JPH08105834A

JPH08105834A - 蛍光検出電気泳動装置

Info

Publication number: JPH08105834A
Application number: JP6242593A
Authority: JP
Inventors: Hideki Kanbara; 秀記神原; Satoshi Takahashi; 智高橋; Takashi Anazawa; 隆穴沢; Hisashi Yamada; 尚志山田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1994-10-06
Filing date: 1994-10-06
Publication date: 1996-04-23

Abstract

(57)【要約】【目的】電気泳動により分離される試料を高感度に計
測できる装置を提供する。【構成】試料の蛍光像を屈折率分布型ロッドレンズア
レイ７で等倍に結像し、その像を光ファイバー束８に導
き、エリアセンサ９の光ピクセル形状に合わせて光ファ
イバー束８の出射端の形状を変える。【効果】屈折率分布型ロッドレンズアレイで等倍に結
像することにより蛍光の集光効率（集光立体角）を大き
くでき、さらに光ファイバーによる像変形を行なうこと
で、エリアセンサの受光素子に複数本の光ファイバーか
らの光を集めることができ、受光素子当たりの光量が増
大し、感度が向上する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ、ＲＮＡあるいは
蛋白質、糖類などの分離検出装置に関し、特に蛍光検出
を用いた電気泳動分離検出装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡ等の生体関連物質を蛍光標識し、
ゲル電気泳動により分離し、実時間計測する方法が普及
してきた。たとえば、この方法を用いたＤＮＡシーケン
サ（塩基配列決定装置）が開発され普及してきている。
これら装置では平板ゲルの下部をレーザー光走査により
照射したり、ゲル板の側面から平面に沿ってレーザー光
を入射して泳動始点から一定距離のところを照射し、そ
こを通過する蛍光標識ＤＮＡ断片からの蛍光を検出する
ものである。

【０００３】通常、測定しようとする領域の長さは１０
０ｍｍ〜１５０ｍｍである。レーザー光を細く絞りレー
ザー光走査により照射する場合、レーザー光の径は０．
１〜０．２ｍｍのため、各計測点の平均照射時間は連続
照射に比べて約１０００分の１になってしまい高感度検
出が行えない。一方、レーザー光をゲル板の側面から入
射させ、すべての泳動路を同時に照射する方式では、検
出器として通常ラインセンサ等を用いる。ラインセンサ
の長さは２４ｍｍ程度であるため、通常約１５０ｍｍの
幅の線状の蛍光像を１／６程度に縮小してラインセンサ
上に結像し検出することになる。受光量は近似的に像倍
率の２乗に比例するので、像を縮小して結像し、検出す
る系では受光量が少なく、やはり高い検出感度を得にく
い難点がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】以上述べたように、従
来用いられているレーザー光走査による方式では平均照
射時間が少ないため、また、ゲル側面からすべての泳動
路を均一に照射し、得られる蛍光像を縮小受光する方式
では像倍率の２乗に比例して受光量が減少するため高感
度が得られない難点があった。また、発光点近傍に光フ
ァイバーなどを設置して受光する方法もあるが、通常用
いる光ファイバー径０．１ｍｍと同程度まで発光点にフ
ァイバーを近づけるとレーザー光が光ファイバ端に照射
されるため背景光が多くなり高感度は得られなかった。
また現実には、ゲル保持ガラス板（厚さ５ｍｍ）等が存
在するので近くに光ファイバーを配置することは物理的
に不可能であった。

【０００５】そこで、蛍光の受光量が多く、背景光の小
さな高感度計測の可能な装置が切望されていた。受光量
を多くするには、レンズの開口比（Ｆ値）を大きくし、
かつ縮小率を小さく、つまりより拡大結像系にする必要
があり径が大きく、明るいレンズが必要となる。しかし
上記のように、測定する発光領域が広くなるとレンズの
径も大きくする必要があり（たとえば発光領域が４０ｍ
ｍのときは６０〜７０ｍｍのレンズ径）、このような大
きな径のレンズでＦ値が１に近い（またはさらに小さな
値の）ものは非常に高価になるため、使用は現実的では
ない。また拡大結像系にすると発光領域よりも長さの長
いセンサが必要となるが一般的に光センサ素子（ライン
センサ、エリアセンサ）は小型（２０〜３０ｍｍ以下）
であり、このような素子を使って等倍ないしは拡大系で
受光するのは困難である。本発明の目的は、上記の問題
を解決し、電気泳動により分離される試料を高感度に検
出することのできる安価な装置を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明においては、明る
い正立線画像が得られしかも安価な屈折率分布型ロッド
レンズアレイを用いて、照射部から離れた位置に照射部
の正立実像を形成し、この正立実像を光ファイバー等で
受光し、ラインセンサあるいはエリアセンサに導くこと
によって前記目的を達成する。屈折率分布型ロッドレン
ズは半径方向に連続的な２乗屈折率分布を有する集束性
ロッドレンズである。本発明で用いる屈折率分布型ロッ
ドレンズアレイは、光軸を中心に波状に進行する光線の
周期の整数倍の長さで切断した上記集束性ロッドレンズ
をその光路周期の整数倍の長さで切断したものを複数
個、１列あるいは複数列に配置したもので、入射端の正
立実像を出射端に結像する性質を有するものである。

【０００７】屈折率分布型ロッドレンズアレイを用いる
ことにより、発光部の横方向長さに関係なく明るい正立
実像を照射位置から離れた位置に形成することができ、
そこに光ファイバーを配置して受光するが、ラインセン
サ等に導くとき、必要に応じて間引きしたり、横方向に
並んだ光ファイバーのいくつかを重ねて受光ピクセルに
導くなどして、横方向の縮重像を検出するようにした。

【０００８】

【作用】屈折率分布型ロッドレンズアレイを用いること
により、高価なレンズを用いることなく明るい正立実像
を照射部から離れた位置に作ることができるので、そこ
に光ファイバーを配置することにより発光点に光ファイ
バーを置くのと同様の効果が得られ、大きな受光量を得
ることができる。また、得られる蛍光像を光ファイバー
を用いて縮重像に変換して受光することにより像縮小に
よる受光量の減少を招くことなく、短いラインセンサで
受光できるので高感度を得ることができる。

【０００９】

【実施例】本発明の実施例を図を用いて説明する。図１
は本発明の一実施例による蛍光検出電気泳動装置の模式
図である。装置はレーザー光源１、ゲル泳動板２、蛍光
検出部３、およびデータ処理部４からなる。ゲル泳動板
２は厚さ５ｍｍの２枚のガラス板に挟まれた幅２００ｍ
ｍ、長さ４００ｍｍ、厚さ０．３ｍｍのポリアクリルア
ミド板で、上部に３．５ｍｍピッチで幅２ｍｍ、深さ５
ｍｍの試料注入ウェルを４０個持っており、ＤＮＡ試料
はこのウェルにマイクロシリンジ５により注入される
（図２）。注入後、ゲル両端に電圧をかけ、ＤＮＡ断片
を下方へ泳動させる。ウェル下端の泳動始点から約３０
ｃｍの所をゲル板の側面から平面に沿ってレーザー光を
入射させてレーザー光照射し、通過するＤＮＡを検出す
る。レーザー光照射方式には、照射すべき領域に沿って
スキャンする方法もある。

【００１０】直線状の発光部から出た蛍光は屈折率分布
型ロッドレンズアレイ７を用いて集光され１：１の正立
実像を作る。なお屈折率分布型ロッドレンズアレイの前
あるいは後に散乱された励起光を遮断する光学フィルタ
ー６を設ける。結像部にラインセンサをおいてもよい
が、多色検出や短いラインセンサを用いるときは光ファ
イバーで結合し、いくつかの部位からくる信号を重畳さ
せ短い蛍光像として、すなわち像を縮重させて検出す
る。結像部には、例えば外径０．１ｍｍの光ファイバー
が１５３６本並べられた光ファイバー束８を配置し、ラ
インセンサ９に光を導く。この例では光ファイバー束は
１段であるが、２段あるいは３段としても良い。この場
合、受光素子のピクセルのピッチに合うように光ファイ
バー径または配列ピッチを最適化するのがよい。

【００１１】光ファイバー８はラインセンサ９に結合さ
れるが、そのまま結合したのでは非常に長いセンサが必
要になる。一方、ＤＮＡバンドの横幅は２ｍｍ以上ある
ので直線状の蛍光像を受光するときの横方向の空間分解
能は０．５ｍｍあれば十分である。そこで、光入射端で
横方向に一列に配列した光ファイバー束８を出射端では
６本ずつ縦方向に束ねて受光ラインセンサ９の０．１ｍ
ｍ幅分のピクセルと結合することにより、ラインセンサ
の１ピクセルに入射する光量を６倍に、像の横方向の広
がりを１／６にすることができる（蛍光像の縮重受光と
ここでは言う）。ＤＮＡ信号は約１４０ｍｍの領域から
得られるが、その１／６の２４ｍｍの長さのラインセン
サで受光できる。この場合の光ファイバー束８の形状
は、光入射端が、縦１列×横１５３６本、光出射端が縦
６列×横２５６本に整形したものである。ラインセンサ
９は光ファイバー束８の形状に合わせて光ピクセル数が
横方向に５１２（１ピクセルの大きさが、横５０μｍ×
縦２５００μｍ）のものを使用した。

【００１２】図１では、いくつかの光ファイバーで受光
した光を縮重（ライン状の信号を複数ファイバーで受光
し、それを１つのピクセルでまとめて受光するか垂直方
向ピクセルで受光し加算処理して１つのデータとする）
して検出したが、光量が十分な場合には、図３に示すよ
うに、光ファイバー束８’の光ファイバーを間引きして
ラインセンサに結合するようにしても良い。蛍光を波
長分離して受光する場合には、複数のラインセンサある
いは二次元センサを用いる。４色検出の例を図４に示し
た。光ファイバーをシート状に４段に重ねた光ファイバ
ー束１０を結像部に設置する。光ファイバー径は０．０
５ｍｍのものを使用した。各ラインセンサ１５，１６，
１７，１８には、受光ピクセルサイズが５０μｍ×２５
００μｍで２５６ピクセルのものを使用した。図４に示
したように各シートの光ファイバーから１２本ずつを取
り、図１と同様に縦方向に束ねて各波長のバンドパスフ
ィルター１１，１２，１３，１４を具備した４個のセン
サ１５，１６，１７，１８に結合する。光ファイバーの
出射端はレンズを形成し光の発散を抑えてある。ここで
は検出に複数のラインセンサを用いたが、１つのライン
センサを分割したり、二次元ＣＣＤ検出路などのエリア
センサを用いて１つのセンサで４色を同時に検出しても
よい。

【００１３】次に、多数のキャピラリーゲル電気泳動管
を並べたいわゆるキャピラリーアレイ型電気泳動装置
（特願平５−１９８１５７号）で、屈折率分布型ロッド
レンズアレイと光ファイバーにより蛍光検出する例を示
す。キャピラリーアレイ型電気泳動装置では発光点は点
状で一直線上に並ぶ。これをレンズを用いラインセンサ
上に結像させて受光する場合、５〜１５ｃｍと長い発光
領域の像を通常２．４ｃｍ程度のラインセンサの長さに
縮小受光する必要がある。縮小する場合には受光点とレ
ンズの間の距離を長く取るので受光量が小さくなる。点
状発光点の像だけを抜き出して、詰めてラインセンサ上
に結像できれば大きな受光量が得られる。

【００１４】図５は、屈折率分布型ロッドレンズアレイ
７で各発光点３０の両端の長さ７０ｍｍにわたる領域の
正立実像をつくり、点状発光点の各結像位置にそれぞれ
光ファイバー束２０を配置して信号をラインセンサ２１
に導いたものである。この例では散乱光を遮断する光学
フィルター６を屈折率分布型ロッドレンズアレイの前に
取り付け、各発光点からの信号を複数の光ファイバー束
で受光したのち、これらを４分割して異なる光学フィル
ター２２，２３，２４，２５を具備したラインセンサ２
１に導いている。光ファイバーの出力端はレンズを形成
させ極力出射光が発散することを防いでいる。用いた各
光ファイバー束２０は１６本の光ファイバーを束ねたも
ので、その各光ファイバー径は５０μｍで、４本づつに
分割してラインセンサ２１に結合させている。この例で
は発光点は９６個であり、ラインセンサには受光素子の
大きさが５０μｍ×２５００μｍで２５６素子並んだダ
イオードアレイタイプを用いた。受光面を４分割し、そ
れぞれに異なる透過帯の光学フィルターを設置して多色
検出を行っている。

【００１５】この例では光ファイバーを１個のラインセ
ンサに結合したが、４つの独立したラインセンサ、ある
いはエリアセンサを４つに区分して用いてもよい。ま
た、複数の光ファイバー束２０の代わりに図４の様に発
光領域を連続的に受光するような光ファイバー束を用い
てもよい。

【００１６】

【発明の効果】以上述べたように本発明では、長い発光
領域像を単に縮小あるいは拡大するのでなく、光ファイ
バー束を用いて像を変形させることで、受光効率を高め
ることができ高感度な計測が可能になる。そこで、受光
部は受光効率が大きくなる形状とし、検出部は検出器に
都合の良い蛍光検出が可能となる。また、安価で明るい
レンズである屈折率分布型ロッドレンズアレイを用いて
発光領域の長さに関係なく受光部の効率を大幅に向上さ
せることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による電気泳動装置の光検出部の一実施
例の模式図。

【図２】ゲル泳動板の概略図。

【図３】光ファイバー束の他の例の概略図。

【図４】４色検出を行なう場合に用いる光検出部の構成
図。

【図５】本発明による電気泳動装置の光検出部の他の実
施例の模式図。

【符号の説明】

１…レーザー光源、２…ゲル泳動板、３…蛍光検出部、
４…データ処理部、５…マイクロシリンジ、６…光学フ
ィルタ、７…屈折率分布型ロッドレンズアレイ、８…光
ファイバー束、９…ラインセンサ、１０…光ファイバー
束、１１〜１４…光学フィルタ、１５〜１８…ラインセ
ンサ、２０…光ファイバー束、２２〜２５…光学フィル
タ、３０…蛍光発光点

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山田尚志東京都国分寺市東恋ヶ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数の試料を同時に電気泳動させる電気
泳動手段と、光源と、該光源からの光線を一直線上に並
んだ前記複数の試料の測定点に照射する手段と、前記一
直線上に並んだ複数の測定点から発せられる蛍光を検出
する蛍光検出手段とを含む蛍光検出電気泳動装置におい
て、前記蛍光検出手段は、直線上に位置する蛍光発光点の正
立実像を形成する屈折率分布型ロッドレンズアレイと、
前記蛍光発光点の正立実像を検出するアレイセンサを有
することを特徴とする蛍光検出電気泳動装置。
【請求項２】屈折率分布型ロッドレンズアレイとアレ
イセンサの間に光ファイバーを配置したことを特徴とす
る請求項１記載の蛍光検出電気泳動装置。
【請求項３】屈折率分布型ロッドレンズアレイで結像
した正立実像を光ファイバー束で分割してアレイセンサ
に結合させたことを特徴とする請求項２記載の蛍光検出
電気泳動装置。
【請求項４】屈折率分布型ロッドレンズアレイで結像
した正立実像を光ファイバー束で受光し、光ファイバー
束中の光ファイバーを空間的に間引きしてアレイセンサ
に結合させたことを特徴とする請求項２記載の蛍光検出
電気泳動装置。
【請求項５】屈折率分布型ロッドレンズアレイで結像
した正立実像を光ファイバー束で受光し、光入射端側で
横方向に隣接する複数の光ファイバーを前記アレイセン
サの１ピクセルに結合させたことを特徴とする請求項２
記載の蛍光検出電気泳動装置。
【請求項６】前記光ファイバー束は、光入射端と光出
射端の形状が異なることを特長とする請求項２〜５のい
ずれか１項記載の蛍光検出電気泳動装置。
【請求項７】発光波長の異なる複数の蛍光体から発せ
られる蛍光を分光して検出する手段を有することを特徴
とする請求項１〜６のいずれか１項記載の蛍光検出電気
泳動装置。