JP2008139543A - 蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光顕微鏡において、複数波長の励起光の場合、発生する複数波長の蛍光像を重畳して観測したり、個々の像として観測したりすることが困難であった。特に可視域外の蛍光像は観測できなかった。
【解決手段】複数波長の励起光と、これに伴い生起する複数波長の蛍光とを第１のダイクロイックミラーで分け、このミラーを透過した複数波長の蛍光を更に単波長の蛍光へと順次波長分割してゆく複数段のダイクロイックミラー設け、単波長の蛍光が得られる最終段の各ダイクロイックミラー出力を検出する電子的検出器と、この出力を画像信号として取り込み、或いはこの出力を波長ごとに可視光を割る振り処理する信号処理部と、この出力を表示する表示部とから構成したことを特徴とする蛍光顕微鏡であり、単波長となった蛍光像を、個別に観測、重畳観測できるように構成したもの。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光顕微鏡、例えば、複数波長で励起された試料から複数波長の蛍光が発生している場合、複数波長の蛍光像を略同時に波長ごとの蛍光独立画像として、あるいは複数蛍光波長の重畳画像としてそれぞれ検出する装置に関するものであり、特定の波長の光で励起されて蛍光を発する二種またはそれ以上の蛍光タンパク質（遺伝子）を、細胞内の各組織を構成する遺伝子と融合させ、その融合遺伝子を宿主細胞に導入（ラベリング）し、その細胞分裂挙動を蛍光顕微鏡下で観察する、あるいは薬剤と細胞との関係を蛍光顕微鏡下で観察するなどの細胞分裂（試料）動態を観察する等に適した蛍光顕微鏡に関するもので、特に複数の励起光を照射した結果発生する複数の蛍光を同時的に観察できる蛍光顕微鏡に関するものである。

従来から、細胞構造や分子の局在等を観察するために、蛍光顕微鏡やレーザー顕微鏡が使用されている。蛍光顕微鏡では、試料内の注目する特定分子に特異的に結合する蛍光分子（蛍光プローブ等と呼ばれ、例えば注目するたんぱく質の抗体に蛍光分子を共有結合させたものなどが使用される）を付けて、この分子の分布や動きを励起光の照射に伴って発生する蛍光を観察することで把握している。

例えば動植物の細胞では、誕生から死滅まで細胞分裂を繰り返しながら生存することから、生存している状態での細胞分裂の形態変化、動態変化の観察、特に外来性の物質や遺伝子等による細胞分裂の形態変化への影響を観察することは、生物学的に特に重要であり、この観点から、従来、細胞分裂に作用する物質、例えば、核膜、染色体、中心体、動原体、紡錘体などのダイナミックな変化が追跡されている。

上記のような細胞分裂の形態（動態）変化を生きているままの状態で観察する場合、通常顕微鏡が使用されるが、一般の顕微鏡観察では、細胞内部での詳細な形態変化を観察することは困難であるため、従来から細胞観察に当たっては上記のようなラベリングされた蛍光分子の分布や動きが観察できる蛍光顕微鏡が一般に用いられていた。

例えば、第４図に例示する一般的な蛍光顕微鏡には、試料ＳＰを励起する励起光と試料から発生する蛍光とを分離するダイクロイックミラーＤＭが用いられており、光源ＯＳからの励起光は、開閉シャッターＳＨ、フィルタＦＴを経由して、ダイクロイックミラーＤＭによって、図では９０度上方に反射されて試料ＳＰを照射する。この結果、試料ＳＰより照射光の波長より若干長い波長の蛍光が発生し、この蛍光は、そのままダイクロイックミラーＤＭを通過して例えば、電子的検出器ＤＥ（ＣＣＤカメラ）で検出される。

以上が一般的な蛍光顕微鏡の構造、機能であるが、上記したように近年、試料（細胞）内の複数物質の形態、動態変化を追跡するために、複数の蛍光色素で複数の細胞を染色し（ラベリングし）、それぞれの細胞から蛍光を発現させる多色蛍光法が利用されている。しかし、上記の蛍光顕微鏡では、都度蛍光色素に応じたフィルタセットを用いて蛍光観察を行うため、単色の蛍光観察しか行えず、複数の蛍光の発色現象を同時的に観察することは困難であった。なお、ここで言う同時的或いはリアルタイムとは、時間的に略同時という程度で、完全に同時ではないことを意味する。

そこで蛍光顕微鏡を利用して多色蛍光観察を行う方法として、蛍光顕微鏡に電子的検出器（ＣＣＤカメラ）などの撮像素子を採用し、一方では励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの組み合わせを含む波長特性の相違する複数種のフィルタセットを用意し、これらの各フィルタセットを所定のタイミングで切り替え移動させ、それぞれのタイミングの下に各フィルタセットで撮影した波長ごとの蛍光観察画像を単独画像或いは重ね合わせて（重畳）画像とし試料などの動態、形態映像を得る方式も行われている（特許文献１参照）。

さらに、以上の従来型の蛍光顕微鏡においては、あくまで可視光の蛍光を発色させて観察を試みるタイプであったが、蛍光自体、紫外から赤外、紫外から可視光、或いは可視光から赤外などのいろいろな波長域の蛍光を発する可能性があり、可視光のみは従来タイプで検出できるが、可視光以外の波長域の蛍光は検出できなかったのが実情であった。

特開２００５−３３１８８７号公報

上記の特許文献１に記載の装置にあっては、複数組の励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタの組み合わせセットを、所定のタイミングで切り替えてそれぞれのタイミングで撮影した波長ごとの画像を、並行表示、あるいは重ね合わせて映像を得る方式のため、重畳している多波長の蛍光成分を同時的に観察できず、タイミング切り替えの遅れで必要な画像の撮影（観察）時期を逃すなどの問題点があり、連続的に変化する試料の形態（動態）変化の多色的蛍光観察を同時的に迅速に連続追従して観測（撮影）するためには更なる改良が要求されていた。

さらに、幅広い励起光の波長に伴う蛍光は、紫外から赤外、紫外から可視光、或いは可視光から赤外の波長域の蛍光が発生する可能性が高く、これらの可視光域（範囲）外の蛍光を如何に観察できるようにするかという課題も発生していた。

上記に鑑みこの発明の第１の発明は、上記課題を解決するために多波長（複数波長）の励起光を同時的に発生可能な光源を利用して、多波長（複数波長）の蛍光を発生させ、これらの多数の蛍光像を同時的に重畳象して多色表示し、あるいは各蛍光像を独立に単独像として観察が可能なように構成した蛍光顕微鏡に関するもので、複数の波長の光を同時的に出射する光源と、光源からの複数波長の励起光と試料から生起する複数波長の蛍光とを分離するダイクロイックミラーと、このミラーを透過した複数波長の蛍光を特定の波長域幅の蛍光へと順次波長分割してゆく複数段のダイクロイックミラー機構と、特定の波長域幅の蛍光が得られる最終段の各ダイクロイックミラー出力を検出する電子的検出器と、この各電子的検出器出力を画像信号として処理する信号処理部と、この処理部出力を単独画像或いは重畳画像として表示する表示部とから構成されていることを特徴とする蛍光顕微鏡を提供しようとするものである。

請求項２の発明は、光源からの励起光と試料からの蛍光とを分離するダイクロイックミラーで、蛍光波長をスキャニングして特定波長幅を持つ複数の蛍光象を得るもので、このミラーで高速スキャンをすることによって同時的に各励起波長対す蛍光画像を得ることが可能である。

請求項３の発明は、特定の複数波長の励起光を同時的に出射する光源として射出波長が相違する複数レーザー光源を使用する場合、光チョッパー、セクターミラー、或いは反射（透過）波長が定められたダイクロイックミラー等の波長選択機構をレーザー光源の前方に配置しこれらを駆動することにより特定波長のレーザー光が選択される。

また請求項４の発明のように波長可変レーザー光源を利用することで、発信装置の制御（波長選択）で複数波長の光を同時的に出射することが出来る。

請求項第５の発明は、光源として波長幅の広いハロゲンランプを使用する場合、ランプ前方に複数種のフィルタを配置した波長選択機構としての回転フィルター（励起フィルター）を設け、このフィルタを駆動することで特定の複数波長の光を同時的に出射する光源として利用することが出来る。

なお、以上の説明において、励起光源として特定の波長を持つ複数のレーザー光源、幅広い波長特性を持つハロゲンランプから特定波長の励起光を選択すると説明したが、励起光の波長選択を行わずとも幅広い励起光を試料に照射して、試料から出射する多波長の蛍光から特定波長の蛍光をスキャニングして特定蛍光を波長選択する機能を有するダイクロイックミラーを使用することも可能である。

さらにこの発明の請求項第６、７の発明のように信号処理部としては、蛍光波長に対応して、例えば各波長に、あるいは波長順に適当な色（例えば虹色）を割り当てることも可能で、特に蛍光波長が可視域以外（赤外域、紫外域）の場合は、強制的に色を割り当てることにより、可視域外で目に見えない蛍光象も目に見える像として検出でき有効である。このような構成とすれば、自由に波長幅の広い励起光を照射して、発生する蛍光をダイクロイックミラーで検出・分割し、その分割した波長にあわせて虹色（可視光）を割り当てることにより、励起光の選択幅が広がり、一方では、蛍光が可視光かどうかと考慮することなく蛍光象を観察できるので、この利用分野はさらに広まることになる。

上記のことは、各電子的検出器（ＣＣＤカメラ）出力を画像信号として取り込み信号処理部でダイクロイックミラーでの波長選択に対応して、その波長順に対応色を取り決めておけば、例えば、虹の７色に波長を対応させておけば、７色で順番に表示することも可能となり、操作次第で見えている蛍光象と見えていない蛍光像を重畳させた画像としてみることも可能となる。

以上の結果、複数の波長の光を出射するレーザー光源の場合、レーザー光と、試料から（同時的に）生起する特定の波長幅を持った多波長の蛍光とを分離する第１のダイクロイックミラーと、この第１のダイクロイックミラーで分離された蛍光を２分割する第２のダイクロイックミラーと、この２分割された蛍光の各々を再度２分割するダイクロイックミラーと、各最終段のダイクロイックミラーで分割された蛍光を各々検出する電子的検出器（ＣＣＤカメラ）と、これらの各電子的検出器（ＣＣＤカメラ）出力を画像信号として取り込み（波長順に対応色を取り決めて）画像処理する信号処理部と、この出力を単独画像或いは重畳画像として表示する表示部とから構成され、重畳して発生する可能性のある多くの蛍光画像を、見えている像或いは見えていない像も含め同時的に多色的に重畳表示するか、あるいは個別に表示できる蛍光顕微鏡を得ることが出来る。

これらの電子的検出器（ＣＣＤカメラ）出力は、光源の光路開閉シャッターの開閉時間、励起フィルタの選択などの波長選択動作と各ＣＣＤカメラの前方に配置される迷光除去フィルタの各々の動作タイミングと、各電子的検出器の蛍光取り込み時間のタイミングとが互いに対応するように同期回路で同期制御され、正確な蛍光象の取り込みを可能としているので、これらの像は信号処理部の動作で表示部では各蛍光画像を重畳して画像表示したり、個別表示したりすることが可能となる。

さらに、例えば緑色、赤色、青色、さらに黄色などのいろいろの色を発生させる蛍光物質（蛍光試薬）でラベリングした細胞を、複数波長の励起光で照射することにより発生する複数の蛍光像もこの発明の装置では同時的に重畳像として、或いは独立（個別）像として、観察が可能となる。また、このような蛍光物質（蛍光タンパク質）から発生する蛍光は、緑、赤、青、黄に限ったものではなく、他にもいろいろな蛍光を発するタンパク質が存在し、特許文献１にも開示されているような蛍光色素と試薬の組み合わせ、例えば青、シアン、緑、赤の組み合わせ、あるいは青、黄、赤の組み合わせを一度に用いることで幅広い多くの試料（細胞）の分裂構造（動態）の解析等が可能となる。

また、いろいろな波長の蛍光が発生するたんぱく質の場合、発生波長が可視光の範囲であればよいが紫外あるいは赤外域の波長の場合、これらに７色の虹色を順次対応させ、波長順に虹色の一色、一色を当てはめ出順次表示することにより、発生波長が可視光の範囲外の場合でも、虹色で、単独像として、重畳像として表示可能である。すなわち励起光の波長によっては、蛍光として、紫外から赤外、紫外から可視光（３８０〜８００ｎｍ）、或いは可視光から赤外の波長域の蛍光が発生する場合で肉眼では直接観察することが出来ない場合でも、夫々の波長の蛍光に対し、虹色を対応させておけば、これらの可視光でない肉眼で直接観察できない蛍光象をも、虹色の一色として画面上でリアルタイムに識別して観察できることとなる。

以上のように、この発明によれば、細胞等に各種の発色を呈する蛍光物質をラベリングしておき、分裂観察時、細胞に複数種の波長の励起光を照射することにより、各励起光の波長に対応して発生したその細胞にラベリングされた複数の蛍光物質特有の蛍光像を同時的に検出することによって、例えば細胞の分裂動態（状況）が、蛍光のその分布状況から判明し、リアルタイムで目的とする状態の細胞を探し当てる事も可能である。もちろん分裂進行中においても、繰り返し検出することにより映画のコマのように、その進行状況を観察することも可能となる。もちろんこの独立して検出された各蛍光像を重畳して表示することも当然可能である。

また、蛍光物質がラベリングされていずとも、蛍光を発生する物質が試料に含まれておれば、選択された励起光で発生した蛍光象も表示可能であり、特に肉眼で観察することが出来ない可視域光でない蛍光の場合でも、対応させた虹色の一色で表示され、他のものと区別して観察し得る。すなわち本来ならば目に見えない蛍光像も強制的に色づけされた可視像として観察しうる。

また、電子的検出器の前方に配置される各迷光除去フィルタ装置は、（例えば、励起光の波長が決まりそれで発生する蛍光波長がわかっているときは、回転円盤に複数個のフィルタを配置し、各円盤の回転角度ごとに対応フィルタを決めておくように構成することで）、励起フィルタと迷光除去フィルタと間の各フィルタ間の対応をあらかじめ決定でき、励起フィルタ装置と選択フィルタ装置とは正確な波長選択の連動制御、同期制御が可能となる。また回転円盤方式のため、光軸のずれもなく正確な位置決めが可能となるため、重畳像にズレが発生せず正確な画像が得られる。

なお、この迷光除去フィルタ装置は、フィルタを配置するとして説明したが、単なる開孔の開閉スイッチでもよい。すなわち各ダイクロイックミラーで波長分離されているので、その特定波長の蛍光のみを取り込めばよく、よって回転円盤に中心から周辺に向かってのスリット或いは周辺に開口部を設け特定波長をＣＣＤ側に取り込む構成とすることも可能である。

また、この開孔の開閉スイッチを用いることで全ての蛍光象を取り込むことなく、特定の必要な蛍光象のみを繰り返し取り込むことが可能で、この結果信号量を蓄積して正確な鮮明な画像を得ることも可能となる。

さらにこの説明では、励起光を一波長ごとに照射し、その波長に対応する蛍光象を得ると説明したが、励起フィルタ、ダイクロイックミラー等の構成を変更することで、例えば、幅広い波長の励起光を複数回照射することによって、照射ごとの複数の蛍光像の中から特別に選択した蛍光像を得、これを並べることにより試料・検体中での変化の状況を把握できる等のいろいろな変形例を考えることが出来る。

以下、図面に従いこの発明を実施するための形態を説明する。
第１図に、この発明の蛍光顕微鏡の概略構成図を示す。ただし、この図は、顕微鏡が本来装備している接眼レンズ、コレクタレンズ、対物レンズなどは省略して、この発明に関連する要部の構成のみを示している。また、この概略構成図のようなダイクロイックミラーを使用するタイプの蛍光顕微鏡は一般に落射蛍光顕微鏡と呼ばれ、試料の観察面に励起光が直接照射されて明るくシャープな像が得られるため、一般的に広く用いられている。

図において、符号１は光源、例えばレーザー光源で、波長が相違するレーザー光源を複数個有し、順次各レーザー光源から波長の相違する励起光を励起フィルタ装置を介して同時的に選択発生させるものである。なお、複数のレーザー光源から複数波長を同時に発生させてもよく、波長可変レーザー光源を使用することも可能である。符号２は、第４図において説明した第１のダイクロイックミラーで、光源からの励起光（レーザー光）と試料３から発生する蛍光とを分離するための光学素子で、特定の波長の光（励起光）は反射し、それ以外の波長の光（この発明の場合は蛍光）は透過させる。いわゆる励起光・蛍光分離機構として機能している。このミラー２は、図でも明らかなように、光源からの入射光路Ｏに対し角度４５度で配置されており、光源１からの励起光は、試料３方向にこのミラー２で反射され（この図では９０度上方）、光路Ｐ上を試料３方向へ導かれる。

なお、このミラーは、上記とは逆に励起光は透過させ、蛍光を反射させるタイプのものであってもよい。この場合は、図において試料３は、ダイクロイックミラーを挿んで光源と反対位置に対応して配置されることとなる。

以下４波長の励起光によって、４波長の蛍光が発生した例につき説明する。
このミラー２からの複数の励起光によって試料３は励起され、例えば細胞（試料）にラベリングされた各蛍光物質は複数波長の励起光に対応して夫々の波長に対応した４波長の蛍光を発し、この蛍光は光路Ｐを通ってミラー２を透過し、第２のダイクロイックミラー４に入射する。なお、試料３は、顕微鏡のステージ上のＣＯ₂チャンバー（図示せず）内に導入されており、この中には、例えば、細胞を培養することが出来るようにＣＯ₂インキュベータ内に近い環境を保つために空気と炭酸ガスとの混合気体が封印されている。また生細胞の観察のためには、底面に円形のカバーグラスが貼り付けられたグラスボトムデイッシュが用いられる。

この第２のダイクロイックミラー４は、波長選択ミラーとして、図のように光軸Ｐに対し４５度の角度で配置されており、入射した４波長の蛍光はその波長にしたがって２分割され、一方の特定波長の蛍光は第３のダイクロイックミラー５方向に反射し、他方の特定波長の蛍光はダイクロイックミラー４を透過して第４のダイクロイックミラー６に入射する。この第３、第４のダイクロイックミラー５，６への各入射蛍光（２波長）は、この各ダイクロイックミラー５、６の波長特性で更に２分割され、その直前に配置されている迷光除去フィルタ１１，１２，１３，１４を経由して夫々の後方に配置されている二次元的電子的検出器（ＣＣＤカメラ）７，８，９，１０にて検出される。なお、符号１５は、第３のダイクロイックミラー５から電子的検出器への光路を変更するために光路に挿入された反射鏡であるが、直線の光路長が十分とれ、光路を変更する必要がなければ、このミラーは不要であり、もし必要があれば複数個配置することも可能である。なお、この図においては、５、６のダイクロイックミラーが、最終段のダイクロイックミラーと言いえる。

複数波長のパルスの発生源を持つパルスレーザー光源１の前方には、光路開閉シャッター１６が設けられ、光源からのレーザー光の光路を正確にオンオフ開閉して迷光を取り除きレーザー光を正確に出射させるためのもので、場合によればピエゾ素子を使用して光路を開閉する電子的シャッターでもよい。なお、符号１７は、励起フィルタ装置で、光源の幅広い波長域の励起光の中から、特定波長域の中心波長として特定励起光のみをより正確に選択、抽出するためのもので、レーザー光の波長の場合には、波長に合致したフィルタが順次選択される。この励起フィルタ装置は、特にハロゲン光源のように波長範囲が広い光源から特定波長域の励起光を選択するに当たっては特に有効である。

この上記の励起フィルタ装置１７は、試料にラベリングした蛍光物質の励起に必要なレーザー光を光源１から正確に抽出するため複数の光学素子（フィルタ）群で構成され、例えば赤、シアン、オレンジ、青などの特定の波長の光のみを透過するように選択される複数のバンドパスフィルタ等が一般に用いられる。なお、このフィルタ装置は、複数のレーザー光源が各波長のレーザー光を出射している前方で、複数のフィルタをセットした回転フィルターホイールを回転させ、同時的に複数の励起光を順次得る方式となっている。

一方、迷光除去フィルタ装置１１，１２，１３，１４の各々は、試料からの目的とする波長の蛍光とその他の不必要に重畳している波長の蛍光あるいは散乱光、迷光などを分離する光学素子（フィルタ）群で構成され、図のように試料３からダイロックイックミラー２，４を経由して最終段としてのダイクロイックミラー５或いは６を透過・反射してきた試料からの蛍光を、その他の励起漏れ光（試料や光学系からの散乱光、迷光）などから分離する働きをする。そしてこれらの迷光除去フィルタ装置も検出したい蛍光の波長にも依るが複数のフィルタがセットされた回転フィルターホイールが一般的に用いられる。

符号１８は、フィルタ同期回路で、上記に説明した各迷光除去フィルタ装置１１，１２，１３，１４，及び励起フィルタ１７を同期連動駆動するもので、励起フィルタ装置１７でのフィルタ選択（波長選択）に伴い、対応した励起光で発生する蛍光波長が検出されるように、対応するフィルタを選択する。すなわち励起フィルタ装置１７による選択励起光に対する発生蛍光をフィルタ装置が選択する。

符号１９は信号処理部、符号２０は表示部であり、信号処理部１９は、励起フィルタ１７、光路開閉シャッター１６からの動作確認信号のもとに各電子的検出器（ＣＣＤカメラ）７，８，９，１０からの出力を、同期回路１８からの同期信号に対応して取り込み、表示部２０においては同時的に発生する蛍光像の、個別表示或いは重畳表示を行う。これにより、表示部２０の画面上においては、各電子的検出器（ＣＣＤカメラ）からの蛍光像が複数の画面に夫々表示され、或いは一画面上に複数の蛍光像が重畳して表示され、結果的に、細胞などの時間的形態変化、動態変化が、一連の複数の蛍光像変化から理解できる。

さらにこの信号処理部は、各蛍光波長に対して各々の対応色を選択できる構成を持たせることも可能である。蛍光は、可視光ばかりではなく紫外・赤外の波長域で人の肉眼では見えない蛍光が発生している場合、この信号処理部では、これらの波長順に、例えば虹色を順番に関連づけて表示させ、結果的に試料内の状況を観察できるようにすることも可能である。

第２図は、励起光とこれに伴って発生する蛍光との発生タイミング関係、励起フィルターの動作範囲、及びシャッター機構の開閉範囲（時間）と蛍光の検出波長範囲（時間）を説明するためのものである。図において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各符号の波形は、特定の波長域幅の中心波長４３３ｎｍ、４８８ｎｍ、５４８ｎｍ、５６３ｎｍを示す励起波長で、この図では、この順に青色、緑色、オレンジ色、赤色を示す波長である。

一方、これらの波長で励起されて発生する蛍光は、全蛍光ａ、ｂ、ｃ、ｄとして符号で示すようにこの順にその波長域幅の中心波長４７５ｎｍ、５０７ｎｍ、５５９ｎｍ、５８２ｎｍの波長として示すことが出来、励起波長に対し若干遅れたタイミングで出現する。そして蛍光ａとｄの波長は独立しているが、励起光の波長ＢとＣに対応する蛍光波長ｂとｃの裾野部分は一部重畳している。この発明は、これらの重畳している蛍光も、個別表示させ、或いは重畳表示を可能とするものである。

この図１、図２においてこの発明の動作の概略を説明する。
光源から励起光Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄとして４波長の励起光が同時的に順次発生すると、これらの励起光は第１のダイクロイックミラー２で反射し、試料３を照射する。励起光で照射された試料３からは蛍光ａ、ｂ、ｃ、ｄが発生して、これらの蛍光は、第１のダイクロイックミラー２を透過して、第２のダイクロイックミラー４に入射する。この第２のダイクロイックミラー４は、この実施例では入射してきた蛍光ａ〜ｂのうち、蛍光ａ、ｂを第３のダイクロイックミラー５の方向に反射し、残る蛍光ｃ、ｄを第４のダイクロイックミラー６方向に透過する。

次いで第３のダイクロイックミラー５は、この上記の蛍光ａ、ｂのうち、蛍光ａは透過し、蛍光ｂはミラー５で反射して、更に反射鏡１５で光路を変更されて、夫々電子的検出器（ＣＣＤカメラ）７、８にて検出される。同じく第４のダイクロミラー６は、上記の蛍光ｃ、ｄのうち、蛍光ｃは反射させ、蛍光ｄは透過させて、夫々電子的検出器（ＣＣＤカメラ）９、１０にて検出される。

このときこの発明においては、第１のダイクロイックミラー（励起光・蛍光分離機構）の波長特性は、図２にＤ２として一点差線で示したような波長特性を持つミラーを使用する。すなわちこのミラーは、励起光Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを試料側に反射し、一点差線で示したＤ２で示す波長範囲のみの蛍光を透過させる波長特性を持っており、全蛍光ａ、ｂ、ｃ、ｄの波形の略中心範囲が透過する。この結果、励起光・蛍光分離機構としてこの第１のダイクロイックミラー２で、多波長励起光と試料からの多波長蛍光とが分離できる。次いで第２のダイクロイックミラー４の波長特性は、図においてＤ４として点線で示した波長特性を持っており、蛍光ａ、ｂ部分の波長の光は反射させ、蛍光ｃ、ｄ部分の波長の光は透過させる。なお、これらの波長特性を持たすダイクロイックミラーは、イオンプレーテイング法、イオンスパッタリング法などの手法で容易に作成可能である。

以上の結果から、試料からの発生した蛍光ａ〜ｄは、蛍光ａ、ｂと蛍光ｃ、ｄのグループに分けられ、蛍光ａ、ｂは、第３のダイクロイックミラー５に入射し、このミラー５の波長特性に従い蛍光ａと蛍光ｂは分離され、夫々電子的検出器（ＣＣＤカメラ）７、８で検出される。同じく蛍光ｃ、ｄも第４のダイクロイックミラー６に入射し、このミラー６の波長特性に応じて蛍光ｃと蛍光ｄに分離され、電子的検出器（ＣＣＤカメラ）９および１０で検出される。なお、これらのミラー５、６の波長特性の図面上での表示は省略する。

一方、符号１６のシャッター機構では、光源１からの光路Ｏを開閉し、且つこの開閉時間は信号処理部１９、励起フィルタ１７、迷光除去フィルタ１１、１２、１３、１４等が同期制御されているので電子的検出器（ＣＣＤカメラ）出力は対応した蛍光画像を画像信号として取り込み、信号処理部を介して表示部で表示することが可能となる。この種表示技術は一般に広く利用されている映像技術を容易に採用できる。すなわち、試料への励起光照射タイミングに遅れて発生する蛍光を効率よく取り込み、光路Ｏの開閉時間に遅れたタイミングの蛍光発生時間に、検出器を一定期間動作させ、ノイズ（迷光など）を除去した必要とする蛍光成分のみを効率よく取り込み、検出することができるのである。

以上の構成において、試料として青色、緑色、オレンジ色、赤色の励起光で蛍光を発生するようにラベリングした試料（例えば細胞試料）３を作成し、光源１としてパルスレーザー光源に代え、例えばハロゲンランプの光を投射する。このときフィルタ装置１７で順次、４３３ｎｍ、４８８ｎｍ、５４８ｎｍ、５６３ｎｍを選択し、かつシャッター１６の開閉範囲ａ、ｂ、ｃ、ｄ、を第２図のような波長との関係において励起光として取り込むことでも同じ結果を得ることが可能である。

また、図示していないが、鏡筒の長さの調整手段、いわゆるエレベータ機構を採用することで、例えば試料（細胞）の厚さ方向での光学切片を観察することも可能となり、細胞の水平方向への形態変化のみならず、厚さ方向での変化も検出でき、細胞分裂などの動態変化を、立体的に、継続的に観察することが出来る。

また第３図は、他の実施例を説明するものである。
図においてＡ、Ｂ、Ｃ・・・は励起光で、ａ、ｂ、ｃ・・・は、この励起光で発生した蛍光である。この場合第１のダイクロイックミラー２では、Ｄ１で示す一点差線の波長範囲の特性を持たせて発生した全蛍光を透過するように調整し、次段のダイクロイックミラーには、Ｄ２で示す点線の波長特性を持たせて、蛍光ａ、ｂ、ｃと、蛍光ｄ、ｅ、ｆとを一方は透過させ、他方は反射させて分離し、以下は、いろいろな波長特性をもつダイクロイックミラーで、例えば蛍光ａと蛍光ｂ、ｃとを分離し、さらに蛍光ｂとｃとを分離してゆくなどの手法で、多波長の生起した蛍光は、単波長の蛍光に分離されてゆく。同じくｄ、ｅ、ｆの蛍光も分離してゆくことが同じように可能である。

また、この発明においては、複数の励起光で照射した物質から生起した複数の蛍光波長の例えば短波長から長波長の順に、虹色を強制的に順次対応させて表示することで物質の形態を理解することも可能となる。

以上の実施例においては、励起光・蛍光分離用のダイクロイックミラー２の後段に、複数段のダイクロイックミラーを配置して順次蛍光を分割して行ったが、このように複数段のダイクロイックミラーを使用せずとも、第２図のＤ２のごとき光学特性を持つダイクロイックミラーを利用し、特定波長の蛍光のみを検出できるように励起フィルタ、１個の迷光除去フィルタ、１個の電子的検出器（ＣＣＤ）を利用して、ａ蛍光のみを選択的に検出することが出来る。この場合、励起光の照射の下でダイクロイックミラーを、例えば回転させ、ａの蛍光がダイクロイックミラーを透過するタイミングに同期して電子的検出器（ＣＣＤ）、迷光除去フィルターを動作させることでａ蛍光波長が検出でき、同じくｂ，ｃ，ｄ，・・・蛍光波長が順次検出できる。

また、レーザー光源として波長可変レーザー光源を利用すれば、レーザー発信機の制御により励起波長を自由に変更することも可能で、波長が相違する多くのレーザー光源を使用する必要はなくなる。

さらに表示部はテレビ画面としてもよいが、この画面を顕微鏡視野内にはめ込むことで、本来は見えない紫外域、赤外域の蛍光画像を観察しながら試料の動態観察を可能とすることが出来る。

本発明は、蛍光顕微鏡において励起フィルタ装置と選択フィルタ装置との連動機構、更にはシャッター機構と電子的検出器との連動操作をする同期制御回路などを装備しているので、種々の励起光に対する発生蛍光を、波長の重畳している蛍光も同時に独立成分として検出できるので、例えば生体試料の生存状態を維持しながら細胞分裂などの動態変化を連続的に観察でき、更には薬剤投与の結果の生体試料の動態変化なども継続的に観察でき、場合によっては、理解を深めるために虹色で順次色づけた画像を得ることも可能となる。特に紫外、赤外など可視光でない蛍光を色づけて表示することのより、本来目に見えない蛍光像も観察することが可能となり、本装置の更なる活用範囲が広がる。

この発明の蛍光顕微鏡の要部構成を説明する図である。 この発明の励起フィルタ装置、選択フィルタ装置、シャッター装置、更には電子的検出器の連動関係から、励起光とこれに伴う蛍光の検出タイミングなどを説明する図である。 図２と違った方式で単波長に分離してゆく過程を説明する図である。 一般的な蛍光顕微鏡の要部構成を説明する概略図である。

符号の説明

１ 光源
３ 試料
２，４，５，６ ダイクロイックミラー
７，８，９，１０ 電子的検出器（ＣＣＤカメラ）
１１，１２，１３，１４ 迷光除去フィルタ
１６ 光路開閉シャッター
１７ 励起フィルタ
１８ フィルタ同期回路
１９ 信号処理部
２０ 表示部
Ｏ 入射光路
Ｐ 光路
ＤＥ 電子的検出器（ＣＣＤカメラ）
ＤＭ ダイクロイックミラー
ＦＴ フィルタ
ＯＳ 光源
ＳＨ シャッター
ＳＰ 試料
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ 励起光
ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ 励起光で発生する蛍光

Claims (8)

1. 光源からの励起光で試料を照射し、試料から発生する蛍光を検出表示するものにおいて、
   試料への励起光とこの励起光に伴う試料からの蛍光とを分離するダイクロイックミラーと、この分離された蛍光を、特定の波長域幅の蛍光へと順次波長分割してゆく複数段のダイクロイックミラー機構と、特定の波長域幅の蛍光が得られる最終段の各ダイクロイックミラー出力を検出する電子的検出器と、各電子的検出器出力を画像信号として処理する信号処理部と、この処理部出力を単独画像或いは重畳画像として表示する表示部とから構成されていることを特徴とする蛍光顕微鏡。
2. 光源からの励起光と試料からの蛍光とを分離するダイクロイックミラーで蛍光を波長スキャンして波長選択し、特定波長域の蛍光画像を得ることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。
3. 光源は出力波長が相違する複数のレーザー光源を高速選択する波長選択機構を有することを特徴とする請求項１、２記載の蛍光顕微鏡。
4. 波長可変レーザーと、この光源からの出力波長を高速選択する波長選択機構を有することを特徴とする請求項１、２記載の蛍光顕微鏡。
5. 光源のハロゲンランプと、このランプからの特定波長または複数波長を高速選択する波長選択機構を有することを特徴とする請求項１、２記載の蛍光顕微鏡。
6. 蛍光波長に対応して、波長毎に対応色を取り決める信号処理部を有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５記載の蛍光顕微鏡。
7. 蛍光波長に対応して、波長順に虹色の対応色を取り決める信号処理部を有することを特徴とする請求項６記載の蛍光顕微鏡。
8. 励起光の照射により発生する蛍光波長に対応色を割り当てることにより、可視光域以外の赤外域あるいは紫外域の波長域の蛍光象を検出することを特徴とする請求項１、２、３、４、５記載の蛍光顕微鏡。

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