JPS6321556A

JPS6321556A - Ｄｎａ塩基配列決定装置

Info

Publication number: JPS6321556A
Application number: JP61164647A
Authority: JP
Inventors: Hideki Kanbara; 秀記神原; Tetsuo Nishikawa; 哲夫西川
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1986-07-15
Filing date: 1986-07-15
Publication date: 1988-01-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はＤＮＡ上の塩基配列を迅速に決定するＤ　Ｎ　
Ａ塩基配列決定装置に関するものである。

［従来の技術］ＤＮＡ上の塩基配列決定には従来オートラジオグラフィ
ーが用いられてきた。すなわち第４図に示すように配列
決定をしようとするＤＮＡ１の両末端をａ、ｂとすると
、まずａを持ちアデニン塩基Ａの所で切断された一部の
ＤＮＡファミリーを炸裂する。他の３種の塩基チミン（
Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グラニン（Ｇ）についても同様
のファミリー２を得る。これらを放射性リンでラベルし
ておき、泳動ゲル３を有するゲル電気泳動にかけるが、
ＤＮＡ断片５をファミリー毎に異なる泳動レーン上を泳
動方向４に泳動させる。泳動終了後に写真フィルムにパ
ターンを転写し、オートラジオグラムを得る。これを泳
動速度が早く泳動距離の長い順に読んでゆけば配列６が
決定できる。しかし、この方法ではラジオアイソトープ
を使用する必要があり、手間と時間がかかる難点があっ
た。

そこでラジオアイソトープ標識に代わって蛍光体でラベ
ルする方式が検討されている。

光を用いる方法では、蛍光ラベルしたＤＮＡ断片をゲル
中に泳動させるが、泳動開始部から１５〜２０ｃｍ下方
に各泳動路毎に光励起部と光検出器を設けておき、ここ
を通過するＤＮＡフラグメントを順に計測する。検出時
間から泳動スピードすなわちＤＮＡ断片の大きさがわか
る。

第５図および第６図はその例である６第５図の例では泳
動ゲル７として板状のものを用い、光源８からの励起光
を泳動板に直角方向から入射させ、斜め横から蛍光を蛍
光検出用光電増倍管９を用いて検出回路１０によって検
出している。又、部分反射板１１９反射板１２を用いて
励起光の一部をモニター用泳動ゲル部に導びき、モニタ
ー光検出器１３．検出回路１４でモニタ一部の光を検出
し、データ処理機１５でデータ処理し、Ｄ　Ｎ　Ａ断片
から光のみを検出し、出力機器１６に出力するようにな
っている（昭和５８年度科研総合研究Ａ、研究成果報告
集Ｐ２０〜２５参照）。一方、第６図ではガラス管を用
いて円柱状のゲル１９を作成し用いている（特開昭６０
−２２’０８６０号参照）。

図において、１７はビームスキャナー、１８は光モニタ
−，２０は反射鏡、２１はレンズ、２２はフィルター、
２３は光トラップである。いずれの場合も１つの泳動路
に１ケの検出器９を具備している。

［発明が解決しようとする問題点］これらＤＮＡ塩基配列決定装置に必要な事項は、各泳動
路で泳動速度が等しいこと、および、多種類のＤＮＡ試
料の解析を同時に行なえることである。前者を克服する
には泳動ゲルを均一な温度に保つと共に、泳動路の間隔
を小さくして条件をそろえる必要がある。しかし、光電
子増倍管を用いる通常の方法では光電子増倍管径で泳動
路の中心間距離が制限され、１０ｍｍ以上にせざるを得
ない。

また、多数の泳動路を狭い領域に設けるのは光照射法や
検出器のサイズに何らかの工夫が必要であった。

［問題を解決するための手段］上記課題を解決するために、本発明では電気泳動ゲルを
泳動路と直角をなす直線状に光照射すると共に光学レン
ズを用いて蛍光画像をイメージ増巾器上あるいは光ダイ
オードアレイ上に結像させて測定している。

［作用］測定しようとする泳動部の巾を約１００ｒＢにとる。

この中に泳動帯を２５〜３０ケ設ける。受光部にイメー
ジインテンシファイヤを用いる場合には有径径が約２０
ｍ＋ｎφ（１画素径２０〜３０μ）であるので５：１の
縮小画像をレンズにより生成する。

泳動帯の中心間隔は４〜３ｍｍであり、イメージインテ
ンシファイキー上では０．８〜Ｑ　、　６　ｍ＋ｎとな
るが各泳動帯を十分に区別してｌ！開できる。光ダイオ
ードアレーを用いる場合にも、チャネル数５００〜１０
００のものを用いれば上記同様、各泳動帯を流れるＤＮ
Ａを独立に計測することができる。

［実施例］以下、本発明の一実施例を第１図により説明する。レー
ザ光８から出た光はミラー１２で曲げられて泳動板３を
横方向から照射する。この時径の細い（０，５〜０．２
ｍｍφ）レーザー光はゲル保持板のガラスあるいは石英
板の隙間からゲル３を泳動路に直角方向から照射する。

照射領域に蛍光ラベルＤＮＡが到達すると蛍光を発する
。各泳動路からの蛍光はレンズ２４によりイメージイン
テンシファイヤ２６の受光部に結像２５する。この信号
は増巾されて光ダイオードアレー２７で電気信号に変換
されて計測される。ダイオードアレー２７は泳動方向と
直角に照射ラインに平行におかれているイメージインテ
ンシファイヤー２６の有効径は２０〜２５ｆｆ１ｍφで
ある。蛍光像はレンズ２４により１／４〜１１５縮少さ
れて結像する。

また、各チャンネルの径は２０〜３０μｍφ程度であり
有効径内に結像した蛍光像２５は約１０００分割された
状態で測定される。計測を行なおうとするゲル上の蛍光
像（ａからｂまで）の長さをＬｏｃｍとすると５００チ
ヤンネルの光ダイオードアレー２７を用いると上記蛍光
画像は０．２ｎ＋ｍずつに分割されて計測される事にな
る。

−泳動路あたり１０チヤンネルあれば十分であるが、泳
動時の泳動帯の広がりやゆがみを考えて一泳動帯あたり
３〜４＋ａｍとるのが実用的である。この場合でも泳動
奇数として２５以上が確保できる。

イメージインテンシファイヤーおよびダイオードアレー
に更に大きなものを用いる事により泳動奇数を増す事が
できる。

ＤＮＡ上の塩基配列決定をする場合泳動帯を４本１組で
使用するが上記の例ではこれらは約１５ＩｌｌＤ内にお
さめる事ができ温度むらなどによる泳動帯相互の泳動条
件の違いを無視できる程度に小さくできる。

第２図はレーザ光がゲル３内に入射する部分を示すもの
である。レーザー光３３はガラス側板３０の端面から直
角に入射する。この端面ば平面で乱反射やレンズ作用は
ない、ガラスとゲルの界面で部分反射がおこるが、再反
射してゲル３中に入る量は一次光に比べると極端に弱く
無視できる。

この端面は入射光３３およびゲルを保持しているガラス
板の平面に直角とし、ガラス側板３０を通過する光ビー
ムが偏向されてガラス板等を照射しないようにしている
。

レーザー光３４はゲル中を通過し出射端面に到達するが
、ここで再びガラス側板３１に入射する。

この時、界面で強く反射されるが、第２図に示したよう
に、ガラス面をビーム軸方向と８０°あるいはそれ以下
の角度に傾けて反射光３５が測定部で励起光から数ｍ４
れるようにし、測定する上で妨害とならないようにして
いる。図において３２はスペーサーである。このスペー
サ３２はゲル３の厚みを一定に保持するためのものであ
るが、スペーサーを側面が透明なガラス板で構成するこ
とによりガラス側板と兼用することもできる。このガラ
ススペーサーはゲル保持ガラス板に固定あるいは一体で
作ることもできる。

またゲルから出射されるレーザービームを９０’反射鏡
を二度用いて再度ゲル中に導入する事もできる。これに
より二カ所で泳動ＤＮＡの検出を行ない相補的なデータ
ーを得ることができる。

この蛍光計測における問題点の１つに背景光（散乱光や
ゲルから出る蛍光）の影響をいかに補正するかがある。

背景光強度が常に一定であれば良いが光源のゆらが、照
射部内にある物質のゆらがなどにより変化する。また、
実施例で採用した横入射方式では泳動路上の光照射部を
ＤＮＡフラグメントが通過するたびに、光の吸収がおこ
りそこより光出射側の照射光強度は小さくなる。多くの
泳動路上の光照射部を同時にＤＮＡフラグメントが通過
するとその影響が無視できなくなる。このような場合で
も本発明の装置では十分な補正ができる。第３図はいく
つかの泳動帯の光照射部をＤＮＡ試料が同時に通過した
場合の信号を示した。

各ピーク間の谷間が零とならないのは背景光などによる
。背断光強度が変化するとピーク強度も増減し、小さな
ピークではｗｔ察がむつかしくなる。

背景光強度の変化すなわちゆらぎは照射光の強度変化あ
るいは照射領域にある物質の濃度変化などによるが主な
原因は前者である。いま信号強度ａの変化に注目する。

このピーク中の背景光部分を除去して測定を行ないたい
わけであるが、ａに含まれる背景光強度は位置的に近い
ｂおよびＣの背景光強度とあまり差がないと考えられる
。そこでｂおよびＣの強度の平均値をａにおける光強度
から差し引くことにより背景光の補正を行なうことがで
きる。

ダイオードアレーの受光面の縦方向の長さは１厘ｆｆｌ
程度であり、この検出器を用いた時の泳動路上の位置分
解能は５ｍｍとなってしまう。しかし、本発明では、細
い径のレーザー光で特定の場所を照射することにより塩
基検出時の分解能を高くすることができる。

［発明の効果］本発明によれば、泳動パネル上に隣接した数多くの泳動
帯を設ける事ができるのでいくつものＤＮＡ等の塩基配
列決定を並列して行なえる。この結果塩基配列決定の迅
速化に大きな効果がある。

更に、本発明ではＤＮＡ泳動路の両脇のゲル部からの発
生をモニターし泳動路上からの発光強度を補正できるの
で高感度検出が達成できる。

また、縦方向の分離能はレーザー径に規定し、受光部の
長さを長くしであるために検出器の設定などが容易にな
る利点がある。

本発明では検出部をイメージ増巾器とダイオードアレイ
で構成したが、高感度ダイオードアレーあるいは二次元
ダイオードアレーを用いて同様の効果を得ることもでき
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を示すＤＮＡ塩基配列決定装
置の斜視図、第２図はレーザー光入射部の部分構成図、
第３図は多数試料の検出例を示す特性図、第４図は従来
のＤＮＡ塩基配列決定のプロセスを示す説明図、第５図
および第６図は従来のＤＮＡ断片検出装置の構成図であ
る。１・・・解析しようとするＤＮＡ断片、２・・・Ｄ　Ｎ
　Ａファミリー、３・・・泳動板、４・・・泳動方向、
３・・・泳動中のＤＮＡ群（ＤＮＡバンド）、６・・・
決定された塩基配列、７・・・泳動用ゲル、８・・・レ
ーザー光源、９・・・蛍光検出用光電増倍管、１０．１
４・・・検出回路、１１・・・部分反射板、１２・・・
反射板、１３・・・モニター光検出器、１５・・・デー
ター処理機、１６・・・出力機器、１７・・・ビームス
キャナー、１８・・・光モニタ−，１９・・・チューブ
状ゲルカラム、２０・・・反射ｆｉ、２１・・・レンズ
、２２・・・フィルター、２３・・・光トラップ、２４
・・・結像用レンズ、２５・・・ａ−ｂ蛍光像、２６・
・・イメージ増巾器、２７・・・光ダイオードアレー、
２８・・・蛍光信号、３０．３１・・・ガラス側板、３
６・・・測定部。 πへ第１ａ第２図第３Ｅ現“１／Ｘ、＋ペン矛ル菊４４え　　　　ｂ、、−ｌ

Claims

【特許請求の範囲】１、ＤＮＡ断片を分離検出するＤＮＡ塩基配列決定装置
において、多数のＤＮＡ断片泳動路を有する平板型電気
泳動装置、該電気泳動装置の泳動路にレーザー光を照射
する光励起用レーザ光源、レーザー光によって照射され
たＤＮＡ断片からの光を検出し電気信号に変換するレン
ズシステムおよび光ダイオードアレーを具備する事を特
徴とするＤＮＡ塩基配列決定装置。２、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ塩基配列決定装
置において、レーザーで照射される上記電気泳動装置の
ゲル上のラインおよび上記光ダイオードアレーの配列方
向が上記電気泳動装置内のＤＮＡ断片の泳動方向と直角
であることを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定装置。３、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ塩基配列決定装
置において、試料泳動部の外側から出る光をモニターし
、試料泳動部からの光信号強度を補正する手段を具備す
ることを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定装置。４、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ塩基配列決定装
置において、該電気泳動装置の励起光入射部ゲル端面を
平面ならしめる透明導入窓を設けたことを特徴とするＤ
ＮＡ塩基く列決定装置。５、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ塩基配列決定装
置において、該電気泳動装置の励起光出射側に励起光と
直角な面から１０゜以上傾いている部材を設けたことを
特徴とするＤＮＡ塩基配列決定装置。