JP2014512548A5

JP2014512548A5 -

Info

Publication number: JP2014512548A5
Application number: JP2014508184A
Authority: JP
Filing date: 2012-04-30
Publication date: 2015-05-28
Anticipated expiration: 2032-04-30

Description

2．先行技術の記載
多数の試料または反応混合物のそれぞれにある複数の種を検出する検出システムは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うのに用いられるサーマルサイクラーに代表される。PCR及び他の類似のシステムにおいて、試料または反応混合物は、典型的には、従来のマイクロタイタープレートのような、二次元アレイに配置された個々のウェルに分配され、試料状態及び各反応の進行のモニタリングは、各ウェルの各標的種を別々に検出及び定量化することを必要とする。そのようなモニタリングは、通常、各標的に結合する別個のラベルを用いた、蛍光ラベルの標的種への付着によって達成され、標的の検出及び定量化は、各ラベルが、そのラベルに好適な一つの波長帯域の励起光を受け取り、かつ励起された各ラベルからもたらされる放射光が別々に検出される、光学走査によって達成される。発光帯と同様、異なるフルオロフォアの励起帯域が往々にして互いに近接しており、かつ往々にしてオーバーラップするので、通常の走査システムは、各フルオロフォア及び、ひいてはそれぞれの標的のために別々の光学システムを含む。例えば、6色システムは、走査ヘッドに6つの別々の光学チャンネルを含み、各チャンネルは、その独自の光源 (典型的には、発光ダイオード、またはLED)、その独自の励起フィルター、その独自のダイクロイックミラー、その独自の放射フィルター、その独自のレンズセット、及びその独自の検出器を含む。走査ヘッドは、一度に6個のウェルと整列され、一つの光学チャンネルが各ウェルに向けられ、ヘッドは、各ウェルが最終的に6個の光学システムすべてに曝露されるように、両軸に沿って1ウェル単位の増分でウェルアレイ全体にわたって操作される。コースの数は、標的の数、すなわち色の数によって変動する。しかし、すべての場合において、走査ヘッドは、パーツが多く、構造がかさ高く、コストが高くなる。

上記の従来の走査システムの限界は、本明細書において、複数の検出構成要素が、各々が一つのマルチバンド放射フィルター及び一つの検出器を含む一つ以上のマルチバンド蛍光検出チャンネルに置き換えられている走査ヘッドにより対処される。この配置によって、走査ヘッドは、試料ウェルのアレイ全体にわたって、先行技術の走査ヘッドと同様に操作され得、かつ、次のウェルに移る前に複数のフルオロフォアが検出されながら、励起光は、各ウェルによって受け取られ、放射光は各ウェルから検出される。したがって、走査は、より小さい走査ヘッドを用いてより簡単な走査動作で達成され得る。走査ヘッドが二つ以上のマルチバンド検出チャンネルを含む態様では、異なるチャンネルは、同一のマルチバンド放射フィルターまたは、異なるマルチバンド放射フィルターのどちらかを有し得る。同じ発光帯を透過させる二つ以上のマルチバンド放射フィルターを含むときは、走査ヘッドは並行して走査でき、それぞれは、平面アレイのウェルの一部分を走査し、それにより、単一の検出チャンネルに必要であろう時間の何分の一かの時間で走査できる。すなわち、二つのチャンネルは、半分の時間で同一のウェルの広がりを走査でき、三つのチャンネルは、三分の一の時間で走査できる等である。異なる発光帯を透過させる二つ以上のマルチバンド放射フィルターを含むときは、帯域は互いに相補的であり得、すなわち、共同で各ウェルの蛍光ラベルのすべてに対処することができる。しかし、走査ヘッドのある特定の態様は、単一のマルチバンド放射フィルター及び単一の検出器を有する、単一のマルチバンド蛍光検出チャンネルを含むであろう。本発明のある特定の態様では、励起光は、異なる波長帯域の光線を連続して発生させる単一のマルチバンド光源から供給され、各波長帯域は、種々の標的フルオロフォアのうちの一つを励起するために選択されている。フルオロフォアが、フルオロフォアの励起のオーバーラップが最小限であるか全く存在しないで個々に励起されることをさらに確実にするために、単一のマルチバンド光源は、ある特定の態様では、さらに、単一のマルチバンド励起フィルターと組み合わされる。

発明の詳細な説明及び特定の態様
本明細書において記載される検出チャンネルにおける各マルチバンドフィルターは、選択された波長の放射光を透過させるだけでなく、透過させた放射光を、放射光が検出器に届く前に個別の帯域に精製するフィルターであり得る。この精製は、各帯域の幅を狭くしかつ各帯域の境界を鮮明にすることができ、かつ、隣接する帯域間に、より広い分離を提供することもできる。多くの場合において、下記のある特定の実施例が説明するように、各マルチバンド検出フィルターは、励起に用いられる波長の光の透過を妨害し、これは、励起光が試料から反射されてそうでなければ検出器に到達し得る場合に有用な効果である。これらの精製のすべては、検出システムが異なるフルオロフォアからの放射をより明確に区別して、誤ったシグナルを最小限にすることを可能にする。本発明の実施において検出チャンネルに使用されるのに好適なマルチバンドフィルターは当技術分野において公知であり、通常、蛍光顕微鏡及び保護メガネと組み合わせて使用される。公知のマルチバンドフィルターの中に、基材上に適用された複数の層、またはそうでなければ互いに積層された複数の層を含むものがあり、その複数の層は、屈折率において異なる。フェルスター共鳴エネルギー転移(FRET)フィルターセットのようなマルチバンドフィルターセットもまた使用され得る。FRETフィルターセットは、Horiba Instruments Inc., Ann Arbor, Michigan, USA及びChroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont, USAから入手可能であり、エネルギー転移を示すフルオロフォアの適合した対が使用される場合、すなわち、対のうちの一つのフルオロフォアからの放射が、二つ目のフルオロフォアからの二次的な放射を生み、二次的な放射が、検出される放射として使用される場合、有用である。

上記のように、この発明のある特定の態様は、ただ一つのマルチバンド放射フィルターを含む走査ヘッドを使用するが、一方他の態様は、二つ以上のマルチバンド放射フィルターを使用する。単一のマルチバンド放射フィルター及び単一の検出器を使用する態様では、任意の単一の試料に含まれるすべての蛍光ラベルにより放射される光を透過させ、したがって、単一の検出チャンネルで、ラベルの、完全な1セットの検出を走査ヘッドが行うことを可能にするフィルターが、使用されうる。各々が、同じ組み合わせの波長帯域を透過させるが別々の蛍光検出チャンネルにある二つ以上のマルチバンド放射フィルターを使用し、かつ、可能なら各チャンネル用に別々の光源を使用する態様では、検出チャンネルと等しい数の試料が、同時に照射及び検出され得、それにより、大きいアレイの試料が比較的短い時間で検出されることを可能になる。これらの態様では、異なる検出チャネルは一緒に動くか、あるいは試料アレイが動く間静止したままであり、同期して、それらの機能を並行して行う。各々が異なる組み合わせの波長帯域を透過させる二つ以上のマルチバンド放射フィルターを使用する態様では、この異なる組み合わせが、ある特定の帯域をオーバーラップまたは重複する場合があるが、これらはまた、互いに重複することなく補完し合う場合もある。異なる波長の組み合わせが、重複する帯域を含むか含まないかにかかわらず、検出チャンネルは、すべてのチャンネルが、一度に単一のウェルからの放射光を受け取るように、または別々のウェルからの放射光を受け取るように配置され得、後者の場合、走査プロトコルが、各ウェルからのすべての放射が検出されるようにデザインされる。複数の走査ヘッドも使用され得、それぞれが独自の光源、マルチバンド放射フィルター、及び検出器を有し、それぞれが試料アレイの一部分を走査し、そして共同でアレイのすべての点をカバーする。複数のマルチバンド放射フィルターを使用する任意の態様において、そのようなフィルターの数は、一般的には2〜6であり、ほとんどの場合2または3である。

マルチエミッタ光源、すなわち、単一の光源に統合された複数の励起帯域を有する光源が使用される場合、マルチバンド励起フィルターが、マルチバンド放射フィルターと同様に、試料ウェルを照射する励起帯域をさらに形づくるように含まれ得る。そのような、励起光経路における精製フィルターの使用は、各帯域に、より狭い帯域幅及びより鮮明な境界、さらには、隣接する励起帯域間のより幅広い分離を提供する。これらの調節は、個々のフルオロフォアに照射光をより厳密に適合させるためになされ得る。励起光経路に含めるためのマルチバンドフィルターは、検出チャンネルに含まれるマルチバンドフィルターのように、商業的に入手可能または取得可能であり、そのようなフィルターのすべてが、当技術分野において周知の従来の製造工程によって、特定の帯域用に製造され得る。マルチバンド励起フィルターの帯域幅の範囲及び隣接する帯域の分離は、マルチバンド放射フィルターについて上記で述べたのとほぼ同じである。

特に、各試料中の種々のフルオロフォアからの放射光をそれ自体は識別しない光検出器を用いる場合は、フルオロフォア間の識別は、放射シグナルのタイミングを、励起光パルスのタイミングと関連付けることにより達成される。したがって、各放射シグナルは、特定のフルオロフォアに向けられた励起光パルスと関連付けられ、得られたシグナルは、検出システムにおいて、タイミングメカニズムによって分類され得る。このように、任意の単一の試料中の各標的種は、個々に検出、同定、及び定量化され得る。

ビームスプリッターは、特に、走査ヘッド及びウェルの軸に沿って励起が行われる場合に、励起光及び放射光のために異なる光の経路を形成するように、よく走査システムに含まれている。本発明の走査ヘッドにおいて、二色性ビームスプリッターが、二つの方向付けのどちらかに使用され得る。一つの方向付けにおいては、ビームスプリッターは、励起光を通過させ、それにより、励起光が鏡を透過することを可能にし、一方で、そうでなければ励起光の経路に沿って元の方向に戻るであろう放射光を、横向きに検出器へと反射するように、方向づけられる。別の方向付けにおいては、光源は、ウェルの軸の片側に位置づけされ、一方検出器は軸に沿っている。後者の場合のビームスプリッターは、励起光をウェルの軸に沿ってかつウェルの中に反射させるように方向付けられ、一方、放射光を検出器の方へ通過させる。他の方向付けは、当業者に容易に明らかになるであろう。軸外照射を用いて、ビームは、ビームスプリッターなしで容易に分離される。有用なビームスプリッターは、50:50ビームスプリッター、二色性ビームスプリッター、及びマルチバンドビームスプリッターを含む。50:50ビームスプリッターは、波長の違いに基づいて光をビームに分割しないが、望ましい波長の識別をもたらすために、マルチバンドフィルターと一緒に使用され得る。二色性ビームスプリッターは、励起波長が放射波長よりすべて低いかまたはすべて高い場合に、励起波長と放射波長とを識別するのに使用され得る。マルチバンドビームスプリッターは、特定の励起帯域及び放射帯域に適合されうる。したがって、マルチバンドビームスプリッターは、試料のフルオロフォアからの蛍光放射波長帯域の光を多く透過させながら、LED(マルチエミッタLEDが使用される場合)からの光を効率的に反射するようにデザインされうる。

Claims

複数の試料のそれぞれにある、各々が別個の蛍光ラベルを有する複数の標的を検出及び識別するための走査システムであって、以下を含む走査システム：
試料ウェルの平面アレイが配列された、試料プレート；
以下を含む走査ヘッド：
(i)各々が前記蛍光ラベルのうちの一つを励起するように選択されている複数の励起波長の励起光を供給するように作動可能な光源;
(ii)前記励起光により前記蛍光ラベルが励起されたときに該ラベルのうちの二つ以上により放射された放射光を受け取るように、及び、そうして受け取った該放射光を個々に区別可能な波長帯域で透過させるように配置された、マルチバンド放射フィルターであって、各波長帯域が前記蛍光ラベルのうちの一つからの放射光を含む、マルチバンド放射フィルター；及び
(iii)検出器に衝突する光を測定可能な信号に変換する検出器であって、前記マルチバンド放射フィルターを透過した放射光を受け取るように配置されている、検出器；及び
連続して、試料ウェルのそれぞれの上で、前記走査ヘッドの並進運動を起こすための駆動手段。
走査ヘッドが、単一の前記マルチバンド放射フィルター及び単一の前記検出器を含む、請求項1記載の走査システム。
前記マルチバンド放射フィルターが、すべての前記蛍光ラベルから放射された光を透過させる、請求項2記載の走査システム。
前記走査ヘッドが、複数の前記マルチバンド放射フィルター、及び、該マルチバンド放射フィルターのそれぞれのための別々の検出器を含む、請求項1記載の走査システム。
前記マルチバンド放射フィルターのそれぞれが、前記蛍光ラベルのすべてから放射された光を透過させる、請求項4記載の走査システム。
異なるマルチバンド放射フィルターが、異なる組み合わせの波長帯域の光を透過させ、該複数のマルチバンド放射フィルターが、共同で前記蛍光ラベルのすべてから放射される光を透過させる、請求項4記載の走査システム。
前記光源が、連続して、前記複数の励起波長のそれぞれの励起光を供給するために作動可能である、請求項1記載の走査システム。
前記マルチバンド放射フィルターが、前記励起光の透過を妨害する、請求項1記載の走査システム。
前記マルチバンド放射フィルターのそれぞれが、前記励起光の透過を妨害する、請求項4記載の走査システム。
前記光源が、前記波長帯域の中で、選択的に複数の波長帯域の光を生じる単一の光源である、請求項1記載の走査システム。
前記光源が、マルチエミッタLEDである、請求項10記載の走査システム。
前記マルチエミッタLEDが、三色LEDである、請求項11記載の走査システム。
前記マルチエミッタLEDが、四色LEDである、請求項11記載の走査システム。
前記光源が、各々が異なる波長帯域の光を放射する個々の光源の組み合わせであり、一つの波長帯域が、フルオロフォアのそれぞれのための励起光を含む、請求項1記載の走査システム。
前記検出器が、非画像センサーである、請求項1記載の走査システム。
前記非画像センサーがフォトダイオードである、請求項15記載の走査システム。
前記検出器が、画像センサーである、請求項1記載の走査システム。
前記画像センサーが、CCD及びCMOSからなる群より選択される、請求項17記載の走査システム。
前記画像センサーが、前記試料ウェルそれぞれの個々の画像を作成し、かつ平面アレイ全体の画像を形成するために該個々の画像を組み合わせる、請求項17記載の走査システム。
前記マルチバンド放射フィルターを透過する波長帯域が、幅が約10nm〜約30nmであり、隣接する波長帯域が、約30nm〜約75nm離れている、請求項1記載の走査システム。
平面アレイに配置された複数の試料のそれぞれにおける、各々が別個の蛍光ラベルを有する複数の種の間の反応をモニタリングするための方法であって、該試料のそれぞれにおける該種のそれぞれを、該種が持っている蛍光ラベル用の励起波長の励起光により照射し、かつ該蛍光ラベルのそれぞれから放射される放射光を検出するために、請求項1記載の走査ヘッドで該平面アレイを走査する工程を含む、方法。
前記平面アレイを静止させたまま、該平面アレイに対する前記走査ヘッドの並進運動により該平面アレイを走査する工程を含む、請求項21記載の方法。
前記走査ヘッドを静止させたまま、該走査ヘッドに対する前記平面アレイの並進運動により該平面アレイを走査する工程を含む、請求項21記載の方法。
前記平面アレイが直線アレイである、請求項21記載の方法。
前記平面アレイが二次元アレイである、請求項21記載の方法。
前記光源が、前記複数の励起波長のそれぞれの励起光を連続して放射するために作動可能である方法であって、複数の前記励起波長のそれぞれの励起光の連続した照射により各試料を照射する工程を含む、請求項21記載の方法。
前記マルチバンド放射フィルターが、励起光の透過を妨害する、請求項21記載の方法。
前記光源が、前記波長帯域の中で、選択的に複数の波長帯域の光を生じる単一の光源である、請求項21記載の方法。
前記光源が、マルチエミッタLEDである、請求項21記載の方法。
前記光源が、三色マルチエミッタLEDである、請求項21記載の方法。
前記光源が、四色マルチエミッタLEDである、請求項21記載の方法。
前記検出器が、CCD検出器またはCMOS検出器である方法であって、前記平面アレイにおける前記蛍光ラベルの画像を形成する工程をさらに含む、請求項21記載の方法。
前記マルチバンド放射フィルターを透過する波長帯域が、幅が約10nm〜約30nmであり、隣接する波長帯域と約30nm〜約75nm離れている、請求項21記載の方法。