JPH02269936A - 蛍光検出型電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は蛍光検出型電気泳動装置に関し、さらに詳しく
は、発光波長の異なる複数の蛍光体を用いて塩基配列を
決定すべきＤＮＡを標識し、電気泳動分離した後発する
蛍光を検出することにより前記ＤＮＡの塩基配列を決定
するのに好適な蛍光検出型電気泳動装置に関する。

〔従来の技術〕

末端塩基種の異なるＤＮＡ断片を発光波長の異なる蛍光
体を用いて標識し、ゲル電気泳動分離しなから泳動路の
一定位置を光照射し発する蛍光波長と強度の時間変化か
ら照射部を通過するＤＮＡ断片の末端塩基種を知り配列
決定する手法が発展してきている。蛍光波長の識別検出
には光電増倍管の前部に４種のバンドパスフィルターを
具備した回転フィルターを使用したり、透過波長帯の異
なるフィルターを具備した２本の光電子増倍管を用いた
りしている。いずれの場合もいくつもある泳動路を横切
って検出器を掃引し複数試料ＤＮＡの塩基配列を決定し
ており、一方、ゲル板の側面からレーザー光を入射し、
各測定点を連続照射し、得られる蛍光像をプリズムで分
光し、二次元検出器で検出する方式も提案されている。

　　−しかしながら、上記検出器を掃引する計測系では
ゲルの１つの測定点あたりの計測時間の割合αは、測定
領域の長さを２照射レーザービームの幅をｄとすると となる。通常ｄは０．２〜０．３　ｍｍ、　１２１００
ｍｍなのでα≦１０−３となり、連続光照射、受光した
場合の１０−３程度の蛍光受光量しか得られず、高感度
が得られない難点があった。一方、上記のプリズムで分
光し、二次元検出器で検出する方式では受光量は大きく
この難点は克服されうる。しかし、プリズムによる分光
精度は低く、精度の高い塩基識別に難点があった。

〔発明が解決しようとする課題］ 上記のように、従来技術は感度を高める点で配慮がなさ
れていなかったり、あるいは精度高い波長分離について
配慮がなく、高精度の塩基配列決定ができなかった。

本発明の目的は上記難点を解消し、高精度・高感度のＤ
ＮＡ分離検出が可能な装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段］ 本発明者らは研究の結果、電気泳動分離板へのレーザー
照射によって得られる蛍光画像をプリズムによってまず
複数の虚像に像分割し、ついで、前記像分割された個々
の像の光をバンドパスフィルターによって波長分散させ
る等のプロセスを経て、これらの像を検出器上に結像さ
せて所要の分離検出を行うようにすることにより、上記
目的が良好に達成させることを見出し、この新知見に基
づいてさらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の蛍光検出型電気泳動装置は、少な
くともレーザー光源とゲル電気泳動分離板と蛍光検出器
を具備した蛍光検出電気泳動装置において、前記電気泳
動分離板の所要個所へのレーザー照射によって得られる
線状の蛍光画像を分割する複数の光学的平面を有するプ
リズムと、前記プリズムの複数の光学的平面によって分
割された複数の像を前記蛍光検出器上に個別に結像せし
める光学系とを具備したことを特徴とする特本発明の装
置の実用的な構成としては、前記電気泳動分離板の所要
個所へのレーザー照射が、前記電気泳動分離板中のゲル
板の側面から前記電気泳動分離板の平面に平行に貫通す
る方向のレーザー照射であり、レーザー照射によって得
られる線状の蛍光画像を前記ゲル板中のレーザー照射の
通路にそって発する蛍光画像である。

光学系が、プリズムの複数の光学的平面から出た分割さ
れた像の光の通路中に、それぞれ、対応して設置された
透過波長帯の個々に異なるバンドパスフィルタを具備し
たものとされる。

前記プリズムの具体的形状としては、実施例の図面に示
すような中心部の頂角の稜を含む断面に対象な多面体、
或いは、台形のように中心部の断面に対象な多面体等が
ある。

そして、前記プリズムの材質としては、特に、本発明の
装置を多色蛍光検出型電気泳動装置として用いる場合に
は、屈折率の高い材質のものとする必要があり、具体的
には、ＢａＦＯｌ、　ＬａＦ３．　ＳＦ３＋　ガラス等
を挙げることができる。

さらに、本発明の装置を、多色標識した試料の分離検出
に用いる多色蛍光検出型電気泳動装置とする場合におい
ては、電気泳動分離板を泳動させる分離検出用試料とし
て多色標識された試料が用いられる。そして、その場合
の多色標識のために用いられる蛍光色素としては、ＦＩ
ＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎ
ａｔｅＨ発光波長５１５ｎｍ）、ＮＢＤ−Ｆ（４−ｆｌ
ｕｏｒ。

−７ｎ１ｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ；発光波長５
４０ｒ＋ｒ＠）　、　ＴＲＩＴＣ（ｔｅ−ｔｒａｍｅｔ
ｈｙｌ　ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１ｓｏＬｈｉｏｃｙａｎ
ａｔｅＨ発光波長５７３）およびＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ（
発光波長６１０ｎｍ）あるいは金属錯体を含む蛍光体な
どを利用できる。

多色標識に対応してバンドパスフィルタとしては、誘電
体蒸着多層膜フィルターと色ガラスフィルターの組合せ
等が用いられる。

また、プリズムの望ましい配置としては、少なくともプ
リズムの１つの頂角が、電気泳動分離板の所要個所への
レーザー照射によって得られる線状の蛍光画像の発光線
像と蛍光検出器の結像部位の中心を含む平面内にあり、
かつ、前記蛍光画像の発光線像と平行におかれているよ
うにされたり、或いは、プリズムが、電気泳動分離板の
所要個所へのレーザー照射によって得られる線状の蛍光
画像発光線像と蛍光検出器の結像部位の中心を含む平面
内に対し上下対象になり、かつ、その中心部の頂角が前
記蛍光画像発光線像と平行になるように設置される。

前記蛍光検出器としては、通常、二次元蛍光検出器が用
いられる。

本発明の蛍光検出型電気泳動装置による、分離検出の対
象試料としては、塩基配列を決定すべきＤＮＡ或いはＲ
ＮＡが挙げられるが、蛋白質等も対象試料とすることが
できる。

本発明の装置は、上記のように最も好適には、多色蛍光
検出型電気泳動装置として用いられるが、単色の蛍光検
出の場合にも用いることができる。

この場合においても、本発明の装置を用い、線状の蛍光
画像を例えば２つに像分割して前者で蛍光のピークの光
を計測し、後者で特定の低波長の光を計測するようにバ
ンドパスフィルタの組み合わせを選択することにより、
装置のレーザー照射光のゆらぎ等の計測条件の変化によ
る計測誤差を補正して正６ｉな分離検出を行うことが可
能となる等のメリットを生ずるものである。

〔作　用〕

本発明によれば、電気泳動分離板へのレーザー照射によ
って得られる蛍光画像は、まず、プリズムによって複数
の虚像に像分割され、ついで、前記像分割された個々の
像の光がバンドパスフィルターによる波長分散等のプロ
セスを経て、これらの像が検出器上に結像され、所要の
分離検出が行われるものである。

これを更に具体的に述べれば、本発明の蛍光検出型電気
泳動装置において、受光レンズのひとみ位置から照射部
を見ると、プリズムの中心部の頂角は好ましくは線状発
光部と重なるように置かれている。そして、プリズムの
上半部と下半部を通った光は異なる点から出た光のよう
に２つの像として二次元検出器上に結像すると共に波長
分散を上下方向に起す、それぞれのプリズムから来る光
は異なるフィルターを通過して検出部に至る波長の近い
信号はプリズムの上半部を通過したか下半部を通過した
かで分離検出し、波長差の大きい信号はプリズムによる
波長分散で分散検出できる。

本発明ではプリズムとフィルターの組み合わせにより発
光波長の異なる蛍光を時分割、すなわち、時間的に分け
て検出することなしに高精度で同時に分離検出できる。

したがって、本発明の装置は、多色蛍光標識されたＤＮ
Ａ断片の塩基配列の決定等に好適に使用できる。

また、照射部を側面から連続的に照射し、二次元検出器
で全照射領域を同時に観測するので受光光量も多く高感
度が得られる。

〔実施例］ 以下、本発明の一実施例を第１図により説明する。第１
図は装置の概念図である。光学系は断面図となっている
。２枚の０．３　ｍｍ間隔のガラス板１（３００ｍｍＸ
２００　ｍｍＸ　５　ｎｕ＋＋）で挟まれた６％ポリア
クリルアミドのゲル板２は側面からアルゴンレーザー（
４００ｎｍ　１０ｎ＋ｗ）で照射される。照射部３は断
面図では点として表わされる。照射部から上方に出た光
は上部プリズム４で屈折された後、レンズ６で二次元検
出器９の下側に結像する。一方下部に出た光は下部プリ
ズムで屈折された後、やはりレンズ６で二次元検出器９
の上側に結像する。本実施例においては、蛍光検出の試
料であるＤＮＡ断片は４種の末端塩基種に対応した４種
の異なる発光波長の蛍光色素、すなわち、ＦＩＴＣ（ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃ−ｅｉｎ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔ
ｅ；発光波長５１５ｎｍ）、ＮＢＤ−Ｆ（４−ｆｌ−ｕ
ｏｒｏ−７ｎｌｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎＨ発光
波長５４０ｎｍ）　、　ＴＲＩＴＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔ
ｈｙｌ　ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎ
ａｔｅ；発光波長５７３）およびＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ（
発光波長６１０ｎｍ）で蛍光標識されているので、発光
部からは前記４つの波長の光が出て、これらはプリズム
で分散され、第２図に示したように上部および下部にそ
れぞれ４本のライン（断面図では４点）ができる。−１
５と１５′１６と１６’、　１７と１７’、　１８と１
８′　はそれぞれ同じ波長の光による像で下部および上
部プリズムを通過した光に対応する。この場合１５．１
５’　はＴｅｘａｓ　Ｒｅｄからの光、１６．１６’　
　はＴＲＩＴＣ１１７，１７’　　はＮＢＤ−Ｆ、１８
．１８’はＦＩＴＣからの発光像である。この例では、
１５と１６．１７と１８の波長差は小さくプリズムによ
る波長分散で十分識別することは難しいが、１５と１７
および１６と１８は十分識別できる。そこでバンドパス
フィルターとして上部７には５１５ｎｍと５７３ｎｍの
二カ所に透過帯のあるものを、下部には５４０ｎｍと６
１０ｎｓ＋の二カ所に透過帯のあるフィルターを用いる
事により４色を区別して検出できる。第２図はこの様子
を示したものでフィルターのない場合（励起光除去フィ
ルターは具Ｉ）には二次元検出器上に８本の線が観測さ
れ、隣接する線ははっきり分離されない。フィルター７
および８を装着すると４本の線が分離して検出できるよ
うになる。（第２図右上部および第１図モニター画面参
照）４本の蛍光像による信号はそれぞれ二次元検出器の
１〜２本の水平走査線を用いて独立に読み出すことがで
きる。得られた信号はデータ処理装置１１を用いてＤＮ
Ａ断片における４種の末端塩基種の情報に変換され塩基
配列決定される。

本実施例ではプリズム４，５は一体化し狭い頂角を３０
″とした。プリズム素材にはＢａＦガラスを用いた。プ
リズムの頂角はプリズム４の肉厚部を通る光が屈折によ
りレンズ６の下端より下を通過し、レンズが像を見る立
体角分の光がレンズに入り得るように決定している。

第３図には多面体プリズムを用いた例である。

発光点３から出た光は上部プリズム、あるいは下部プリ
ズムを通過してレンズ６により二次元検出器９上の別の
位置に結像する。上部プリズムおよび下部プリズムを図
のように角度の異なる二つの面で構成すると上部および
下部プリズムを通過する光はそれぞれ２本の像として、
合計４本の像として検出器９上に結像する。検数は増加
するがプリズムの所で見た受光立体角も全体として大き
くなるので検出蛍光像１本あたりの受光量はプリズムを
使用しない場合と比べてほとんど変化しない。

それぞれの像の結像位置あるいはプリズム（４，５）の
直後に透過波長の異なるフィルター２０を置き波長分離
して信号を検出する。バンドパスフィルターは波長によ
る透過率の切れを非常に鋭くできるのでプリズムによる
波長分散を利用するよりも波長分離を高精度で行なうこ
とができる。なお上記実施例でのプリズム素材にはＢＫ
５を用いた。プリズムの角度２１．２２はそれぞれ１０
°および２０°である。

〔発明の効果〕

本発明によれば、まずプリズムを用いて複数個の蛍光像
を作り、ついで各々の像は波長の異なる発光を識別して
透過させるフィルターを通して受光器上に結像させるの
で、従来のプリズム分光のみによる分離検出の方式に比
べて、多色標識されたＤＮＡ断片等からの信号を高精度
で区別して同時に計測でき、高い精度の分離検出或いは
塩基配列決定等ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の蛍光検出型電気泳動装置を用いた計測
系の断面模式図を含むブロック図、第２図は光学系の断
面模式図、第３図は多面プリズムを用いた測定系の概念
図である。 １・・・ガラス板、２・・・ゲル板、３・・・照射部、
４・・・上部プリズム、５・・・下部プリズム、６・・
・レンズ、７・・・上部フィルター、８・・・下部フィ
ルター、９・・・二次元検出器、１０・・・制御装置、
１１・・・データ処理装置、１２・・・表示装置、１３
・・・モニター、１４・・・線画像、１５、１５’〜１
８．１８’　・・・蛍光像、１９・・・励起光カットフ
ィルター、２０・・・４段分割バンドパスフィルター、
２１、２２・・・プリズムの頂角。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくともレーザー光源とゲル電気泳動分離板と蛍
   光検出器を具備した蛍光検出電気泳動装置において、前
   記電気泳動分離板の所要個所へのレーザー照射によって
   得られる線状の蛍光画像を像分割する複数の光学的平面
   を有するプリズムと、前記プリズムの複数の光学的平面
   によって像分割された複数の像を前記蛍光検出器上に個
   別に結像せしめる光学系とを具備したことを特徴とする
   蛍光検出型電気泳動装置。 ２、電気泳動分離板の所要個所へのレーザー照射が、前
   記電気泳動分離板中のゲル板の側面から前記電気泳動分
   離板の平面に平行に貫通する方向のレーザー照射であり
   、レーザー照射によって得られる線状の蛍光画像が前記
   ゲル板中のレーザー照射の通路にそって発する蛍光画像
   であることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出型電気
   泳動装置。 ３、光学系が、プリズムの複数の光学的平面から出た分
   割された像の光の通路中に、それぞれ、対応して設置さ
   れた透過波長帯の個々に異なるバンドパスフィルタを具
   備することを特徴とする請求項１又は請求項２記載の蛍
   光検出型電気泳動装置。 ４、蛍光検出型電気泳動装置が、多色蛍光検出型電気泳
   動装置であり、電気泳動分離板を泳動させる分離検出用
   試料が多色標識された試料であることを特徴とする請求
   項１乃至請求項３のいずれかの項記載の蛍光検出型電気
   泳動装置。 ５、少なくともプリズムの１つの頂角が、電気泳動分離
   板の所要個所へのレーザー照射によって得られる線状の
   蛍光画像発光線像と蛍光検出器の結像部位の中心を含む
   平面内にあり、かつ、前記蛍光画像の発光線像と平行に
   おかれていることを特徴とする請求項１乃至請求項４の
   いずれかの項記載の蛍光検出型電気泳動装置。 ６、プリズムが、電気泳動分離板の所要個所へのレーザ
   ー照射によって得られる線状の蛍光画像の発光線像と蛍
   光検出器の結像部位の中心を含む平面内に対し上下対象
   になり、かつ、その中心部の頂角が前記蛍光画像発光線
   像と平行になるように設置されていることを特徴とする
   請求項１乃至請求項５のいずれかの項記載の蛍光検出型
   電気泳動装置。 ７、蛍光検出器が二次元蛍光検出器であることを特徴と
   する請求項１乃至請求項６のいずれかの項記載の蛍光検
   出型電気泳動装置。 ８、蛍光検出型電気泳動装置がＤＮＡ或いはＲＮＡの分
   離検出装置であることを特徴とする請求項１乃至請求項
   ７のいずれかの項記載の蛍光検出型電気泳動装置。