JP2009065848A - 遺伝子発現解析方法および遺伝子発現解析システム - Google Patents

Abstract

【課題】長期間にわたって細胞を追跡することができ、その細胞に導入された遺伝子の発現を精度よく解析することができる遺伝子発現解析方法および遺伝子発現解析システムを提供する。
【解決手段】発光タンパク質からなるレポーター遺伝子を導入するとともに、細胞核に特異的に発現するマーカー遺伝子によって標識した複数の生きた細胞に対し、レポーター遺伝子の発現に伴って発生するレポーターシグナルを互いに異なる経過時間で検知する一方、マーカー遺伝子によって発生するマーカーシグナルを互いに異なる経過時間で検知し、検知した複数のマーカーシグナルを用いて異なる経過時間における細胞の同定を行い、同定した細胞の少なくとも一部に対して、レポーターシグナルのシグナル強度の時間変化に基づく解析を行う。
【選択図】 図１

Description

本発明は、生きた細胞に対して導入した遺伝子の発現を解析する遺伝子発現解析方法および遺伝子発現解析システムに関するものである。

近年、生きた細胞に導入した遺伝子の発現量の時間変化などを検出する目的で、細胞を生きたままの状態で長期間にわたって観察する実験用途が増えてきている。細胞を長期間にわたって観察する場合、細胞の成長や分裂によってその細胞の形態および位置が変化するため、同一の細胞を追跡することが難しいという問題があった。

上述した問題を解決するための技術として、従来、赤外光を利用して細胞を撮像し、撮像した画像の細胞画像データを用いて細胞の同一性を確認する技術が開示されている（例えば、特許文献１を参照）。

特開２００６−２３８８０２号公報

しかしながら、上述した従来技術では、細胞全体を用いて同一性を評価しているため、時間の経過とともに細胞質の形状が大きく変化するような場合には細胞を追跡することが困難となり、遺伝子の発現を精度よく検出する上での障害となっていた。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、長期間にわたって細胞を追跡することができ、その細胞に導入された遺伝子の発現を精度よく解析することができる遺伝子発現解析方法および遺伝子発現解析システムを提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る遺伝子発現解析方法は、発光タンパク質からなるレポーター遺伝子を導入するとともに、細胞核で特異的に発現するマーカー遺伝子によって標識した複数の生きた細胞に対し、前記レポーター遺伝子の発現を解析する遺伝子発現解析方法であって、前記レポーター遺伝子の発現によって上昇するレポーターシグナルおよび前記マーカー遺伝子の発現によって上昇するマーカーシグナルをそれぞれ検知可能であり、前記レポーターシグナルおよび前記マーカーシグナルに関する情報を記憶する記憶手段を備えた遺伝子発現解析システムが、前記レポーターシグナルを光学的に検知するレポーターシグナル検知ステップと、前記レポーターシグナル検知ステップで検知したレポーターシグナルのシグナル強度を測定し、この測定した結果を前記記憶手段に記憶するレポーターシグナル強度測定ステップと、前記マーカーシグナルを光学的に検知するマーカーシグナル検知ステップと、前記マーカーシグナル検知ステップで検知したマーカーシグナルのシグナル強度を測定し、この測定した結果を前記記憶手段に記憶するマーカーシグナル強度測定ステップと、を異なる経過時間ごとに繰り返し行った後、複数の前記マーカーシグナルのシグナル強度を含む情報を前記記憶手段から読み出し、この読み出した情報を用いて異なる経過時間における細胞の同定を行う細胞同定ステップと、前記細胞同定ステップで同定した複数の細胞の少なくとも一部に対し、前記レポーターシグナルのシグナル強度の時間変化に基づく解析を行う解析ステップと、を行うことを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析方法は、上記発明において、前記細胞同定ステップの前に、前記レポーターシグナル検知ステップ、前記レポーターシグナル強度測定ステップ、前記マーカーシグナル検知ステップおよび前記マーカーシグナル強度測定ステップを繰り返し行うか否かを判定する判定ステップをさらに行うことを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析方法は、上記発明において、前記細胞同定ステップの前に、前記レポーターシグナルの像と前記マーカーシグナルの像とを重ね合わせた画像を異なる経過時間ごとに生成する画像生成ステップと、前記画像生成ステップで生成した画像を出力する出力ステップと、をさらに行うことを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析方法は、上記発明において、前記レポーター遺伝子はルシフェラーゼであることを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析方法は、上記発明において、前記マーカー遺伝子は、前記レポーター遺伝子と異なる色を示す波長の光を発する発光タンパク質であることを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析方法は、上記発明において、前記マーカー遺伝子はルシフェラーゼであることを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析方法は、上記発明において、前記解析ステップは、前記レポーターシグナルのシグナル強度を、同じ細胞における前記マーカーシグナルのシグナル強度を用いて補正するシグナル強度補正ステップを含むことを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析方法は、上記発明において、前記マーカー遺伝子は蛍光タンパク質であることを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析方法は、上記発明において、前記細胞は、前記マーカー遺伝子が導入されてなり、前記細胞の成育または分裂の過程において、前記マーカーの発現量の変化は、前記レポーター遺伝子の発現量の変化と比較して無視しうることを特徴とする。

本発明に係る遺伝子発現解析システムは、発光タンパク質からなるレポーター遺伝子を導入するとともに、細胞核で特異的に発現するマーカー遺伝子によって標識した複数の生きた細胞に対し、前記レポーター遺伝子の発現を解析する遺伝子発現解析システムであって、前記レポーター遺伝子の発現に伴って発生するレポーターシグナルの光学的な検知を異なる経過時間ごとに繰り返し行うレポーターシグナル検知手段と、前記マーカー遺伝子によって発生するマーカーシグナルの光学的な検知を異なる経過時間ごとに繰り返し行うマーカーシグナル検知手段と、前記レポーターシグナル検知手段が検知したレポーターシグナルのシグナル強度および前記マーカーシグナル検知手段が検知したマーカーシグナルのシグナル強度をそれぞれ測定するシグナル強度測定手段と、複数の前記マーカーシグナルのシグナル強度を含む情報を用いることによって異なる経過時間における細胞の同定を行う細胞同定手段と、前記細胞同定手段で同定した細胞の少なくとも一部に対し、前記レポーターシグナル検知手段で検知したレポーターシグナルのシグナル強度の時間変化に基づく解析を行う解析手段と、を備えたことを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析システムは、上記発明において、前記レポーターシグナル検知手段および前記マーカーシグナル検知手段における繰り返し処理を続行するか否かを判定する判定手段をさらに備え、前記細胞同定手段は、前記判定手段が繰り返し処理を続行しないと判定した場合、異なる経過時間における細胞の同定を行うことを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析システムは、上記発明において、前記レポーターシグナルの像と前記マーカーシグナルの像とを重ね合わせた画像を異なる経過時間ごとに生成する画像生成手段と、前記画像生成手段が生成した画像を出力する出力手段と、をさらに備えたことを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析システムは、上記発明において、前記レポーターシグナル検知手段は、前記レポーターシグナルの像を結像する第１の結像光学系と、前記第１の結像光学系で結像した前記レポーターシグナルの像を撮像する第１の撮像手段と、を有することを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析システムは、上記発明において、前記マーカーシグナル検知手段は、前記マーカーシグナルの像を結像する第２の結像光学系と、前記第２の結像光学系で結像した前記マーカーシグナルの像を撮像する第２の撮像手段と、を有することを特徴とする。

また、本発明に係る遺伝子発現解析システムは、上記発明において、前記マーカー遺伝子は、前記レポーター遺伝子と異なる色を示す波長の光を発する発光タンパク質であり、前記解析手段は、前記レポーターシグナルのシグナル強度を、同じ細胞における前記マーカーシグナルのシグナル強度を用いて補正するシグナル強度補正手段を有することを特徴とする。

本発明によれば、発光タンパク質からなるレポーター遺伝子を導入するとともに、細胞核に特異的に発現するマーカー遺伝子によって標識した複数の生きた細胞に対し、レポーター遺伝子の発現によって上昇するレポーターシグナルを互いに異なる経過時間で検知する一方、マーカー遺伝子の発現によって上昇するマーカーシグナルを互いに異なる経過時間で検知し、検知した複数のマーカーシグナルを用いて異なる経過時間における細胞の同定を行い、同定した細胞の少なくとも一部に対して、レポーターシグナルのシグナル強度の時間変化に基づく解析を行うことにより、長期間にわたって細胞を追跡することができ、その細胞に導入された遺伝子の発現を精度よく解析することが可能となる。

以下、添付図面を参照して本発明を実施するための最良の形態（以後、「実施の形態」と称する）を説明する。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係る遺伝子発現解析システムの全体構成を模式的に示す図である。同図に示す遺伝子発現解析システム１は、複数の生きた細胞からなるサンプルＳｐを撮像することによってサンプルＳｐから発せられる遺伝子発現のシグナルを画像データとして光学的に観察する観察装置２と、観察装置２との間でデータの送受信が可能であり、観察装置２の駆動制御を行うとともに、観察装置２から送られてくる画像データを用いた演算処理を行うデータ処理装置３と、を有し、これら２つの装置が連携してサンプルＳｐの遺伝子発現量変化を検出する。

ここで、本実施の形態１で使用するサンプルＳｐについて説明する。サンプルＳｐを構成する複数の生きた細胞には、発光タンパク質からなるレポーター遺伝子と、レポーター遺伝子とは異なる色を示す波長の光を発する発光タンパク質からなるマーカー遺伝子とが導入されている。本実施の形態１では、レポーター遺伝子およびマーカー遺伝子として、発現の際に互いに異なる色を示す波長の光を発する２種類のルシフェラーゼ遺伝子を導入する。ルシフェラーゼ遺伝子を細胞に導入する際には、リポフェクション法などのように、従来知られている遺伝子導入方法のいずれかを適用することができる。

ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を指標として発現の強さを調べる場合には、ルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流に目的のＤＮＡ断片をつなぐことによってそのＤＮＡ断片の転写に及ぼす影響を調べることができる。また、転写に影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターにつないでレポーター遺伝子と共発現させることにより、その遺伝子産物のレポーター遺伝子の発現に対する影響を調べることもできる。

サンプルＳｐに導入されるマーカー遺伝子は、細胞核に局在しており、細胞核で特異的に発現する。このようにマーカー遺伝子を細胞核に局在させるために、マーカー遺伝子を導入するベクターに、発光タンパク質を細胞核に移行させる核局在シグナル配列（ＮＬＳ：Nuclear Localization Signal）を付与しておく。

マーカー遺伝子は、異なる経過時間における細胞の追跡、同定を行うために導入される。このため、マーカー遺伝子としては、細胞の成育や分裂の過程において、レポーター遺伝子よりも遺伝子発現量の変化が顕著に少ない遺伝子を用いることが好ましい。例えば、目的遺伝子の発現が薬剤などの刺激によってどのように変化するかを検出したい場合には、その薬剤の刺激によって遺伝子発現が左右されない遺伝子をマーカー遺伝子として用いるのが望ましい。また、時計遺伝子の遺伝子発現解析を行う場合には、時計遺伝子の発現量が昼と夜とで大きく変化するため、マーカー遺伝子としては、日内変動の影響を受けない遺伝子であることが望ましい。

以下、遺伝子発現解析システム１の構成を説明する。観察装置２は、サンプルＳｐを収納する容器２１と、容器２１を配置する可動式のステージ２２と、サンプルＳｐから発せられるレポーターシグナルとしての発光の像を結像した発光画像を撮像する発光画像撮像ユニット２３と、サンプルＳｐから発せられるマーカーシグナルとしての発光の像を結像した発光画像を撮像する発光画像撮像ユニット２４と、ステージ２２を２次元的に駆動するステージ駆動部２５と、発光画像撮像ユニット２３，２４の各光路の切替を行う光路切替駆動部２６と、を備える。発光画像撮像ユニット２３は、レポーターシグナル検知手段の少なくとも一部の機能を有する一方、発光画像撮像ユニット２４は、マーカーシグナル検知手段の少なくとも一部の機能を有する。

容器２１としては、シャーレ、スライドガラス、マイクロプレートのほか、ゲル支持体、微粒子担体などを適用することもできる。

発光画像撮像ユニット２３は、正立型の発光顕微鏡を用いて実現され、対物レンズ２３１と、対物レンズ２３１を介して入射してくる像を結像する結像レンズ２３２と、サンプルＳｐの発光画像や明視野画像を撮像する撮像装置２３３と、明視野画像用の白色光を発するハロゲンランプ等からなる光源２３４と、光源２３４から照射された透過光の透過および遮蔽を切り替えるシャッター２３５と、対物レンズ２３１、結像レンズ２３２およびシャッター２３５の間に挿脱可能に配置されるミラー２３６と、を有する。

対物レンズ２３１と結像レンズ２３２を含む結像光学系が極微弱な発光を画像化するための光学的条件として、投影倍率をβとするとき、（ＮＡ／β）²が０．０１以上となるように対物レンズ２３１および結像レンズ２３２を組み合わせることが望ましい。

撮像装置２３３は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等の固体撮像素子を有し、この固体撮像素子の撮像面上に結像された像を光電変換することによって画像データを生成し、データ処理装置３に出力する。撮像装置２３３は、発光画像撮像時、サンプルＳｐのレポーター遺伝子による発光を撮像可能である。この意味で、撮像装置２３３は第１の撮像手段を構成し、撮像装置２３３を除く発光画像撮像ユニット２３は、第１の結像光学系をなす。なお、撮像装置２３３が有する固体撮像素子としては、高感度のモノクロームＣＣＤ、例えば０℃以下の冷却ＣＣＤを利用することができ、好ましくは−８０〜−３０℃の冷却ＣＣＤであればよく、さらに好ましくは−６０℃程度の冷却ＣＣＤであればよい。

ミラー２３６は、データ処理装置３の制御のもと、光路切替駆動部２６によって移動する。具体的には、ミラー２３６は、明視野照明用の透過光をサンプルＳｐに照射する場合には発光画像撮像ユニット２３の光路上に挿入される一方、撮像装置２３３が発光画像を撮像する際にはその光路から離脱される。なお、ミラー２３６を手動によって動かす構成としてもよい。

発光画像撮像ユニット２４は、倒立型の発光顕微鏡を用いて実現され、対物レンズ２４１と、対物レンズ２４１を介して入射してくる像を結像する結像レンズ２４２と、サンプルＳｐの発光画像や明視野画像を撮像する撮像装置２４３と、明視野画像用の白色光を発するハロゲンランプ等からなる光源２４４と、光源２４４から発せられた白色光の透過および遮蔽を切り替えるシャッター２４５と、対物レンズ２４１、結像レンズ２４２およびシャッター２４５の間に挿脱可能に配置されるミラー２４６と、を有する。発光画像撮像ユニット２４は、正立型と倒立型の違いを除いて、上述した発光画像撮像ユニット２３と同様の構成を有する。

対物レンズ２４１は、サンプルＳｐ、容器２１およびステージ２２を挟んで対物レンズ２３１と対向する位置に配置される。

撮像装置２４３は、撮像装置２３３とは異なる色の発光を測定するために設けられている。すなわち、撮像装置２４３は、発光画像撮像時、サンプルＳｐのマーカー遺伝子による発光を撮像可能である。この意味で、撮像装置２４３は第２の撮像手段を構成し、撮像装置２４３を除く発光画像撮像ユニット２４は、第２の結像光学系をなす。

光路切替駆動部２６は、データ処理装置３の制御のもと、ミラー２３６および２４６の各光路上における挿脱を行う一方、シャッター２３５および２４５の開閉を個別に行う。なお、シャッター２３５および２４５の開閉を行う代わりに、光源２３４および２４４を点滅させるようにしてもよい。

ところで、発光画像撮像ユニット２３および発光画像撮像ユニット２４では、結像倍率を変更することができる。例えば、レポーターシグナル検出用の発光画像撮像ユニット２３の結像倍率を相対的に高くし、マーカーシグナル検出用の発光画像撮像ユニット２４の結像倍率を相対的に低くすることにより、個々の細胞のレポーター発光量の変化を細かく検出する一方、追跡用のマーカー遺伝子の発光量の変化を大雑把にとらえることができる。

次に、データ処理装置３の機能構成を、図２に示すブロック図を参照して説明する。データ処理装置３は、観察装置２から画像データを含む情報を受信するとともに、観察装置２に対して制御信号を含む情報を送信する送受信部３１と、キーボードやマウスなどによって実現され、観察装置２における測定条件等の情報や各種操作指示信号が外部から入力される入力部３２と、観察装置２から受信した情報に基づいた演算を行うとともに、遺伝子発現解析システム１の動作制御を行う制御部３３と、画像データや制御部３３における演算結果を含む情報を記憶する記憶部３４と、制御部３３における演算結果を含む情報を出力する出力部３５と、を備える。

制御部３３は、画像データをもとに細胞の発光量（発光強度）を測定する発光量測定部３３１（シグナル強度測定手段）と、遺伝子発現解析システム１が行う処理の中で所定の条件を満足しているか否かの判定を行う条件判定部３３２（判定手段）と、観察装置２から入力された画像データおよび発光量測定部３３１で測定した発光量に基づいて出力部３５が表示する画像を生成する画像生成部３３３と、マーカー遺伝子の発光量を用いることによってサンプルＳｐ中に含まれる細胞を同定する細胞同定部３３４と、解析対象の細胞を含む解析対象領域を選択する領域選択部３３５と、を有する。制御部３３は、演算機能および制御機能を有するＣＰＵなどを用いて実現される。以上の機能構成を有する制御部３３は、レポーターシグナルのシグナル強度の時間変化に基づく解析を行う解析手段の少なくとも一部の機能を具備している。

記憶部３４は、画像生成部３３３が生成した画像データを記憶する画像データ記憶部３４１と、入力部３２から入力されたサンプルＳｐの測定条件を記憶する測定条件記憶部３４２と、発光量測定部３３１が測定した発光量を記憶する発光量記憶部３４３と、を有する。記憶部３４は、本実施の形態１に係る処理や所定のＯＳを起動するプログラムなどを予め記憶するＲＯＭ、制御部３３が演算を行う際に使用する情報を一時的に記憶するＲＡＭなどを用いて実現され、記憶手段の少なくとも一部を構成する。また、記憶部３４として、ハードディスク、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＭＯディスク、ＰＣカード等の記録媒体に記録された情報を読み取ることができる補助記憶装置をさらに備えてもよい。

出力部３５は、制御部３３からの制御信号に基づいて画像を生成し、この生成した画像を表示する機能を有しており、液晶、プラズマ、有機ＥＬ等のディスプレイを具備する。なお、出力部３５として、紙などを媒体とした情報の出力が可能なプリンタを具備してもよい。

図３は、本実施の形態１に係る遺伝子発現解析方法の処理の概要を示すフローチャートである。本実施の形態１では、生物発光を用いて遺伝子発現を定量的に検出するレポーターアッセイを用いた発現量変化の検出を行う。以下の処理に先立って、サンプルＳｐには、ルシフェラーゼの発光基質であるルシフェリンをサンプルＳｐの培養液に添加する処理や、解析内容に応じた処理（刺激光を加える処理等）が適宜施されているものとする。また、発光画像撮像ユニット２３の光源２３４および発光画像撮像ユニット２４の光源２４４は予め点灯しており、一連の処理中は点灯状態を維持するものとする。

まず、データ処理装置３は、入力部３２から測定条件の入力を受け付け、記憶部３４の測定条件記憶部３４２に記憶する（ステップＳ１）。測定条件は、観察装置２における撮影の際の条件やサンプルＳｐの培養の条件などである。このステップＳ１で入力を受け付ける際、出力部３５が所定の条件入力画面を表示し、各種条件の選択入力を利用者に促すようにしてもよい。

この後、観察装置２は、発光画像撮像ユニット２３、２４の各光路を明視野画像用の光路へ切り替える（ステップＳ２）。具体的には、光路切替駆動部２６が、データ処理装置３の制御部３３から送信されてくる制御信号に応じて、発光画像撮像ユニット２３のシャッター２３５を開くとともにミラー２３６を発光画像撮像ユニット２３の光路上に挿入する一方、発光画像撮像ユニット２４のシャッター２４５を閉じるとともにミラー２４６を発光画像撮像ユニット２４の光路上から離脱させる。これにより、光源２３４が発する白色光はミラー２３６で反射され、サンプルＳｐを透過し、対物レンズ２４１、結像レンズ２４２を介して撮像装置２４３に入射する。

撮像装置２４３は、制御部３３から送信されてくる制御信号に応じて明視野画像を撮像する（ステップＳ３）。撮像した画像データはデータ処理装置３に送信される。

続いて、ステップＳ３で撮像した明視野画像の画像データをもとに、撮像装置２４３が撮像する明視野画像の撮像領域の設定が行われる（ステップＳ４）。この際の設定は、制御部３３が、画像データに対して所定の画像処理を施し、自動的に撮像領域を設定してもよいし、画像データに基づく明視野画像を出力部３５が表示し、この表示された明視野画像を見た利用者が入力部３２によって所望の撮像領域を設定入力してもよい。制御部３３は、設定された撮像領域を含む制御信号を観察装置２に送信する。観察装置２では、ステージ駆動部２５が、受信した制御信号に基づいてステージ２２を駆動する。なお、ステージ２２は、手動で動かすことができるようにしておいてもよい。

次に、データ処理装置３は、撮像領域設定処理の後に撮像した明視野画像の画像データを撮像時刻の情報とともに記憶部３４の画像データ記憶部３４１に格納して記憶する（ステップＳ５）。図４は、撮像装置２４３が撮像した明視野画像（領域設定後）の出力部３５における表示出力例を示す模式図である。図４に示す明視野画像Ｐ１においては、撮像領域内に５つの細胞が撮像された場合を示している。

続いて、観察装置２は、発光画像撮像ユニット２３、２４の各光路を発光画像用の光路へ切り替える（ステップＳ６）。具体的には、光路切替駆動部２６が、データ処理装置３の制御部３３から送信されてくる制御信号に応じて、発光画像撮像ユニット２３のシャッター２３５を閉じるとともにミラー２３６を発光画像撮像ユニット２３の光路上から離脱させる。これにより、光源２４４に加えて光源２３４が照射する光もサンプルＳｐに照射されなくなり、撮像装置２３３、２４３は、サンプルＳｐから発せられる発光を撮像することが可能な状態となる。

この後、撮像装置２３３、２４３は、サンプルＳｐの発光画像を撮像し、この撮像した発光画像の画像データをデータ処理装置３へ送信する。データ処理装置３は、受信した発光画像の画像データを撮像時刻の時刻情報とともに画像データ記憶部３４１に書き込んで記憶する（ステップＳ７）。

続いて、データ処理装置３は、ステップＳ７で撮像した発光画像が一連の処理の中で初めて撮像した発光画像である場合（ステップＳ８，Ｙｅｓ）、撮像領域内に発光している細胞があるか否かを判定する（ステップＳ９）。この判定の結果、撮像領域内に発光している細胞が存在している場合（ステップＳ９，Ｙｅｓ）には、後述するステップＳ１０に進む。他方、判定の結果、撮像領域内に発光している細胞が存在していない場合（ステップＳ９，Ｎｏ）、ステップＳ２に戻って明視野画像の撮像処理からやり直す。

なお、ステップＳ９において発光している細胞の有無を判定する際には、利用者が撮像した発光画像を出力部３５で表示出力したものを目視することによって判定し、この判定結果に基づいて処理を選択するようにしてもよい。

データ処理装置３は、ステップＳ７で撮像した発光画像が一連の処理の中で初めて撮像した発光画像ではない場合（ステップＳ８，Ｎｏ）、後述するステップＳ１０に進む。

ステップＳ１０において、発光量測定部３３１は、画像データ記憶部３４１で記憶する発光画像の画像データを用いて細胞ごとの発光量（発光強度）を測定し、撮像領域内での位置情報（座標等で識別）および時刻情報とともに発光量記憶部３４３に書き込んで記憶する（ステップＳ１０）。

この後、条件判定部３３２は、ステップＳ１０終了後の状態が所定の画像生成条件を満たしているか否かを判定する（ステップＳ１１）。ここでいう画像生成条件とは、例えば以下に示す条件（１）〜（３）のいずれか１つを用いて定義される。
（１）発光画像の撮像回数が所定回数に到達。
（２）発光画像の発光量が所定値より大。
（３）最初の発光画像の撮像時刻から一定時間が経過。

条件判定部３３２が判定した結果、画像生成条件を満たしていない場合（ステップＳ１１，Ｎｏ）、条件判定部３３２は、明視野画像の撮像を再度行うか否かを判定する（ステップＳ１２）。ここでの判定は、測定条件記憶部３４２で記憶する測定条件を用いることによって行われる。条件判定部３３２の判定の結果、明視野画像を再度撮像するとき（ステップＳ１２，Ｙｅｓ）、観察装置２は、データ処理装置３の制御のもと、明視野画像用光路への切り替えを行う（ステップＳ１３）。ステップＳ１３における光路切替は、上述したステップＳ２で説明したのと同じ光路への切替である。

この後、観察装置２は、撮像領域を変更することなく明視野画像を撮像し、この撮像した明視野画像の画像データをデータ処理装置３へ送信する。データ処理装置３は、受信した明視野画像の画像データを撮像時刻の時刻情報とともに画像データ記憶部３４１に書き込んで記憶する（ステップＳ１４）。

続いて、遺伝子発現解析システム１は、ステップＳ６に戻って発光画像用光路への切替を行った後、それに続くステップＳ７以降の処理を繰り返し行う。

ステップＳ１２における条件判定部３３２の判定の結果、明視野画像を再度撮像しないとき（ステップＳ１２，Ｎｏ）、遺伝子発現解析システム１は、発光画像の撮像処理（ステップＳ７）を再度行い、それに続くステップＳ８以降の処理を繰り返し行う。

なお、ステップＳ１２において、条件判定部３３２が明視野画像を撮像するか否かの判定を行う際には、利用者に対して明視野画像を撮像するか否かの選択をその都度促すようにしてもよい。

次に、ステップＳ１１における条件判定部３３２の判定の結果、画像生成条件を満たしている場合（ステップＳ１１，Ｙｅｓ）について説明する。この場合、データ処理装置３では、制御部３３の画像生成部３３３が、互いに対応する明視野画像および発光画像を画像データ記憶部３４１から読み出し、この読み出した明視野画像および発光画像を重ね合わせた画像を生成する（ステップＳ１５）。本実施の形態１では、発光画像として、撮像装置２３３、２３４がそれぞれ撮像した２種類の発光画像がある。そこで、画像生成部３３３は、明視野画像と２種類の発光画像との重ね合わせを行う。この際、撮像装置２３３で撮像した発光画像は、撮像装置２４３で撮像した明視野画像や発光画像と上下逆方向から撮像しているため、画像生成部３３３は、この発光画像に対しては、重ね合わせを行う前に鏡映（鏡像変換）を施す。

この後、出力部３５が、画像生成部３３３で生成した重ね合わせ画像を表示する（ステップＳ１６）。図５は、明視野画像および発光画像を重ね合わせた画像の表示例を示す模式図である。同図に示す重ね合わせ画像Ｐ２では、サンプルＳｐの細胞は、レポーター遺伝子とマーカー遺伝子の各発現に伴う２色の発光を生じる。例えば、細胞Ｃ１において、点状領域Ｍが細胞核に局在したマーカー遺伝子としてのルシフェラーゼの発光を示し、細胞質に対応する面状領域Ｒがレポーター遺伝子としてのルシフェラーゼの発光を示している。なお、細胞Ｃ５は、レポーター遺伝子およびマーカー遺伝子の各発現に伴う発光を生じていない。図５では、マーカー遺伝子の発光が細胞核に局在しているのに対して、レポーター遺伝子の発光が細胞全体にわたっている状況を模式的に示している。なお、重ね合わせ画像Ｐ２におけるマーカー遺伝子やレポーター遺伝子の各発光部分に対して、互いに異なる擬似カラーを付与してもよい。

図６は、明視野画像および発光画像を重ね合わせた画像の出力部３５における表示出力例（第２例）を示す模式図である。図６においては、出力部３５が、発光画像の取得時刻（ｔ₁，ｔ₂，ｔ₃，ｔ₄）に応じて明視野画像と発光画像との重ね合わせ画像Ｐ３をアニメーション表示した場合を模式的に示している。このように出力部３５がアニメーション表示を行うことにより、利用者は、サンプルＳｐの細胞ごとの発光量の時間変化を視覚的に把握することができる。

続いて、細胞同定部３３４は、マーカー遺伝子の発光量や形状を認識することによって異なる経過時間における細胞の同定を行う（ステップＳ１７）。

この後、領域選択部３３５は、ステップＳ１７で同定した細胞の中で解析対象とする細胞を含む解析対象領域を選択する（ステップＳ１８）。領域選択部３３５が解析対象領域を選択する際には、レポーター遺伝子やマーカー遺伝子の発光量の閾値に基づいて測定領域を自動的に指定してもよいし、画像のＳ／Ｎ比に基づいて測定領域を自動的に指定してもよい。このステップＳ１８で選択した解析対象領域は、その領域に含まれる細胞のマーカー遺伝子によって特定されるため、細胞が移動すれば解析対象領域の位置も移動する。なお、重ね合わせ画像を見た利用者が入力部３２から所望の解析対象領域を入力し、この入力に応じて領域選択部３３５が解析対象領域を選択するようにすることも可能である。

続いて、画像生成部３３３は、解析対象領域の経過時間ごとの発光強度を順次読み出し、この読み出した発光強度を用いて解析対象領域の発光強度の時間変化を示すグラフを生成し、この生成したグラフを出力部３５が表示する（ステップＳ１９）。

図７は、解析対象領域に含まれる細胞のレポーター遺伝子の発光量の時間変化を示す図である。図７においては、図５に示す４つの細胞Ｃ１〜Ｃ４の時間変化が示されている（細胞Ｃ５は発現していない）。このようなグラフを出力部３５が表示出力することにより、利用者は、発光量の時間変化を視覚的に把握することができる。

以上説明した本発明の実施の形態１によれば、発光タンパク質からなるレポーター遺伝子を導入するとともに、細胞核に特異的に発現するマーカー遺伝子によって標識した複数の生きた細胞に対し、レポーター遺伝子の発現によって上昇するレポーターシグナルを互いに異なる経過時間で検知する一方、マーカー遺伝子の発現によって上昇するマーカーシグナルを互いに異なる経過時間で検知し、検知した複数のマーカーシグナルを用いて異なる経過時間における細胞の同定を行い、同定した細胞の少なくとも一部に対して、レポーターシグナルのシグナル強度の時間変化に基づく解析を行うことにより、長期間にわたって細胞を追跡することができ、その細胞に導入された遺伝子の発現を精度よく解析することが可能となる。

また、本実施の形態１によれば、細胞核は細胞質に比べて形状の変化が少ない細胞核にマーカー遺伝子を局在させたため、細胞の同定が容易となる。したがって、ソフトウェアによる自動認識にも好適である。

さらに、本実施の形態１によれば、マーカー遺伝子として発光タンパク質を適用しているため、定量性に優れ、細胞へのダメージも極力抑えた観察を行うことが可能となる。特に、レポーター遺伝子やマーカー遺伝子としてルシフェラーゼを用いる場合、ルシフェラーゼは励起光を照射せずに観察できる化学的励起型の発光酵素であるため、サンプルに損傷を与えることがなく、数日〜数週間程度の長期的な観察が可能となる。

なお、本実施の形態１では、マーカー遺伝子も発光タンパク質であることに鑑み、マーカー遺伝子をレポーター遺伝子の補正の指標として用いてもよい。レポーター遺伝子やマーカー遺伝子として一過性の発現細胞を用いる場合、レポーター遺伝子およびマーカー遺伝子の各導入効率や発現に個々の細胞で大きなばらつきが生じる。そこで、恒常的に発現するハウスキーピング遺伝子（βアクチン、ＧＡＰＤＨ（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase）など）をマーカー遺伝子として適用し、レポーター遺伝子の発光強度を同じ細胞のマーカー遺伝子の発光強度を用いて補正することにより、細胞間の遺伝子発現のばらつきを抑えて平均化することができる。このようなシグナル強度補正手段としての機能は、制御部３３に具備させることができる。

また、本実施の形態１では、一方の撮像装置２４３のみが明視野画像を撮像する場合を説明したが、撮像装置２３３側でも明視野画像を撮像することができる。これにより、２つの明視野画像間で補正を行うこともでき、より高精度な明視野画像を得ることが可能となる。

また、本実施の形態１では、発光画像撮像ユニット２３がマーカー遺伝子による発光を検知して撮像する一方、発光画像撮像ユニット２４がレポーター遺伝子による発光を検知して撮像するようにしてもよい。

（変形例）
図８は、本実施の形態１の一変形例に係る遺伝子発現解析システムの構成を示す図である。同図に示す遺伝子発現解析システム４は、上述した実施の形態１と観察装置の構成が異なり、一つの発光画像撮像ユニットがレポーター遺伝子による発光とマーカー遺伝子による発光とをともに撮像可能である。なお、実施の形態１と同じ構成を有する部位については、図１等と同じ符号を付してある。

観察装置５は、サンプルＳｐを収納する容器２１と、容器２１を配置する可動式のステージ２２と、複数の生きた細胞からなるサンプルＳｐの発光画像を撮像する発光画像撮像ユニット５１と、明視野画像用の白色光をサンプルＳｐに照射する透過照明ユニット５２と、ステージ２２を２次元的に駆動するステージ駆動部２５と、透過照明ユニット５２の光路の切替を行う光路切替駆動部５３と、を備える。

発光画像撮像ユニット５１は、具体的には正立型の発光顕微鏡を用いて実現され、対物レンズ５１１と、サンプルＳｐから発せられた発光を色別に分離するダイクロイックミラー５１２と、ダイクロイックミラー５１２によって分離された２色の成分ごとの像をそれぞれ結像する結像レンズ５１３ａ、５１３ｂと、結像レンズ５１３ａ、５１３ｂでそれぞれ結像された２色の成分の発光画像を撮像する撮像装置５１４ａ、５１４ｂと、を備える。なお、ダイクロイックミラー５１２を用いる代わりに、スプリットイメージユニットまたはフィルターホイールを用いてもよい。

透過照明ユニット５２は、透過照明用の白色光を発するハロゲンランプ等の光源５２１と、白色光の照射および未照射を切り換えるシャッター５２２と、光源５２１からの白色光をサンプルＳｐ上に集光させる照明レンズ系５２３とを備え、サンプルＳｐに対して発光画像撮像ユニットと反対側に配置されている。

照明レンズ系５２３は、コレクタレンズ５２３ａおよびコンデンサーレンズ５２３ｂを有し、サンプルＳｐに対してクリティカル照明を行う。なお、照明レンズ系５２３は、サンプルＳｐに対してケーラー照明を行うようにしてもよい。

以上の構成を有する遺伝子発現解析システム４によれば、上記実施の形態１に係る遺伝子発現解析システム１と同様の効果を得ることができる。

（実施の形態２）
図９は、本発明の実施の形態２に係る遺伝子発現解析システムの全体構成を模式的に示す図である。同図に示す遺伝子発現解析システム６は、複数の生きた細胞からなるサンプルＳｐを撮像することによってサンプルＳｐから発せられる遺伝子発現のシグナルを画像データとして光学的に測定する観察装置７と、観察装置７との間でデータの送受信が可能であり、観察装置７の駆動制御を行うとともに、観察装置７から送られてくる画像データを用いた演算処理を行うデータ処理装置３と、を有し、これら２つの装置が連携してサンプルＳｐの遺伝子発現量変化を検出する。なお、図９において、図１に示す遺伝子発現解析システム１と同じ構成部位については、図１と同じ符号を付してある。

サンプルＳｐを構成する複数の生きた細胞には、発光タンパク質からなるレポーター遺伝子と、蛍光タンパク質からなり、細胞核で特異的に発現するマーカー遺伝子とが導入されている。本実施の形態２では、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを適用する。ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質を細胞に導入する際には、従来知られている方法のいずれかを適用することができる。なお、マーカー遺伝子としての蛍光タンパク質を細胞に導入する代わりに、蛍光色素を用いて細胞核を染色してもよい。

観察装置７は、サンプルＳｐを収納する容器２１と、容器２１を配置する可動式のステージ２２と、サンプルＳｐから発せられるレポーターシグナルとしての発光の像を結像した発光画像を撮像する発光画像撮像ユニット２３と、ステージ２２を２次元的に駆動するステージ駆動部２５と、サンプルＳｐから発せられるマーカーシグナルとしての蛍光の像を結像した蛍光画像を撮像する蛍光画像撮像ユニット７１と、発光画像撮像ユニット２３および蛍光画像撮像ユニット７１の各光路の切替を行う光路切替駆動部７２と、を備える。

蛍光画像撮像ユニット７１は、倒立型の蛍光顕微鏡を用いて実現され、対物レンズ７１１と、対物レンズ７１１を介して入射してくる像を結像する結像レンズ７１２と、サンプルＳｐの蛍光画像や明視野画像を撮像する撮像装置７１３と、サンプルＳｐを励起する励起光を発する光源７１４と、光源７１４から照射された透過光の透過および遮蔽を切り替えるシャッター７１５と、対物レンズ７１１、結像レンズ７１２およびシャッター７１５の間に挿脱可能に配置され、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラー７１６と、を備える。

撮像装置７１３は、蛍光画像撮像時、サンプルＳｐのマーカー遺伝子による蛍光の発光を撮像する。この意味で、撮像装置７１３は第２の撮像手段を構成し、撮像装置７１３を除く蛍光画像撮像ユニット７１は、第２の結像光学系をなす。この第２の結像光学系は、蛍光の像を４０倍以上の高倍率で結像する。

光源７１４は、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、レーザー等のいずれかによって実現される。本実施の形態２における蛍光の波長領域は可視光領域であり、４００〜８００ｎｍ程度の領域である。

ダイクロイックミラー７１６は、光源７１４から発せられた励起光を反射してサンプルＳｐへ照射する一方、サンプルＳｐから発せられた蛍光を透過する。

光路切替駆動部７２は、データ処理装置３の制御のもと、ミラー２３６およびダイクロイックミラー７１６の各光路上における挿脱を行う一方、シャッター２３５および７１５の開閉を個別に行う。なお、シャッター２３５および７１５の開閉を行う代わりに、光源２３４および７１４を点滅させるようにしてもよい。

図１０は、本実施の形態２に係る遺伝子発現解析方法の処理の概要を示すフローチャートである。本実施の形態２の場合も、サンプルＳｐには、所定の化合物を添加する処理や刺激光を加える処理等が施されているものとする。また、発光画像撮像ユニット２３の光源２３４および蛍光画像撮像ユニット７１の光源７１４は予め点灯しており、一連の処理中は点灯状態を維持するものとする。

まず、データ処理装置３は、入力部３２から測定条件の入力を受け付け、記憶部３４の測定条件記憶部３４２に記憶する（ステップＳ２１）。

この後、観察装置７は、発光画像撮像ユニット２３および蛍光画像撮像ユニット７１の各光路を明視野画像用の光路へ切り替える（ステップＳ２２）。具体的には、光路切替駆動部７２が、データ処理装置３の制御部３３から送信されてくる制御信号に応じて、発光画像撮像ユニット２３のシャッター２３５を開くとともにミラー２３６を発光画像撮像ユニット２３の光路上に挿入する一方、蛍光画像撮像ユニット７１のシャッター７１５を閉じるとともにダイクロイックミラー７１６を蛍光画像撮像ユニット７１の光路上から離脱させる。これにより、光源２３４が発する白色光はミラー２３６で反射され、サンプルＳｐを透過し、対物レンズ７１１、結像レンズ７１２を介して撮像装置７１３に入射する。

撮像装置７１３は、データ処理装置３の制御部３３から送信されてくる制御信号に応じて明視野画像を撮像する（ステップＳ２３）。撮像した画像データはデータ処理装置３に送信される。

続いて、ステップＳ２３で撮像した明視野画像の画像データをもとに、撮像装置７１３が撮像する明視野画像の撮像領域の設定が、上記実施の形態１に係る遺伝子発現解析方法のステップＳ４と同様に行われる（ステップＳ２４）。制御部３３は、設定された撮像領域を含む制御信号を観察装置７に送信する。観察装置７では、ステージ駆動部２５が、受信した制御信号に基づいてステージ２２を駆動する。

次に、データ処理装置３は、撮像領域設定処理の後に撮像した明視野画像の画像データを撮像時刻の情報とともに画像データ記憶部３４１に格納して記憶する（ステップＳ２５）。

続いて、観察装置７は、発光画像撮像ユニット２３および蛍光画像撮像ユニット７１の各光路を蛍光画像用の光路へ切り替える（ステップＳ２６）。具体的には、光路切替駆動部７２が、データ処理装置３の制御部３３から送信されてくる制御信号に応じて、発光画像撮像ユニット２３のシャッター２３５を閉じるとともにミラー２３６を発光画像撮像ユニット２３の光路上から離脱させる一方、蛍光画像撮像ユニット７１のダイクロイックミラー７１６を蛍光画像撮像ユニット７１の光路上に挿入する。これにより、光源２３４からの光が遮蔽される一方、光源７１４が照射する励起光がサンプルＳｐに照射され、撮像装置７１３は、サンプルＳｐから発せられる蛍光を撮像することが可能な状態となる。

この後、撮像装置７１３は、サンプルＳｐの蛍光画像を撮像し、データ処理装置３の記憶部３４の画像データ記憶部３４１に撮像時刻の時刻情報とともに記憶する（ステップＳ２７）。

続いて、データ処理装置３は、ステップＳ２７で撮像した蛍光画像が一連の処理の中で初めて撮像した蛍光画像である場合（ステップＳ２８，Ｙｅｓ）、撮像領域内に蛍光を発している細胞があるか否かを判定する（ステップＳ２９）。この判定の結果、撮像領域内に蛍光を発している細胞が存在している場合（ステップＳ２９，Ｙｅｓ）には、続くステップＳ３０に進む。他方、判定の結果、撮像領域内に蛍光を発している細胞が存在していない場合（ステップＳ２９，Ｎｏ）、ステップＳ２２に戻って明視野画像の撮像処理からやり直す。

なお、ステップＳ２９において蛍光により発光している細胞の有無を判定する際には、撮像した蛍光画像を出力部３５で表示出力したものを利用者が目視して判断し、その判断結果に応じて以後の処理を選択するようにしてもよい。

データ処理装置３は、ステップＳ２７で撮像した発光画像が一連の処理の中で初めて撮像した発光画像ではない場合（ステップＳ２８，Ｎｏ）、後述するステップＳ３０に進む。

ステップＳ３０において、発光量測定部３３１は、画像データ記憶部３４１で記憶する蛍光画像を用いて細胞ごとの発光量（発光強度）を測定し、撮像領域内での位置情報（座標等で識別）および時刻情報とともに発光量記憶部３４３に書き込んで記憶する（ステップＳ３０）。

続いて、観察装置７は、発光画像撮像ユニット２３および蛍光画像撮像ユニット７１の各光路を発光画像用の光路へ切り替える（ステップＳ３１）。具体的には、光路切替駆動部２６が、データ処理装置３の制御部３３から送信されてくる制御信号に応じて、発光画像撮像ユニット２３のシャッター２３５を閉じるとともにミラー２３６を発光画像撮像ユニット２３の光路上から離脱させる一方、蛍光画像撮像ユニット７１のシャッター７１５を閉じるとともにダイクロイックミラー７１６を蛍光画像撮像ユニット７１の光路上から離脱させる。これにより、光源２３４に加えて光源７１４が照射する光もサンプルＳｐに照射されなくなり、撮像装置２３３、７１３は、サンプルＳｐから発せられる発光を撮像することが可能な状態となる。

この後、撮像装置２３３は、サンプルＳｐの発光画像を撮像し、データ処理装置３の記憶部３４の画像データ記憶部３４１に撮像時刻の時刻情報とともに記憶する（ステップＳ３２）。

続いて、データ処理装置３は、ステップＳ３２で撮像した発光画像が一連の処理の中で初めて撮像した発光画像である場合（ステップＳ３３，Ｙｅｓ）、撮像領域内に発光している細胞があるか否かを判定する（ステップＳ３４）。この判定の結果、撮像領域内に発光している細胞が存在している場合（ステップＳ３４，Ｙｅｓ）には、後述するステップＳ３５に進む。他方、判定の結果、撮像領域内に発光している細胞が存在していない場合（ステップＳ３４，Ｎｏ）、ステップＳ２２に戻って明視野画像の撮像処理からやり直す。

データ処理装置３は、ステップＳ３７で撮像した発光画像が一連の処理の中で初めて撮像した発光画像ではない場合（ステップＳ３３，Ｎｏ）、後述するステップＳ３５に進む。

ステップＳ３５において、発光量測定部３３１は、画像データ記憶部３４１で記憶する発光画像を用いて細胞ごとの発光量（発光強度）を測定し、撮像領域内での位置情報（座標等で識別）および時刻情報とともに発光量記憶部３４３に書き込んで記憶する（ステップＳ３５）。

この後、条件判定部３３２は、ステップＳ３５終了後の状態が所定の画像生成条件を満たしているか否かを判定する（ステップＳ３６）。ここでいう画像生成条件とは、上記実施の形態１で説明した条件と同様である。

条件判定部３３２が判定した結果、画像生成条件を満たしていない場合（ステップＳ３６，Ｎｏ）、条件判定部３３２は、明視野画像の撮像を再度行うか否かを判定する（ステップＳ３７）。条件判定部３３２の判定の結果、明視野画像を再度撮像するとき（ステップＳ３７，Ｙｅｓ）、観察装置７は、データ処理装置３の制御のもと、明視野画像用光路への切り替えを行う（ステップＳ３８）。ステップＳ３８における光路切替は、上述したステップＳ２２で説明したのと同じ光路への切替である。

この後、観察装置７は、撮像領域を変更することなく明視野画像を撮像し、この撮像した明視野画像の画像データをデータ処理装置３へ送信する。データ処理装置３は、受信した明視野画像の画像データを撮像時刻の時刻情報とともに画像データ記憶部３４１に書き込んで記憶する（ステップＳ３９）。

続いて、遺伝子発現解析システム６は、ステップＳ２６に戻って発光画像用光路への切替を行った後、それに続くステップＳ２６以降の処理を繰り返し行う。

ステップＳ３７における条件判定部３３２の判定の結果、明視野画像を再度撮像しないとき（ステップＳ３７，Ｎｏ）、遺伝子発現解析システム６は、ステップＳ２６に戻って発光画像用光路への切替を行った後、それに続くステップＳ２６以降の処理を繰り返し行う。

次に、ステップＳ３６における条件判定部３３２の判定の結果、画像生成条件を満たしている場合（ステップＳ３６，Ｙｅｓ）について説明する。この場合、データ処理装置３では、制御部３３の画像生成部３３３が、互いに対応する明視野画像、蛍光画像および発光画像を画像データ記憶部３４１から読み出し、この読み出した明視野画像および発光画像を重ね合わせた画像を生成する（ステップＳ４０）。重ね合わせを行う際、撮像装置２３３で撮像した発光画像は、撮像装置７１３で撮像した明視野画像や蛍光画像と上下逆方向から撮像しているため、画像生成部３３３は、この発光画像に対しては、重ね合わせを行う前に鏡映（鏡像変換）を施す。

この後、出力部３５が、画像生成部３３３で生成された重ね合わせ画像を表示する（ステップＳ４１）。この際には、上記実施の形態１で説明した図５や図６に示すのと同様の表示を行う。

以降のステップＳ４２〜Ｓ４４の処理は、上記実施の形態１に係る遺伝子発現解析方法で説明したステップＳ１６〜Ｓ１９の処理と同様である。

以上説明した本発明の実施の形態２によれば、発光タンパク質からなるレポーター遺伝子を導入するとともに、細胞核に特異的に発現するマーカー遺伝子によって標識した複数の生きた細胞に対し、レポーター遺伝子の発現によって上昇するレポーターシグナルを互いに異なる経過時間で検知する一方、マーカー遺伝子の発現によって上昇するマーカーシグナルを互いに異なる経過時間で検知し、検知した複数のマーカーシグナルを用いて異なる経過時間における細胞の同定を行い、同定した細胞の少なくとも一部に対して、レポーターシグナルのシグナル強度の時間変化に基づく解析を行うことにより、長期間にわたって細胞を追跡することができ、その細胞に導入された遺伝子の発現を精度よく解析することが可能となる。

また、本実施の形態２によれば、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質を適用したことにより、発光強度が大きく、より鮮明な画像が得られ、細胞の同定を行いやすい。このため、細胞が何層にも重なっている場合の検出などにおいても、立体的な解析を行うことができる。加えて、撮像装置の撮像時間（露出時間）がミリ秒程度と短時間で済むため、レポーター遺伝子の発現が低く、観察のインターバル時間中はできるだけレポーター遺伝子観察のための露出時間を確保したい場合などに好適である。

なお、発光画像撮像ユニットと蛍光画像撮像ユニットの配置を上下入れ替えてもよい。この場合には、蛍光よりも微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニットを下側に配置することとなるため、観察装置のカバーの開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断することができ、発光画像のＳ／Ｎ比を増すことができる。

ここまで、本発明を実施するための最良の形態として、実施の形態１、２を詳述してきたが、本発明はそれらの実施の形態によって限定されるべきものではない。すなわち、本発明は、ここでは記載していない様々な実施の形態等を含みうるものであり、特許請求の範囲により特定される技術的思想を逸脱しない範囲内において種々の設計変更等を施すことが可能である。

本発明の実施の形態１に係る遺伝子発現解析システムの全体構成を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態１に係る遺伝子発現解析システムが備えるデータ処理装置の機能構成を示すブロック図である。 本発明の実施の形態１に係る遺伝子発現解析方法の処理の概要を示すフローチャートである。 明視野画像の表示例を示す模式図である。 明視野画像および発光画像を重ね合わせた画像の表示例（第１例）を示す模式図である。 明視野画像および発光画像を重ね合わせた画像の表示例（第２例）を示す模式図である。 解析対象の細胞のレポーター遺伝子の発光量の時間変化を示す図である。 本発明の実施の形態１の変形例に係る遺伝子発現解析システムの全体構成を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態２に係る遺伝子発現解析システムの全体構成を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態２に係る遺伝子発現解析方法の処理の概要を示すフローチャートである。

符号の説明

１、４、６ 遺伝子発現解析システム
２、５、７ 観察装置
３ データ処理装置
２１ 容器
２２ ステージ
２３、２４、５１ 発光画像撮像ユニット
２５ ステージ駆動部
２６、５３、７２ 光路切替駆動部
３１ 送受信部
３２ 入力部
３３ 制御部
３４ 記憶部
３５ 出力部
５２ 透過照明ユニット
７１ 蛍光画像撮像ユニット
２３１、２４１、５１１、７１１ 対物レンズ
２３２、２４２、５１３ａ、５１３ｂ、７１２ 結像レンズ
２３３、２４３、５１４ａ、５１４ｂ、７１３ 撮像装置
２３４、２４４、５２１、７１４ 光源
２３５、２４５、５２２、７１５ シャッター
２３６、２４６ ミラー
３３１ 発光量測定部
３３２ 条件判定部
３３３ 画像生成部
３３４ 細胞同定部
３３５ 領域選択部
３４１ 画像データ記憶部
３４２ 測定条件記憶部
３４３ 発光量記憶部
５１２、７１６ ダイクロイックミラー
５２３ 照明レンズ系
５２３ａ コレクタレンズ
５２３ｂ コンデンサーレンズ
Ｐ１ 明視野画像
Ｐ２、Ｐ３ 重ね合わせ画像
Ｓｐ サンプル

Claims (15)

1. 発光タンパク質からなるレポーター遺伝子を導入するとともに、細胞核で特異的に発現するマーカー遺伝子によって標識した複数の生きた細胞に対し、前記レポーター遺伝子の発現を解析する遺伝子発現解析方法であって、
   前記レポーター遺伝子の発現によって上昇するレポーターシグナルおよび前記マーカー遺伝子の発現によって上昇するマーカーシグナルをそれぞれ検知可能であり、前記レポーターシグナルおよび前記マーカーシグナルに関する情報を記憶する記憶手段を備えた遺伝子発現解析システムが、
   前記レポーターシグナルを光学的に検知するレポーターシグナル検知ステップと、
   前記レポーターシグナル検知ステップで検知したレポーターシグナルのシグナル強度を測定し、この測定した結果を前記記憶手段に記憶するレポーターシグナル強度測定ステップと、
   前記マーカーシグナルを光学的に検知するマーカーシグナル検知ステップと、
   前記マーカーシグナル検知ステップで検知したマーカーシグナルのシグナル強度を測定し、この測定した結果を前記記憶手段に記憶するマーカーシグナル強度測定ステップと、
   を異なる経過時間ごとに繰り返し行った後、
   複数の前記マーカーシグナルのシグナル強度を含む情報を前記記憶手段から読み出し、この読み出した情報を用いて異なる経過時間における細胞の同定を行う細胞同定ステップと、
   前記細胞同定ステップで同定した複数の細胞の少なくとも一部に対し、前記レポーターシグナルのシグナル強度の時間変化に基づく解析を行う解析ステップと、
   を行うことを特徴とする遺伝子発現解析方法。
2. 前記細胞同定ステップの前に、
   前記レポーターシグナル検知ステップ、前記レポーターシグナル強度測定ステップ、前記マーカーシグナル検知ステップおよび前記マーカーシグナル強度測定ステップを繰り返し行うか否かを判定する判定ステップ
   をさらに行うことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現解析方法。
3. 前記細胞同定ステップの前に、
   前記レポーターシグナルの像と前記マーカーシグナルの像とを重ね合わせた画像を異なる経過時間ごとに生成する画像生成ステップと、
   前記画像生成ステップで生成した画像を出力する出力ステップと、
   をさらに行うことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現解析方法。
4. 前記レポーター遺伝子はルシフェラーゼであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子発現解析方法。
5. 前記マーカー遺伝子は、前記レポーター遺伝子と異なる色を示す波長の光を発する発光タンパク質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子発現解析方法。
6. 前記マーカー遺伝子はルシフェラーゼであることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子発現解析方法。
7. 前記解析ステップは、
   前記レポーターシグナルのシグナル強度を、同じ細胞における前記マーカーシグナルのシグナル強度を用いて補正するシグナル強度補正ステップを含むことを特徴とする請求項５または６に記載の遺伝子発現解析方法。
8. 前記マーカー遺伝子は蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子発現解析方法。
9. 前記細胞は、前記マーカー遺伝子が導入されてなり、
   前記細胞の成育または分裂の過程において、前記マーカーの発現量の変化は、前記レポーター遺伝子の発現量の変化と比較して無視しうることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子発現解析方法。
10. 発光タンパク質からなるレポーター遺伝子を導入するとともに、細胞核で特異的に発現するマーカー遺伝子によって標識した複数の生きた細胞に対し、前記レポーター遺伝子の発現を解析する遺伝子発現解析システムであって、
    前記レポーター遺伝子の発現に伴って発生するレポーターシグナルの光学的な検知を異なる経過時間ごとに繰り返し行うレポーターシグナル検知手段と、
    前記マーカー遺伝子によって発生するマーカーシグナルの光学的な検知を異なる経過時間ごとに繰り返し行うマーカーシグナル検知手段と、
    前記レポーターシグナル検知手段が検知したレポーターシグナルのシグナル強度および前記マーカーシグナル検知手段が検知したマーカーシグナルのシグナル強度をそれぞれ測定するシグナル強度測定手段と、
    複数の前記マーカーシグナルのシグナル強度を含む情報を用いることによって異なる経過時間における細胞の同定を行う細胞同定手段と、
    前記細胞同定手段で同定した細胞の少なくとも一部に対し、前記レポーターシグナル検知手段で検知したレポーターシグナルのシグナル強度の時間変化に基づく解析を行う解析手段と、
    を備えたことを特徴とする遺伝子発現解析システム。
11. 前記レポーターシグナル検知手段および前記マーカーシグナル検知手段における繰り返し処理を続行するか否かを判定する判定手段
    をさらに備え、
    前記細胞同定手段は、
    前記判定手段が繰り返し処理を続行しないと判定した場合、異なる経過時間における細胞の同定を行うことを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子発現解析システム。
12. 前記レポーターシグナルの像と前記マーカーシグナルの像とを重ね合わせた画像を異なる経過時間ごとに生成する画像生成手段と、
    前記画像生成手段が生成した画像を出力する出力手段と、
    をさらに備えたことを特徴とする請求項１０または１１に記載の遺伝子発現解析システム。
13. 前記レポーターシグナル検知手段は、
    前記レポーターシグナルの像を結像する第１の結像光学系と、
    前記第１の結像光学系で結像した前記レポーターシグナルの像を撮像する第１の撮像手段と、
    を有することを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子発現解析システム。
14. 前記マーカーシグナル検知手段は、
    前記マーカーシグナルの像を結像する第２の結像光学系と、
    前記第２の結像光学系で結像した前記マーカーシグナルの像を撮像する第２の撮像手段と、
    を有することを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子発現解析システム。
15. 前記マーカー遺伝子は、前記レポーター遺伝子と異なる色を示す波長の光を発する発光タンパク質であり、
    前記解析手段は、前記レポーターシグナルのシグナル強度を、同じ細胞における前記マーカーシグナルのシグナル強度を用いて補正するシグナル強度補正手段を有することを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子発現解析システム。

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