JPS63317770A - 走査型検出装置 - Google Patents
走査型検出装置Info
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- JPS63317770A JPS63317770A JP63141860A JP14186088A JPS63317770A JP S63317770 A JPS63317770 A JP S63317770A JP 63141860 A JP63141860 A JP 63141860A JP 14186088 A JP14186088 A JP 14186088A JP S63317770 A JPS63317770 A JP S63317770A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［発明の分野］
この出願は、プローバーらによって １９８６年７月２
日に出願された米国特許出願第８８１ 、３７２号（特
願昭６２−１６６２２３ ）のＤＮＡ配列決定の方法、
システム及び試薬という名称の出願に関連するものであ
る。
日に出願された米国特許出願第８８１ 、３７２号（特
願昭６２−１６６２２３ ）のＤＮＡ配列決定の方法、
システム及び試薬という名称の出願に関連するものであ
る。
この発明は走査型蛍光検出システム及び、特に蛍光系Ｄ
ＮＡシーケンサ−とともに用いるのに好適な装置に関す
るものである。このシステムは類似の蛍光団を比叡的低
レベルの発光で識別することができる。フィルターと光
学繊維フェースプレートを独自に組合わせることによっ
て、このシステムは複合フィルターの必須の光学的な特
性を維持しつつ、比較的多くの標本範囲が含有されてい
る広い検出領域からの信号を監視できる。
ＮＡシーケンサ−とともに用いるのに好適な装置に関す
るものである。このシステムは類似の蛍光団を比叡的低
レベルの発光で識別することができる。フィルターと光
学繊維フェースプレートを独自に組合わせることによっ
て、このシステムは複合フィルターの必須の光学的な特
性を維持しつつ、比較的多くの標本範囲が含有されてい
る広い検出領域からの信号を監視できる。
［発明の背景］
ＤＮＡ配列、すなわち配列決定やヌクレオチド配列又は
ＤＮＡを構成する塩基を決定することは現代分子生物学
の分析技術の基礎の１つである。
ＤＮＡを構成する塩基を決定することは現代分子生物学
の分析技術の基礎の１つである。
信頼できる塩基配置決定の方法の発達によって、遺伝情
報の組繊化の理解が進み遺伝物質の操作、すなわち遺伝
子工学が可能になった。
報の組繊化の理解が進み遺伝物質の操作、すなわち遺伝
子工学が可能になった。
ＤＮＡの塩基・配列決定の一般的な方法は現在２つある
。それらはマキサム−ギルバート化学分解法［エイ、エ
ム、°マキサムら、メス、イン、エンザイム、（Ｈｅｔ
ｈ、 ｉｎ、Ｅｎｚｙｎ、 ） ６５４９９−５９９
（１９８０） ］及びサンガージデオキシチェーンター
ミネーション法［エフ、サンガーら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７４５４６３−５
４６７ （１９７７） ］である、これらの２つの方
法において共通な特徴は個々のグループが標識されたＤ
ＮＡ［片の集団を有し、個々の集団が異なった数のヌク
レオチドを有する断片を含む、標識されたＤＮＡ断片の
４つのグループを生成させることである。これらすべて
のグループ中の断片の集団は４つのヌクレオチド中の１
つ又はＤＮＡを構成する塩基になる。この２つの方法は
、いずれも断片を標識する手段として Ｐ又はＳのよう
な放射性同位元素を利用する。２つの技術の根本的な相
違は断片の調製方法である。
。それらはマキサム−ギルバート化学分解法［エイ、エ
ム、°マキサムら、メス、イン、エンザイム、（Ｈｅｔ
ｈ、 ｉｎ、Ｅｎｚｙｎ、 ） ６５４９９−５９９
（１９８０） ］及びサンガージデオキシチェーンター
ミネーション法［エフ、サンガーら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７４５４６３−５
４６７ （１９７７） ］である、これらの２つの方
法において共通な特徴は個々のグループが標識されたＤ
ＮＡ［片の集団を有し、個々の集団が異なった数のヌク
レオチドを有する断片を含む、標識されたＤＮＡ断片の
４つのグループを生成させることである。これらすべて
のグループ中の断片の集団は４つのヌクレオチド中の１
つ又はＤＮＡを構成する塩基になる。この２つの方法は
、いずれも断片を標識する手段として Ｐ又はＳのよう
な放射性同位元素を利用する。２つの技術の根本的な相
違は断片の調製方法である。
両方の方法において、一般的に物理的方法によって直接
決定することができない塩基配列情報は、測定すること
ができる鎖の長さの情報に変換されなければならない、
この測定は電気泳動分離によって行なわれる。変性条件
下（高温、尿素存在等）において、短いＤＮＡ断片は固
い棒として泳動媒体中を泳動する。もし、ゲルが電気泳
動のため用いられると、ＤＮＡ断片は大きさの順に並べ
られ、その結果数百塩基以下の単一塩基分解能でＤＮＡ
配列決定できる。
決定することができない塩基配列情報は、測定すること
ができる鎖の長さの情報に変換されなければならない、
この測定は電気泳動分離によって行なわれる。変性条件
下（高温、尿素存在等）において、短いＤＮＡ断片は固
い棒として泳動媒体中を泳動する。もし、ゲルが電気泳
動のため用いられると、ＤＮＡ断片は大きさの順に並べ
られ、その結果数百塩基以下の単一塩基分解能でＤＮＡ
配列決定できる。
ＤＮＡ塩基配列の決定方法であるサンガー法及びマキサ
ム−ギルバート法は概念的に優雅で有効であるが、操作
的に困雑で時間を要ししばしば不正確である０問題点の
多くは単一の放射性同位体レポーターが塩基類を識別で
きないということがら派生している。４つの塩基の位置
の配列を分析するために単一レポーターを使用すること
は、全体的な操作にかなりの複雑さを与える。完全な配
列を決定するために、マキサム−ギルバート法又はサン
ガー法により形成された４つの断片の組は４つの平行な
レーンで電気泳動される。その結果ゲルの長さ方向に沿
って断片が、その大きさに従って空間的に分離される。
ム−ギルバート法は概念的に優雅で有効であるが、操作
的に困雑で時間を要ししばしば不正確である０問題点の
多くは単一の放射性同位体レポーターが塩基類を識別で
きないということがら派生している。４つの塩基の位置
の配列を分析するために単一レポーターを使用すること
は、全体的な操作にかなりの複雑さを与える。完全な配
列を決定するために、マキサム−ギルバート法又はサン
ガー法により形成された４つの断片の組は４つの平行な
レーンで電気泳動される。その結果ゲルの長さ方向に沿
って断片が、その大きさに従って空間的に分離される。
標識された断片のパターンは、しばしばシーフェンシン
グラダー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ １ａｄｄｅｒ ）と
称される４つのレーン間に分配された連続的なバンドを
現わすオートラジオグラフィーによって典型的に読まれ
る。ラダーは可視的にフィルムを観察し、ラダー上の各
々のステップについて次のバンドが生じるレーンを決定
することによって読まれる。熱的に誘導されるゲル中の
塩基移動度の歪みにより（これは通常、ゲルを横切る「
スマイル効果」として現われる）、４つのレーンを比較
することが困難になる。これらの歪みは、単一のゲル上
で読むことができる塩基の数をしばしば制限する。
グラダー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ １ａｄｄｅｒ ）と
称される４つのレーン間に分配された連続的なバンドを
現わすオートラジオグラフィーによって典型的に読まれ
る。ラダーは可視的にフィルムを観察し、ラダー上の各
々のステップについて次のバンドが生じるレーンを決定
することによって読まれる。熱的に誘導されるゲル中の
塩基移動度の歪みにより（これは通常、ゲルを横切る「
スマイル効果」として現われる）、４つのレーンを比較
することが困難になる。これらの歪みは、単一のゲル上
で読むことができる塩基の数をしばしば制限する。
単一の放射性同位元素を用いることによる問題点は、感
度不足と標本を評価するのに必要な時間である。オート
ラジオグラフィーでの映１象化に必要な長い時間及び４
つの平行なレーンを用いる必要性の故に、可視化が「ス
ナップ撮影的」になる。
度不足と標本を評価するのに必要な時間である。オート
ラジオグラフィーでの映１象化に必要な長い時間及び４
つの平行なレーンを用いる必要性の故に、可視化が「ス
ナップ撮影的」になる。
Ｓ数のバンドを同時に空間的に分離することか必要なの
で、大きいゲルを用いることが必要である。
で、大きいゲルを用いることが必要である。
これにより追加的な問題がもたらされる。すなわち大き
なゲルは取扱いが困難で、泳動が緩慢であり操作全体に
要する時間が長くなる。
なゲルは取扱いが困難で、泳動が緩慢であり操作全体に
要する時間が長くなる。
一度露光を受けたゲルパターンの像を得てしまうと視覚
での分析という問題がある。シーフェンシングラダーを
塩基配列に変換することは時間を要し間違え易い工程で
、非常に熟練した実験者が全力集中することが必要であ
る。この問題点を解決するためのいくつかの機械も存在
するが、塩基配列ゲルを解釈する工程はいまでもなお苦
痛を伴い遅い工程である。最後に放射性物質の利用は長
期間にわたって放射能の１ ｇを受けるという健康上の
問題点もある。適当な３ｓ蔽や処理工程の使用により被
ばくレベルがある程度制御されているが、同位体の使用
をやめるのが最も望ましい。
での分析という問題がある。シーフェンシングラダーを
塩基配列に変換することは時間を要し間違え易い工程で
、非常に熟練した実験者が全力集中することが必要であ
る。この問題点を解決するためのいくつかの機械も存在
するが、塩基配列ゲルを解釈する工程はいまでもなお苦
痛を伴い遅い工程である。最後に放射性物質の利用は長
期間にわたって放射能の１ ｇを受けるという健康上の
問題点もある。適当な３ｓ蔽や処理工程の使用により被
ばくレベルがある程度制御されているが、同位体の使用
をやめるのが最も望ましい。
これらの問題を解決するためにオートラジオグラフィー
を他の方法、すなわち蛍光を用いた非放射性同位元素レ
ポーター／検出システムに交換するようになった。１種
又は２種以上の蛍光標識（蛍光染料）で標識され適当な
光源で励起されたＤＮＡ断片は、標識から断片を同定す
ることができる特徴的な光を出す。
を他の方法、すなわち蛍光を用いた非放射性同位元素レ
ポーター／検出システムに交換するようになった。１種
又は２種以上の蛍光標識（蛍光染料）で標識され適当な
光源で励起されたＤＮＡ断片は、標識から断片を同定す
ることができる特徴的な光を出す。
放射性同位体標識に対し、蛍光ａｌＪｉを用いることに
よって特徴ある蛍光標識の光学的パラメーターに対応す
るＤ Ｎ Ａ Ｉｆｒ片検出システムに特殊性を与える
ことができる０例えば、何らかの発光特徴（例えばスペ
クトル分布、寿命、分極化）に基づいて特定の塩基に関
連した塩基配列決定断片に特定の標識を特異的に結合す
ることができる。一度この結合が確立すると、単一の標
本からの断片はまとめられ解像されて、塩基の割当ては
選択された発光特性に基づいて行なうことができる。電
気泳動が分離方法として選択されたとき、例えば塩基特
異性蛍光標識と共にＤＮＡ断片を含有する単一の標本は
単一のゲルレーン中で分離することができる。
よって特徴ある蛍光標識の光学的パラメーターに対応す
るＤ Ｎ Ａ Ｉｆｒ片検出システムに特殊性を与える
ことができる０例えば、何らかの発光特徴（例えばスペ
クトル分布、寿命、分極化）に基づいて特定の塩基に関
連した塩基配列決定断片に特定の標識を特異的に結合す
ることができる。一度この結合が確立すると、単一の標
本からの断片はまとめられ解像されて、塩基の割当ては
選択された発光特性に基づいて行なうことができる。電
気泳動が分離方法として選択されたとき、例えば塩基特
異性蛍光標識と共にＤＮＡ断片を含有する単一の標本は
単一のゲルレーン中で分離することができる。
蛍光検出のリアルタイム性の故に、空間的に分離された
バンド（空間的解像）を含有するゲルを電気泳動方向に
走査することもできるし、ゲル上のある一点でモニター
し、順次検出領域を通過する分離された断片のバンドを
検出することができる（時間的解像）０時間的解像が選
択されたときは、断片を区別するために必ずしも大きな
ゲルは必要ない、さらに、リアルタイムの単一レーン検
出モードは完全に自動化された塩基割当て及びデータ移
動に非常に適している。
バンド（空間的解像）を含有するゲルを電気泳動方向に
走査することもできるし、ゲル上のある一点でモニター
し、順次検出領域を通過する分離された断片のバンドを
検出することができる（時間的解像）０時間的解像が選
択されたときは、断片を区別するために必ずしも大きな
ゲルは必要ない、さらに、リアルタイムの単一レーン検
出モードは完全に自動化された塩基割当て及びデータ移
動に非常に適している。
カリフォルニア工科大学によって開発され、よく知られ
ている「リアルタイム」の蛍光系ＤＮＡ塩基配列決定シ
ステムは少なくても公開された特許用１ｖ１１つと少な
くとも２つの論文に開示されている。それらはエル、エ
ム、スミスの西独特許出願ＤＥ ３４４６６３５Ａｌ
（１９８５） 、ヌクレイヅク、アシッズ、リサーチ
、 １３ ２３９９−２４１２イ１９８５ ）及びエル
、エム、スミスらによるネイチャー３２１ ６７４−６
７９ （１９８６）である、このシステムは４種の特
殊な蛍光染料のうち１種で各々標識されたＤＮＡ塩基配
列決定断片の４組を用いる。不幸なことに、蛍光（発光
）の最大値は４種の染料を容易に識別するために大きな
波長領域（約１０１００ｎに広がるが、吸収（励起）最
大値もまた比較的広がっている。このため、単一の単色
光源で全て４ａの染料を励起させることは困難であり、
得られる発光を十分に検出することが困難である。
ている「リアルタイム」の蛍光系ＤＮＡ塩基配列決定シ
ステムは少なくても公開された特許用１ｖ１１つと少な
くとも２つの論文に開示されている。それらはエル、エ
ム、スミスの西独特許出願ＤＥ ３４４６６３５Ａｌ
（１９８５） 、ヌクレイヅク、アシッズ、リサーチ
、 １３ ２３９９−２４１２イ１９８５ ）及びエル
、エム、スミスらによるネイチャー３２１ ６７４−６
７９ （１９８６）である、このシステムは４種の特
殊な蛍光染料のうち１種で各々標識されたＤＮＡ塩基配
列決定断片の４組を用いる。不幸なことに、蛍光（発光
）の最大値は４種の染料を容易に識別するために大きな
波長領域（約１０１００ｎに広がるが、吸収（励起）最
大値もまた比較的広がっている。このため、単一の単色
光源で全て４ａの染料を励起させることは困難であり、
得られる発光を十分に検出することが困難である。
近接した吸収スペクトルを有する（従って対応する発光
スペクトルも近接する）染料を用いて励起効率を高める
と他の問題が生じる。ＤＮＡ塩基配列決定のためのリア
ルタイム検出システムは、各々標識された断片を同定す
るために異なる染料の発光スペクトルを識別できなけれ
ばならない。
スペクトルも近接する）染料を用いて励起効率を高める
と他の問題が生じる。ＤＮＡ塩基配列決定のためのリア
ルタイム検出システムは、各々標識された断片を同定す
るために異なる染料の発光スペクトルを識別できなけれ
ばならない。
これらの発光は通常比較的低い強度である。従うて検出
システムは高感度及び高選択性（バンド当りＤ Ｎ Ａ
１０ モル以上）を有していなければならず、所望
の性能特性に合致するために迷光及び背景ノイズを小さ
くするための手段を有していなければならない、またこ
のシステムは、走査量の検出窓を通過して泳動する断片
を見逃すことがない −ように検出領域をモニターでき
なければならない。
システムは高感度及び高選択性（バンド当りＤ Ｎ Ａ
１０ モル以上）を有していなければならず、所望
の性能特性に合致するために迷光及び背景ノイズを小さ
くするための手段を有していなければならない、またこ
のシステムは、走査量の検出窓を通過して泳動する断片
を見逃すことがない −ように検出領域をモニターでき
なければならない。
効果的に電気泳動ゲルを用いるために、典型的なりＮＡ
塩基配列決定の実験ではスラブゲルの平行レーン中で同
時に多くの標本を泳動させることを包含する。それ故に
励起／検出システムもゲルの個々のレーンをほぼ同時に
モニターできなくてはならない、システムは用いるゲル
の幅いっばいに広がる検出帯をモニターできなければな
らない。
塩基配列決定の実験ではスラブゲルの平行レーン中で同
時に多くの標本を泳動させることを包含する。それ故に
励起／検出システムもゲルの個々のレーンをほぼ同時に
モニターできなくてはならない、システムは用いるゲル
の幅いっばいに広がる検出帯をモニターできなければな
らない。
典型的なシーケンシングゲルは幅４〜５Ｉのレーンを有
し、そのレーン間の隙間は１〜２闇である。
し、そのレーン間の隙間は１〜２闇である。
それ故に１０個のレーンゲルをモニターするために、検
出システムは通常７０ｎｒｎもの広い領域を励起させそ
こからの発光を検出しなければならない。
出システムは通常７０ｎｒｎもの広い領域を励起させそ
こからの発光を検出しなければならない。
類似の用途に開発された他の蛍光検出システムが、プロ
ーバーらによって１９８６年の７月２日に出願された米
国特許出願第８８１．７３２に開示されている。この出
願は時間的及び／又は空間的分離の後に異なる種、通常
染料で標識されたＤＮＡからの蛍光エネルギーの存在を
検出し、種を同定するためのシステムを開示している。
ーバーらによって１９８６年の７月２日に出願された米
国特許出願第８８１．７３２に開示されている。この出
願は時間的及び／又は空間的分離の後に異なる種、通常
染料で標識されたＤＮＡからの蛍光エネルギーの存在を
検出し、種を同定するためのシステムを開示している。
４つの標識の組は単一の光源によって効率的にすべて励
起することができ、波長内で類似するが識別可能な発光
スペクトルを有するものが選択される。結合されたＤＮ
Ａ断片の電気泳動移動度における示差的動揺は小さいの
で、この工程での妨害は類似の分子量、形状及び電荷を
有する４つの染料を用いることによって小さくすること
ができる。
起することができ、波長内で類似するが識別可能な発光
スペクトルを有するものが選択される。結合されたＤＮ
Ａ断片の電気泳動移動度における示差的動揺は小さいの
で、この工程での妨害は類似の分子量、形状及び電荷を
有する４つの染料を用いることによって小さくすること
ができる。
プローバーらの機構により、種の同定を決定する信号を
得るために異なる２つの波長の範囲内で蛍光エネルギー
に対応する信号の変調及び比率が与えられている。波長
の関数として変化する透過／反射特性を有する二色フィ
ルター又は波長の関数として変化する透過帯域を有する
２枚のフィルターによって変調が生じる。２つの検出器
はそれぞれ透過光及び反射光を受けることができ、個々
の強度に対応した第１及び第２の信号を発生するために
適当な場所に設置する。好ましくは、二色フィルター特
性は種発光スペクトルの中央付近で発生する透過から反
射にわたる比較的鋭い遷移を有する。
得るために異なる２つの波長の範囲内で蛍光エネルギー
に対応する信号の変調及び比率が与えられている。波長
の関数として変化する透過／反射特性を有する二色フィ
ルター又は波長の関数として変化する透過帯域を有する
２枚のフィルターによって変調が生じる。２つの検出器
はそれぞれ透過光及び反射光を受けることができ、個々
の強度に対応した第１及び第２の信号を発生するために
適当な場所に設置する。好ましくは、二色フィルター特
性は種発光スペクトルの中央付近で発生する透過から反
射にわたる比較的鋭い遷移を有する。
このシステムはスミスらの多くの問題点を解決しており
、また比較的高感度を維持しながら発光スペクトルの比
較的小さな波長差をリアルタイムで識別する能力を有す
る。更にこのシステムは蛍光種を含むゲルの連続的なモ
ニタリングを維持するために２つの光検出器上に用いる
光の一部を照射する。
、また比較的高感度を維持しながら発光スペクトルの比
較的小さな波長差をリアルタイムで識別する能力を有す
る。更にこのシステムは蛍光種を含むゲルの連続的なモ
ニタリングを維持するために２つの光検出器上に用いる
光の一部を照射する。
上記の２つのシステムはモニタリング領域内で唯一１点
でのみ共にモニターすることができる固定した光線及び
固定した検出器を操作するものである。ゲルの１つ以上
の空間的位置（レーン又はレーンの位置）をモニターす
るために、染料からの発光を検出するための手段を提供
して光線を走査しなければならなず、又は光線を固定し
たままでゲルを物理的に移動させなければならない、前
述の２つの方法のうちの後者、つまりゲルを移動すると
いうことは、大きな電気泳動ゲルと共に緩Ｓ液摺を動か
ずのは物理的に厄介なので実用的ではない、また迷光が
入ることを妨げ及び集光を最大にするために検出器を光
源と近接して連結させておかなければならないので、ゲ
ルを固定して光線を動かすというもう一方の方法は独自
の問題点を有する。
でのみ共にモニターすることができる固定した光線及び
固定した検出器を操作するものである。ゲルの１つ以上
の空間的位置（レーン又はレーンの位置）をモニターす
るために、染料からの発光を検出するための手段を提供
して光線を走査しなければならなず、又は光線を固定し
たままでゲルを物理的に移動させなければならない、前
述の２つの方法のうちの後者、つまりゲルを移動すると
いうことは、大きな電気泳動ゲルと共に緩Ｓ液摺を動か
ずのは物理的に厄介なので実用的ではない、また迷光が
入ることを妨げ及び集光を最大にするために検出器を光
源と近接して連結させておかなければならないので、ゲ
ルを固定して光線を動かすというもう一方の方法は独自
の問題点を有する。
この課題を達成した１つの方法は、ゲル中の数個のレー
ンを効果的に走査するために前述の２つの検出システム
の一方とそれらに付随する光学系及び光線を物理的に移
動させるというものである。
ンを効果的に走査するために前述の２つの検出システム
の一方とそれらに付随する光学系及び光線を物理的に移
動させるというものである。
この型のシステムは追加的ノイズを与える一方で機械的
な複雑さという欠点を有する。このシステムの信頼度及
び高値であるということにも問題がある。
な複雑さという欠点を有する。このシステムの信頼度及
び高値であるということにも問題がある。
他の既知の「走査型ｊ検出システムがグリーンらによっ
て米国特許第３，７６４，５１２号で議論されている。
て米国特許第３，７６４，５１２号で議論されている。
このシステムはレーザー走査型の電気泳動機器及び水性
溶液中の分散粒子の界面動電位又はゼータ電位を決定す
るシステムを開示している。
溶液中の分散粒子の界面動電位又はゼータ電位を決定す
るシステムを開示している。
このシステムでは電気泳動媒体を横切ってレーザー光線
を走査するためにガルバノメーター鏡を用いている。こ
のシステムは光線の走査運動に対して垂直面を移動する
多くの標本を検出することができない。
を走査するためにガルバノメーター鏡を用いている。こ
のシステムは光線の走査運動に対して垂直面を移動する
多くの標本を検出することができない。
他の走査システムがチャンスらによって米国特許第４，
１６２，４０５号に開示されている。それには潅流及び
そのままの状態の器官へ放出された酸素の不均質性を測
定する機器が記載されている。レーザーがフライングス
ポット走査励起源として用いられ、発光信号及び励起波
長をモニターするために２つの光検出器を用いる。標本
領域上でレーザー光線を移動させるためにｘ−ｙスキャ
ナーが用いられているが、全走査領域はわずか１ ｃｍ
Ｘ １ ａｎである（先に述べた多種のＤＮＡ塩基配列
の標本と比較して、７倍の広さが必要である）。
１６２，４０５号に開示されている。それには潅流及び
そのままの状態の器官へ放出された酸素の不均質性を測
定する機器が記載されている。レーザーがフライングス
ポット走査励起源として用いられ、発光信号及び励起波
長をモニターするために２つの光検出器を用いる。標本
領域上でレーザー光線を移動させるためにｘ−ｙスキャ
ナーが用いられているが、全走査領域はわずか１ ｃｍ
Ｘ １ ａｎである（先に述べた多種のＤＮＡ塩基配列
の標本と比較して、７倍の広さが必要である）。
チャンスらの計画を完成するためには、検出器の大きさ
を大きくするか又は検出器を標本から遠ざけな場所に置
かなければならないが、このようなことは集光能率を低
下させてしまう、更にまた発光スペクトルよりも強い励
起光源の存在下では、比較的低い発光強度の近い発光ス
ペクトルの検出は干渉フィルターによる選択的透過性が
必要である。比較的大きな空間領域をモニターするため
に大きな検出器及び大きなフィルターを用いなければな
らない、不幸なことに大きな立体角の光を集めることが
できる大きな干渉フィルターは光の入射角によって変化
する透過性の影響を受けてしまう、このように発光源の
近くに配置すると、約２２度よりも大きな入射角でフィ
ルターに入射した光−は垂直入射の光よりも励起光の拒
否が小さい、それ故にもしフィルターが発光源に対して
比教的大きな立体角を有していたとしたならば、フィル
ターの全励起波長拒否性は大きい入射角で入射してきた
励起光線の漏れのために折衷される。
を大きくするか又は検出器を標本から遠ざけな場所に置
かなければならないが、このようなことは集光能率を低
下させてしまう、更にまた発光スペクトルよりも強い励
起光源の存在下では、比較的低い発光強度の近い発光ス
ペクトルの検出は干渉フィルターによる選択的透過性が
必要である。比較的大きな空間領域をモニターするため
に大きな検出器及び大きなフィルターを用いなければな
らない、不幸なことに大きな立体角の光を集めることが
できる大きな干渉フィルターは光の入射角によって変化
する透過性の影響を受けてしまう、このように発光源の
近くに配置すると、約２２度よりも大きな入射角でフィ
ルターに入射した光−は垂直入射の光よりも励起光の拒
否が小さい、それ故にもしフィルターが発光源に対して
比教的大きな立体角を有していたとしたならば、フィル
ターの全励起波長拒否性は大きい入射角で入射してきた
励起光線の漏れのために折衷される。
し課題を解決するための手段］
従来技術である放射エネルギー検出システムの前述した
多くの問題点は、ＤＮＡ塩基配列決定システムへの特別
な用途を有する本発明によって解決されている０本発明
は、時間的及び／又は空間的に分離した後、異なる種（
通常、染料で標識されたＤＮＡ断片）からの放射エネル
ギーの存在を検出して種を同定するためのシステムに用
いて有用なものである。このシステムは第一の意味（ｓ
ｅｎｓｅ ）で上記種の性質の関数として振幅が変化す
る第１の信号を発生するための、十記種によって発生さ
れる放射エネルギーに応答する第１の検出手段、上記第
一の意味とは異なる第二の意味で上記種の性質の固有の
関数として振幅が変化する第２の信号を発生するための
、放射エネルギーに応答する第２の検出手段及び上記第
１の信号と第２の信号の関数比に対応する第３の信号を
得るための、上記第１の信号と第２の信号に応答する第
３の手段を有する。第３の信号の振幅が上記種それぞれ
の指標となる。
多くの問題点は、ＤＮＡ塩基配列決定システムへの特別
な用途を有する本発明によって解決されている０本発明
は、時間的及び／又は空間的に分離した後、異なる種（
通常、染料で標識されたＤＮＡ断片）からの放射エネル
ギーの存在を検出して種を同定するためのシステムに用
いて有用なものである。このシステムは第一の意味（ｓ
ｅｎｓｅ ）で上記種の性質の関数として振幅が変化す
る第１の信号を発生するための、十記種によって発生さ
れる放射エネルギーに応答する第１の検出手段、上記第
一の意味とは異なる第二の意味で上記種の性質の固有の
関数として振幅が変化する第２の信号を発生するための
、放射エネルギーに応答する第２の検出手段及び上記第
１の信号と第２の信号の関数比に対応する第３の信号を
得るための、上記第１の信号と第２の信号に応答する第
３の手段を有する。第３の信号の振幅が上記種それぞれ
の指標となる。
本発明は上記のようなシステムの改良であって、第１及
び第２の手段の中に上記種からの放射エネルギーを受け
るために、上記種に隣接して設けられた大きな立体角を
有する検出器とそれぞれの検出器と上記種との間に配置
され、それぞれが相補的な透過対波長特性を有する波長
選択フィルターとを有し、上記第１の検出手段及び第２
の検出手段の一方が、所定の値より大きい角度で検出器
に入射する放射エネルギーを拒絶するための透過フィル
ターを含んでいる。
び第２の手段の中に上記種からの放射エネルギーを受け
るために、上記種に隣接して設けられた大きな立体角を
有する検出器とそれぞれの検出器と上記種との間に配置
され、それぞれが相補的な透過対波長特性を有する波長
選択フィルターとを有し、上記第１の検出手段及び第２
の検出手段の一方が、所定の値より大きい角度で検出器
に入射する放射エネルギーを拒絶するための透過フィル
ターを含んでいる。
好ましくはレーザーからの放射エネルギーのビームによ
って種が励起され、システムは発光物質で標識された分
子（通常、ＤＮＡ断片）を分離する手段を包含する。検
出手段は、順次上記種を励起させるためにビームが分離
手段を横切って掃引されるところのレーザービームを伝
播する領域の反対側に設置する。波長選択フィルターは
透過対波長特性の中で種の放射エネルギースペクトルの
真中付近に中心を有する遷移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）
を有する。透過フィルターは平行母線を持つために第１
及び第２の検出器に対して横断して設置した複数の光学
繊維中に別の壁面吸収体（＋ｎｕｒａｌ ａｂｓｏｒｂ
ｅｒ）を有する。
って種が励起され、システムは発光物質で標識された分
子（通常、ＤＮＡ断片）を分離する手段を包含する。検
出手段は、順次上記種を励起させるためにビームが分離
手段を横切って掃引されるところのレーザービームを伝
播する領域の反対側に設置する。波長選択フィルターは
透過対波長特性の中で種の放射エネルギースペクトルの
真中付近に中心を有する遷移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）
を有する。透過フィルターは平行母線を持つために第１
及び第２の検出器に対して横断して設置した複数の光学
繊維中に別の壁面吸収体（＋ｎｕｒａｌ ａｂｓｏｒｂ
ｅｒ）を有する。
このシステムは光学的に有効であり、レンズや他の集光
装置を用いる必要はない、広い入射角を存する検出器を
用いることによって、複数の電気泳動レーンを含み得る
広い領域を観察することができる。これらの複数のレー
ンは順次がっ反復的に走査される。これらの効率の故に
、このシステムは放射エネルギーが低い標識を用いて操
作かで・ きる、このシステムで唯−動く部分として必
要なのは、レーザー走査を行なう光学要素である。透過
フィルター及びそれに付随する余分の壁吸収体は、検出
器に当なる外部の光を実質的に減少させる。このシステ
ムは異なるが近接した広がりの波長でエネルギーを発す
る複数の発光源からの放射エネルギーを検出及び識別で
きる。
装置を用いる必要はない、広い入射角を存する検出器を
用いることによって、複数の電気泳動レーンを含み得る
広い領域を観察することができる。これらの複数のレー
ンは順次がっ反復的に走査される。これらの効率の故に
、このシステムは放射エネルギーが低い標識を用いて操
作かで・ きる、このシステムで唯−動く部分として必
要なのは、レーザー走査を行なう光学要素である。透過
フィルター及びそれに付随する余分の壁吸収体は、検出
器に当なる外部の光を実質的に減少させる。このシステ
ムは異なるが近接した広がりの波長でエネルギーを発す
る複数の発光源からの放射エネルギーを検出及び識別で
きる。
［実施例］
非常に密接している発光バンドがらの放射は、この発明
のシステムを用いて検出できる。これらの密接した発光
はレポーターちして典型的に作用し、分析さ′れる物質
と非可逆的に結合した予め選択された種から生じる。許
容できるレポーターは、一般に、狭い波長範囲（典型的
には５０〜１００ｎＩＤ、好ましくは２０〜５０ｎｉ１
）に渡る放射を発生ずる能力があるなめに選ばれた１種
または２種以上の種である。好ましくは最大ピークが２
ｒ＋ｎ＋よりも近くないべきである。１つのレポータ一
種は、対照物質への結合方法及びこのシステムにおける
分析条件に依存して、１を越える波長でエネルギーを発
生し得る。しかし、このソステムで独自の発光特性を有
する個々のレポーターは検出されるべき波長範囲内で放
射を発生するように選ぶことがより好都合である。この
発明の好ましい形式はレポーターで標識したＤＮＡシー
ゲンシング断片を検出することなので、そのことを記載
する。しがしながら、この発明は、発光性標識標本のい
ずれをも検出するのに用いられることができ、特に発光
が密接した波長のとき有利であることを理解すべきであ
る。この発明は例えば蛍光、化学発光及びその他同様な
ものの検出に用いることができる。このように染料で漂
識されたＤＮＡシーケンシング断玲を分離のために電気
泳動装置中に通過させる。
のシステムを用いて検出できる。これらの密接した発光
はレポーターちして典型的に作用し、分析さ′れる物質
と非可逆的に結合した予め選択された種から生じる。許
容できるレポーターは、一般に、狭い波長範囲（典型的
には５０〜１００ｎＩＤ、好ましくは２０〜５０ｎｉ１
）に渡る放射を発生ずる能力があるなめに選ばれた１種
または２種以上の種である。好ましくは最大ピークが２
ｒ＋ｎ＋よりも近くないべきである。１つのレポータ一
種は、対照物質への結合方法及びこのシステムにおける
分析条件に依存して、１を越える波長でエネルギーを発
生し得る。しかし、このソステムで独自の発光特性を有
する個々のレポーターは検出されるべき波長範囲内で放
射を発生するように選ぶことがより好都合である。この
発明の好ましい形式はレポーターで標識したＤＮＡシー
ゲンシング断片を検出することなので、そのことを記載
する。しがしながら、この発明は、発光性標識標本のい
ずれをも検出するのに用いられることができ、特に発光
が密接した波長のとき有利であることを理解すべきであ
る。この発明は例えば蛍光、化学発光及びその他同様な
ものの検出に用いることができる。このように染料で漂
識されたＤＮＡシーケンシング断玲を分離のために電気
泳動装置中に通過させる。
第１図及び第２図で示しているように、この目的のなめ
に通常厚さ約０．３ｎｍ 、長さ約４０ＣＩ１１及び幅
約１５ｃｍの適切なスラブ１０を用いて電気泳動を行な
うことができる。他の大きさのものも用いられる。
に通常厚さ約０．３ｎｍ 、長さ約４０ＣＩ１１及び幅
約１５ｃｍの適切なスラブ１０を用いて電気泳動を行な
うことができる。他の大きさのものも用いられる。
このスラブ１０は適当なゲル１１、典型的には６％のポ
リアクリルアミドをガラスまたは低い蛍光をもつプラス
チック支持板１２間に有している。
リアクリルアミドをガラスまたは低い蛍光をもつプラス
チック支持板１２間に有している。
スラブ１０はホルダー中に通常垂直に置かれており、上
端部は緩衝液２４を収容する上部［１６を通ってその中
へ入っており、下端部はｖｊ：街液１８を収容する第２
のＷ１１４の中に入っている。緩衝溶液は０．１Ｍのト
リス、０．１Ｍのホウ酸及び０．０５ ＭのＮａ２ＥＤ
ＴＡからなる溶液から得、最終ＰＨが約８．３である緩
ｉ液のようないず耽の好適な緩衝液であり得る。こうし
て、緩衝液はゲルと電気接触するためにスラブの両端で
ゲルと接触する。
端部は緩衝液２４を収容する上部［１６を通ってその中
へ入っており、下端部はｖｊ：街液１８を収容する第２
のＷ１１４の中に入っている。緩衝溶液は０．１Ｍのト
リス、０．１Ｍのホウ酸及び０．０５ ＭのＮａ２ＥＤ
ＴＡからなる溶液から得、最終ＰＨが約８．３である緩
ｉ液のようないず耽の好適な緩衝液であり得る。こうし
て、緩衝液はゲルと電気接触するためにスラブの両端で
ゲルと接触する。
この装置では、レポーター染料でｅ識されたＤＮＡ断片
を含む標本はゲル１１の上部に作られ、分離レーンを規
定する空洞１５中ヘビベツトで分注することができる。
を含む標本はゲル１１の上部に作られ、分離レーンを規
定する空洞１５中ヘビベツトで分注することができる。
梢１４及び槽１６には緩衝溶液１８及び２４が入ってい
る。電気回路は槽１４及び槽１６中のターミナル２０に
よって完結している。この特別な長さ及び厚さのゲルで
分離を得るためには適切な電界（通常５０■／■）が必
要である。ＤＮＡ断片を下方へ泳動させるために、正極
はスラブの下端に位置している。これらの条件下では断
片がゲル中を泳動するにつれ空間的にバンド（図示せず
）として分離される。
る。電気回路は槽１４及び槽１６中のターミナル２０に
よって完結している。この特別な長さ及び厚さのゲルで
分離を得るためには適切な電界（通常５０■／■）が必
要である。ＤＮＡ断片を下方へ泳動させるために、正極
はスラブの下端に位置している。これらの条件下では断
片がゲル中を泳動するにつれ空間的にバンド（図示せず
）として分離される。
ＤＮＡ断片がスラブ１０の底付近にある検出帯１９中へ
下方泳動したとき、これらのバンドは本発明のシステム
及び装置で検出される。この検出帯１９では適当な励起
波長のレーザービーム３２によってＤＮＡ断片が照射さ
れ、数個の断片に結合した異なるレポーターは検出可能
な光を出す、レポーター及びそれらとＤＮＡ断片との結
合は本発明の目的ではないので、このことは詳しくは記
載しない。
下方泳動したとき、これらのバンドは本発明のシステム
及び装置で検出される。この検出帯１９では適当な励起
波長のレーザービーム３２によってＤＮＡ断片が照射さ
れ、数個の断片に結合した異なるレポーターは検出可能
な光を出す、レポーター及びそれらとＤＮＡ断片との結
合は本発明の目的ではないので、このことは詳しくは記
載しない。
適切なレポーターの例は１０−バーらによって１９８６
年７月２日に出願された米国特許出願第８８１，７３２
号（ＩＰ−０５９７）に記載されている。
年７月２日に出願された米国特許出願第８８１，７３２
号（ＩＰ−０５９７）に記載されている。
発光最大値が、５０５，５１２，５１９及び５２６ｎｍ
の４つの蛍光染料を選択した。これらの最大値はゲル電
器泳動の環境中では多少シフトしがちである。これらの
発光特性は親化合物（９−カルボキシエチル−６−ヒド
ロキシ−３−オキソ−３Ｈ−−’ｒサンテン）の特定の
場所にメチル基のような適当な化学基を置換させること
によって得られる。調製したそれぞれ４つの染料は親化
合物の９位にサルコシニル基を共有結合させることによ
って得た反応活性カルボキシル基を有する。これは染料
と選択されたヌクレオチドを結合させるリンカ−中のア
ミン基と共有結合することができる。有用なリンカ−は
染料のカルボキシル基と共有結合することができる木端
アミノ基を含むアルキニルアミン誘導体である。好まし
いリンカ−はウラシル（Ｕ）もしくはシトシン（Ｃ）の
５位またはデアザグアニン（ｄ−Ｇ）もしくはデアザア
デニン（ｄ−Ａ）の７位に共有結合する３−アミノプロ
ピル誘導体である。
の４つの蛍光染料を選択した。これらの最大値はゲル電
器泳動の環境中では多少シフトしがちである。これらの
発光特性は親化合物（９−カルボキシエチル−６−ヒド
ロキシ−３−オキソ−３Ｈ−−’ｒサンテン）の特定の
場所にメチル基のような適当な化学基を置換させること
によって得られる。調製したそれぞれ４つの染料は親化
合物の９位にサルコシニル基を共有結合させることによ
って得た反応活性カルボキシル基を有する。これは染料
と選択されたヌクレオチドを結合させるリンカ−中のア
ミン基と共有結合することができる。有用なリンカ−は
染料のカルボキシル基と共有結合することができる木端
アミノ基を含むアルキニルアミン誘導体である。好まし
いリンカ−はウラシル（Ｕ）もしくはシトシン（Ｃ）の
５位またはデアザグアニン（ｄ−Ｇ）もしくはデアザア
デニン（ｄ−Ａ）の７位に共有結合する３−アミノプロ
ピル誘導体である。
本発明のシステムに用いられる適当なリンカー−ヌクレ
オチド誘導体は２−．３−−デオキシリボヌクレオチド
と蛍光染料の共有結合は未置換の２−．３−−ジデオキ
シヌクレオチドの鎖成長停止性を実質的に減少させない
ことが見出だされた。
オチド誘導体は２−．３−−デオキシリボヌクレオチド
と蛍光染料の共有結合は未置換の２−．３−−ジデオキ
シヌクレオチドの鎖成長停止性を実質的に減少させない
ことが見出だされた。
４つの染料−リンカー−選択されたジデオキシヌクレオ
チドＡ、Ｇ、Ｃ，Ｔを構造式によって明らかにする。
チドＡ、Ｇ、Ｃ，Ｔを構造式によって明らかにする。
これらはよく知られたＤＮＡ塩基配列決定方法であるサ
ンガー法の改良方法において、逆転写酵素（トリ骨髄芽
球ウィルス）の鎖成長停止物質として働くことがわかっ
た。古典的なサンガー法は始動物質、鍋形のＤＮＡ、Ｄ
ＮＡポリマラーゼＩ（フレノウ断片）、３つの標識され
ていないデオキシヌクレオチド及び１つの放射標識され
たデオキシヌクレオチドを４つのＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ。
ンガー法の改良方法において、逆転写酵素（トリ骨髄芽
球ウィルス）の鎖成長停止物質として働くことがわかっ
た。古典的なサンガー法は始動物質、鍋形のＤＮＡ、Ｄ
ＮＡポリマラーゼＩ（フレノウ断片）、３つの標識され
ていないデオキシヌクレオチド及び１つの放射標識され
たデオキシヌクレオチドを４つのＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ。
Ｔ、Ｇ）に対応する４つの２−．３−−ジデオキシヌク
レオチドのうち１つをそれぞれ含む４つの反応器中で用
いている。
レオチドのうち１つをそれぞれ含む４つの反応器中で用
いている。
ポリマラーゼが鍋形を複製する適切な反応条件は、始動
物質の３゛末端にヌクレオチドを付加することによって
作られる。多重反応が多くの始動物質複製上で同時に生
じ、各断片中の適当なヌクレオチドにおける放射標識を
含み、かつ上記４つのジデオキシヌクレオチドの１つに
おいて不可逆的に停止する長さが異なるＤＮＡ断片が生
成する。
物質の３゛末端にヌクレオチドを付加することによって
作られる。多重反応が多くの始動物質複製上で同時に生
じ、各断片中の適当なヌクレオチドにおける放射標識を
含み、かつ上記４つのジデオキシヌクレオチドの１つに
おいて不可逆的に停止する長さが異なるＤＮＡ断片が生
成する。
この断片の組は１つのレーンが４つのジデオキシヌクレ
オチド反応混合物の各々に対応する４つのレーン中でポ
リアクリルアミドの・スラブゲル電気泳動によって通常
分離される。断片を分離した後、写真用フィルムをゲル
上に置いて適当な条件下で露光させる。ＤＮＡ塩基配列
は、フィルム上の放射標識によって作られたバンドのパ
ターンを４つのレーンにおけるそれらの出現順序で読む
ことによって推察される。
オチド反応混合物の各々に対応する４つのレーン中でポ
リアクリルアミドの・スラブゲル電気泳動によって通常
分離される。断片を分離した後、写真用フィルムをゲル
上に置いて適当な条件下で露光させる。ＤＮＡ塩基配列
は、フィルム上の放射標識によって作られたバンドのパ
ターンを４つのレーンにおけるそれらの出現順序で読む
ことによって推察される。
これらの染料で標識されたターミネータ−を用いること
ができる改良型は、放射標識されたヌクレオチドを取除
き、標識されていない２−．３−一ジデオキシヌクレオ
チドの代わりに染料で標識された鎖ターミネータ−を用
いることを包含する。
ができる改良型は、放射標識されたヌクレオチドを取除
き、標識されていない２−．３−一ジデオキシヌクレオ
チドの代わりに染料で標識された鎖ターミネータ−を用
いることを包含する。
反応混合物（実際には単一反応成分を用いることができ
る）は４つのＤＮＡ塩基に各々に対応する発蛍光団で３
−末端が標識された断片を含むこととなる０反応器合物
を併せ、電気泳動的に分離する。塩基配列は蛍光の存在
によって現われ、時間的または空間的に分離されたバン
ドの順序によって推察される。それ故に、前述の蛍光染
料で標識されたジデオキシヌクレオチドは、本発明のシ
ステム及び方法で検出することができる好ましい密接し
た間隔を有する放射源である０本発明のシステム及び方
法で用いることができる他の発光源は、スミスらの出願
に記載された発蛍光団である。これらを用いるためには
、予め選択されたフィルターの周波数及び波長を有する
適当なレーザーを選択する必要がある。
る）は４つのＤＮＡ塩基に各々に対応する発蛍光団で３
−末端が標識された断片を含むこととなる０反応器合物
を併せ、電気泳動的に分離する。塩基配列は蛍光の存在
によって現われ、時間的または空間的に分離されたバン
ドの順序によって推察される。それ故に、前述の蛍光染
料で標識されたジデオキシヌクレオチドは、本発明のシ
ステム及び方法で検出することができる好ましい密接し
た間隔を有する放射源である０本発明のシステム及び方
法で用いることができる他の発光源は、スミスらの出願
に記載された発蛍光団である。これらを用いるためには
、予め選択されたフィルターの周波数及び波長を有する
適当なレーザーを選択する必要がある。
電気泳動スラブ１０のレーンを照射するための光学系を
第２図に示す、第２図のシステム及び装置は、どのよう
な蛍光または他の型のシステムにも用いられ、密接した
間隔の発光バンドを区別しその強度を測定できる。しか
しながら、プローバーらの出願に説明されているレポー
ター（染料）で標識されたＤＮＡ断片からの発光を検出
することを例にとって記載することとする。プローバー
らの出願に記載された染料は約５０５，５１２，５１９
及び５２６ ｎｍの最大発光波長を有している。
第２図に示す、第２図のシステム及び装置は、どのよう
な蛍光または他の型のシステムにも用いられ、密接した
間隔の発光バンドを区別しその強度を測定できる。しか
しながら、プローバーらの出願に説明されているレポー
ター（染料）で標識されたＤＮＡ断片からの発光を検出
することを例にとって記載することとする。プローバー
らの出願に記載された染料は約５０５，５１２，５１９
及び５２６ ｎｍの最大発光波長を有している。
この光字系は使用した発蛍光団の発光波長の関数として
決定した特定の波長を有する放射の励起ビーム３２を提
供するように選択されたレーザー３０を含む、プローバ
ーらによって開示された発蛍光染料と共に用いられる特
定の光源は、波長が４８８ｎｍ、光径が０．８ｍｍで約
５０ｍＷで作用するアルゴンイオンレーザ−である、ビ
ーム３２は励起フィルター３４を通過し、走査光学系３
６に向けられる。検出過程を妨害する不必要な励起波長
を阻止するようにフィルター３４を選択する。しかし、
スペクトル的に十分に純粋なレーザーに対しては、この
フィルターは省略してもよい。
決定した特定の波長を有する放射の励起ビーム３２を提
供するように選択されたレーザー３０を含む、プローバ
ーらによって開示された発蛍光染料と共に用いられる特
定の光源は、波長が４８８ｎｍ、光径が０．８ｍｍで約
５０ｍＷで作用するアルゴンイオンレーザ−である、ビ
ーム３２は励起フィルター３４を通過し、走査光学系３
６に向けられる。検出過程を妨害する不必要な励起波長
を阻止するようにフィルター３４を選択する。しかし、
スペクトル的に十分に純粋なレーザーに対しては、この
フィルターは省略してもよい。
走査光学系３６は、固定された支持体く図示せず）の上
に載せられたプリズムまたはｊｆｉ３８．非点収差のフ
ォーカスレンズ４０、第２のプリズム又は鏡４３、及び
筒状の光学系支持体４４を含み、これらすべてはステッ
プモーター４６のシャフトにマウントされている。ビー
ム３２は、操作光学系３６に入ると、まず初めにプリズ
ム３８によって下方へと向けられ光学系支持体４４の筒
状の開口部に入り、フォーカスレンズ４０を通過する。
に載せられたプリズムまたはｊｆｉ３８．非点収差のフ
ォーカスレンズ４０、第２のプリズム又は鏡４３、及び
筒状の光学系支持体４４を含み、これらすべてはステッ
プモーター４６のシャフトにマウントされている。ビー
ム３２は、操作光学系３６に入ると、まず初めにプリズ
ム３８によって下方へと向けられ光学系支持体４４の筒
状の開口部に入り、フォーカスレンズ４０を通過する。
プリズム３８はレーザーからのビームを走査光学系３６
へと向けるように働くため、レーザー３０に都合のよい
位置決めを容易にする、フォーカスレンズ４０を通過し
たビームは楕円状の点に集められる。この点の棲断面は
約０．２＋ｎｎ＋×１〜２ｎｍが好ましい、焦点の合っ
たビーム３２は第２のプリズム４３によって射出アパー
チャ４２へと向けられる。シャフト軸及びゲル１０の面
に対して垂直な面でビーム３２を角度的に走査させるよ
うに、ステップモーター４６を動かすことによってレン
ズ４０及びプリズム４３を回転させるように光学系支持
体４４をステップモーター４６のシャフトに設置する。
へと向けるように働くため、レーザー３０に都合のよい
位置決めを容易にする、フォーカスレンズ４０を通過し
たビームは楕円状の点に集められる。この点の棲断面は
約０．２＋ｎｎ＋×１〜２ｎｍが好ましい、焦点の合っ
たビーム３２は第２のプリズム４３によって射出アパー
チャ４２へと向けられる。シャフト軸及びゲル１０の面
に対して垂直な面でビーム３２を角度的に走査させるよ
うに、ステップモーター４６を動かすことによってレン
ズ４０及びプリズム４３を回転させるように光学系支持
体４４をステップモーター４６のシャフトに設置する。
このビーム３２は電気泳動スラブ１０の検出帯１９へと
向けられる。
向けられる。
レポーター物’Ｅｆ（ここでは蛍光染料で標識されたＤ
ＮＡ断片）が検出帯１９を通過するとき、スラブ１０に
入ったビーム３２はレポーター物質を励起させる。その
結果レポーター物質は励起波長からシフトされた波長で
蛍光を発する。プローバーらの出願に記載されている染
料の最大発光波長は、約５０５．５１２，５１９及び５
２６ｎｍであるが、このシステムは密接した間隔の発光
バンドを有する他の染料の組による波長も識別できる１
、更にまた、外部のフィルター及び光学系を最少限にで
きるのでレーザー光源が好ましいが、キセノンアークラ
ンプのような非コヒーレント光源を含む他の光源も用い
ることができる。
ＮＡ断片）が検出帯１９を通過するとき、スラブ１０に
入ったビーム３２はレポーター物質を励起させる。その
結果レポーター物質は励起波長からシフトされた波長で
蛍光を発する。プローバーらの出願に記載されている染
料の最大発光波長は、約５０５．５１２，５１９及び５
２６ｎｍであるが、このシステムは密接した間隔の発光
バンドを有する他の染料の組による波長も識別できる１
、更にまた、外部のフィルター及び光学系を最少限にで
きるのでレーザー光源が好ましいが、キセノンアークラ
ンプのような非コヒーレント光源を含む他の光源も用い
ることができる。
蛍光種によって放出される全放射エネルギーを増加させ
るために、反射面５０（第３図）を励起光源の逆側に置
くことができる。好ましい装置では、ゲルを支持又は含
有する外側のプレート１２の外側に鏡面を直接室いてい
る６発光種によって吸収されない励起光３２はプレート
１２を通過し、実質的に２倍量の励起光線を得るために
面５０によって後方へと反射される。さらに、蛍光断片
から発せられる光はすべての方向に向けて発射されるの
で反射面５０へ向かった光もまた同様に反射する。検出
することができる蛍光信号の正味の増加は、反射面を使
用しないときの約４倍である０反射面を提供する好まし
い方法は、ゲル１０を支持しているプレートの外側をコ
ーティングすることによって行なわれている。あるいは
また鏡をガラスの外面にすることもできるが、光が通過
する界面の数が多くなるので好ましくない散乱した励起
光線が生じてしまう、蛍光種によって発せられた放射エ
ネルギー又は光は、それぞれ上方及び下方に適当に設置
された２つの光検出器５２モジユール及び５４によって
集められる。これらの検出器モジュールは、これらの構
造の詳細が示されている第３図ではっきりと理解するこ
とができる。
るために、反射面５０（第３図）を励起光源の逆側に置
くことができる。好ましい装置では、ゲルを支持又は含
有する外側のプレート１２の外側に鏡面を直接室いてい
る６発光種によって吸収されない励起光３２はプレート
１２を通過し、実質的に２倍量の励起光線を得るために
面５０によって後方へと反射される。さらに、蛍光断片
から発せられる光はすべての方向に向けて発射されるの
で反射面５０へ向かった光もまた同様に反射する。検出
することができる蛍光信号の正味の増加は、反射面を使
用しないときの約４倍である０反射面を提供する好まし
い方法は、ゲル１０を支持しているプレートの外側をコ
ーティングすることによって行なわれている。あるいは
また鏡をガラスの外面にすることもできるが、光が通過
する界面の数が多くなるので好ましくない散乱した励起
光線が生じてしまう、蛍光種によって発せられた放射エ
ネルギー又は光は、それぞれ上方及び下方に適当に設置
された２つの光検出器５２モジユール及び５４によって
集められる。これらの検出器モジュールは、これらの構
造の詳細が示されている第３図ではっきりと理解するこ
とができる。
本発明ではビームの走査平面の上方及び下方に検出器５
２モジユール及び５４が置かれている。励起領域から直
接には由来しない迷光を取除くために、検出器モジュー
ルは遮光性である。それぞれの検出器は広い入射領域を
有する通常タイプの光電子増倍管（ＰＭＴ）５６を備え
ている。Ｊ当な光電子増倍管はハママツＲ１６１２であ
る。それぞれの検出器モジュール５２及び５４は、ＰＭ
Ｔとスラブゲル１０中の蛍光種のあいだに位置する別の
波長選択フィルター５８を有する。好ましくは、フィル
ター５８はウェストフォード、エムニーのバールアソシ
エーションから得ることができ、第４図に示したように
相補的な透過バンド特性を有する干渉フィルターを用い
るのがよい、フィルター５８は種からの発光６０に対し
て横断的（平均的に直角が好ましい）に設置する。この
配置により以下記載するとおりの最適効率で操作できる
。第４図の波形Ａによって表わされる透過特性を有する
、１つのフィルター５８は低い発光波長のほとんどを透
過させるが高い発光波長は透過させないということが示
されている。第４図の波形Ｂによって表わされる透過特
性を有するもう１つのフィルター５８は逆に、高い波長
のほとんどを通過させるが低い波長を通過させない。
２モジユール及び５４が置かれている。励起領域から直
接には由来しない迷光を取除くために、検出器モジュー
ルは遮光性である。それぞれの検出器は広い入射領域を
有する通常タイプの光電子増倍管（ＰＭＴ）５６を備え
ている。Ｊ当な光電子増倍管はハママツＲ１６１２であ
る。それぞれの検出器モジュール５２及び５４は、ＰＭ
Ｔとスラブゲル１０中の蛍光種のあいだに位置する別の
波長選択フィルター５８を有する。好ましくは、フィル
ター５８はウェストフォード、エムニーのバールアソシ
エーションから得ることができ、第４図に示したように
相補的な透過バンド特性を有する干渉フィルターを用い
るのがよい、フィルター５８は種からの発光６０に対し
て横断的（平均的に直角が好ましい）に設置する。この
配置により以下記載するとおりの最適効率で操作できる
。第４図の波形Ａによって表わされる透過特性を有する
、１つのフィルター５８は低い発光波長のほとんどを透
過させるが高い発光波長は透過させないということが示
されている。第４図の波形Ｂによって表わされる透過特
性を有するもう１つのフィルター５８は逆に、高い波長
のほとんどを通過させるが低い波長を通過させない。
最後に各検出器モジュール５２及び５４は、波長選択フ
ィルター５８と発光種のあいだに透過フィルター６２を
有する。これらのフィルターは逆にすることができる。
ィルター５８と発光種のあいだに透過フィルター６２を
有する。これらのフィルターは逆にすることができる。
各透過フィルター６２は所定の角度よりも大きな角度で
フィルターに入ってきた光を通過させない、２つの波長
選択フィルター５８によって、このシステムは密接した
間隔の発光スペクトルを識別できる。これら波長選択フ
ィルター５８に入射した光は透過、吸収又は反射する。
フィルターに入ってきた光を通過させない、２つの波長
選択フィルター５８によって、このシステムは密接した
間隔の発光スペクトルを識別できる。これら波長選択フ
ィルター５８に入射した光は透過、吸収又は反射する。
Ｇ５０５゜Ａ３１２．Ｃ５１９及びＴ５２６という４つ
の例として選択した染料の発光スペクトルを第４図に示
す、透過フィルター５８は、第４図に記載した曲ａＡ及
びＢに対応する相補的な透過特性を持つように選ばれて
いる。
の例として選択した染料の発光スペクトルを第４図に示
す、透過フィルター５８は、第４図に記載した曲ａＡ及
びＢに対応する相補的な透過特性を持つように選ばれて
いる。
２つのフィルター５８は、転移波長と共に４つの染料の
発光波長領域においておおよそ相補的な透過体波長特性
を有し、遷移波長は種放射エネルギースペクトル種の中
心又は中央付近で起こることがわかる。蛍光スペクトル
が短波長から長波長へとシフトしたとき、下方のフィル
ター５８（図に示しである）を通過した光に対する上方
のフィルター５８（図に示しである）を透過した光の割
合は連続的に変化する０本出願に最も適切なフィルター
は励起波長で高い相対透過性及び高い阻止性を有する干
渉フィルターである。これらのフィルターは本出願のた
めに選択された染料に適合するように選ばれているが、
上記原理に基づく他のフィルターの組を用いても染料の
紐を適切に識別できる。
発光波長領域においておおよそ相補的な透過体波長特性
を有し、遷移波長は種放射エネルギースペクトル種の中
心又は中央付近で起こることがわかる。蛍光スペクトル
が短波長から長波長へとシフトしたとき、下方のフィル
ター５８（図に示しである）を通過した光に対する上方
のフィルター５８（図に示しである）を透過した光の割
合は連続的に変化する０本出願に最も適切なフィルター
は励起波長で高い相対透過性及び高い阻止性を有する干
渉フィルターである。これらのフィルターは本出願のた
めに選択された染料に適合するように選ばれているが、
上記原理に基づく他のフィルターの組を用いても染料の
紐を適切に識別できる。
本出願では検出器及び対応するフィルターは比較的大き
な領域を有するものが選ばれる。検出器５６、好ましく
は光電子増倍管は公称１約８×３゜５ｃｍの大きい入口
窓を有する。こうして光収集において本来的に効率を低
下させ、散乱光の源となる映像光学系の必要なしに、ゲ
ルスラブ上の比較的大きい領域１９をモニターできる。
な領域を有するものが選ばれる。検出器５６、好ましく
は光電子増倍管は公称１約８×３゜５ｃｍの大きい入口
窓を有する。こうして光収集において本来的に効率を低
下させ、散乱光の源となる映像光学系の必要なしに、ゲ
ルスラブ上の比較的大きい領域１９をモニターできる。
このシステムでは多くの標本を高集光率で連続的にモニ
ターできるように発光種から約２〜３■の場所に検出器
５６を設置する。これらの条件下において検出器は大き
な立体入射角を有するものということができる。
ターできるように発光種から約２〜３■の場所に検出器
５６を設置する。これらの条件下において検出器は大き
な立体入射角を有するものということができる。
先に述べたように、このことは、通常、垂直（検出器に
対して）から大きく離れた、所望の散乱励起光線を透過
させることとなる。垂直から離れた角度ではフィルター
５８の堆積層（空洞）を通る経路の長さが大きく変化す
るし、短波長へフィルター特性がシフトするのでこのこ
とが起こる（フィルターに対して垂直より小さい入射角
ならば、バンド幅及び透過ピークの変化は小さくなる）
、標本はすべての方向に検出帯から放射するので、軸か
ら逸れた放射の検出は避けにくい、直角に近い角度で透
過フィルター５８に入射する光が望ましいが、発光種か
らある固定した距離間隔のある大きな検出器を用いるこ
とによって、発蛍光団から発せられた光と同様に散乱し
た励起光線は比較的平行な角度でフィルターの全表面に
当なってしまう。この光は特定のフィルター特性に関係
なくフィルターを透過する。
対して）から大きく離れた、所望の散乱励起光線を透過
させることとなる。垂直から離れた角度ではフィルター
５８の堆積層（空洞）を通る経路の長さが大きく変化す
るし、短波長へフィルター特性がシフトするのでこのこ
とが起こる（フィルターに対して垂直より小さい入射角
ならば、バンド幅及び透過ピークの変化は小さくなる）
、標本はすべての方向に検出帯から放射するので、軸か
ら逸れた放射の検出は避けにくい、直角に近い角度で透
過フィルター５８に入射する光が望ましいが、発光種か
らある固定した距離間隔のある大きな検出器を用いるこ
とによって、発蛍光団から発せられた光と同様に散乱し
た励起光線は比較的平行な角度でフィルターの全表面に
当なってしまう。この光は特定のフィルター特性に関係
なくフィルターを透過する。
本発明では、波長フィルター５８に当たる光が垂直に近
い角度の範囲に限定′されるようにフィルター５８と組
合わせた特殊透過フィルター６２を用いることによって
この問題点を解決している。除去値よりも大きい角度で
当たった光の大部分は反射若しくは吸収される。もし追
加的な除去が必要ならば、カラーフィルターガラス又は
その他の方法を用いた適当な障害物をこの発明に取付け
ることができる。透過フィルター６２として有用であり
、ある角度から離れた光を除去する能力を有する既知の
装置６２はマス、サウスブリッジ、にあるインコム（Ｉ
ＮＣＯＭ）によって製造されている。この装置は個々
の直径が１０ミクロンの光学ファイバーを互いに融着し
てしっかりとまとめた束から成る。
い角度の範囲に限定′されるようにフィルター５８と組
合わせた特殊透過フィルター６２を用いることによって
この問題点を解決している。除去値よりも大きい角度で
当たった光の大部分は反射若しくは吸収される。もし追
加的な除去が必要ならば、カラーフィルターガラス又は
その他の方法を用いた適当な障害物をこの発明に取付け
ることができる。透過フィルター６２として有用であり
、ある角度から離れた光を除去する能力を有する既知の
装置６２はマス、サウスブリッジ、にあるインコム（Ｉ
ＮＣＯＭ）によって製造されている。この装置は個々
の直径が１０ミクロンの光学ファイバーを互いに融着し
てしっかりとまとめた束から成る。
所望の厚さの光字要素を作るために束を横断的に切断す
る。要素中の各々のファイバーは公称的０．３５の開口
数を有するので±２１度以内で当たった光のみが透過で
きる。受入れられる角度よりも大きい角度で当たった光
は第１の面反射によって除去されるか又は透過ファイバ
ーのクラッド層を通過する。クラッド層内を通過した光
は次の近接しているファイバーを同じように通過して、
最後にプレートの反対面に到達して、もとの入射角と同
様の角度で出ていく、この光はモジュール５２及び５４
の各々の波長フィルター５８に望ましくない角度で当り
、設計されたフィルター特性を避ける。ファイバープレ
ート中を透過するこの型の光を取除くために、３〜６％
の「余分の壁吸収体（ｅｘｔｒａｌｕｒａｌ ａｂｓｏ
ｒｂｅｒ） Ｊ （ＥＭＡ）ファイバーを束のいたる
ところに均等に分散させる。これらのファイバーの標準
的な分配は光学ファイバーの壁を通過した光を測的に弱
めるが、プレート中の個々のファイバー中を伝搬する内
部の反射光には壽響しない吸収障壁を生成する。
る。要素中の各々のファイバーは公称的０．３５の開口
数を有するので±２１度以内で当たった光のみが透過で
きる。受入れられる角度よりも大きい角度で当たった光
は第１の面反射によって除去されるか又は透過ファイバ
ーのクラッド層を通過する。クラッド層内を通過した光
は次の近接しているファイバーを同じように通過して、
最後にプレートの反対面に到達して、もとの入射角と同
様の角度で出ていく、この光はモジュール５２及び５４
の各々の波長フィルター５８に望ましくない角度で当り
、設計されたフィルター特性を避ける。ファイバープレ
ート中を透過するこの型の光を取除くために、３〜６％
の「余分の壁吸収体（ｅｘｔｒａｌｕｒａｌ ａｂｓｏ
ｒｂｅｒ） Ｊ （ＥＭＡ）ファイバーを束のいたる
ところに均等に分散させる。これらのファイバーの標準
的な分配は光学ファイバーの壁を通過した光を測的に弱
めるが、プレート中の個々のファイバー中を伝搬する内
部の反射光には壽響しない吸収障壁を生成する。
第２図及び第３図に戻る。それぞれのフィルターシステ
ム６２−５８を透過した光はそれぞれの検出器５６に向
けられる。検出器からの電気信号は個々の前置増幅器６
６、６８を経由してアナログをデジタルに換えるそれぞ
れ（Ａ／Ｄ＞変換器７０．７２へと進み、そこからシス
テムコントローラー８０に入る。
ム６２−５８を透過した光はそれぞれの検出器５６に向
けられる。検出器からの電気信号は個々の前置増幅器６
６、６８を経由してアナログをデジタルに換えるそれぞ
れ（Ａ／Ｄ＞変換器７０．７２へと進み、そこからシス
テムコントローラー８０に入る。
システムコントローラーの働きはアイビーエムピーシ−
（ＩＢＮＰＣ）のような小型コンピューターによってな
される。流れ図第４Ａ、４Ｂ及び４０図に記載されてい
るシステムコントローラー３０の機能は他の制御動作の
中でもとりわけ、２つの信号の関数（それぞれ異なる発
光波長でのＰＭＴ５８上での発光強度）の比を計算する
ことである。波長フィルター６２は１つの検出器からの
波長、すなわち波長が短くなればなるほど振幅が小さく
なり波長が長くなればなるほど振幅が大きくなるという
異なる波長領域の個々の波長内の信号強度を変調する。
（ＩＢＮＰＣ）のような小型コンピューターによってな
される。流れ図第４Ａ、４Ｂ及び４０図に記載されてい
るシステムコントローラー３０の機能は他の制御動作の
中でもとりわけ、２つの信号の関数（それぞれ異なる発
光波長でのＰＭＴ５８上での発光強度）の比を計算する
ことである。波長フィルター６２は１つの検出器からの
波長、すなわち波長が短くなればなるほど振幅が小さく
なり波長が長くなればなるほど振幅が大きくなるという
異なる波長領域の個々の波長内の信号強度を変調する。
前述した通りフィルターは相補的な特性を有するため逆
も正しい。
も正しい。
このように染料で標識したＤＮＡ断片のような発光種が
スラブゲル中で空間的に分離したあとスラブゲル１０中
の検出帯１つを通過するので、その発光スペクトルは発
光波長及び時間（スラブゲル１０中を移動するので）の
関数として振幅が変化する２つの信号を発生する（１つ
は各検出器５６の出力）、振幅が変調された光信号は、
この時点において電気信号に変換され、ついでこの信号
は上記の処理のためにデジタル化される。変ＩＡ後、２
つのデジタル信号の関数の比率をとる、すなわち各発蛍
光団の蛍光の第１及び第２の１８号の商を得る。信号の
比率の大きさは発光種の同定の指標となる。
スラブゲル中で空間的に分離したあとスラブゲル１０中
の検出帯１つを通過するので、その発光スペクトルは発
光波長及び時間（スラブゲル１０中を移動するので）の
関数として振幅が変化する２つの信号を発生する（１つ
は各検出器５６の出力）、振幅が変調された光信号は、
この時点において電気信号に変換され、ついでこの信号
は上記の処理のためにデジタル化される。変ＩＡ後、２
つのデジタル信号の関数の比率をとる、すなわち各発蛍
光団の蛍光の第１及び第２の１８号の商を得る。信号の
比率の大きさは発光種の同定の指標となる。
実際に各染料の振幅信号の比率によって、すぐに区別で
きる集合体又は分属を識別することができる。
きる集合体又は分属を識別することができる。
ここで用いた「密接した間隔Ｊという染料又は発蛍光団
の発光特性を表わす用語はいくらか相対的な用語である
。染料の発光中心間の最小距雛というのは、隣接したい
ずれの２つの染料について２つの検出器からの信号の比
率の相違を固有のシステムノイズを越えて識別すること
ができるほど十分に大きい。
の発光特性を表わす用語はいくらか相対的な用語である
。染料の発光中心間の最小距雛というのは、隣接したい
ずれの２つの染料について２つの検出器からの信号の比
率の相違を固有のシステムノイズを越えて識別すること
ができるほど十分に大きい。
染料検出の選択性を改善するために、フィルター特性を
さらに最適化することができる。これは異なる染料発光
スペクトルにわたって実質的に変化する特性を有するフ
ィルターを選択することによってできる。しかし、密接
した間隔の染料群を識別するためには、異なる発光スペ
クトルに対する２つのフィルターにおける信号の比率の
変化を一様に分配するために、染料発光の群の中心波長
付近で起こる比較的鋭いフィルター遷移性を有するフィ
ルターが好ましい、前述した通り干渉フィルターの特異
性のために、個々のフィルター特性は干渉フィルターの
垂線に対して、光学繊維フェースプレート出カフラック
スの入射角を代かに変えることによって非常に良くする
ことができる。
さらに最適化することができる。これは異なる染料発光
スペクトルにわたって実質的に変化する特性を有するフ
ィルターを選択することによってできる。しかし、密接
した間隔の染料群を識別するためには、異なる発光スペ
クトルに対する２つのフィルターにおける信号の比率の
変化を一様に分配するために、染料発光の群の中心波長
付近で起こる比較的鋭いフィルター遷移性を有するフィ
ルターが好ましい、前述した通り干渉フィルターの特異
性のために、個々のフィルター特性は干渉フィルターの
垂線に対して、光学繊維フェースプレート出カフラック
スの入射角を代かに変えることによって非常に良くする
ことができる。
多くの場合、レーザーの励起波長と最も近接した通過体
域を有する波長フィルターに対しては透過フィルター６
２の余分の壁吸収が他の透過フィルターよりも必要であ
る。励起レーザーを４８８μｍで動作させる本実施例に
おいて、透過帯域（ρａＳＳｂａｎｄ ） Ａ （第４
図）を有する波長フィルター５８は、透過帯域Ｂ（第４
図）を有する波長フィルター５８に用いる２倍のＥＭＡ
を有する透過フィルター６２が必要である。ある場合で
は、ただ１つの透過フィルターが必要なだけである。
域を有する波長フィルターに対しては透過フィルター６
２の余分の壁吸収が他の透過フィルターよりも必要であ
る。励起レーザーを４８８μｍで動作させる本実施例に
おいて、透過帯域（ρａＳＳｂａｎｄ ） Ａ （第４
図）を有する波長フィルター５８は、透過帯域Ｂ（第４
図）を有する波長フィルター５８に用いる２倍のＥＭＡ
を有する透過フィルター６２が必要である。ある場合で
は、ただ１つの透過フィルターが必要なだけである。
（システムコントロール）
システムコントロラー８０はＡ／Ｄコンバーター７０及
び７２から受信したデジタル信号をＤＮＡ塩基配列情報
に変換する。多くの場合、これはリアルタイムでプログ
ラムを実行するコンピューターによって行なわれる。こ
れは、検出器からの生データの獲得と同時にデータが処
理され、配列情報が決定されることを意味する。
び７２から受信したデジタル信号をＤＮＡ塩基配列情報
に変換する。多くの場合、これはリアルタイムでプログ
ラムを実行するコンピューターによって行なわれる。こ
れは、検出器からの生データの獲得と同時にデータが処
理され、配列情報が決定されることを意味する。
概念的にシステムコントローラーの操作はデーター獲得
又は入力、データー解析及び出力の３つの相互に関連す
る過程に分解できる。各過程はデータを共有することに
よりおよびそれらを「同期」に保つタイミング情報を共
有することにより相互作用する。これらの相互作用がど
のくらい達成されるかということの詳細は選択する言語
及びハードウェアーに依存するがこれらのことは基本的
な関心事ではない。
又は入力、データー解析及び出力の３つの相互に関連す
る過程に分解できる。各過程はデータを共有することに
よりおよびそれらを「同期」に保つタイミング情報を共
有することにより相互作用する。これらの相互作用がど
のくらい達成されるかということの詳細は選択する言語
及びハードウェアーに依存するがこれらのことは基本的
な関心事ではない。
ＤＮＡ塩基配列情報を得るためにこのように行なわれる
データは獲得及び処理は第５Ａ図、第５Ｂ図及び第５０
図中のフローチャートを参照することによって最もよく
解釈することができる。これらの図は走査型蛍光検出シ
ステムがらの生の検出器入力が出力、すなわち標本のＤ
ＮＡ塩基配列に変換される一般的な方法を表わしている
。この論文での用語の意味を以下に示す。
データは獲得及び処理は第５Ａ図、第５Ｂ図及び第５０
図中のフローチャートを参照することによって最もよく
解釈することができる。これらの図は走査型蛍光検出シ
ステムがらの生の検出器入力が出力、すなわち標本のＤ
ＮＡ塩基配列に変換される一般的な方法を表わしている
。この論文での用語の意味を以下に示す。
１、ｉは得ようとしている現在のデータポイントのイン
デックスである。このポイントは時間ｔ（ｉ）分で得ら
れる。
デックスである。このポイントは時間ｔ（ｉ）分で得ら
れる。
２、にはｔ（ｋ）分で取られた処理しようとする現在の
データポイントのインデックスである。
データポイントのインデックスである。
一般的なデータ処理では、ｋはｉと等しい必要はない、
すなわちデータ処理はデータ獲得よりも遅れてもよい。
すなわちデータ処理はデータ獲得よりも遅れてもよい。
３、ｔ（ｉ）はデータが得られたタイムポイントの配列
である。例： ｔ （５）＝６．２分というのは操作開
始ｔ＆６．２分で得られた５番目のデータポイントを表
わしている。
である。例： ｔ （５）＝６．２分というのは操作開
始ｔ＆６．２分で得られた５番目のデータポイントを表
わしている。
４、Ｄｉ （ｉ）は１番目の検出器がらのデータの配列
を表わしている。
を表わしている。
５、Ｄ２ （ｉ）は２番目の検出器からのデータの配列
を表わしている。
を表わしている。
６、Ｊは検出されたピークのカウントである。
７、Ｎは与えられたピークを横切るデータポイントの数
を表わす。
を表わす。
８、ｍはＤＩ （ｔ）又はＤ２（１）のいずれか一方に
おける規定されたピークを横切るポイントを表わす。
おける規定されたピークを横切るポイントを表わす。
９、Ｗは検出器出力ＤＩ （ｉ）及びＤ２（ｉ）の関数
（例えば比率）であり、その値は所定のピークに対応す
るＤＮＡ塩基を同定する。
（例えば比率）であり、その値は所定のピークに対応す
るＤＮＡ塩基を同定する。
（データ獲得）
シングルチャンネルのための一般的なデータ獲得過程を
フローチャート５Ａに示す、現在獲得されたデータを示
すインデックスｉは初期化されている。プログラムはど
のくらいの時間、操作が進むかを決定する入力、すなわ
ちデータポイント■（トータル）の総数を受入れる。生
データ配列ＤＩ及びＤ２の初期化後、過程は獲得ループ
に入る。
フローチャート５Ａに示す、現在獲得されたデータを示
すインデックスｉは初期化されている。プログラムはど
のくらいの時間、操作が進むかを決定する入力、すなわ
ちデータポイント■（トータル）の総数を受入れる。生
データ配列ＤＩ及びＤ２の初期化後、過程は獲得ループ
に入る。
データは検出器から読まれ、デジタル化され、検出器５
２及び検出器５４によるＤｉ （ｉ）及びＤ２（ｉ）の
配列中に置かれ、時間ｔ（ｉ）で得られる（本論議の目
的のため、２つの解読は同時に行なわれる）、この点に
おいて、インデックスｉはインクリメントされＩ（）−
タル）と比較される。
２及び検出器５４によるＤｉ （ｉ）及びＤ２（ｉ）の
配列中に置かれ、時間ｔ（ｉ）で得られる（本論議の目
的のため、２つの解読は同時に行なわれる）、この点に
おいて、インデックスｉはインクリメントされＩ（）−
タル）と比較される。
ｌがＩ（トータル）より小さいときは獲得ループを繰り
返す、ｌがＩ（トータル）と等しいときは操作は停止す
る。より入念な計画では、そのプログラムは操作の個々
のピークでの数個の性能パラメーター（信号／ノイズ比
、ピーク分解能又は塩基割当てにおける不確定さ等）を
測定することによって自動的にいつ操作を終了させるか
を感知できる。もしこのような因子の組合わせが予め設
定された基準に合致しないならば、操作をコンピュタ−
によって停止させる。
返す、ｌがＩ（トータル）と等しいときは操作は停止す
る。より入念な計画では、そのプログラムは操作の個々
のピークでの数個の性能パラメーター（信号／ノイズ比
、ピーク分解能又は塩基割当てにおける不確定さ等）を
測定することによって自動的にいつ操作を終了させるか
を感知できる。もしこのような因子の組合わせが予め設
定された基準に合致しないならば、操作をコンピュタ−
によって停止させる。
最初のデータ入力は検出器からの生データであり、出力
は獲得過程及びデータ回折過程間に共有されるＤｉ （
ｉ）及びＤ２（Ｌ）のデータ配列中に蓄えられる。この
計画は第５Ｂ図に図式で表わしている。この２つのプロ
グラムは独立的かつ同時に動くが、あるコントロール情
報は適切なタイミングを維持するために２つのプログラ
ム間を通過しなければならない６例えば処理段階は存在
しないデータを処理するためにあるので、この段階は獲
得段階に追いつくことを許すことはできない。
は獲得過程及びデータ回折過程間に共有されるＤｉ （
ｉ）及びＤ２（Ｌ）のデータ配列中に蓄えられる。この
計画は第５Ｂ図に図式で表わしている。この２つのプロ
グラムは独立的かつ同時に動くが、あるコントロール情
報は適切なタイミングを維持するために２つのプログラ
ム間を通過しなければならない６例えば処理段階は存在
しないデータを処理するためにあるので、この段階は獲
得段階に追いつくことを許すことはできない。
（解析）
第５Ｂ図及び第５Ｃ図に示したデータ処理のアルゴリズ
ムは、染料で標識された種を検出及び同定する一般的な
方法の例である。これはずべてを包含するということを
意味していない、むしろ、これは実際の解析プログラム
を完成するのに必要である主要な特徴を説明するもので
あり、本発明の好ましい態様の一実施例である。
ムは、染料で標識された種を検出及び同定する一般的な
方法の例である。これはずべてを包含するということを
意味していない、むしろ、これは実際の解析プログラム
を完成するのに必要である主要な特徴を説明するもので
あり、本発明の好ましい態様の一実施例である。
処理インデックスｋ（Ｗ得インデックス１とは異なる）
を初期化後、プログラムは獲得過程によって与えられた
データ配列からデータＤｉ（１＜）及びＤ２ （ｋ）を
読取る単純なループへ入る。プログラムは現在のポイン
トがピーク上にあるかどうかを問う、この状態を決定で
きる多くのアルゴリズムが存在するが、そのｊｆＡＩＢ
はここでは必要ない、「ピーク」という用語は一般的な
意味である。
を初期化後、プログラムは獲得過程によって与えられた
データ配列からデータＤｉ（１＜）及びＤ２ （ｋ）を
読取る単純なループへ入る。プログラムは現在のポイン
トがピーク上にあるかどうかを問う、この状態を決定で
きる多くのアルゴリズムが存在するが、そのｊｆＡＩＢ
はここでは必要ない、「ピーク」という用語は一般的な
意味である。
Ｄｌのピークは通常Ｄ２のピークを伴う、しかし、染料
の種類に依存して、これら２つのチャンネルのピークは
それらの強度はかなり異なる。しかし、これらは時間に
おいて一致する。それ故に２つの信号の加重平均、２つ
の信号のうち強い信号又はその他のＤＩ （ｋ）及びＤ
２ （ｋ）の複合をその時間の「ピーク」として定義す
るために用いられる。
の種類に依存して、これら２つのチャンネルのピークは
それらの強度はかなり異なる。しかし、これらは時間に
おいて一致する。それ故に２つの信号の加重平均、２つ
の信号のうち強い信号又はその他のＤＩ （ｋ）及びＤ
２ （ｋ）の複合をその時間の「ピーク」として定義す
るために用いられる。
もし現在の処理ポイントがピークにないならば、インデ
ックスにはインクリメントされ獲得インデックスｉと比
較される。ｋが■（トータル）と等しいときは操作は終
了してプログラムは停止する。
ックスにはインクリメントされ獲得インデックスｉと比
較される。ｋが■（トータル）と等しいときは操作は終
了してプログラムは停止する。
ｋが１よりも小さいときは、次のデータポイントがＤｌ
、Ｄ２の配列から取出され、ループが再び実行される。
、Ｄ２の配列から取出され、ループが再び実行される。
ｋがｉと等しいときは処理がデータ獲得に追いついたこ
とを意味する。この場合、処理プログラムは少しのあい
だ（通常１秒）待ち、更に処理ができるようになるまで
ｋ及びｉの値を再びテストする。
とを意味する。この場合、処理プログラムは少しのあい
だ（通常１秒）待ち、更に処理ができるようになるまで
ｋ及びｉの値を再びテストする。
もし現在の処理ポイントがピークにあるならば、インデ
ックスｍはインクリメントされる。インデックスｍは現
在のピークを横切るポイント数を数える。ＤＩ（ｋ）及
びＤ２ ＜ｋ）値はそれぞれＤｌピーク＜ｍ）及びＤ２
ピーク〈ｍ）と呼ばれる一時的な配列に置かれる。そし
てプログラムは現在のポイントがピークの最後のポイン
トかどうかテストする。もしこれがピーク上のｆ＆ｔ＆
のポイントでない場合、プログラムコントロールはｋを
インクリメントされ、ｉに対するその値をテストし、Ｄ
ｌ及びＤ２配列からの次の対をなしたデータを解読する
上部のループへ戻る。
ックスｍはインクリメントされる。インデックスｍは現
在のピークを横切るポイント数を数える。ＤＩ（ｋ）及
びＤ２ ＜ｋ）値はそれぞれＤｌピーク＜ｍ）及びＤ２
ピーク〈ｍ）と呼ばれる一時的な配列に置かれる。そし
てプログラムは現在のポイントがピークの最後のポイン
トかどうかテストする。もしこれがピーク上のｆ＆ｔ＆
のポイントでない場合、プログラムコントロールはｋを
インクリメントされ、ｉに対するその値をテストし、Ｄ
ｌ及びＤ２配列からの次の対をなしたデータを解読する
上部のループへ戻る。
もし現在のポイントがピーク上の最後の点ならば、ピー
クカウンターはインクリメントされ、プログラムはピー
クを同定するために進行する。結果はＤＮＡ塩基配列中
の次の塩基と同一である。
クカウンターはインクリメントされ、プログラムはピー
クを同定するために進行する。結果はＤＮＡ塩基配列中
の次の塩基と同一である。
プログラムは入力データとしてＤ１ビーク（ｍ）及びＤ
２ビーク（ｍ＞配列を用いて、前述の通り現在のピーク
のために関数Ｗを計算する。各ヌクレオチド塩基は特徴
的なＷを与えるピーク対に関連ずけられる。このように
このピークについてのＷ値に基づいてプログラムは出力
としてＤＮＡ塩基Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇを与える。ピークポイ
ントインデックスｍ、ＤＩピーク及びＤ２と−クはＯに
戻され、プログラムは第５Ｂ図に示した上部のデータ獲
得ループに再び入る。
２ビーク（ｍ＞配列を用いて、前述の通り現在のピーク
のために関数Ｗを計算する。各ヌクレオチド塩基は特徴
的なＷを与えるピーク対に関連ずけられる。このように
このピークについてのＷ値に基づいてプログラムは出力
としてＤＮＡ塩基Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇを与える。ピークポイ
ントインデックスｍ、ＤＩピーク及びＤ２と−クはＯに
戻され、プログラムは第５Ｂ図に示した上部のデータ獲
得ループに再び入る。
上の方法は多重標本走査にまで広げることができる。多
重チャンネル装置では、レーザー光線は第５Ａ図のデー
タ獲得ループに再び入ってくる前に次の標本の位置に移
動する。加えて、別々のデータ配列（例えばレーンＡ、
Ｂ、、、にのＤＩＡ（ｉ）、ＤＩＲ（ｉ）、、、Ｄｌｋ
（ｉ）及びＤ２Ａ（ｉ）、Ｄ２Ｂ（ｉ）、、、Ｄ２ｋ
（ｉ））は個々のレーン又は標本の位置に割当てられる
。
重チャンネル装置では、レーザー光線は第５Ａ図のデー
タ獲得ループに再び入ってくる前に次の標本の位置に移
動する。加えて、別々のデータ配列（例えばレーンＡ、
Ｂ、、、にのＤＩＡ（ｉ）、ＤＩＲ（ｉ）、、、Ｄｌｋ
（ｉ）及びＤ２Ａ（ｉ）、Ｄ２Ｂ（ｉ）、、、Ｄ２ｋ
（ｉ））は個々のレーン又は標本の位置に割当てられる
。
データ獲得及び処理は前述したのと同様に、順次各レー
ンについて進行する。
ンについて進行する。
第１図は複数の標本を入れる窪みとレーンを表わす電気
泳動スラブゲルの燈台の概観である。 第２図は近接した広さの波長であるが異なるエネルギー
を発する異なる発光種からの放射エネルギーの存在を検
出する本発明に従って構成したシステム配置の一部分を
表わした図である。 第３図は放射エネルギーの存在を検出するための検出器
／フィルター装置の側面図である。 第４図は波長の関数としての相補的なフィルター透過特
性を表わしたグラフである。 第５Ａ図、第５Ｂ図及び第５Ｃ図は本発明のシステムを
用いたＤＮＡ断片塩基配列を得るために用いたルーチン
及びサブルーチンを記載した流れ図である。 Ｔｏ、、、スラブゲル １８，２４．、、緩衝液槽 ３
０．、。 レーザー ４０．、、フォーカスレンズ４６、 、 、
ステップモーター ５２．５４． 、 、光検出器モジ
ュール 出願人代理人 弁理士 鈴江武彦 Ｇ、５０．５ Ａ２Ｂ Ｃ５１，９’Ｉ’５２６ｊ崎
良Ｃｎｒｎ＞
泳動スラブゲルの燈台の概観である。 第２図は近接した広さの波長であるが異なるエネルギー
を発する異なる発光種からの放射エネルギーの存在を検
出する本発明に従って構成したシステム配置の一部分を
表わした図である。 第３図は放射エネルギーの存在を検出するための検出器
／フィルター装置の側面図である。 第４図は波長の関数としての相補的なフィルター透過特
性を表わしたグラフである。 第５Ａ図、第５Ｂ図及び第５Ｃ図は本発明のシステムを
用いたＤＮＡ断片塩基配列を得るために用いたルーチン
及びサブルーチンを記載した流れ図である。 Ｔｏ、、、スラブゲル １８，２４．、、緩衝液槽 ３
０．、。 レーザー ４０．、、フォーカスレンズ４６、 、 、
ステップモーター ５２．５４． 、 、光検出器モジ
ュール 出願人代理人 弁理士 鈴江武彦 Ｇ、５０．５ Ａ２Ｂ Ｃ５１，９’Ｉ’５２６ｊ崎
良Ｃｎｒｎ＞
Claims (27)
- （１）時間的及び／又は空間的に分離した後に異なる種
からの放射エネルギーの存在を検出し、該種を同定する
ための装置であって、第一の意味で該種の性質の関数と
して振幅が変化する第１の信号を発生するための、該種
から放射された放射エネルギーに応答する第１の検出手
段と、該種の性質の関数として第一の意味とは異なる第
二の意味で振幅が変化する第２の信号を発生するための
、放射エネルギーに応答する第２の手段と、該第１の信
号と第２信号の関数の比に対応し、振幅が該種のそれぞ
れの同定の指標となる第３の信号を得るための該第１の
信号と第２の信号に応答する第三の手段とを有し、該第
１及び第２の検出手段が各々、 該第１の信号及び第２の信号の一方を発生するための該
種からの放射エネルギーを受けるように該種に近接した
位置に設置された大きな立体入射角を有する検出器、及
び それぞれの検出器と該種のあいだに設置され、それぞれ
相補的な透過対波長特性を有する波長選択フィルター手
段を含み、 該第１及び第２の検出手段の一方が所定の値よりも大き
な角度で透過手段に入射した放射エネルギーを透過させ
ないための透過フィルター手段を含むことを特徴とする
装置。 - （２）種の励起領域内に波長を有する放射エネルギーで
あるレーザービームを種に指向させるレーザーを含む請
求項１記載の装置。 - （３）透過フィルターが、レーザー光線放射エネルギー
の波長に最も近い透過帯を有する波長フィルター手段を
伴う請求項２記載の装置。 - （４）レーザーからの放射エネルギーにより励起される
ように位置し、発光物質で標識されたＤＮＡ断片もしく
は他の分子を分離する手段を含む請求項３記載の装置。 - （５）放射エネルギーにより励起されるように位置し、
発光物質で標識されたＤＮＡ断片もしくは他の分子を分
離する手段を含む請求項２記載の装置。 - （６）第１及び第２の検出手段が、放射エネルギーであ
るレーザービームが伝播する領域の反対側に設置された
請求項４記載の装置。 - （７）レーザーからの放射エネルギーにより励起される
ように位置し、発光物質で標識されたＤＮＡ断片もしく
は他の分子を分離する手段を含む請求項１記載の装置。 - （８）第１及び第２の検出手段が、放射エネルギーであ
るレーザービームが伝播する領域の反対側に設置された
請求項２記載の装置。 - （９）種を順次励起させるために、分離手段を横切って
放射エネルギーであるレーザービームを掃引する手段を
包含する請求項８記載の装置。 - （１０）波長選択フィルターが、種の放射エネルギース
ペクトルの真中付近に中心を有する、透過対波長特性の
中に遷移を有する請求項９記載の装置。 - （１１）透過フィルターが、第１及び第２検出器に対し
て横断して平行母線を有するように設置された複数の光
学繊維の中に別の壁吸収体を有する請求項１０記載の装
置。 - （１２）第１及び第２の応答手段と種のあいだにレンズ
が存在しないことを特徴とする請求項１１記載の装置。 - （１３）透過フィルターの拒絶角の所定の値が約２２度
である請求項１１記載の装置。 - （１４）第１及び第２の検出手段が励起放射を含む領域
の反対側に設置されている請求項１記載の装置。 - （１５）種を順次励起させるために、分離手段を横切っ
て放射エネルギーであるレーザービームを掃引する手段
を包含する請求項１４記載の装置。 - （１６）波長選択フィルターが、種の放射エネルギース
ペクトルの真中付近に中心を有する、透過対波長特性の
中に遷移を有する請求項１５記載の装置。 - （１７）各検出手段が透過フィルター手段を有する請求
項１記載の装置。 - （１８）波長選択フィルターが、種の放射エネルギース
ペクトルの真中付近に中心を有する、透過対波長特性の
中に遷移を有する請求項１７記載の装置。 - （１９）透過フィルターが、第１及び第２検出器に対し
て横断して平行母線を有するように設置された複数の光
学繊維の中に別の壁吸収体を有する請求項１８記載の装
置。 - （２０）透過フィルターが、第１及び第２検出器に対し
て横断して平行母線を有するように設置された複数の光
学繊維の中に別の壁吸収体を有する請求項１記載の装置
。 - （２１）種類に従って異なる蛍光種で標識されたＤＮＡ
断片その他の分子から発する蛍光放射の存在を検出する
ための装置であって、空間的に該分子を分離するのに適
合した分離手段、 分離手段を横切って第１面内で放射エネルギーのビーム
掃引して該種を励起するための、レーザーを含む手段、 該種からの蛍光を第１の信号及び第２の信号に変換する
ための、該第１面の反対側に設置された大きな立体入射
角有する第１及び第２の光検出器、各々の光検出器と分
離手段のあいだに設置された相補的な透過−波長特性を
有する第１及び第２の波長フィルター、 所定の値より大きな角度で光検出器に入射した光を拒絶
するための、各々の光検出器の１つとその分離手段のあ
いだに設置した透過フィルター及び 第１の信号と第２の信号の関数の比に対応し、発蛍光種
の同定指標となる第３の信号を発生するための、第１の
信号と第２の信号に応答する手段を具備したことを特徴
とする装置。 - （２２）波長選択フィルターが、種の放射エネルギース
ペクトルの真中付近に中心を有する、透過対波長特性の
中に遷移を有する請求項２１記載の装置。 - （２３）透過フィルターが、第１及び第２検出器に対し
て横断して平行母線を有するように設置された複数の光
学繊維の中に別の壁吸収体を有する請求項２２記載の装
置。 - （２４）第１及び第２の検出手段と発光種のあいだにレ
ンズが存在しないことを特徴とする請求項２３記載の装
置。 - （２５）透過フィルターの拒絶角の所定の値が約２２度
である請求項２４記載の装置。 - （２６）透過フィルターが、第１及び第２検出器に対し
て横断して平行母線を有するように設置された複数の光
学繊維の中に別の壁吸収体を有する請求項２１記載の装
置。 - （２７）第１及び第２の検出手段と発光種のあいだにレ
ンズが存在しないことを特徴とする請求項２１記載の装
置。
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