とする請求項１乃至請
   求項６のいずれかの項記載の多色光検出型電気泳動装置
   。 ８、スリットの巾を分割像のみかけ上の物点位置の間隔
   よりも狭くしたことを特徴とする請求項７記載の多色光
   検出型電気泳動装置。 ９、蛍光検出器が二次元蛍光検出器であることを特徴と
   する請求項１乃至請求項７のいずれかの項記載の多色光
   検出型電気泳動装置。 １０、多色光検出型電気泳動装置がＤＮＡ或いはＲＮＡ
   の分離検出装置であることを特徴とする請求項１乃至請
   求項８のいずれかの項記載の多色光検出型電気泳動装置
   。