WO2006106882A1

WO2006106882A1 - 所定部位発光量測定方法、所定部位発光量測定装置、発現量測定方法、および測定装置

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Publication number: WO2006106882A1
Application number: PCT/JP2006/306755
Authority: WO
Inventors: Hirobumi Suzuki; Yoko Ohashi; Kenji Kawasaki; Kiyotsugu Kojima; Kenichi Koyama; Akihiko Yoshikawa
Original assignee: Olympus Corporation
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2006-03-30
Publication date: 2006-10-12
Also published as: US20090274360A1; CN101151378B; CN101151378A; JP5914561B2; JP2014157157A; EP1865073A4; US20110249137A1; EP1865073B1; JP2012165757A; JP5123660B2; US8280142B2; JP5646538B2; JPWO2006106882A1; EP2562266A1; EP2562266B1; US7986824B2; EP1865073A1

Abstract

　生きたサンプル内の所定の部位からの発光量を測定するにあたって、当該サンプルと同一のものに対して、所定の部位に発光たんぱく質が局在しているか否かを確認することができる所定部位発光量測定方法および所定部位発光量測定装置などを提供することを課題とする。本発明における所定部位発光量測定装置１００は、移行塩基配列および発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合した融合遺伝子が導入されたサンプル１０２と、サンプル１０２を収納する容器１０３と、容器１０３を配置するステージ１０４と、サンプル１０２の発光画像を撮像する発光画像撮像ユニット１０６（対物レンズ１０６ａ～ＣＣＤカメラ１０６ｃ、結像レンズ１０６ｆ）と、サンプル１０２の蛍光画像を撮像する蛍光画像撮像ユニット１０８（対物レンズ１０８ａ～シャッター１０８ｆ）と、情報通信端末１１０と、で構成されている。

Description

明細書

所定部位発光量測定方法、所定部位発光量測定装置、発現量測定方法、および測定装置

技術分野

[0001] 本発明は、生きたサンプル内の所定の部位からの発光量を測定する所定部位発光量測定方法および所定部位発光量測定装置に関するものである。

本発明は、解析対象の遺伝子を導入した生きた細胞を対象として、蛍光測定および発光測定を組み合わせて、細胞周期のステージを同定すると共に解析対象の遺伝子の発現量を測定する発現量測定方法に関するものである。

本発明は、標本像を撮像して標本を観察する測定装置に関し、特に微弱光を発する発光標識および励起されて蛍光を発する蛍光標識が付与された標本の観察に適用して好適な測定装置に関するものである。

背景技術

[0002] [I]ATPは、細胞内のエネルギーの供給源であり、生命現象に深く関わっている物質である。一方、ホタルのルシフェラーゼは、 ATP、 O、 Mg²⁺の存在下で、 D-ルシフ

2

エリンを発光基質として、ォキシルシフェリン、 CO、 AMP、ピロリン酸を生成する反

2

応を触媒し、当該反応により発光する。また、ルシフェラーゼの発光反応は ATP量に依存する。

[0003] そのため、ルシフェラーゼの発光反応を利用して ATPを定量することは古くから行われており、バイオ、臨床検査、食品衛生などの分野では、ルシフェラーゼを用いた細胞内の ATP量の測定法が開発されて、る。

[0004] 例えば、細胞内の ATP量の測定は、通常、以下の（1 1)〜（1 3)の工程で行われている。

(1 1)細胞または細菌を溶解して ATPを抽出する。

(1 - 2)その抽出液をルシフェリンおよびルシフェラーゼを含む反応液に添加する。 (1 3)抽出液が添加された反応液力も発光量を測定することで、細胞内の ATPを定量する。 [0005] また、破砕されてない細胞内の ATP量の測定は、通常、以下の（2— 1)〜（2— 3) の工程で行われる。

(2- 1)ルシフェラーゼ遺伝子を細胞に導入して発現させる。

(2- 2)細胞を含む培養液中にルシフェリンをカ卩える。

(2— 3)ルシフリンが加えられた培養液力発光量を測定することで、細胞内の AT Pを定量する。

[0006] さらに、生きた細胞内の所定の部位 (具体的にはミトコンドリア）における ATP量の経時的測定は、以下の（3— 1)および（3— 2)の工程で行われる（非特許文献 1)。 (3— 1)ルシフェラーゼ遺伝子にミトコンドリア移行シグナル遺伝子を融合し、その融合した遺伝子を細胞に導入する。

(3— 2)ルシフェラーゼが細胞内のミトコンドリアに局在して、ると、う前提の下、細胞力もの発光量を経時的に測定することで、細胞内のミトコンドリアにおける ATP量の変動を測定する。

なお、細胞内から発せられる発光の強度は極めて弱いので、 1つの細胞を認識するために、イメージ'インテンシファイアを装着した CCDカメラでフオトンカウンティングを行う。また、ルシフェラーゼが細胞内のミトコンドリアに局在している力否かは、発光量を測定した細胞とは別の細胞で確認する。具体的には、当該別の細胞を固定し、固定した細胞に抗ルシフェラーゼ抗体を反応させ、蛍光抗体法で細胞を観察することで局在の確認を行なう。これにより、測定した細胞からの発光量がミトコンドリアからの発光量に対応することを示した。

[0007] [Π]細胞増殖は生命維持において生物の基本的且つ重要な特徴の一つである。そして、細胞周期は細胞の成長や DNAの複製や染色体の分配や細胞の分裂などからなる複数の連続反応であり、細胞周期の各ステージにお、て様々な遺伝子の発現が変動することは十分に考えられる。また、細胞周期の異常や破綻は多くの慢性疾患や発癌に関与していると考えられている (特許文献 1参照)。なお、特許文献 1には、細胞周期調節因子の活性の測定法とそれを用いた癌の診断法に関する技術が開示されている。

[0008] ところで、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として細胞に導入し、ルシフエラーゼ活性を指標にしてルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さを調べる際、ルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流に目的の DNA断片を繋ぐことで当該 DNA断片がルシフエラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることができる。また、ルシフェラーゼ遺伝子の転写に影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターに繋 Vヽでルシフェラーゼ遺伝子と共発現させることで、当該遺伝子の遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることができる。なお、ルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を細胞に導入する方法には例えばリン酸カルシウム法ゃリポフクチン法やエレクト口ポーシヨン法などがあり、各方法は目的や細胞の種類の違、に応じて使、分けられて、る。

[0009] また、細胞内に導入され発現しているルシフェラーゼの活性の測定 (モニター）は、まず細胞を溶解した細胞溶解液とルシフェリンや ATPやマグネシウムなどを含む基質溶液とを反応させ、つ!ゝで基質溶液と反応させた細胞溶解液からの発光量を光電子増倍管を用いたルミノメーターで定量する、という手順で行われている。つまり、発光量は細胞を溶解した後に測定されている。これにより、ある時点でのルシフラーゼ遺伝子の発現量を細胞全体の平均値として測定することができる。

[0010] また、時間経過に沿ってルシフェラーゼ遺伝子の発現量を捉えるには生きた細胞力もの発光量を経時的に測定する必要がある。そして、生きた細胞からの発光量の経時的測定は、まず細胞を培養するインキュベーターにルミノメーターの機能を付け、ついで全細胞集団からの発光量を、培養しながらルミノメーターで一定時間ごと〖こ定量する、という手順で行われている。これにより、一定の周期性をもった発現リズムなどを測定することができ、よって、細胞全体におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることができる。

[0011] しかし、上述した従来のレポーターアツセィでは、細胞周期のステージが異なる複数の細胞が混在しており、様々なステージの細胞を一群のデータとして取り扱つていた。そのため、細胞周期に関わる遺伝子を解析する際は、同調培養などの操作を行つて細胞周期のステージを揃えて、る。

[0012] [ΠΙ]従来、標本像の結像倍率を高倍率と低倍率とに切り換えて標本を観察できる顕微鏡装置がよく利用されている。このような顕微鏡装置では、近年、高倍率の対物レンズによって低倍率の観察視野が制限されずに、より広範囲に標本の全体像を把握できるようにした顕微鏡装置が提案されている (たとえば、特許文献 2参照)。特許文献 2で開示されている顕微鏡装置では、低倍率で標本を観察する場合、高倍率の対物レンズを介さずに、焦点深度が従来よりも深い、すなわち、標本側の開口数 (NA; Numerical Aperture)が従来よりも小さ!/、低倍率専用の結像レンズを用いて標本像を結像するようにして、る。

[0013] 特許文献 1：特開 2002— 335997号公報

特許文献 2：特開平 10— 339845号公報

非特許文献 1 :H. J. Kennedy, A. E. Pouli, E. K. Ainscow, L. S. Jouavil le, R. Rizzuto, G. A. Rutter, "Glucose generates sub— plasma me mbrane ATP microdomains in single islet β—cells. , Journal of Biological Chemistry, vol. 274, pp. 13281— 13291, 1999

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0014] [I]しかしながら、従来技術では、細胞内の所定の部位に発光タンパク質が局在している力否かを、発光量を測定した細胞とは別の細胞で確認しており、しかも蛍光抗体法で確認する際、細胞は死んでしまうので、発光量の測定対象である生きた細胞において、当該細胞内の所定の部位に発光タンパク質が局在している力否かは必ずしも定かでなぐよつて当該細胞からの発光量が所定の部位からの発光量であることも必ずしも明確でな、、 t 、う問題点があった。

特に、複数の細胞に対する一過性の遺伝子導入の場合、全ての細胞に遺伝子が導入されるわけではないので、発光量の測定対象である生きた細胞と同じものに対して、遺伝子が細胞に導入されたか否かを確認し、遺伝子が導入された細胞内の所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かを確認することが必要となる。

[0015] 本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、生きたサンプル内の所定の部位力の発光量を測定するにあたって、当該サンプルと同一のものに対して、所定の部位に発光たんぱく質が局在している力否かを確認することができる所定部位発光量測定方法および所定部位発光量測定装置を提供することを目的とする。 [0016] [Π]しかしながら、従来技術における同調培養の操作は煩雑であるので、実験者にとつて作業的に大きな負担となっていた、という問題点があった。

[0017] 本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、細胞に導入した解析対象の遺伝子の発現量の測定において同調培養の操作を行わずに細胞周期のステージを同定することができ、その結果、実験者の作業的な負担を軽減することができる発現量測定方法を提供することを目的とする。

[0018] [III]ところで、近年、細胞生物学、分子生物学などの研究分野では、緑色蛍光蛋白質（GFP ;Green Fluorescent Protein)や生物発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を発現のレポーターとして働力せ、細胞内の特定部位や機能蛋白質に蛍光標識や発光標識を付して生体細胞を観察する必要性が高まって、る。このような細胞の観察では、通常、発現量の経時変化を捉えるため、時系列に細胞を観察し続ける必要がある。

[0019] ところが、 GFPを用いる観察では、 GFPが励起光の照射に応じて蛍光を発する蛋白質であり、 GFPを作用させた標本に大きな強度の励起光を照射して蛍光を得るため、標本に損傷を与えやすぐ 1〜2時間程度の観察が限度である。これに対して、ルシフェラーゼ遺伝子を用いる観察では、ルシフェラーゼ遺伝子が自己発光酵素であり、標本に損傷を与えることがなぐ数日〜数週間程度の観察が可能である。このため、ルシフェラーゼ遺伝子を用いて経過観察を行い、この観察結果に応じて適宜に GFPを用いた観察に切り換えるようにして、標本の経時変化を捉えることが所望されている。

[0020] し力しながら、ルシフェラーゼ遺伝子力も発せられる光は極めて微弱なため、 GFP 力の蛍光を観察する場合などの蛍光観察で通常用いられる高倍率の結像光学系や、標本側および像側の NAが共に小さい従来の低倍率の結像光学系では、ルシフエラーゼ遺伝子からの微弱光を観察することはできず、蛍光観察と微弱光による微弱光観察とを両立する顕微鏡装置はこれまで実現されていない。また、微弱光観察による経過観察の結果に応じて即時に蛍光観察に切り換えられる顕微鏡装置も開発されていない。

[0021] 本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、微弱光観察と蛍光観察とを適宜に切り換えることができるとともに、微弱光観察による観察結果に応じて即時に蛍光観察に切り換えることができる測定装置を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0022] [I]上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にカゝかる所定部位発光量測定方法は、発光タンパク質をサンプル内の所定の部位に移行させる移行塩基配列と、当該発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と、を融合した融合遺伝子が導入された生きたサンプル力の発光量を測定することにより、前記所定の部位からの発光量を得る所定部位発光量測定方法であって、前記融合遺伝子は、前記移行塩基配列および前記発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものであり、当該融合遺伝子が導入されたサンプルの蛍光画像を撮る蛍光画像撮像ステップと、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを判定する判定ステツプと、前記判定ステップの判定結果が局在すると判定された場合、サンプルからの発光量を測定する発光量測定ステップと、を含むことを特徴とする。

[0023] また、本発明に力かる所定部位発光量測定方法は、前記に記載の所定部位発光量測定方法において、前記融合遺伝子が導入された生きたサンプルが撮像範囲中に複数存在する場合、複数の前記サンプルの発光画像を撮る発光画像撮像ステツプと、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像および前記発光画像撮像ステップで撮像した発光画像を重ね合わせることで、前記判定ステップの判定結果が局在すると判定されたサンプルの中カゝら測定対象のサンプルを選定する選定ステップと、をさらに含み、前記蛍光画像撮像ステップは、複数の前記サンプルの蛍光画像を撮り、前記判定ステップは、前記蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かをサンプルごとに判定し、前記発光量測定ステップは、前記選定ステップで選定したサンプル力ゝらの発光量を測定すること、を特徴とする。

[0024] また、本発明に力かる所定部位発光量測定方法は、前記に記載の所定部位発光量測定方法において、前記蛍光画像撮像ステップ、前記判定ステップ、前記発光画像撮像ステップ、前記選定ステップ、前記発光量測定ステップを繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位力の発光量を経時的に得ること、を特徴とする。 [0025] また、本発明に力かる所定部位発光量測定方法は、前記に記載の所定部位発光量測定方法において、前記サンプルからの発光を発光色別に分離する発光分離ステツプ、をさらに含み、前記サンプルに導入される融合遺伝子は、複数存在し、前記移行塩基配列で移行させる発光タンパク質の移行先の部位と、前記発光タンパク質から発せられる発光の発光色と、前記蛍光タンパク質から発せられる蛍光の蛍光色との組み合わせがそれぞれ異なるように予め作製され、前記判定ステップは、前記蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否力を蛍光色ごとに判定し、前記発光量測定ステップは、前記判定ステップの判定結果が局在すると判定された場合、前記発光分離ステップで分離した複数の発光のうち当該局在すると判定された部位力の発光を特定し、特定した発光の発光量を測定すること、を特徴とする。

[0026] また、本発明に力かる所定部位発光量測定方法は、前記に記載の所定部位発光量測定方法において、前記サンプルは、試料、組織、細胞、個体のいずれか 1つであること、を特徴とする。

[0027] また、本発明に力かる所定部位発光量測定方法は、前記に記載の所定部位発光量測定方法において、前記発光量測定ステップで測定した発光量に基づいて、前記選定ステップで選定したサンプル内の所定の部位における ATPを定量する ATP 定量ステップ、をさらに含み、前記サンプルは細胞であり、前記所定の部位はミトコンドリアであり、前記移行塩基配列はミトコンドリア移行シグナルであり、前記発光タンパク質はルシフラーゼであり、前記蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質であり、前記蛍光画像撮像ステップ、前記判定ステップ、前記発光画像撮像ステップ、前記選定ステップ、前記発光量測定ステップにカ卩えてさらに前記 ATP定量ステップを繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位からの ATPを経時的に定量すること、を特徴とする。

[0028] また、本発明は所定部位発光量測定装置に関するものであり、本発明にかかる所定部位発光量測定装置は、発光タンパク質をサンプル内の所定の部位に移行させる移行塩基配列と、当該発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と、を融合した融合遺伝子が導入された生きたサンプル力の発光量を測定することにより、前記所定の部位からの発光量を得る所定部位発光量測定装置であって、前記移行塩基配列および前記発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合した融合遺伝子を用い、当該融合遺伝子が導入されたサンプルの蛍光画像を撮る蛍光画像撮像手段と、前記蛍光画像撮像手段で撮像した蛍光画像に基づ、て所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かを判定する判定手段と、前記判定手段の判定結果が局在すると判定された場合、サンプル力ゝらの発光量を測定する発光量測定手段と、を備えたことを特徴とする。

[0029] [II]上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にカゝかる発現量測定方法は、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞を対象として、細胞から発せられた発光の発光強度を測定する発光測定ステップと、細胞力発せられた蛍光の蛍光強度を測定する蛍光測定ステップと、前記発光測定ステップで測定した発光強度または前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を測定する発現量測定ステップと、を含む発現量測定方法であって、前記細胞は、前記発光関連遺伝子、前記蛍光関連遺伝子および前記解析対象の遺伝子に加えてさらに、細胞周期の所定のステージで発現する細胞周期関連遺伝子を導入したものであり、前記発現量測定ステップで発光強度を用いる場合には前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定し、前記発現量測定ステップで蛍光強度を用いる場合には前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定することで、細胞周期のステージを同定するステージ同定ステップ、をさらに含むことを特徴とする。

[0030] また、本発明に力かる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法にぉ、て、前記細胞が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞の蛍光画像を撮像する蛍光画像撮像ステップと、前記複数の細胞の発光画像を撮像する発光画像撮像ステツプと、をさらに含み、前記発光測定ステップは、前記発光画像撮像ステップで撮像した発光画像に基づ!ヽて、各細胞から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、前記蛍光測定ステップは、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づいて、各細胞から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定し、前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度または前記蛍光測定ステツプで測定した蛍光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定し、前記ステージ同定ステップは、前記発現量測定ステップで発光強度を用いる場合には前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞ごとに判定し、前記発現量測定ステップで蛍光強度を用いる場合には前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞ごとに同定すること、を特徴とする。

[0031] また、本発明にかかる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法において、前記ステージ同定ステップでステージが同定された細胞の中力も測定対象の細胞を選択する選択ステップ、をさらに含み、前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度または前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づ!、て、前記選択ステップで選択した細胞に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定すること、を特徴とする。

[0032] また、本発明に力かる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法にぉ、て、前記発光画像撮像ステップ、前記蛍光画像撮像ステップ、前記発光測定ステツプ、前記蛍光測定ステップ、前記ステージ同定ステップ、前記選択ステップ、前記発現量測定ステップを繰り返し実行することで、前記選択ステップで選択した細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら前記解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定すること、を特徴とする。

[0033] また、本発明に力かる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法にぉ、て、前記発現量測定ステップは、前記選択ステップで選択した細胞を対象として、前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づ!ゝて前記解析対象の遺伝子の細胞内における発現部位を同定すること、を特徴とする。

[0034] また、本発明は発現量測定方法に関するものであり、本発明にかかる発現量測定方法は、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞を対象として、細胞力発せられた発光の発光強度を測定する発光測定ステップと、前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づ、て前記解析対象の遺伝子の発現量を測定する発現量測定ステップと、を含む発現量測定方法であつて、前記細胞は、その所定の部位を蛍光物質で染色したものであり、当該細胞の蛍光画像を撮像する蛍光画像撮像ステップと、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づヽて細胞の形状が変化したか否かを判定することで、細胞周期のステージを同定するステージ同定ステップと、をさらに含むことを特徴とする。

[0035] また、本発明に力かる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法にぉ、て、前記細胞が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞の発光画像を撮像する発光画像撮像ステップ、をさらに含み、前記蛍光画像撮像ステップは、前記複数の細胞の蛍光画像を撮像し、前記発光測定ステップは、前記発光画像撮像ステップで撮像した発光画像に基づヽて、各細胞カゝら発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づ、て前記解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定し、前記ステージ同定ステップは、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づヽて細胞の形状が変化した力否かを細胞ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞ごとに同定すること、を特徴とする。

[0036] また、本発明に力かる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法にぉ、て、前記ステージ同定ステップでステージが同定された細胞の中力も測定対象の細胞を選択する選択ステップ、をさらに含み、前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づ、て、前記選択ステップで選択した細胞に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定すること、を特徴とする。

[0037] また、本発明にかかる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法において、前記発光画像撮像ステップ、前記蛍光画像撮像ステップ、前記発光測定ステツプ、前記ステージ同定ステップ、前記選択ステップ、前記発現量測定ステップを繰り返し実行することで、前記選択ステップで選択した細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら前記解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定すること、を特徴とする。 [0038] [m]上記の目的を達成するために、この発明にかかる測定装置は、微弱光を発する発光標識および励起されて蛍光を発する蛍光標識が付与されて保持手段に保持される標本の標本像を結像する結像光学系と、該標本像を撮像する撮像手段とを備える測定装置において、前記結像光学系は、前記発光標識からの微弱光を前記標本像としての微弱光標本像を結像する微弱光結像光学系と、前記蛍光標識からの蛍光を前記標本像としての蛍光標本像を結像する蛍光結像光学系と、を備え、前記撮像手段は、前記微弱光標本像と前記蛍光標本像とを撮像することを特徴とする。なお、この発明にかかる測定装置は、顕微鏡光学系を有する計測装置を含むものである。

[0039] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記蛍光結像光学系は、前記標本を照明する照明手段を備えることを特徴とする。

[0040] また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記撮像手段によって撮像された微弱光標本像の像特性をもとに、該微弱光標本像の撮像と前記蛍光標本像の撮像とを切り換える制御を行う撮像切換制御手段を備えたことを特徴とする。

[0041] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記像特性は、前記微弱光標本像の像強度であり、前記撮像切換制御手段は、前記像強度が所定のしきヽ値より大き!ヽ場合、前記微弱光標本像の撮像から前記蛍光標本像の撮像に切り換えることを特徴とする。

[0042] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記像強度は、前記微弱光標本像の全体または部分の像強度であって、所定時点から現時点までの累積の像強度または現時点の像強度であることを特徴とする。

[0043] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記蛍光結像光学系は、前記蛍光標識の各点からの蛍光を略平行光束に変換する蛍光対物レンズと、前記蛍光対物レンズによって略平行光束に変換された蛍光を集光して前記蛍光標本像を結像する蛍光結像レンズと、前記蛍光標識を励起する励起光を選択的に透過させる励起光透過フィルター、前記蛍光標識からの蛍光を選択的に透過させる蛍光透過フィルターおよび前記励起光を反射し前記蛍光を透過させるダイクロイツクミラーを有し、前記蛍光対物レンズと前記蛍光結像レンズとの間に配置される蛍光ユニットと、前記励起光を発する励起光源を有し、該励起光源力の励起光を前記ダイクロイツクミラーによって反射させ前記標本に照射させる励起光照射手段と、を備えたことを特徴とする。

[0044] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記微弱光結像光学系は、前記発光標識の各点からの微弱光を略平行光束に変換する微弱光対物レンズと、前記微弱光対物レンズによって略平行光束に変換された微弱光を集光して前記微弱光標本像を結像する微弱光結像レンズと、を備えたことを特徴とする。

[0045] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記標本に対して互いに反対側に配置され、前記励起光照射手段は、前記標本に対して励起光を未照射にする未照射手段を有し、前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記未照射手段に励起光を未照射にさせ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記励起光照射手段に励起光を照射させる制御を行うことを特徴とする。

[0046] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野を相対的に平行移動させる視野移動手段を備えることを特徴とする。

[0047] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記保持手段は、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野内に前記標本を移動させる標本移動手段を有することを特徴とする。

[0048] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記微弱光対物レンズおよび前記蛍光対物レンズは、同一の対物レンズであり、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記対物レンズを共用することを特徴とする。

[0049] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記対物レンズと前記蛍光ユニットとの間の瞳空間に挿脱可能に配置され、該瞳空間に配置された場合、前記対物レンズからの微弱光を前記微弱光結像レンズに向けて反射させるミラーを備え、前記励起光照射手段は、前記標本に対して励起光を未照射にする未照射手段を有し、前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記ミラーを瞳空間に配置するとともに前記未照射手段に励起光を未照射にさせ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記ミラーを瞳空間に未配置にするとともに前記励起光照射手段に励起光を照射させる制御を行うことを特徴とする。

[0050] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記標本に対して同じ側に配置され、前記保持手段は、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野内に前記標本を移動させる標本移動手段を有し、前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記標本移動手段によって前記標本を前記微弱光結像光学系の視野内に移動させ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記標本移動手段によって前記標本を前記蛍光結像光学系の視野内に移動させる制御を行うことを特徴とする。

[0051] また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野が前記標本を含むように前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系を移動させる光学系移動手段を備え、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記標本に対して同じ側に配置され、前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記微弱光結像光学系の視野が前記標本を含むように前記光学系移動手段によって該微弱光結像光学系を移動させ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記蛍光結像光学系の視野が前記標本を含むように前記光学系移動手段によって該蛍光結像光学系を移動させる制御を行うことを特徴とする。

[0052] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記光学系移動手段は、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野の略中心点を結ぶ線分の中点を通り前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各光軸に略平行な回転軸を有し、該回転軸を中心に前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系を回転移動させることを特徴とする。

[0053] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記撮像手段は、前記微弱光標本像を撮像する微弱光撮像手段と、前記蛍光標本像を撮像する蛍光撮像手段と、を備えることを特徴とする。 [0054] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記撮像手段は、前記微弱光標本像を撮像する微弱光撮像手段と、前記蛍光標本像を撮像する蛍光撮像手段と、を備え、前記光学系移動手段は、前記微弱光結像光学系および前記微弱光撮像手段と、前記蛍光結像光学系および前記蛍光撮像手段と、をそれぞれ一体に移動させることを特徴とする。

[0055] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記微弱光標本像および前記蛍光標本像は、それぞれ前記微弱光結像レンズおよび前記蛍光結像レンズによって略同じ位置に結像され、前記撮像手段は、前記微弱光標本像および前記蛍光標本像が結像される位置に略一致して固定されることを特徴とする。

[0056] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の少なくとも一方に対応し、前記標本に対して透過照明を行う照明手段を備えることを特徴とする。

[0057] また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記透過照明は、明視野観察用照明、暗視野観察用照明、微分干渉観察用照明および位相差観察用照明の少なくとも 1つであることを特徴とする。

[0058] また、この発明に力かる測定装置は、上記の発明にお、て、前記微弱光結像光学系は、該微弱光結像光学系の標本側の開口数を NAoとし、前記微弱光標本像を結像する倍率をとして、（NAoZ jS ) ²によって演算される値が 0. 01以上 (本出願人による特許出願である特願 2004— 342940を引用。）であることを特徴とする。発明の効果

[0059] [I]本発明によれば、発光タンパク質をサンプル内の所定の部位に移行させる移行塩基配列と、当該発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と、を融合した融合遺伝子が導入された生きたサンプルからの発光量を測定することにより、所定の部位からの発光量を得るにあって、融合遺伝子は、移行塩基配列および発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものであり、当該融合遺伝子が導入されたサンプルの蛍光画像を撮り、撮像した蛍光画像に基づ V、て所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かを判定し、判定結果が局在すると判定された場合、サンプル力もの発光量を測定する。これにより、生きたサンプル内の所定の部位からの発光量を測定するにあたって、当該サンプルと同一のものに対して、所定の部位に発光たんぱく質が局在している力否かを確認することができる、という効果を奏する。

[0060] また、本発明によれば、融合遺伝子が導入された生きたサンプルが撮像範囲中に複数存在する場合、複数のサンプルの蛍光画像を撮り、蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かをサンプルごとに判定し、複数のサンプルの発光画像を撮り、撮像した蛍光画像および撮像した発光画像を重ね合わせることで、判定結果が局在すると判定されたサンプルの中力測定対象のサンプルを選定し、選定したサンプル力の発光量を測定する。これにより、複数のサンプルの中力個々のサンプルを識別し、単一のサンプル内の所定の部位力の発光量を測定することができる、という効果を奏する。

[0061] また、本発明によれば、蛍光画像の撮像、局在の判定、発光画像の撮像、測定対象のサンプルの選定、発光量の測定を繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位力もの発光量を経時的に得る。これにより、サンプル内の所定の部位における発光量の変動を経時的に測定することができる、という効果を奏する。

[0062] また、本発明によれば、サンプルに導入される融合遺伝子は、複数存在し、移行塩基配列で移行させる発光タンパク質の移行先の部位と、発光タンパク質から発せられる発光の発光色と、蛍光タンパク質から発せられる蛍光の蛍光色との組み合わせがそれぞれ異なるように予め作製され、サンプルからの発光を発光色別に分離し、蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否力を蛍光色ごとに判定し、判定結果が局在すると判定された場合、分離した複数の発光のうち当該局在すると判定された部位からの発光を特定し、特定した発光の発光量を測定する。これにより、例えば、 1つのサンプル内の複数の部位からの発光量を同時に測定することができる、という効果を奏する。

[0063] また、本発明によれば、サンプルは、試料、組織、細胞、個体の、ずれか 1つであるので、様々なサンプルを対象とすることができる、という効果を奏する。

[0064] また、本発明によれば、サンプルは細胞であり、所定の部位はミトコンドリアであり、移行塩基配列はミトコンドリア移行シグナルであり、発光タンパク質はルシフェラーゼであり、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質であり、測定した発光量に基づいて、選定したサンプル内の所定の部位における ATPを定量し、蛍光画像の撮像、局在の判定、発光画像の撮像、測定対象のサンプルの選定、発光量の測定に加えてさらに ATPの定量を繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位からの ATPを経時的に定量する。これより、特定の細胞内のミトコンドリアにおける ATP量の変動を経時的に測定することができる、という効果を奏する。

[0065] [II]本発明によれば、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞を対象として、細胞力発せられた発光の発光強度を測定し、細胞から発せられた蛍光の蛍光強度を測定し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づ!ヽて解析対象の遺伝子の発現量を測定するにあたって、細胞は、発光関連遺伝子、蛍光関連遺伝子および解析対象の遺伝子に加えてさらに、細胞周期の所定のステージで発現する細胞周期関連遺伝子を導入したものであり、発現量の測定で発光強度を用いた場合には測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定し、発現量の測定で蛍光強度を用いた場合には測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定することで、細胞周期のステージを同定する。これにより、細胞に導入した解析対象の遺伝子の発現量の測定において同調培養の操作を行わずに当該細胞に対して細胞周期のステージを同定することができ、その結果、実験者の作業的な負担を軽減することができる、という効果を奏する。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を評価することができる、という効果を奏する。具体的には、細胞周期との直接の関与が不明である解析対象の遺伝子に関して、薬剤投与や温度変化などの刺激で引き起こされる発現量の変化を細胞周期のステージと共に得ることができるので、当該解析対象の遺伝子と細胞周期との関与を検証することができる、という効果を奏する。また、細胞周期との直接の関与が示唆される解析対象の遺伝子に関して、当該解析対象の遺伝子の発現量と細胞周期のステージとを一緒に取得することができるので、当該解析対象の遺伝子が細胞周期マーカーとして有用である力否かを評価することができる、という効果を奏する。

[0066] また、本発明によれば、細胞が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞の蛍光画像を撮像し、複数の細胞の発光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各細胞から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、撮像した蛍光画像に基づいて、各細胞から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定し、発現量の測定で発光強度を用いる場合には測定した蛍光強度に基づ!、て細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞ごとに判定し、発現量の測定で蛍光強度を用いる場合には測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞ごとに同定する。これにより、複数の細胞を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定すると共に、細胞周期のステージを細胞ごとに同定することができる、という効果を奏する。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を細胞ごとに評価することができる、という効果を奏する。

[0067] また、本発明によれば、ステージが同定された細胞の中力測定対象の細胞を選択し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて、選択した細胞に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定する。これにより、複数の細胞の中から個々の細胞を識別し、単一の細胞を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、細胞周期のステージを同定することができる、という効果を奏する。

[0068] また、本発明によれば、発光画像の撮像、蛍光画像の撮像、発光強度の測定、蛍光強度の測定、ステージの同定、細胞の選択、発現量の測定を繰り返し実行することで、選択した細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定する。これにより、単一の細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量の変動を経時的に測定することができる、という効果を奏する。

[0069] また、本発明によれば、発現量の測定にお!ヽて、選択された細胞を対象として、測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、撮像した蛍光画像に基づいて解析対象の遺伝子の細胞内における発現部位を同定する。これにより、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を評価することができるだけでなぐ解析対象の遺伝子の細胞内における発現部位を得ることができる、という効果を奏する。

[0070] また、本発明によれば、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞を対象として、細胞から発せられた発光の発光強度を測定し、測定した発光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定するにあたって、細胞は、その所定の部位 (具体的には、核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色したものであり、当該細胞の蛍光画像を撮像し、撮像した蛍光画像に基づ、て細胞の形状が変化したか否かを判定することで、細胞周期のステージを同定する。これにより、細胞に導入した解析対象の遺伝子の発現量の測定において同調培養の操作を行わずに当該細胞に対して細胞周期のステージを同定することができ、その結果、実験者の作業的な負担を軽減することができる、という効果を奏する。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を評価することができる、という効果を奏する。具体的には、細胞周期との直接の関与が不明である解析対象の遺伝子に関して、薬剤投与や温度変化などの刺激で引き起こされる発現量の変化を細胞周期のステージと共に得ることができるので、当該解析対象の遺伝子と細胞周期との関与を検証することができる、という効果を奏する。また、細胞周期との直接の関与が示唆される解析対象の遺伝子に関して、当該解析対象の遺伝子の発現量と細胞周期のステージとを一緒に取得することができるので、当該解析対象の遺伝子が細胞周期マーカーとして有用であるか否かを評価することができる、という効果を奏する。

[0071] また、本発明によれば、細胞が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞の発光画像を撮像し、複数の細胞の蛍光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各細胞力発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、測定した発光強度に基づヽて解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定し、撮像した蛍光画像に基づいて細胞の形状が変化したか否力を細胞ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞ごとに同定する。これにより、複数の細胞を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定すると共に、細胞周期のステージを細胞ごとに同定することができる、という効果を奏する。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を細胞ごとに評価することができる、という効果を奏する。 [0072] また、本発明によれば、ステージが同定された細胞の中力測定対象の細胞を選択し、測定した発光強度に基づいて、選択した細胞に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定する。これにより、複数の細胞の中から個々の細胞を識別し、単一の細胞を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、細胞周期のステージを同定することができる、という効果を奏する。

[0073] また、本発明によれば、発光画像の撮像、蛍光画像の撮像、発光強度の測定、ステージの同定、細胞の選択、発現量の測定を繰り返し実行することで、選択した細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定する。これにより、単一の細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量の変動を経時的に測定することができる、という効果を奏する。

[0074] [III]本発明にかかる測定装置によれば、微弱光観察と蛍光観察とを保持手段に保持されている同一の標本に対して個別に実行することができるとともに、微弱光観察による観察結果に応じて即時に蛍光観察に切り換えることができる。

図面の簡単な説明

[0075] [図 1]図 1は、所定部位発光量測定装置 100の全体構成の一例を示す図である。

[図 2]図 2は、所定部位発光量測定装置 100の発光画像撮像ユニット 106の構成の一例を示す図である。

[図 3]図 3は、所定部位発光量測定装置 100の発光画像撮像ユニット 106の構成の別の一例を示す図である。

[図 4]図 4は、所定部位発光量測定装置 100の情報通信端末 110の構成の一例を示すブロック図である。

[図 5]図 5は、所定部位発光量測定装置 100で行われる処理の一例を示すフローチヤートである。

[図 6]図 6は、蛍光画像撮像ユニット 108で撮像した明視野像および蛍光像の一例を示す図である。

[図 7]図 7は、発光画像撮像ユニット 106で撮像した明視野像および蛍光像の一例を示す図である。 [図 8]図 8は、発光画像撮像ユニット 106および蛍光画像撮像ユニット 108で撮像した重ね合わせ画像の一例を時系列で示す図である。

[図 9]図 9は、特定した細胞の発光強度の経時的変動の一例を示す図である。

[図 10]図 10は、 GFP-ミトコンドリア移行シグナル-ルシフェラーゼを融合したプラスミドベクターを示す図である。

[図 11]図 11は、蛍光画像撮像ユニット 108で撮像した、プラスミドベクターを導入した HeLa細胞の明視野像および蛍光像を示す図である。

[図 12]図 12は、発光画像撮像ユニット 106で撮像した、プラスミドベクターを導入した HeLa細胞の明視野像および発光像を示す図である。

[図 13]図 13は、特定した HeLa細胞の発光強度の経時的変動を示す図である。

[図 14]図 14は、所定部位発光量測定装置 100の全体構成の一例を示す図である。

[図 15]図 15は、所定部位発光量測定装置 100の全体構成の一例を示す図である。

[図 16]図 16は、所定部位発光量測定装置 100の全体構成の一例を示す図である。

[図 17]図 17は、 EGFP Luc遺伝子を導入した HeLa細胞の蛍光画像を示す図である。

[図 18]図 18は、 EGFP - Luc遺伝子を導入した HeLa細胞の明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像を示す図である。

[図 19]図 19は、 EGFP Luc遺伝子を導入した HeLa細胞の発光画像を示す図である。

[図 20]図 20は、発現量測定装置 1000の全体構成の一例を示す図である。

[図 21]図 21は、発現量測定装置 1000の発光画像撮像ユニット 1060の構成の一例を示す図である。

[図 22]図 22は、発現量測定装置 1000の発光画像撮像ユニット 1060の構成の別の一例を示す図である。

[図 23]図 23は、発現量測定装置 1000の情報通信端末 1100の構成の一例を示すブロック図である。

[図 24]図 24は、発現量測定装置 1000で行われる処理の一例を示すフローチャートである。 [図 25]図 25は、本発明の実施の形態 1にかかる顕微鏡装置の構成を示す図である。

[図 26]図 26は、図 25に示した顕微鏡装置が微弱光観察と蛍光観察とを切り換える撮像切換処理の処理手順を示すフローチャートである。

[図 27]図 27は、本発明の実施の形態 2にかかる顕微鏡装置の構成を示す図である。

[図 28]図 28は、本発明の実施の形態 2にかかる顕微鏡装置の変形例の構成を示す図である。

[図 29]図 29は、本発明の実施の形態 3にかかる顕微鏡装置の構成を示す図である。

[図 30]図 30は、本発明の実施の形態 4にかかる顕微鏡装置の構成を示す図である。

[図 31]図 31は、本発明の実施の形態 5にかかる顕微鏡装置の構成を示す図である。

[図 32]図 32は、本発明の実施の形態 5にかかる顕微鏡装置の変形例の構成を示す図である。

[図 33]図 33は、本発明の実施の形態 5にかかる顕微鏡装置の変形例の構成を示す図である。

[図 34]図 34は、本発明の実施の形態 5にかかる顕微鏡装置の変形例の構成を示す図である。

符号の説明

100 所定部位発光量測定装置

102 サンプノレ

103 容器

104 ステージ

106 発光画像撮像ユニット

106a 対物レンズ (発光観察用）

106b ダイクロイツクミラー

106c CCDカメラ

106d スプリットイメージユニット

106e フイノレターホイ一ノレ

106f 結像レンズ

108 蛍光画像撮像ユニット 108a 対物レンズ (蛍光観察用)

108b ダイクロイツクミラー

108c 光源

108d CCDカメラ

108e 結像レンズ

108f シャッター

108g 励起用分光フィルター

108h 光ファイバ一

108i コンデンサーレンズ

108J 発光 ·蛍光分光用フィルター情報通信端末

112 制御部

112a 蛍光画像撮像指示部

112b 蛍光画像取得部

112c 判定部

112d 発光画像撮像指示部

112e 発光画像取得部

112f 選定部

112g 発光量測定部

112h 関連物質定量部

114 クロック宪生咅

116

118 通信インターフェース音

120 人出力インターフェース部

122 入力部

124 出力部

発現量測定装置

1020 細胞 1030 容器

1040 ステージ

1060 発光画像撮像ユニット

1060a 対物レンズ (発光観察用）

1060b ダイクロイツクミラー

1060c CCDカメラ

1060d スプリットイメージユニット

1060e フイノレターホイ一ノレ 1080 蛍光画像撮像ユニット

1080a 対物レンズ (蛍光観察用）

1080b ダイクロイツクミラー

1080c キセノンランプ

1080d CCDカメラ

1100 情報通信端末

1120 制御部

1120a 蛍光画像撮像指示部 1120b 発光画像撮像指示部 1120c 蛍光画像取得部 1120d 発光画像取得部 1120e 判定部 1120f 蛍光測定部

1120g 発光測定部

1120h ステージ同定部 11201 選択部

1120j 発現量測定部

1140 クロック発生咅 ^

1160 記憶部

1180 通信インターフェース咅 1200 入出力インターフェース部

1220 入力部

1240 出力部

, 11 対物レンズ

, 12， 32 結像レンズ

, 13 撮像装置

励起光源

レンズ

蛍光キューブ

a 励起フィルター

b 吸収フィルター

c ダ'ィクロイツクミラー

, 17 保持部

a 保持部材

b, 17b 可動ステージ

, 18 ステージ駆動部

モニター

4 回転駆動装置

5a, 15b 固定軸

1, 22, 23, 24, 25, 26 筐体

3, 43 シャッター

4 ミラー

5 光路切換駆動部

4 白色光源

5 照明レンズ系

5a コレクタレンズ

5b コンデンサーレンズ

6 照明駆動部 100a, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 顕微鏡装置

101, 201 蛍光顕微鏡ユニット

102a, 202 微弱光顕微鏡ユニット

103a 透過照明ユニット

104a, 105 蛍光照明ユニット

PC1〜PC9 制御装置

S 標本

発明を実施するための最良の形態

[0077] [I]以下に、本発明にかかる所定部位発光量測定方法および所定部位発光量測定装置の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。

[0078] まず、本発明を実現する所定部位発光量測定装置 100の構成について、図 1〜図

3を参照して説明する。図 1は、所定部位発光量測定装置 100の全体構成の一例を示す図である。

[0079] 図 1に示すように、所定部位発光量測定装置 100は、サンプル 102と、サンプル 10 2を収納した容器 103 (具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器 103を配置するステージ 104と、発光画像撮像ュニット 106と、蛍光画像撮像ユニット 108と、情報通信端末 110と、で構成されている。また、所定部位発光量測定装置 100において、発光画像撮像ユニット 106に含まれる対物レンズ 106aと蛍光画像撮像ユニット 108に含まれる対物レンズ 108aとは、図示の如ぐサンプル 102、容器 103およびステージ 104を挟んで上下の対向する位置に配置される。なお、図 14に示すように、発光画像撮像ユニット 106および蛍光画像撮像ユニット 108の配置を入れ替えてもよヽ。蛍光よりも微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット 106を下側に配置することにより、カバー開閉によるサンプル上方力の外乱光を完全に遮断できて発光画像の SZN比を増すことができる。発光画像撮像ユニット 106と別体の蛍光画像撮像ユニット 108は、レーザー走査式の光学系であってもよ、。

[0080] 再び図 1に戻り、サンプル 102は、発光タンパク質をサンプル 102内の所定の部位 (例えば、ミトコンドリアや細胞質、核など）に移行させる移行塩基配列および当該発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合した融合遺伝子を導入したものである。また、サンプル 102 は、生きたものであり、例えば、試料、組織、細胞、個体などである。なお、サンプル 1 02は、具体的には、当該融合遺伝子が入ったプラスミドベクターを導入したものでもよい。

[0081] 発光画像撮像ユニット 106は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、サンプル 1 02の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット 106は、図示の如ぐ対物レンズ 1 06aと、ダイクロイツクミラー 106bと、 CCDカメラ 106cと、結像レンズ 106fと、で構成されている。対物レンズ 106aは、具体的には、（開口数 Z倍率) ²の値が 0. 01以上のものである。ダイクロイツクミラー 106bは、サンプル 102から発せられた発光を色別に分離し、 2色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合に用いる。 CCDカメラ 10 6cは、対物レンズ 106a、ダイクロイツクミラー 106bおよび結像レンズ 106fを介して当該 CCDカメラ 106cのチップ面に投影されたサンプル 102の発光画像および明視野画像を撮る。また、 CCDカメラ 106cは、情報通信端末 110と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、サンプル 102が撮像範囲中に複数存在する場合、 CCD カメラ 106cは、当該撮像範囲中に含まれる複数のサンプル 102の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ 106fは、対物レンズ 106aおよびダイクロイックミラー 106bを介して当該結像レンズ 106fに入射した像 (具体的にはサンプル 10 2を含む像)を結像する。なお、図 1では、ダイクロイツクミラー 106bで分離した 2つの発光に対応する発光画像を 2台の CCDカメラ 106cで別々に撮像する場合の一例を示しており、 1つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット 106は、対物レンズ 106a、 1台の CCDカメラ 106cおよび結像レンズ 106fで構成されてもよい。

[0082] ここで、 2色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット 106は、図 2に示すように、対物レンズ 106aと、 CCDカメラ 106cと、スプリットイメージユニット 106dと、結像レンズ 106fと、で構成されてもよい。そして、 CCDカメラ 106c は、スプリットイメージユニット 106dおよび結像レンズ 106fを介して当該 CCDカメラ 1 06cのチップ面に投影されたサンプル 102の発光画像 (スプリットイメージ）および明視野像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット 106dは、サンプル 102から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイツクミラー 106bと同様、 2色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合に用いる。

[0083] また、複数色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合 (つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット 106は、図 3に示すように、対物レンズ 106aと、 CCDカメラ 106cと、フィルターホイール 106eと、結像レンズ 106fと、で構成されてもよい。そして、 CCDカメラ 106cは、フィルターホイール 106eおよび結像レンズ 106f を介して当該 CCDカメラ 106cのチップ面に投影されたサンプル 102の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール 106eは、サンプル 102から発せられた発光をフィルター交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合に用いる。

[0084] 再び図 1に戻り、蛍光画像撮像ユニット 108は、具体的には倒立型の蛍光顕微鏡であり、サンプル 102の蛍光画像を撮像する。蛍光画像撮像ユニット 108は、図示の如く、対物レンズ 108aと、ダイクロイツクミラー 108bと、光源 108cと、 CCDカメラ 108 dと、結像レンズ 108eと、シャッター 108fと、で構成されている。対物レンズ 108aは、具体的には、（開口数/倍率)²の値が 0. 01以上のものである。ダイクロイツクミラー 1 08bは、サンプル 102からの蛍光を透過するとともに、光源 108cから照射された励起光がサンプル 102へ照射されるように励起光の方向を変える。光源 108cは、励起光を照射するためのものであり、具体的には、キセノンランプ、ハロゲン等のランプ、レ一ザ一、 LEDなどである。 CCDカメラ 108dは、対物レンズ 108a、ダイクロイツクミラ一 108bおよび結像レンズ 108eを介して当該 CCDカメラ 108dのチップ面に投影されたサンプル 102の蛍光画像および明視野画像を撮る。また、 CCDカメラ 108dは、情報通信端末 110と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、サンプル 10 2が撮像範囲中に複数存在する場合、 CCDカメラ 108dは、当該撮像範囲中に含まれる複数のサンプル 102の蛍光画像および明視野画像を撮像してもょヽ。結像レンズ 108eは、対物レンズ 108aおよびダイクロイツクミラー 108bを介して当該結像レンズ 108eに入射した像 (具体的にはサンプル 102を含む像)を結像する。シャッター 1 08fは、光源 108cから照射された励起光を切り替える。換言すると、シャッター 108f は、光源 108cから照射された励起光を透過したり遮断したりすることで、サンプル 10 2への励起光の照射を切り替える。

[0085] ここで、発光画像撮像ユニット 106および蛍光画像撮像ユニット 108は、具体的には、それぞれ倒立型の発光顕微鏡および倒立型の蛍光顕微鏡でもよぐステージ 10 4は回転するものでもよい。

[0086] また、図 1および図 14に示した所定部位発光量測定装置 100は発光画像撮像ュニット 106と蛍光画像撮像ユニット 108とを別々に備えた構成であった力所定部位発光量測定装置 100は、図 15に示すように、蛍光画像撮像ユニット 108のみを備えた構成であってもよい。換言すると、所定部位発光量測定装置 100は、蛍光画像撮像ユニット 108のみで蛍光観察と発光観察の両方を行う構成であってもよい。なお、図 15に示す所定部位発光量測定装置 100で蛍光 ·発光観察を行う場合、所定部位発光量測定装置 100は、発光画像を撮像する (発光検出を行う）際に、シャッター 10 8fの切り替えを自動又は手動で行うと共にダイクロイツクミラー 108bを光路（図 15中の点線)力外れた位置まで自動又は手動で移動することが可能な構成であることが好ましい。これにより、発光画像中のノイズを減らすことができる。また、図 15に示す所定部位発光量測定装置 100の場合、対物レンズ 108aは、具体的には、 "（開口数 /倍率) ²の値が 0. 01以上"と、う条件を満たすものであることが好ま、。

また、所定部位発光量測定装置 100は、図 16に示すように、励起光の照射をサンプル 102の上方から行い且つ蛍光 ·発光観察をサンプル 102の下方力も行う構成であってもよい。ここで、図 16に示す所定部位発光量測定装置 100の構成のうち、これまで説明してない構成のみを説明する。励起用分光フィルター 108gは、光源 108c から発せられた励起光を、波長領域の異なる複数の励起光に分離する。光ファイバ一 108hは、励起用分光フィルター 108gで分離した各励起光をサンプル 102へ導く。コンデンサーレンズ 108iは、サンプル 102を均等に照明するために用いるレンズであり、光ファイバ一 108hにより導かれた各励起光を集光する。発光'蛍光分光用フィルター 10¾は、サンプル 102から放出された蛍光や発光を、強度や波長などの違いで分離する。なお、図 16に示す所定部位発光量測定装置 100の場合、対物レンズ 1 08aは、具体的には、 "（開口数 Z倍率)²の値が 0. 01以上"という条件を満たすものであることが好ましい。

[0087] 再び図 1に戻り、情報通信端末 110は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、情報通信端末 110は、図 4に示すように、大別して、制御部 112と、システムの時刻を計時するクロック発生部 114と、記憶部 116と、通信インターフェース部 1 18と、入出力インターフェース部 120と、入力部 122と、出力部 124と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。

[0088] 記憶部 116は、ストレージ手段であり、具体的には、 RAMや ROM等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部 116は制御部 112の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。

[0089] 通信インターフェース部 118は、情報通信端末 110と、 CCDカメラ 106cおよび CC Dカメラ 108dと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部 1 18は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。

[0090] 入出力インターフェース部 120は、入力部 122や出力部 124に接続する。ここで、出力部 124には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力部 124をモニタとして記載する場合がある。 )₀また、入力部 122には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニタを用いることができる。

[0091] 制御部 112は、 OS (Operating System)等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部 102は、大別して、蛍光画像撮像指示部 112aと、蛍光画像取得部 112bと、判定部 112cと、発光画像撮像指示部 112dと、発光画像取得部 112eと、選定部 112fと、発光量測定部 112gと、関連物質定量部 112hと、で構成されている。

[0092] 蛍光画像撮像指示部 112aは、通信インターフェース部 116を介して、 CCDカメラ 1 08dへ蛍光画像および明視野画像の撮像を指示する。蛍光画像取得部 112bは、 C CDカメラ 108dで撮像した蛍光画像および明視野画像を、通信インターフェース部 1 16を介して取得する。

[0093] 判定部 112cは、蛍光画像取得部 112bで取得した蛍光画像および明視野画像に基づいて、サンプル 102に融合遺伝子が導入された力否かを判定したり、所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かを判定したりする。ここで、蛍光画像取得部 11 2bで取得した蛍光画像および明視野画像に複数のサンプル 102が存在する場合、判定部 112cは、蛍光画像および明視野画像に基づいて、サンプル 102に融合遺伝子が導入されたカゝ否かをサンプル 102ごとに判定したり、所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かをサンプル 102ごとに判定したりしてもよい。

[0094] 判定発光画像撮像指示部 112dは、通信インターフェース部 116を介して、 CCD力メラ 106cへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部 112e は、 CCDカメラ 106cで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフエ一ス部 116を介して取得する。

[0095] 選定部 112fは、蛍光画像取得部 112bで取得した蛍光画像および明視野画像ならびに発光画像撮像取得部 112eで取得した発光画像および明視野画像を重ね合わせることで、判定部 112cの判定結果が局在すると判定されたサンプル 102の中から測定対象のサンプル 102を選定する。

[0096] 発光量計測部 112gは、判定部 112cの判定結果が局在すると判定されたサンプル 102や選定部 112fで選定したサンプル 102からの発光量を発光画像に基づいて測定する。関連物質定量部 112gは、発光量計測部 112gで測定した発光量に基づいて、当該発光量の増減に対して直接的または間接的に関連する物質の量を定量する。例えば、発光タンパク質がルシフェラーゼの場合、関連物質定量部 112gは、例えば当該ルシフェラーゼの発光量の増減に対して直接的に関連する物質である AT Pの量を定量する。つまり、関連物質定量部 112gは、発光量計測部 112gで測定した発光量に基づ、て ATPを定量する ATP定量手段として用いることができる。

[0097] 以上の構成において、所定部位発光量測定装置 100で行われる処理の一例を、図 5を参照して説明する。なお、以下では、複数のサンプル 102に同じ融合遺伝子を導入して、複数のサンプル 102のうち特定のサンプル 102における所定の部位での発光量を経時的に測定する場合の処理の一例について説明する。 [0098] まず、情報通信端末 110は、蛍光画像撮像指示部 110aの処理で、通信インターフエース部 116を介して、 CCDカメラ 108dへ蛍光画像および明視野画像の撮像を指示する (ステップ SA— 1)。つぎに、 CCDカメラ 108dは、撮像範囲中に存在する複数のサンプル 102の蛍光画像および明視野画像を撮像し、（ステップ SA— 2：図 6参照 )、情報通信端末 110へ送信する (ステップ SA— 3)。なお、励起光は蛍光画像を撮像する時のみサンプル 102へ照射する。つぎに、情報通信端末 110は、蛍光画像取得部 112bの処理で、 CCDカメラ 108dで撮像した蛍光画像および明視野画像を、通信インターフェース部 116を介して取得し、記憶部 116の所定の記憶領域に記憶する（ステップ S A— 4)。

[0099] つぎに、情報通信端末 110は、判定部 112cの処理で、蛍光画像と明視野画像とを比較することで、融合遺伝子が導入されているカゝ否かをサンプル 102ごとに判定し、導入されていると判定されたサンプル 102に対してさらに当該サンプル 102の所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かを判定する (ステップ SA—5)。これにより、図 6に示すように、例えば、複数のサンプル 102 (細胞 1〜細胞 5)の中から、遺伝子が導入され、且つ所定の部位に発光タンパク質が局在しているもの（細胞 1)を確認することができる。

[0100] つぎに、遺伝子が導入され、且つ所定の部位に発光タンパク質が局在しているサンプル 102が存在した場合 (ステップ SA— 6 : Yes)、情報通信端末 110は、発光画像撮像指示部 112dの処理で、通信インターフェース部 116を介して、 CCDカメラ 10 6cに対して発光画像および明視野画像の撮像を指示する (ステップ SA— 7)。つぎに、 CCDカメラ 106cは、撮像範囲中に存在する複数のサンプル 102の発光画像および明視野画像を撮像し (ステップ SA— 8：図 7参照）、情報通信端末 110へ送信する (ステップ SA— 9)。なお、図 7に示した発光画像では、細胞 2の発光が最も強い場合を一例として示している。

[0101] つぎに、情報通信端末 110は、発光画像取得部 112eの処理で、 CCDカメラ 106c で撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部 116を介して取得すると共に、制御部 112の処理で、クロック発生部 114から時刻（後述する図 8〖こおける Tに対応)を取得し、発光画像および明視野画像と時刻とを、既に記憶されて V、る蛍光画像および明視野画像とさらに対応付けて記憶部 116の所定の記憶領域に記憶する（ステップ S A— 10)。

[0102] つぎに、情報通信端末 110は、選定部 112fの処理で、明視野画像、蛍光画像および発光画像を重ね合わせることで、判定部 112cの判定結果が局在すると判定されたサンプルの中力も測定対象のサンプルを選定 (特定)する（ステップ SA— 11)。なお、図 6に示した例では、遺伝子が導入され、且つ所定の部位に発光タンパク質が局在している細胞は細胞 1のみであるので、ステップ SA— 11では、図 8に示すように、自動的に細胞 1が特定される。

[0103] つぎに、情報通信端末 110は、発光量計測部 112gの処理で、選定したサンプル 1 02に対応する発光量 (発光強度)を発光画像に基づいて測定し、選定したサンプル 102 (例えば図 8における細胞 1)を識別する識別情報と当該発光量とを、既に記憶されている蛍光画像、発光画像、明視野画像および時刻とさらに対応付けて記憶部 1 16の所定の記憶領域に記憶する（ステップ SA— 12)。

[0104] そして、情報通信端末 110は、制御部 112の処理で、上述したステップ SA— 1〜ステツプ SA— 12を、例えば予め設定した時間間隔で所定の回数繰り返し実行する（S A— 13)ことで、図 9に示すように、選定したサンプル 102 (例えば、図 6、図 7および図 8に示す細胞 1)内の所定の部位における発光量の変動を、経時的（例えば、図 8 および図 9に示す時刻 T〜Tごと）に得る。

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[0105] 以上、詳細に説明したように、所定部位発光量測定装置 100によれば、サンプル 1 02に導入する融合遺伝子は、移行塩基配列および発光関連遺伝子に加えてさら〖こ蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものであり、当該融合遺伝子が導入されたサンプル 102の蛍光画像を撮り、撮像した蛍光画像に基づ!/、て所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かを判定し、判定結果が局在すると判定された場合、サンプル 102からの発光量を測定する。これにより、生きたサンプル 102内の所定の部位からの発光量を測定するにあたって、当該サンプル 102と同一のものに対して、所定の部位に発光たんぱく質が局在している力否かを確認することができる。また、融合遺伝子が導入された生きたサンプルに対し発光タンパク質の局在を確認すると共に、当該サンプルからの発光量を測定するので、サンプルからの発光量は所定の部位からの発光量に明確に対応しており、測定した発光量が所定の部位力ものものであることの信頼性を確保することができる。なお、サンプル 102が例えば細胞の場合、発光成分を取り込んでいない細胞をカウントせずに、正確な統計解析が可能である。また、所定部位発光量測定装置 100は、例えば、各種反応 (例えば薬物刺激や光照射など)の検査や治療などに好適に用いることができる。

また、所定部位発光量測定装置 100によれば、融合遺伝子が導入された生きたサンプル 102が撮像範囲中に複数存在する場合、複数のサンプル 102の蛍光画像を撮り、蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否力をサンプル 102ごとに判定し、複数のサンプル 102の発光画像を撮り、撮像した蛍光画像および撮像した発光画像を重ね合わせることで、判定結果が局在すると判定されたサンプル 102の中力も測定対象のサンプル 102を選定し、選定したサンプル 102からの発光量を測定する。これにより、複数のサンプル 102の中力個々のサンプル 102を識別し、単一のサンプル 102内の所定の部位からの発光量を測定することができる。また、蛍光および発光を画像で取得することで、測定対象のサンプル 102と同一のサンプル 102における発光タンパク質の局在と、当該サンプル 102から発せられる発光強度と、を得ることができる。そのため、遺伝子の導入効率や細胞周期による個々の細胞の生理的な状態の違いの影響を排除した解析を行うことができる。ここで、本実施の形態の所定部位発光量測定装置 100では、図 5に示すように、一例として、蛍光画像を撮像した後、発光タンパク質が所定の部位に局在してヽる力否かの判定を行い、そして、局在すると判定された場合に発光画像を撮像する、という処理を行なっているが、発光画像の撮像は、蛍光画像の撮像とともに行なってもよい。換言すると、所定部位発光量測定装置 100は、蛍光画像および発光画像を撮像した後、局在の判定を行なってもよい。具体的には、所定部位発光量測定装置 100は、融合遺伝子が導入された生きたサンプル 102が撮像範囲中に複数存在する場合、複数のサンプル 102について、蛍光画像および発光画像を撮り、蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かをサンプル 102ごとに判定し、撮像した蛍光画像および撮像した発光画像を重ね合わせることで、判定結果が局在すると判定されたサンプル 102の中から測定対象のサンプル 102を選定し、選定したサンプル 102からの発光量を測定してもよい。

[0107] さらに、所定部位発光量測定装置 100によれば、蛍光画像の撮像、局在の判定、発光画像の撮像、測定対象のサンプル 102の選定、発光量の測定を繰り返し実行することで、サンプル 102内の所定の部位からの発光量を経時的に得る。これにより、例えば特定のサンプル 102内の所定の部位における発光量の変動を経時的に測定することができる。

[0108] ここで、所定部位発光量測定装置 100において、サンプルに導入される融合遺伝子は、複数存在し、移行塩基配列で移行させる発光タンパク質の移行先の部位と、発光タンパク質から発せられる発光の発光色と、蛍光タンパク質から発せられる蛍光の蛍光色との組み合わせがそれぞれ異なるように予め作製されたものでもよ、。そして、この場合、所定部位発光量測定装置 100は、サンプル 102からの発光を発光色別に分離し、撮像した蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを蛍光色ごとに判定し、判定結果が局在すると判定された場合、分離した複数の発光のうち当該局在すると判定された部位からの発光を特定し、特定した発光の発光量を測定してもよい。これにより、例えば、 1つのサンプル 102内の複数の部位からの発光量を同時に測定することができたり、サンプル 102内の複数の部位からの発光量をサンプル 102ごとに同時に測定することができたりする。

具体的には、サンプル 102が細胞である場合、細胞に導入される融合遺伝子を 2 つ作製し、 1つは、ミトコンドリア移行シグナルで移行させる緑色ルシフェラーゼの移行先の部位であるミトコンドリアと、緑色ルシフェラーゼカも発せられる発光の発光色（緑色）と、 GFPから発せられる蛍光の蛍光色 (緑色）と、の組み合わせで作製され、残りの 1つは、細胞質で発現させる赤色ルシフェラーゼから発せられる発光の発光色（赤色）と、 CFPから発せられる蛍光の蛍光色 (シアン）と、の組み合わせで作製されてもよい。そして、この場合、所定部位発光量測定装置 100は、細胞力ゝらの発光を発光色別（緑色、赤色）に分離し、撮像した蛍光画像に基づいて、ミトコンドリアに緑色ルシフェラーゼが局在する力否かを GFPから発せられる蛍光色 (緑色)で判定し、細胞質に赤色ルシフェラーゼが局在するか否かを CFP力発せられる蛍光色（シアン）で判定し、判定結果が局在すると判定された場合、分離した 2つの発光 (緑色、赤色）のうち当該局在すると判定された部位力の発光を特定し、特定した発光の発光量を測定してもよい。換言すると、細胞内のミトコンドリアに対しては、移行塩基配列としてミトコンドリア移行シグナル、発光タンパク質として緑色ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質として GFPを選択し、一方、当該細胞内の細胞質に対しては、移行塩基配列は用いず、発光タンパク質として赤色ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質として CFPを選択し、ミトコンドリアと細胞質での発光量 (さらには ATP量など）の変動を発光強度の変化として個別に且つ同時に測定してもよい。

[0109] また、所定部位発光量測定装置 100において、測定した発光量に基づいて、当該発光量の増減に対して直接的または間接的に関連する物質の量を定量してもよい。具体的には、発光タンパク質がルシフェラーゼの場合、例えば当該ルシフェラーゼの発光量の増減に対して直接的に関連する物質である ATPの量を定量してもよい。これにより、特定のサンプル 102内の所定の部位における関連物質 (例えば ATPなど )の量の変動を例えば経時的に測定することができる。

[0110] また、他の実施の形態として、例えば、細胞周期ごとに発現量及び Z又は局在部位が変化するような蛍光タンパク質および発光タンパク質を含む細胞を作製し、当該細胞から発せられる蛍光および発光を経時的に測定することで、細胞周期を、蛍光タンパク質の発現量及び Z又は局在部位の変化で確認するとともに細胞の発光量の変動を経時的に測定してもよい。

また、複数の神経細胞を対象とした場合、神経細胞に導入する融合遺伝子として、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子、当該発光タンパク質を別の神経細胞へ移行させる移行塩基配列および蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものを作製し、当該融合遺伝子が導入された神経細胞から別の神経細胞へ発光タンパク質が移行する過程を、神経細胞から発せられる蛍光色で確認し、当該移行する過程における神経細胞における発光量の変動を経時的に測定してもよい。

[0111] (付記)蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子および発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子を融合した融合遺伝子を導入したサンプルから発せられる蛍光の蛍光強度を測定する蛍光測定ステップと、

前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいてサンプルの位置を特定する位置特定ステップと、

当該サンプル力発せられる発光の発光強度を測定する発光測定ステップと、前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて発光量を定量する発光量定量ステップと、

を含むことを特徴とする蛍光'発光測定方法。

[0112] [Π]以下に、本発明にかかる発現量測定方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。

[0113] まず、本発明を実施するための装置である発現量測定装置 1000の構成について、図 20〜図 22を参照して説明する。図 20は、発現量測定装置 1000の全体構成の一例を示す図である。

[0114] 図 20に示すように、発現量測定装置 1000は、細胞 1020と、細胞 1020を収納した容器 1030 (具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器 1030を配置するステージ 1040と、発光画像撮像ユニット 10 60と、蛍光画像撮像ユニット 1080と、情報通信端末 1100と、で構成されている。また、発現量測定装置 1000において、発光画像撮像ユニット 1060に含まれる対物レンズ 1060aと蛍光画像撮像ユニット 1080に含まれる対物レンズ 1080aとは、図示の如ぐ細胞 1020、容器 1030およびステージ 1040を挟んで上下の対向する位置に配置される。なお、発光画像撮像ユニット 1060および蛍光画像撮像ユニット 1080の配置を入れ替えてもよい。

[0115] 細胞 1020は、発光タンパク質 (具体的にはルシフェラーゼ)を発現する発光関連遺伝子、蛍光タンパク質 (具体的には GFP)を発現する蛍光関連遺伝子および解析対象の遺伝子に加えてさらに、細胞周期における所定のステージで発現する細胞周期関連遺伝子を導入した生きたものである。ここで、本明細書において発光とは、生物発光および化学発光を含む概念である。

なお、細胞 1020は、発光関連遺伝子と蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合した融合遺伝子を導入した生きたものでもよい。具体的には、細胞 1020は、発光関連遺伝子と蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合したベクターを導入した生きたものでもよい。また、細胞 10 20に対し発光関連遺伝子または蛍光関連遺伝子と組み合わせて導入する解析対象の遺伝子の数は複数でもよい。換言すると、細胞 1020に対し解析対象の遺伝子と発光関連遺伝子または蛍光関連遺伝子との組を複数導入してもよい。これにより、細胞周期のステージを同定すると共に、細胞 1020に導入した複数の解析対象の遺伝子の発現量を一緒に測定することができる。

[0116] ここで、蛍光で細胞周期のステージを同定し、発光で解析対象の遺伝子の発現量を測定する場合、細胞 1020は、蛍光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを関連付けて導入すると共に、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを関連付けて導入した生きたものでもよい。具体的には、細胞 1020は、蛍光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合したベクター (蛍光関連遺伝子導入ベクター）を導入すると共に、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクター (発光関連遺伝子導入べクタ一）を導入した生きたものでもよい。また、細胞周期関連遺伝子プロモーターを導入したベクターを細胞 1020に導入してもよい。具体的には、細胞周期マーカーとして知られて!/、る Cyclin B1プロモーターを導入した GFPセンサー（アマシャムバイオサィエンス社製)を細胞 1020に導入してもよい。また、 HaloTag (登録商標）ベクター（プロメガ社製)を細胞 1020に導入し、 HaloTag (登録商標）リガンド (プロメガ社製)を細胞 1020に添加して、細胞 1020を蛍光標識してもよい。また、解析対象の遺伝子プロモーターを導入したルシフェラーゼベクターを細胞 1020に導入し、発現させてもよい。また、 HaloTag (登録商標）ベクター（プロメガ社製)を細胞 1020に導入し、 Ha loTag (登録商標）リガンド (プロメガ社製)を細胞 1020に添加して、細胞 1020をルシフェラーゼ標識してもよい。

[0117] また、蛍光で細胞周期のステージを同定し、発光で解析対象の遺伝子の発現量を測定する場合、細胞 1020は、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入し、細胞 1020の所定の部位 (具体的には、核、細胞膜、細胞質など)を蛍光物質で染色した生きたものでもよい。具体的には、細胞 1020は、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合した融合遺伝子 (具体的には、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクター）を導入し、細胞 1020の所定の部位 (具体的には、核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色した生きたものでもよい。ここで、細胞 1020の核を、生細胞核染色試薬" DRAQ5" (Biostatus社製)を用いて染色してもよい。また、細胞 1020の細胞膜を、 "PKH LinkerKits" (SIGMA社製）を用いて染色してもよ！/ヽ (ただし、この場合、その形状力細胞周期のステージが同定可能な細胞 (具体的には PC 12など）を用いる。 ) ₀

[0118] また、発光で細胞周期のステージを同定し、蛍光で解析対象の遺伝子の発現量を測定する場合、細胞 1020は、発光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを関連付けて導入すると共に、蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを関連付けて導入した生きたものでもよい。具体的には、細胞 1020は、発光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合したベクター (発光関連遺伝子導入ベクター）を導入すると共に、蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクター (蛍光関連遺伝子導入ベクター）を導入した生きたものでもよい。また、細胞周期関連遺伝子プロモーターを導入したベクターを細胞 1020に導入してもよい。具体的には、 Cyclin B1プロモーターを導入したルシフェラーゼベクターを作製し、細胞 1020に導入してもよい。また、 HaloTa g (登録商標）ベクター（プロメガ社製)を細胞 1020に導入し、 HaloTag (登録商標）リガンド (プロメガ社製）を細胞 1020に添加して、細胞 1020をルシフヱラーゼ標識してもよい。また、解析対象の遺伝子プロモーターを導入した蛍光タンパク質ベクターを細胞 1020に導入し、発現させてもよい。また、 HaloTag (登録商標）ベクター（プロメガ社製)を細胞 1020に導入し、 HaloTag (登録商標）リガンド (プロメガ社製)を細胞 1020に添加して、細胞 1020を蛍光標識してもよい。また、 β lactamase遺伝子をレポーター遺伝子として細胞 1020に導入してもよい。

[0119] なお、細胞周期関連遺伝子としては、サイクリン (具体的には、 Cyclin Al、 Cycli n A2、 Cyclin Bl、 Cyclin B2、 Cyclin B3、 Cyclin C、 Cyclin Dl、 Cyclin

D2、 Cyclin D3、 Cyclin El、 Cyclin E2、 Cyclin F、 Cyclin Gl、 Cyclin G2、 Cyclin H、 Cyclin I、 Cyclin Tl、 Cyclin T2a、 Cyclin T2bなど）、サイクリンキナーゼ (具体的には、 CDK2、 CDK28など)などを適用してもよい。また、解析対象の遺伝子としては、上述した細胞周期関連遺伝子、サ一力ディアンリズム調節遺子 (具体的には、 period¾伝子、 Kai遺子、 timeless遺子、 per遺 is子、 cl ock遺伝子など）、その他細胞周期との関連性が不明な遺伝子などを適用してもよい [0120] 再び図 20の説明に戻り、発光画像撮像ユニット 1060は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、細胞 1020の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット 1060は、図示の如ぐ対物レンズ 1060aと、ダイクロイツクミラー 1060bと、 CCDカメラ 1060c と、で構成されている。対物レンズ 1060aは、具体的には、（開口数 Z倍率)²の値が 0. 01以上のものである。ダイクロイツクミラー 1060bは、細胞 1020から発せられた発光を色別に分離し、 2色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合に用いる。 CCDカメラ 1060cは、対物レンズ 1060aを介して当該 CCDカメラ 1060cのチップ面に投影された細胞 1020の発光画像や明視野画像を撮る。また、 CCDカメラ 1060c は、情報通信端末 1100と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞 10 20が撮像範囲中に複数存在する場合、 CCDカメラ 1060cは、撮像範囲中に含まれる複数の細胞 1020の発光画像や明視野画像を撮像してもよい。なお、図 20では、ダイクロイツクミラー 1060bで分離した 2つの発光に対応する発光画像を 2台の CCD カメラ 1060cで別々に撮像する場合の一例を示しており、 1つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット 1060は、対物レンズ 1060aおよび 1台の CCDカメラ 106 Ocで構成されてもよい。

[0121] ここで、 2色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ュニット 1060は、図 21に示すように、対物レンズ 1060aと、 CCDカメラ 1060cと、スプリットイメージユニット 1060dと、で構成されてもよい。そして、 CCDカメラ 1060cは、スプリットイメージユニット 1060dを介して当該 CCDカメラ 1060cのチップ面に投影されたサンプル 1020の発光画像 (スプリットイメージ)や明視野像を撮像してもよ!ヽ。スプリットイメージユニット 1060dは、細胞 1020から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイツクミラー 1060bと同様、 2色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合に用いる。

[0122] また、複数色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合 (つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット 1060は、図 22に示すように、対物レンズ 106 Oaと、 CCDカメラ 1060cと、フィルターホイール 1060eと、で構成されてもよい。そして、 CCDカメラ 1060cは、フィルターホイール 1060eを介して当該 CCDカメラ 1060 cのチップ面に投影された細胞 102の発光画像や明視野画像を撮像してもょヽ。フィルターホイール 1060eは、細胞 1020から発せられた発光をフィルター交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合に用いる。

[0123] 再び図 20に戻り、蛍光画像撮像ユニット 1080は、具体的には倒立型の蛍光顕微鏡であり、細胞 1020の蛍光画像を撮像する。蛍光画像撮像ユニット 1080は、図示の如ぐ対物レンズ 1080aと、ダイクロイツクミラー 1080bと、キセノンランプ 1080cと、 CCDカメラ 1080dと、で構成されている。 CCDカメラ 1080dは、対物レンズ 1080aを介して当該 CCDカメラ 1080dのチップ面に投影された細胞 1020の蛍光画像や明視野画像を撮る。また、 CCDカメラ 1080dは、情報通信端末 1100と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞 1020が撮像範囲中に複数存在する場合、 C CDカメラ 1080dは、撮像範囲中に含まれる複数の細胞 1020の蛍光画像や明視野画像を撮像してもよい。ダイクロイツクミラー 1080bは、細胞 102からの蛍光を透過するとともに、キセノンランプ 1080cから照射された励起光が細胞 1020へ照射されるように励起光の方向を変える。キセノンランプ 1080cは励起光を照射する。

[0124] ここで、発光画像撮像ユニット 1060および蛍光画像撮像ユニット 1080は、具体的には、それぞれ倒立型の発光顕微鏡および倒立型の蛍光顕微鏡でもよぐステージ 1040は回転するものでもよ!/、。

[0125] 情報通信端末 1100は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、情報通信端末 1100は、図 23に示すように、大別して、制御部 1120と、システムの時刻を計時するクロック発生部 1140と、記憶部 1160と、通信インターフェース部 1180と、入出力インターフェース部 1200と、入力部 1220と、出力部 1240と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。

[0126] 記憶部 1160は、ストレージ手段であり、具体的には、 RAMや ROM等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部 1160は制御部 1120の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。

[0127] 通信インターフェース部 1180は、情報通信端末 1100と、 CCDカメラ 1060cおよび CCDカメラ 1080dと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフエース部 1180は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。

[0128] 入出力インターフェース部 1200は、入力部 1220や出力部 1240に接続する。ここで、出力部 1240には、モニタ (家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力部 1240をモニタとして記載する場合がある。 )₀また、入力部 1220には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニタを用いることができる。

[0129] 制御部 1120は、 OS (Operating System)等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部 1020は、大別して

、蛍光画像撮像指示部 1120aと、発光画像撮像指示部 1120bと、蛍光画像取得部 1120cと、発光画像取得部 1120dと、判定部 1120eと、蛍光測定部 1120fと、発光測定部 1120gと、ステージ同定部 1120hと、選択部 1120i、発現量測定部 1120jと、で構成されている。

[0130] 蛍光画像撮像指示部 1120aは、通信インターフェース部 1160を介して、 CCDカメラ 1080dへ蛍光画像や明視野画像の撮像を指示する。発光画像撮像指示部 1120 bは、通信インターフェース部 1160を介して、 CCDカメラ 1060cへ発光画像や明視野画像の撮像を指示する。蛍光画像取得部 1120cは、 CCDカメラ 1080dで撮像した蛍光画像や明視野画像を、通信インターフェース部 1160を介して取得する。発光画像取得部 1120dは、 CCDカメラ 1060cで撮像した発光画像や明視野画像を、通信インターフェース部 1160を介して取得する。

[0131] 判定部 1120eは、蛍光画像および Zまたは発光画像に基づいて、各遺伝子が導入されている力否かを細胞 1020ごとに判定する。蛍光測定部 1120fは、 CCDカメラ 1080dで撮像した蛍光画像に基づいて、各細胞 1020から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定する。発光測定部 1120gは、 CCDカメラ 1060cで撮像した発光画像に基づいて、各細胞 1020から発せられた発光強度をそれぞれ測定する。

[0132] ステージ同定部 1120hは、蛍光測定部 1120fで測定した蛍光強度または発光測定部 1120gで測定した発光強度に基づ、て細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞 1020ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞 1020ごとに同定する。なお、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入し、その所定の部位 (具体的には核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色した生きた細胞 1020を対象とした場合、 CCDカメラ 1080dで撮像した蛍光画像に基づ、て細胞 1020の形状が変化したか否かを判定することで、細胞周期のステージを同定してもよい。選択部 1120iは、ステージ同定部 1120hでステージが同定された細胞 1020の中力も測定対象の細胞 1020を選択する。

[0133] 発現量測定部 1120jは、選択部 1120iで選択した細胞 1020を対象として、ステージ同定部 1120hで発光強度を用いる場合には蛍光測定部 1120fで測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定し、ステージ同定部 1120hで蛍光強度または蛍光画像を用いる場合には発光測定部 1120gで測定した発光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定する。なお、発現量測定部 1120jは、複数の細胞 1020または選択部 1120iで選択した細胞 1020を対象として、蛍光測定部 1120fで測定した蛍光強度に基づヽて解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、 CCDカメラ 1080dで撮像した蛍光画像に基づヽて解析対象の遺伝子の細胞 10 20内における発現部位を同定してもよい。

[0134] 以上の構成において、発現量測定装置 1000で行われる処理の一例を、図 24を参照して説明する。なお、以下では、発光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合したベクターおよび蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクターを複数の細胞 1020に導入し、導入した複数の細胞 1020のうち特定の細胞 1020を対象として、発光強度で細胞周期のステージを同定しながら、蛍光強度で解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定すると共に蛍光画像で解析対象の遺伝子の細胞 102 0内における発現部位を経時的に同定する場合の処理の一例について説明する。

[0135] まず、情報通信端末 1100は、蛍光画像撮像指示部 1100aの処理で通信インターフェース部 1160を介して CCDカメラ 1080dへ蛍光画像の撮像を指示し、発光画像撮像指示部 1120bの処理で通信インターフェース部 1160を介して CCDカメラ 106 Ocへ発光画像の撮像を指示する（ステップ SB— 1)。つぎに、 CCDカメラ 1080dは、撮像範囲中に存在する複数の細胞 1020の蛍光画像を撮像し (ステップ SB— 2)、当該蛍光画像を情報通信端末 1100へ送信する (ステップ SB— 3)。一方、 CCDカメラ 1060cは、撮像範囲中に存在する複数の細胞 1020の発光画像を撮像し (ステップ SB— 4)、当該発光画像を情報通信端末 1100へ送信する (ステップ SB— 5)。なお、蛍光画像の撮像指示および発光画像の撮像指示は、異なる時刻または時間間隔で行ってもよい。例えば、細胞周期のステージを同定するために用いる発光画像の撮像は数時間おきに行い、解析対象の遺伝子の発現量を測定するために用いる蛍光画像の撮像は数分おきに行ってもよい。また、励起光は蛍光画像を撮像する時のみ細胞 1020へ照射する。

[0136] つぎに、情報通信端末 1100は、（a)蛍光画像取得部 1120cの処理で通信インタ一フェース部 1160を介して蛍光画像を取得し、 (b)発光画像取得部 1120dの処理で通信インターフェース部 1160を介して発光画像を取得し、（c)制御部 1120の処理でクロック発生部 1140から時刻を取得し、 (d)取得した蛍光画像と発光画像と時刻とを対応付けて記憶部 1160の所定の記憶領域に記憶する (ステップ SB— 6)。

[0137] つぎに、情報通信端末 1100は、判定部 1120eの処理で、蛍光画像および Zまたは発光画像に基づいて、ベクターが導入されている力否かを細胞 1020ごとに判定する（ステップ SB— 7)。つぎに、ベクターが導入されている細胞 1020が少なくとも 1 つ存在した場合 (ステップ SB— 8 : Yes)、情報通信端末 1100は、蛍光測定部 1120 fの処理で蛍光画像に基づいて各細胞 1020から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定すると共に、発光測定部 1120gの処理で発光画像に基づいて各細胞 102 0から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定する (ステップ SB— 9)。

[0138] つぎに、情報通信端末 1100は、ステージ同定部 1120hの処理で、発光強度に基づ、て細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞 1020ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞 1020ごとに同定する (ステップ SB— 10)。なお、蛍光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合したベクターおよび発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクターを細胞 1020に導入した場合、蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞 1020ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞 1020ごとに同定してもよい。また、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクターを細胞 1020に導入し、その所定の部位 (具体的には核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色した場合、蛍光画像に基づいて細胞 102 0の形状が変化した力否かを細胞 1020ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞 1020ごとに同定してもよい。

[0139] つぎに、情報通信端末 1100は、選択部 1120iの処理で、ステップ S A— 10でステージが同定された細胞 1020の中力も測定対象の細胞 1020を選択する（ステップ S B— 11)。つぎに、情報通信端末 1100は、発現量測定部 1120jの処理で、ステップ SB— 11で選択した細胞 1020を対象として、蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、蛍光画像に基づいて解析対象の遺伝子の細胞 102 0内における発現部位を同定する（ステップ SB— 12)。なお、ステップ SB— 10において蛍光強度または蛍光画像を用いる場合、ステップ SB— 12では、発光強度に基づ、て解析対象の遺伝子の発現量を測定してもよ、。

[0140] そして、情報通信端末 1100は、制御部 1120の処理で、上述したステップ SB— 1 〜ステップ SB— 12までの処理を例えば予め設定した時間間隔で所定の回数繰り返し実行し、所定の回数終了した場合 (ステップ SB— 13 : Yes)には処理を終了する。ここで、発光画像および蛍光画像の撮像および取得だけを繰り返し実行し、解析の時点で、発光強度の測定、蛍光強度の測定、ステージの同定、細胞 1020の選択、発現量の測定を行ってもよい。つまり、解析に必要な元データである発光画像および蛍光画像だけをまとめて取得し、その後、解析の時点で、発光強度の測定、蛍光強度の測定、ステージの同定、細胞 1020の選択、発現量の測定を行ってもよい。具体的には、発光画像および蛍光画像の取得後に、解析の時点で、細胞 1020の選択、発現量の測定を行ってもよい。また、発光画像および蛍光画像の取得を行った後、解析の時点で、ステージの同定、細胞 1020の選択を行ってもよい。また、発光画像および蛍光画像の取得後に、解析の時点で、細胞 1020の選択を行ってもよい。また、蛍光画像を取得した後、測定対象の細胞 1020を選択し、そして発光画像を取得してちょい。

[0141] 以上、詳細に説明したように、発現量測定装置 1000によれば、発光関連遺伝子と蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞 1020を対象として、細胞 1020から発せられた発光の発光強度を測定し、細胞 1020から発せられた蛍光の蛍光強度を測定し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づ!、て解析対象の遺伝子の発現量を測定するにあたって、細胞は、発光関連遺伝子、蛍光関連遺伝子および解析対象の遺伝子に加えてさらに細胞周期関連遺伝子を導入したものであり、発現量の測定で発光強度を用いる場合には測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定し、発現量の測定で蛍光強度を用いる場合には測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定することで、細胞周期のステージを同定する。これにより、細胞 1020に導入した解析対象の遺伝子の発現量の測定において同調培養の操作を行わずに当該細胞 1020 に対して細胞周期のステージを同定することができ、その結果、実験者の作業的な負担を軽減することができる。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を評価することができる。具体的には、細胞周期との直接の関与が不明である解析対象の遺伝子に関して、薬剤投与や温度変化などの刺激で引き起こされる発現量の変化を細胞周期のステージと共に得ることができるので、当該解析対象の遺伝子と細胞周期との関与を検証することができる。また、細胞周期との直接の関与が示唆される解析対象の遺伝子に関して、当該解析対象の遺伝子の発現量と細胞周期のステージとを一緒に取得することができるので、当該解析対象の遺伝子が細胞周期マーカーとして有用である力否かを評価することができる。なお、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入し、その所定の部位 (具体的には、核、細胞膜、細胞質など)を蛍光物質で染色した生きた細胞 1020を対象とした場合、発現量測定装置 1000は、細胞 1020から発せられた発光の発光強度を測定し、測定した発光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定し、当該細胞 1020の蛍光画像を撮像し、撮像した蛍光画像に基づ!/、て細胞 1020の形状が変化した力否かを判定することで、細胞周期のステージを同定してもよい。なお、発光誘導蛋白遺伝子の取り込みを確認するための方法を除き、蛍光融合遺伝子の変わりに蛍光色素を用いてもよいが、励起光による光毒性の影響を最小限にするために、蛍光色素による撮像は、蛍光のみで撮像する場合に比べて撮像回数を減らすよう〖こすることができる。また、発現量測定装置 1000は、例えば、各種反応 (例えば薬物刺激ゃ光照射など）の検査や治療などに好適に用いることができる。 [0142] ここで、これまでは、レポーターアツセィを行う際に、様々な細胞周期ステージの細胞を一群のデータとして取り扱つていた。細胞周期は、細胞の成長、 DNAの複製、染色体の分配、細胞の分裂などからなる複数の連続反応であり、そのステージにより様々な遺伝子の発現が変動することは十分に考えられる。そこで、発現量測定装置 1000を利用すれば、細胞周期への直接の関与が不明である遺伝子に関して、薬剤や温度変化など、何らかの刺激により引き起こされる遺伝子発現量変化を検出したい場合に、細胞周期データと合わせることで、より詳細な解析結果が得られる。また、発現量測定装置 1000を利用すれば、細胞周期との直接の関与が示唆される遺伝子に関しても、各細胞の細胞周期のステージが判別できるので、従来行ってきた同調培養などの操作を必要とせず、解析を行いたいステージの細胞のみを選択し、観察対象とすることができる。

[0143] また、発現量測定装置 1000によれば、細胞 1020が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞 1020の蛍光画像を撮像し、複数の細胞 1020の発光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各細胞 1020から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、撮像した蛍光画像に基づいて、各細胞 1020から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を細胞 1020ごとに測定し、発現量の測定で発光強度を用いる場合には測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞 1020ごとに判定し、発現量の測定で蛍光強度を用いる場合には測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞 1020ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞 1020ごとに同定する。これにより、複数の細胞 1020を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を細胞 1020ごとに測定すると共に、細胞周期のステージを細胞 1020ごとに同定することができる。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を細胞 1020ごとに評価することができる。なお、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入し、その所定の部位 (具体的には、核、細胞膜、細胞質など)を蛍光物質で染色した生きた細胞 1020を対象とした場合、発現量測定装置 1000は、撮像範囲中に存在する複数の細胞 1020の発光画像を撮像し、複数の細胞 1020の蛍光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各細胞 1020から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、測定した発光強度に基づ!ヽて解析対象の遺伝子の発現量を細胞 1020ごとに測定し、撮像した蛍光画像に基づ、て細胞 1020の形状が変化した力否かを細胞 1020ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞 1020ごとに同定してもよい。また、細胞周期ごとに比較することにより、条件が等しい細胞同士の比較評価を行うようにしてもよい。

[0144] また、発現量測定装置 1000によれば、ステージが同定された細胞 1020の中から測定対象の細胞 1020を選択し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて、選択した細胞 1020に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定する。これにより、複数の細胞 1020の中力も個々の細胞 1020を識別し、単一の細胞 1020 を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、細胞周期のステージを同定することができる。

[0145] また、発現量測定装置 1000によれば、発光画像の撮像、蛍光画像の撮像、発光強度の測定、蛍光強度の測定、ステージの同定、細胞 1020の選択、発現量の測定を繰り返し実行することで、選択した細胞 1020を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定する。これにより、単一の細胞 1020を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量の変動を経時的に測定することができる。なお、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入し、その所定の部位 (具体的には、核、細胞膜、細胞質など)を蛍光物質で染色した生きた細胞 1020を対象とした場合、発現量測定装置 1000は、発光画像の撮像、蛍光画像の撮像、発光強度の測定、ステージの同定、細胞 1020の選択、発現量の測定を繰り返し実行することで、選択した細胞 1020を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定してもよい。また、同一視野内の異なる細胞を、各々の細胞周期に応じたタイミングで撮像したタイムラブス映像または 1画像上に同時に画像再生することにより、細胞周期を一致させた動画 (またはコマ送り）ないし 1画像表示をしてもよい。

[0146] また、発現量測定装置 1000によれば、発現量の測定において、選択された細胞 1 020を対象として、測定した蛍光強度に基づ!/ヽて解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、撮像した蛍光画像に基づいて解析対象の遺伝子の細胞 1020内における発現部位を同定する。これにより、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を評価することができるだけでなぐ解析対象の遺伝子の細胞 1020内における発現部位を得ることができる。

[0147] また、発現量測定装置 1000を利用すれば、具体的には、抗がん剤およびそのリード化合物の評価を行うことができる。特に、抗がん剤が細胞分裂の効率に有害な作用を持つかどうかの判断と、そのリード化合物が解析対象遺伝子の転写活性に影響を与えるかどうかを同時にモニターすることができる。また、発現量測定装置 1000を利用すれば、具体的には、細胞周期と細胞の形態との関連を調べることができる。特に、 PC12細胞などにおいては、細胞周期ステージ、分ィ匕段階によって形態が変わることが知られている力その他の神経様細胞においても、細胞形態による詳細なステージ同定を行うことができ、細胞形態そのものを細胞周期または分ィ匕のフェーズマーカーとして用いることができる。また、発現量測定装置 1000を利用すれば、具体的には、細胞周期に関わる可能性のある遺伝子において、発光検出にて細胞周期をモユタリングしながら、蛍光検出にて発現時期 ·局在性を同定することで、細胞周期との関連性の有無、または細胞周期マーカーとしての有用性を評価することができる。

[0148] [III]以下、添付図面を参照して、本発明に力かる測定装置としての顕微鏡ユニットおよび顕微鏡装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。また、図面の記載において、同一部分には同一の符号を付している。

[0149] (実施の形態 1)まず、本発明の実施の形態 1にかかる顕微鏡装置について説明する。図 25は、この実施の形態 1にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図 25 に示すように、この実施の形態 1にかかる顕微鏡装置 100aは、蛍光観察を行う蛍光顕微鏡ユニット 101と、微弱光観察を行う微弱光観察ユニット 102aと、発光標識および蛍光標識が付与された標本 Sを保持する保持手段としての保持部 7と、各顕微鏡ユニット 101, 102aによって撮像した標本 Sの標本像等を表示するモニター 9と、顕微鏡装置 100aの全体の処理および動作を制御する制御装置 PC1と、を備える。蛍光顕微鏡ユニット 101と微弱光顕微鏡ユニット 102aとは、互いに隣接して配置される

[0150] 蛍光顕微鏡ユニット 101は、蛍光対物レンズとしての対物レンズ 1および蛍光結像レンズとしての結像レンズ 2を有する高倍率の蛍光結像光学系と、この蛍光結像光学系によって結像される標本 Sの標本像である蛍光標本像を撮像する蛍光撮像手段としての撮像装置 3と、標本 Sを励起する励起光を発する励起光源 4と、励起光源 4からの励起光を集光するレンズ 5と、蛍光ユニットとしての蛍光キューブ 6と、を備える。

[0151] 対物レンズ 1は、標本側に大きな NAを有し、標本 Sに付与された蛍光標識の各点力発せられる蛍光をほぼ平行光束に変換する。結像レンズ 2は、対物レンズ 1によつてほぼ平行光束に変換された蛍光を集光して標本 Sの標本像である蛍光標本像を結像する。蛍光結像光学系は、蛍光標本像を 40倍以上の高倍率で結像する。撮像装置 3は、 CCD, CMOS等の固体撮像素子を有し、この固体撮像素子の撮像面上に結像される蛍光標本像を撮像し、画像データを生成して制御装置 PC1に出力する

[0152] 蛍光キューブ 6は、標本 Sを励起するための励起光を選択的に透過させる励起光透過フィルターとしての励起フィルター 6aと、この励起光によって励起された標本 Sから発せられる蛍光を選択的に透過させる蛍光透過フィルターとしての吸収フィルター 6bと、励起光を反射して蛍光を透過させるダイクロイツクミラー 6cとを一体に備える。励起フィルター 6aは、励起光源 4から発せられる各種波長の光の中から所定の波長域の励起光を抽出するバンドパスフィルターであり、吸収フィルター 6bは、所定の力ットオフ波長を有するロングウェーブパスフィルターである。なお、吸収フィルター 6b は、所定の波長範囲の蛍光を抽出するバンドパスフィルターでもよい。ノンドパスフィルターは、標本 Sから発せられる微弱光と蛍光の波長が近、場合に有効である。

[0153] 励起光源 4は、水銀ランプ、キセノンランプ、レーザー等によって実現され、励起光照射手段としての励起光源 4およびレンズ 5は、励起光源 4からの励起光を、励起光フィルター 6aを介し、ダイクロイツクミラー 6cによって反射させ標本 Sに照射する。なお、励起光源 4は、制御装置 PC1からの指示をもとに点灯および消灯を行う。

[0154] 微弱光顕微鏡ユニット 102aは、微弱光対物レンズとしての対物レンズ 11および微弱光結像レンズとしての結像レンズ 12を有する低倍率の微弱光結像光学系と、この微弱光結像光学系によって結像される標本 Sの標本像である微弱光標本像を撮像する微弱光撮像手段としての撮像装置 13と、を備える。

[0155] 対物レンズ 11は、標本側に大きな NAを有し、標本 Sに付与された発光標識の各点力も自己発光によって発せられる微弱光をほぼ平行光束に変換する。結像レンズ 12 は、対物レンズ 11によってほぼ平行光束に変換された微弱光を集光して標本 Sの標本像である微弱光標本像を結像する。微弱光結像光学系は、蛍光結像光学系の結像倍率よりも低い結像倍率で微弱光標本像を結像する。このとき、微弱光結像光学系は、標本側の NAを NAo、結像倍率を |8として、（NAOZ J8 ) ²≥0. 01を満足することが望ましい。

[0156] 撮像装置 13は、 CCD, CMOS等の固体撮像素子を有し、この固体撮像素子の撮像面上に結像される微弱光標本像を撮像し、画像データを生成して制御装置 PC1 に出力する。なお、撮像装置 13が有する固体撮像素子は、高感度のモノクローム C CDであって 0°C程度の冷却 CCDを用いるとよ!/、。

[0157] 保持部 7は、標本 Sを直接載置するプレパラート、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体、インキュベータ一等の保持部材 7aと、この保持部材 7aとともに標本 Sを 2次元的に移動させる可動ステージ 7bとを有する。可動ステージ 7bは、制御装置 PC1からの指示をもとに、ステージ駆動部 8によって駆動される。

[0158] 制御装置 PC1は、 CPUを備えたコンピュータ等の処理装置によって実現され、撮像装置 3, 13、励起光源 4、ステージ駆動部 8およびモニター 9を電気的に接続し、これらの各構成部位の動作を制御する。制御装置 PC 1は、特に、撮像切換制御手段として、撮像装置 13によって撮像される微弱光標本像の像特性をもとに、微弱光顕微鏡ユニット 102aによる微弱光標本像の撮像と、蛍光顕微鏡ユニット 101による蛍光標本像の撮像とを切り換える撮像切換処理の制御を行う。

[0159] ここで、制御装置 PC1が制御する撮像切換処理について説明する。図 26は、撮像切換処理の処理手順を示すフローチャートである。図 26に示すように、制御装置 PC 1は、可動ステージ 7bによって微弱光結像光学系の視野内に移動された標本 Sの微弱光標本像を撮像装置 13によって撮像する (ステップ S101)。この撮像結果をもとに、制御装置 PCIは、微弱光標本像の像特性としての像強度があらかじめ設定したしきい値より大きい領域が微弱光標本像内にあるカゝ否かを判断する (ステップ S103) 。像強度がしき、値より大き、領域がな、と判断された場合 (ステップ S 103： No)、制御装置 PC 1は、ステップ S 101からの処理を繰り返す。

[0160] 一方、像強度がしきい値より大きい領域があると判断された場合 (ステップ S103 :Y es)、制御装置 PCIは、ステップ S101で撮像した微弱光標本像を記録し (ステップ S 105)、可動ステージ 7bによって蛍光結像光学系の視野内に標本 Sを移動する (ステップ S107)。そして、制御装置 PC1は、微弱光標本像の像強度がしきい値より大きい領域に対応する蛍光標本像を撮像装置 3によって撮像して記録し (ステップ S 109)、撮像切換処理を終了する。なお、標本 Sの経過観察を行う場合、制御装置 PC1は、ステップ S109の後、可動ステージ 7bによって標本 Sを再び微弱光結像光学系の視野内に移動し、ステップ S101からの処理を繰り返すように制御するとよい。また、ステップ S 109での撮像は、タイムラブス撮像または 1画像の撮像のどちらでもよい。また、同一視野内の異なる細胞を、各々の細胞周期に応じたタイミングで撮像したタイムラブス映像または 1画像上に同時に画像再生することにより、細胞周期を一致させた動画 (またはコマ送り）な、し 1画像表示をしてもょ、。

[0161] 制御装置 PC1は、ステップ S105および S109では、撮像した微弱光標本像および蛍光標本像を自装置内に備える RAM等の記憶部に記憶する。また、制御装置 PC1 は、ステップ S101および S109では、撮像した微弱光標本像および蛍光標本像をモ二ター 9に逐次表示するようにしてもよい。さらに、制御装置 PC1は、ステップ S101 〜S105の間、すなわち、微弱光顕微鏡ユニット 102によって標本 Sの微弱光観察を行っている間、励起光源 4を消灯し、ステップ S 109で標本 Sの蛍光観察を行う場合、励起光源 4を点灯するように制御を行うとよい。あるいは、励起光源 4から蛍光ユニット 6までの光路上にシャッター等の遮光装置を設け、制御装置 PC1は、未照射手段として、励起光源 4を点灯および消灯する替わりに、遮光装置を開閉することによって励起光の照射を制御するようにしてもょ、。

[0162] なお、制御装置 PC1は、ステップ S103では、微弱光標本像内の部分的な領域の像強度をもとに蛍光観察への切り換えを判断するようにしたが、微弱光標本像の全体の像強度をもとに切り換えを判断するようにしてもよい。また、制御装置 PC1は、これらの像強度を、たとえば、所定時点力現時点までの累積の像強度として取得してもよぐあるいは現時点の瞬間的な像強度として取得してもよい。なお、微弱光標本像の全体の像強度を取得する場合には、撮像装置 13に替えてフォトマルチプライヤ一等の高感度の受光素子を用いてもょ、。

[0163] 以上説明したように、この実施の形態 1にかかる顕微鏡装置によれば、蛍光観察用の蛍光顕微鏡ユニット 101と微弱光観察用の微弱光顕微鏡ユニット 102aとを隣接して備えるとともに、蛍光結像光学系および微弱光結像光学系の各視野内に標本 Sを移動させる可動ステージ 7bとを備えるため、適宜に蛍光観察と微弱光観察とを切り換えることができ、また、微弱光標本像の像特性としての像強度に応じて、微弱光観察力蛍光観察へ即時に切り換えることができる。

[0164] なお、微弱光結像光学系は、対物レンズ 11および結像レンズ 12によって標本像を結像する無限遠補正光学系として説明したが、対物レンズのみによって標本像を結像する有限補正光学系としてもよい。

[0165] また、上述した撮像切換処理では、微弱光標本像の像強度等の像特性をもとに微弱光観察から蛍光観察に切り換えるようにしたが、蛍光観察で標本 Sに照射する励起光強度や標本 Sから発光される蛍光強度が弱ぐ励起光および蛍光によって標本 Sに与えるダメージが小さい場合などには、蛍光標本像の像強度等の像特性をもとに蛍光観察力微弱光観察に切り換えるようにしてもょ、。

[0166] (実施の形態 2)つぎに、本発明の実施の形態 2について説明する。上述した実施の形態 1では、可動ステージ 7bによって蛍光結像光学系および微弱光結像光学系の各視野内に標本 Sを移動させるようにしたが、この実施の形態 2では、蛍光結像光学系および微弱光結像光学系を移動させることによって各視野内に標本 Sを配置するようにしている。

[0167] 図 27は、本発明の実施の形態 2にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。

図 27に示すように、この実施の形態 2にかかる顕微鏡装置 200は、顕微鏡装置 100 aと同様に蛍光顕微鏡ユニット 201および微弱光顕微鏡ユニット 202を備え、また、これらの各顕微鏡ユニット 201, 202の中間位置に光学系移動手段としての回転駆動装置 14および保持軸 15a, 15bを備える。さら〖こ、顕微鏡装置 200は、顕微鏡装置 1 OOaが備えた保持部 7に替えて、可動範囲を小さくした可動ステージ 17bを有する保持部 17を備えるとともに、制御装置 PC1に替えて、制御装置 PC2を備える。その他の構成は、実施の形態 1と同じであり、同一の構成部分には同一符号を付している。

[0168] 蛍光顕微鏡ユニット 201は、蛍光顕微鏡ユニット 101と同じ各構成部位を一体に保持する筐体 21を備え、微弱光顕微鏡ユニット 202は、微弱光顕微鏡ユニット 102aと同じ各構成部位を一体に保持する筐体 22を備える。

[0169] 回転駆動装置 14は、蛍光顕微鏡ユニット 201が備える蛍光結像光学系および微弱光顕微鏡ユニット 202が備える微弱光結像光学系の各視野の略中心点を結ぶ線分の中点を通り各光学系の光軸に略平行な回転軸を有し、この回転軸を中心に、複数の保持軸 15a, 15bによって保持した蛍光顕微鏡ユニット 201および微弱光顕微鏡ユニット 202を回転移動させる。ここで、固定軸 15a, 15bは、それぞれ筐体 21, 2 2を保持している。

[0170] 可動ステージ 17bは、微弱光結像光学系の視野と概ね等しい範囲内で標本 Sを移動させる。また、可動ステージ 17bは、制御装置 PC2からの指示をもとに、ステージ駆動部 18によって駆動される。

[0171] 制御装置 PC2は、制御装置 PC1と同様に撮像装置 3, 13、励起光源 4およびステージ駆動部 18の動作を制御するのに加えて、回転駆動装置 14の動作を制御する。制御装置 PC2は、微弱光観察と蛍光観察とを切り換える場合、回転駆動装置 14を制御して蛍光顕微鏡ユニット 201および微弱光顕微鏡ユニット 202の配置を切り換える。

[0172] このように、この実施の形態 2にかかる顕微鏡装置 200よれば、回転駆動装置 14によって蛍光顕微鏡ユニット 201および微弱光顕微鏡ユニット 202を回転移動して蛍光観察と微弱光観察とを切り換えられるようにしているため、たとえば、培養液中に浸された標本等、高速で移動させることができない標本を観察対象とする場合でも、即時に蛍光観察と微弱光観察とを切り換えることができる。

[0173] なお、顕微鏡装置 200では、回転駆動装置 14によって各顕微鏡ユニット 201, 20 2の全体を回転移動させるようにしているが、撮像装置 3, 13を 1つの撮像装置で共用し、蛍光顕微鏡ユニット 201から撮像装置 3を除いた部分と、微弱光顕微鏡ュ-ット 202から撮像装置 13を除いた部分とを回転移動させて、互いに配置を切り換えるようにしてもよい。

[0174] 図 28は、このようにした場合の顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図 28に示すように、この実施の形態 2の変形例としての顕微鏡装置 300は、顕微鏡装置 200から撮像装置 13を取り除き、微弱光顕微鏡ユニット 202の全体を一体に保持した筐体 22に替えて、微弱光結像光学系を一体に保持する筐体 24を備えるとともに、蛍光顕微鏡ユニット 201の全体を一体に保持した筐体 21に替えて、撮像装置 3を除いた部分を一体に保持する筐体 23を備える。また、顕微鏡装置 300は、制御装置 PC2に替えて、制御装置 PC3を備える。その他の構成は、顕微鏡装置 200と同じであり、同一の構成部分には同一符号を付している。

[0175] 制御装置 PC3は、制御装置 PC2と同様に撮像装置 3、励起光源 4、ステージ駆動部 18および回転駆動装置 14の動作を制御する。ただし、制御装置 PC2が蛍光観察と微弱光観察とに応じて撮像装置 3, 13の制御を切り換えていたのに対し、制御装置 PC3は、蛍光観察および微弱光観察の両方の場合で撮像装置 3を制御して標本像を撮像するようにしている。このとき、制御装置 PC3は、蛍光観察および微弱光観察に応じて、撮像装置 3によって撮像される標本像の範囲、結像倍率等を切り換えて認識する。

[0176] なお、回転駆動装置 14は、固定軸 15a, 15bによって筐体 23, 24を保持し、制御装置 PC3からの指示をもとに、微弱光観察および蛍光観察に応じて、筐体 23, 24の配置を切り換える。

[0177] このように、この実施の形態 2の変形例としての顕微鏡装置 300よれば、蛍光顕微鏡ユニット 201および微弱光顕微鏡ユニット 202から撮像装置 3, 13を除く部分を回転駆動装置 14によって回転移動して蛍光観察と微弱光観察とを切り換えられるようにしているため、移動部分が軽量化され、より高速に移動および切り換えを行うことができる。また、顕微鏡装置 300では、顕微鏡装置 100a, 200に比して撮像装置の数を削減しているため、撮像装置に関連する回路構成を簡略ィ匕することができるとともに、制御装置 PC3の処理負荷を軽減させて処理の高速ィ匕をは力ることができる。また、装置を安価にすることができる。

[0178] なお、顕微鏡装置 200, 300では、回転駆動装置 14によって蛍光顕微鏡ユニット 2 01および微弱光顕微鏡ユニット 202、またはこれら各ユニットの一部を回転移動させるようにしたが、回転移動に限らず、たとえば、可動ステージ 17bに沿って蛍光顕微鏡ユニット 201および微弱光顕微鏡ユニット 202を平行移動させて、各ユニット 201, 202の配置を切り換えるようにしてもょ、。

[0179] (実施の形態 3)つぎに、本発明の実施の形態 3について説明する。上述した実施の形態 1および実施の形態 2では、標本 Sの同じ側に配置され独立した蛍光結像光学系および微弱光結像光学系を備えるようにしていたが、この実施の形態 3では、光学系の一部を共用した蛍光結像光学系および微弱光結像光学系を備えるようにしている。

[0180] 図 29は、本発明の実施の形態 3にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。

図 29に示すように、この実施の形態 3にかかる顕微鏡装置 400は、顕微鏡装置 100 aが独立して備えた蛍光結像光学系および微弱光結像光学系の対物レンズを共用し、一体ィ匕した顕微鏡ユニットを備える。具体的には、顕微鏡装置 400は、顕微鏡装置 100aが備えた蛍光顕微鏡ユニット 101と同様の顕微鏡ユニットを備え、さらに、この顕微鏡ユニットが有する対物レンズ 1と蛍光キューブ 6との間に挿脱可能なミラー 34 を備え、このミラー 34によって図上で左側に約 90度に折り曲げられる光軸上に、結像レンズ 12に替わる結像レンズ 32と撮像装置 13とを備える。

[0181] このようにして顕微鏡装置 400は、対物レンズ 1を共用し、対物レンズ 1と結像レンズ 2を有する蛍光結像光学系と、対物レンズ 1と結像レンズ 32とを有する微弱光結像光学系とを備える。また、顕微鏡 400は、顕微鏡装置 200が備えた保持部 17およびステージ駆動部 18を備えるとともに、励起光源 4とレンズ 5との間に未照射手段としてのシャッター 33と、このシャッター 33およびミラー 34を動作させる光路切換駆動部 35と、制御装置 PC4と、を備える。その他の構成は、実施の形態 1または実施の形態 2と同じであり、同一の構成部分には同一符号を付している。

[0182] 制御装置 PC4は、制御装置 PC2と同様に撮像装置 3, 13およびステージ駆動部 1 8の動作を制御するのにカ卩えて、光路切換駆動部 35を介してシャッター 33およびミラー 34の動作を制御する。制御装置 PC4は、微弱光観察から蛍光観察に切り換える場合、対物レンズ 1と蛍光キューブ 6との間力もミラー 34を取り除き、シャッター 33を開いて励起光源 4からの励起光を標本 Sに照射させる。一方、蛍光観察から微弱光観察に切り換える場合、制御装置 PC4は、シャッター 33を閉じて励起光源 4からの励起光を遮光し、標本 Sに対して励起光を未照射にするとともに、対物レンズ 1と蛍光キユーブ 6との間の光路上にミラー 34を挿入し配置して、標本 Sからの微弱光を結像レンズ 32に向けて反射させる。

[0183] なお、結像レンズ 32は、結像レンズ 2よりも短ヽ焦点距離を有し、結像レンズ 32を有する微弱光結像光学系は、結像レンズ 2を有する蛍光結像光学系の結像倍率よりも低い結像倍率で微弱光標本像を結像する。また、結像レンズ 32を有する微弱光結像光学系は、標本側の NAを NAo'、結像倍率を |8 'として、（NAO'Z JS ' ) ²≥0. 01 を満足することが望ましい。

[0184] このように、この実施の形態 3にかかる顕微鏡装置 400よれば、対物レンズを共用した蛍光結像光学系および微弱光結像光学系によって一体化した顕微鏡ユニットを備えるようにして、るため、顕微鏡装置全体の小型化および簡素化をは力ることができるとともに、蛍光観察と微弱光観察との切り換えにともなう移動部分が単一の光学素子となって軽量ィ匕されるため、より高速に移動および切り換えを行うことができる。

[0185] なお、励起光源 4からの励起光および標本 Sからの蛍光と、標本 Sからの微弱光との波長帯域が異なる場合、ミラー 34に替えて、励起光および蛍光を透過させるとともに微弱光を反射させるダイクロイツクミラーを用いるようにしてもよい。この場合、制御装置 PC4は、蛍光観察と微弱光観察とを切り換える場合、ダイクロイツクミラーを揷脱する必要はない。また、ダイクロイツクミラーを用いる場合、制御装置 PC4は、蛍光観察と微弱光観察とを同時に行うように制御してもよ、。

[0186] (実施の形態 4)つぎに、本発明の実施の形態 4について説明する。上述した実施の形態 1では、標本 Sに対して同じ側に蛍光顕微鏡ユニット 101および微弱光顕微鏡ユニット 102aを配置するようにした力この実施の形態 4では、標本 Sに対して互いに反対側に蛍光顕微鏡ユニットおよび微弱光顕微鏡ユニットを配置するようにして、る [0187] 図 30は、本発明の実施の形態 4にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図 30に示すように、この実施の形態 4にかかる顕微鏡装置 500は、顕微鏡装置 100 aが備えた蛍光顕微鏡ユニット 101および微弱光顕微鏡ユニット 102aを備えるとともに、顕微鏡装置 200が備えた保持部 17およびステージ駆動部 18を備え、さらに、制御装置 PC5およびモニター 9を備える。実施の形態 1または実施の形態 2と同じ構成部分には同一符号を付している。

[0188] 図 30に示す顕微鏡装置 500では、蛍光顕微鏡ユニット 101は、図上で標本 Sの下側に配置され、微弱光顕微鏡ユニット 102aは、標本 Sの上側に配置されている。なお、これら各ユニット 101, 102aの上下の配置関係は逆転させてもよい。

[0189] 制御装置 PC5は、制御装置 PC2と同様に撮像装置 3, 13、励起光源 4およびステージ駆動部 18の動作を制御する。制御装置 PC5は、微弱光観察から蛍光観察に切り換える場合、励起光源 4を点灯して標本 Sに励起光を照射させ、蛍光観察から微弱光観察に切り換える場合、励起光源 4を消灯し標本 Sに対して励起光を未照射にする。

[0190] なお、励起光源 4からダイクロイツクミラー 6cを介した標本 Sまでの光路上にシャツタ一 33等の遮光装置を設け、制御装置 PC5は、未照射手段として、励起光源 4を点灯および消灯する替わりに、遮光装置を開閉することによって励起光の照射および未照射を制御するようにしてもょ、。

[0191] また、励起光源 4からの励起光および標本 Sからの蛍光と、標本 S力の微弱光との波長帯域が異なる場合、たとえば、結像レンズ 12と撮像装置 13との間に、微弱光を透過させるとともに励起光および蛍光を遮光する波長抽出フィルターを設け、制御装置 PC5は、励起光源 4を消灯させることなく蛍光観察と微弱光観察とを切り換えるようにしてもよい。あるいは、この場合、制御装置 PC5は、蛍光観察と微弱光観察とを同時に行うように制御してもよ、。

[0192] このように、この実施の形態 4にかかる顕微鏡装置 500よれば、標本 Sに対して互いに反対側に蛍光顕微鏡ユニット 101および微弱光顕微鏡ユニット 102aを配置するようにしているため、機械的な駆動を全くさせることなぐ蛍光観察と微弱光観察とを即時に切り換えることができる。 [0193] なお、制御装置 PC5は、図示しない駆動装置によって蛍光顕微鏡ユニット 101を微弱光顕微鏡ユニット 102aに対して、可動ステージ 17bに沿って相対的に移動させるようにしてもよい。この場合、微弱光顕微鏡ユニット 102aによって標本 Sの広範囲な領域を観察し続けながら、この広範囲な領域内の任意の微小領域の拡大像を蛍光顕微鏡ユニット 101によって観察することができるとともに、標本 Sを全く移動させることなく蛍光観察および微弱光観察を行うことができる。

[0194] (実施の形態 5)つぎに、本発明の実施の形態 5について説明する。上述した実施の形態 1〜4では、発光標識および蛍光標識からの微弱光および蛍光によって標本 S を観察するようにしていた力この実施の形態 5では、さらに透過照明によって標本 S を観察するようにしている。

[0195] 図 31は、本発明の実施の形態 5にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。

図 31に示すように、この実施の形態 5にかかる顕微鏡装置 600は、実施の形態 1に力かる顕微鏡装置 100aに加えて、透過照明を行う照明手段としての透過照明ュ-ット 103aと、この透過照明ユニット 103aが有するシャッター 43等を駆動させる照明駆動部 46と、制御装置 PC1に替わる制御装置 PC6と、を備える。その他の構成は、実施の形態 1と同じであり、同一の構成部分には同一符号を付している。

[0196] 透過照明ユニット 103aは、透過照明用の白色光を発するハロゲンランプ等の白色光源 44と、白色光の照射および未照射を切り換えるシャッター 43と、白色光源 44からの白色光を標本 S上に集光させる照明レンズ系 45とを備え、標本 Sに対して、蛍光顕微鏡ユニット 101と反対側に配置されている。照明レンズ系 45は、コレクタレンズ 4 5aおよびコンデンサーレンズ 45bを有し、標本 Sに対してクリティカル照明を行う。なお、照明レンズ系 45は、標本 Sに対してケーラー照明を行うようにしてもよい。

[0197] 照明駆動部 46は、制御装置 PC6からの指示をもとに、シャッター 43および蛍光照明ユニット 104aを駆動する。ここで、蛍光照明ユニット 104aは、筐体 26によって一体に保持された励起光源 4、レンズ 5および蛍光キューブ 6を有する。照明駆動部 46は、シャッター 43を開閉して標本 Sに対する白色光の照射および未照射を切り換えるとともに、蛍光キューブ 6を対物レンズ 1と結像レンズ 2との間の光路上に挿脱するように蛍光照明ユニット 104aを移動させる。 [0198] 制御装置 PC6は、制御装置 PCIと同様に撮像装置 3, 13、励起光源 4およびステージ駆動部 8の動作を制御するのにカ卩えて、照明駆動部 46の動作を制御する。制御装置 PC6は、蛍光観察力透過照明による観察に切り換える場合、蛍光キューブ 6を対物レンズ 1と結像レンズ 2との間力も取り除くように蛍光照明ユニット 104aを移動させ、励起光源 4を消灯し、シャッター 43を開いて透過照明させる。透過照明による観察力蛍光観察に切り換える場合、制御装置 PC6は、シャッター 43を閉じ、蛍光キューブ 6が対物レンズ 1と結像レンズ 2との間に配置されるように蛍光照明ユニット 1 04aを移動させ、励起光源 4を点灯する。

[0199] また、微弱光観察力も透過照明による観察に切り換える場合、制御装置 PC6は、蛍光観察力も透過照明による観察に切り換える場合の制御に加えて、ステージ駆動部 8によって可動ステージ 7bを駆動し、標本 Sを蛍光結像光学系の視野内に移動させる制御を行う。なお、制御装置 PC6は、シャッター 43を開閉する替わりに、白色光源 44を点灯および消灯するようにしてもょヽ。

[0200] なお、透過照明ユニット 103aは、明視野観察用の照明を行うように示したが、明視野観察用に限らず、暗視野観察用、微分干渉観察用または位相差観察用の照明を行うようにしてもよい。また、これらの各種観察用の照明を切り換え可能に備えてもよい。なお、微分干渉観察用の照明を行う場合、透過照明ユニット 103aは、コンデンサ一レンズ 45bの光源側に偏光子および偏光分離プリズムを備え、蛍光結像光学系には、対物レンズ 1の瞳側に偏光合成プリズムおよび検光子を配設するとよい。また、位相差観察用の照明を行う場合、透過照明ユニット 103aは、コンデンサーレンズ 45 bの光源側にリングスリットを備え、蛍光結像光学系には、対物レンズ 1の略瞳位置に位相板を配設するか、対物レンズ 1を位相板を有する対物レンズに切り換えるようにするとよい。さらに、暗視野観察用の照明を行う場合、透過照明ユニット 103aは、コンデンサーレンズ 45bの光源側にリングスリット等を備えるようにするとよい。

[0201] また、透過照明ユニット 103aは、高倍率で透過照明による観察を行うために蛍光結像光学系に対応させて配置するように示した力低倍率で観察を行えるように微弱光結像光学系に対応させて配置してもよい。あるいは、これらの結像光学系の両方に対応させて配置してもよぐ各結像光学系に対して適宜配置を切り換えられるようにしてもよい。

[0202] ところで、顕微鏡装置 600では、顕微鏡装置 100aの構成に透過照明ユニット 103a 、照明駆動部 46をさらに備えるように示した力これに限定されず、たとえば、図 32 〜図 34に示すように、顕微鏡装置 200, 300, 400の各構成に、透過照明ユニット 1 03aと、照明駆動部 46もしくは照明駆動部 47とをさらに備えるようにしてもよい。

[0203] 図 32に示す顕微鏡装置 700は、顕微鏡装置 200の構成に透過照明ユニット 103a 、照明駆動部 46をさらに備えた場合であり、制御装置 PC7は、制御装置 PC2と同様に撮像装置 3, 13、励起光源 4、回転駆動装置 14およびステージ駆動部 18を制御するとともに、制御装置 PC6と同様に照明駆動部 46によって透過照明ユニット 103a および蛍光照明ユニット 104aを制御する。

[0204] 図 33に示す顕微鏡装置 800は、顕微鏡装置 300の構成に透過照明ユニット 103a 、照明駆動部 46をさらに備えた場合であり、制御装置 PC8は、制御装置 PC3と同様に撮像装置 3、励起光源 4、回転駆動装置 14およびステージ駆動部 18を制御するとともに、制御装置 PC6と同様に照明駆動部 46によって透過照明ユニット 103aおよび蛍光照明ユニット 104aを制御する。

[0205] 図 34に示す顕微鏡装置 900は、顕微鏡装置 300の構成に透過照明ユニット 103a 、照明駆動部 47をさらに備えた場合であり、制御装置 PC9は、制御装置 PC4と同様に撮像装置 3, 13、およびステージ駆動部 18を制御するとともに、照明駆動部 47によって透過照明ユニット 103a、ミラー 34および蛍光照明ユニット 105を制御する。

[0206] すなわち、制御装置 PC9は、蛍光観察または微弱光観察から透過照明による観察に切り換える場合、ミラー 34および蛍光キューブ 6を対物レンズ 1と結像レンズ 2との間から取り除くように蛍光照明ユニット 105を移動させ、シャッター 33を閉じて励起光を未照射とし、シャッター 43を開いて透過照明させる。透過照明による観察から蛍光観察または微弱光に切り換える場合、制御装置 PC9は、シャッター 43を閉じ、蛍光キューブ 6またはミラー 34が対物レンズ 1と結像レンズ 2との間に配置されるように蛍光照明ユニット 105またはミラー 34を移動させる。蛍光観察を行う場合には、さらにシャッター 33を開いて標本 Sに蛍光を照射させる。

[0207] このように、この実施の形態 5に力^^る顕微鏡装置 600, 700, 800, 900によれば、、蛍光結像光学系および微弱光結像光学系の少なくとも一方に対応し、標本 sに対して透過照明を行う透過照明ユニットを備えるようにしているため、蛍光観察および微弱光観察ば力りでなく各種の透過照明による観察を行うことができ、標本 sを多角的に観察することができる。

[0208] なお、上述した顕微鏡装置 100a, 200, 300, 400, 600, 700, 800, 900は、それぞれ正立型の顕微鏡装置として示したが、倒立型の顕微鏡装置としてもよい。また、上述した顕微鏡装置は、例えば、各種反応 (例えば薬物刺激や光照射など)の検查ゃ治療などに好適に用いることができる。

[0209] 以上、実施の形態について詳細に説明した力本発明において、発光とは、化学反応により光を発生し得ることをいい、特に生物発光およびィ匕学発光を好適な例として含む用語である。これに対し、蛍光とは励起光により光を発生し得ることをいう。ここで、生物発光による光エネルギーにより励起される BRET (生物発光共鳴エネルギー転移）は、基質溶液との化学反応が支配的要因であるので、本発明では発光に含めるものである。サンプル力も発生する光は、特に生きた細胞に危害が少ない約 400η m〜約 900nmの間の波長を持つ電磁放射線をいう。発光するサンプルの撮像は、極めて低レベルの光 (通常は単一光子事象）を検出し、画像の構築が可能になるまで光子放射を積分できる光検出器の使用を必要とする。そのような高感度光検出器の例には、単一光子事象を増幅した後、検出系に固有の背景ノイズに対して単一光子を検出できるカメラまたはカメラ群で、例えば CCDのような撮像素子群を具備する CCDカメラを例示できる。一般に、高感度を得るために、 CCDカメラを液体窒素などで冷却する場合がある。高い開口数 (NA)とくに、開口数 (NA)Z投影倍率（ι8 )の 2 乗で表される光学的条件が 0. 01以上である対物レンズを用いる場合には、冷却温度をマイナス 5°C〜マイナス 20°C、好ましくはマイナス 5°C〜常温でも画像ィ匕できると本発明者らによって確認された。さらに、検討を進めた結果、上記光学的条件 (NA / |8 )の2乗が0. 071以上である場合に、 5分以内、場合によっては 1分程度で視認可能で且つ解析可能な細胞画像を提供できることを突き止めた。一般に生きたサンプルは形状ないし発光部位の変化の為に、 30分を越える撮像時間では鮮明な発光画像を得ることは困難な場合が多い。従って、本発明では、短時間、特に 30分以内、好ましくは 1分〜 10分の間で 1つの発光画像を取得し、撮像時間が速い蛍光測定との連携に有利な方法と装置を提供する。

[0210] 例えば関連する態様として、選択した生物適合成分の分布および Zまたは局在に対するある処置の効果を記録するために、蛍光シグナルの局在および Zまたは発光シグナルの強度を経時的に追跡したヽ場合は、光子放射の測定または撮像を選択した時間間隔で反復することにより、一連の画像を構築することができる。間隔は数分程度の短、ものであってもよ!/、し、数日または数週間程度に長、ものであってもよい。発光画像または蛍光 (または透過光)発光の重ね合せ画像は、画面表示、印刷された紙、グラフィックカ卩ェされたイメージ等の様々な形式で表現できる。

[0211] 他の関連する態様として、本発明は、発光性タンパク質をコードする遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に含む構築物でトランスジェニックまたはキメラにした動物におけるプロモーター誘導事象の存在を検出した後にプロモーター誘導事象の活性度をモニタリングする方法を包含する。プロモーター誘導事象には、そのプロモータ一を直接活性化する物質の投与、内因性プロモーター活性ィ匕因子の産生を刺激する物質の投与（例えば RNAウィルス感染によるインターフロン産生の剌激）、内因性プロモーター活性ィ匕因子の産生をもたらす状態に置くこと（例えば熱ショックまたはストレス）などがある。

[0212] またもう 1つの態様として、本発明は、病原体による感染の重篤化を抑制するのに有効な治療用化合物を同定する方法をも包含する。この方法では、病原体と蛍光成分と発光成分の複合体を対照動物と実験動物、若しくはそれらの培養された組織 (ないし細胞）に投与し、その実験動物を治療用化合物候補で処置する。そして、上述の方法によって測定対象であるサンプル内の蛍光シグナルの局在を確認した後に、局内が確認されたサンプルのみカゝら発光シグナル (生物発光または化学発光)を連続的に測定する。こうすることによって、その化合物の治療上の有効性をモニタリングできる。

[0213] さらなる別な態様として、本発明は、様々な不透明度を持つ媒質を通して局在化したサンプルを蛍光シグナルによって選んだ後で、局在が確認されたサンプルのみから連続的に発光測定する方法を包含する。この方法では、発光シグナルを、その媒質を透過した光子を積分して画像を作成することもできるが、局在が確認されたサンプルのみを媒質 (例えば、臓器組織)から外科的に取り出して、取り出したサンプルを適宜の培養環境下で発光測定するように方法の改良を行なうことができる。限定された外科手術 (例えばバイオプシー）は、元となる生物（例えば、哺乳類、とくにヒト）への身体的負担を最小限にし、必要なサンプルのみを安定した検査環境下に移して、種々の見込み有る薬剤に対する応答、治療後の経過管理、予防医学的試験を長期に実行できると、う利点を有する。

[0214] さらなる態様として、本発明は、ある生物内の特定の部位で、選択した物質 (例えば溶存酸素またはカルシウム）の濃度を測定する方法を含むことができる。

[0215] 以上の説明において、本発明では次に示すような生物発光の画像解析 (またはィメ一ジング分析)ならではの分析試薬を提供することも可能である。とくに、本発明の好適な実施の形態では、不透明な組織を含まない、単離された細胞もしくは細胞群を主に含んで!/、るような生物学的試料の任意な生物学的活性 (酵素活性、免疫学的活性、分子生物学的活性、遺伝学的活性、内科的活性など)を分析するための方法、試薬、ならびに装置を提供する。ここに、単離された細胞もしくは細胞群は、主に光透過性が高い材質カゝらなる収容容器 (例えば、ゥエル、シャーレ、マイクロスライド、マイク口フルイデイクス用チップ）中で長期間保持するので、細胞内活性を損失を最小限にするか実質的に失活せずに撮像を行うための独特な試薬または試薬環境を提供する。

[0216] 1.基質の長期使用に関する試薬とその取扱い

試料の細胞内活性を、例えば数時間から 24時間、 2日力ら 6日間、 1週間から数週間、または数週間超というように長期間培養などの技術で継続させる際、発光をもたらすためには、次のような特徴をもった取扱いが重要である。次に述べる幾つかの方法および/または試薬は、単独でもよいが、複数の方法を組み合わせる方がよい場合があるので、本発明では限定しない。

[0217] (第 1の取扱い方法）現在市販または報告されている生物発光用試薬は、 24時間まで観察可能な基質があるが、それ以上、例えば、数週間だと、基質の継ぎ足しが必要となる。細胞または細胞群を配置している培地に対して定期的ないし、測定の開始に同期して基質を添加する方法が好ま、。複数回の添加を行うのに適して!/、る試薬キットとして、同じパッケージに同封される発光タンパクを含む発光性試薬を含む収容手段 (容器または袋)と、発光性試薬に対応する量の基質溶液 (または基質含有培養液)を複数回の使用に足りるように複数の分割されて収容して!/ヽる収容手段 (容器または袋)とを具備するのが好ま、。

[0218] (第 2の取扱い方法）他の一面において、 PH調整を長期に亘り実行する。そのために、例えば気体環境としての二酸化炭素ガスの濃度を一定量以上に保つ方法である。より詳細には、細胞が生き続けるに必要な最低量よりも高濃度なガスを存在させることができる。他方、充分大きな容量の気体環境を大気圧以上の蓄積容器 (例えばガス用タンク）内に蓄積し、その容器から定期的ないし徐々に細胞 (ないし細胞群）に向けて移動するように装置設計する。このような気体環境の局所的な移動は、細胞 (な

Vヽし細胞群）の気体に対する代謝速度に応じた速度となるようにするのが好まヽ。

[0219] (第 3の取扱い方法および試薬） PHを長時間一定に保証することが知られている H EPESを添加する。そのための方法には、上記気体環境の場合のように、細胞（ないし細胞群）が消費する固体、液体、気体の全てについての消費速度と関連した HEP ES濃度に応じて HEPESを供給することができる。 HEPESは、公知の除放性カプセルに封入して、有効数のカプセルを細胞 (ないし細胞群）とともに液中ないし培地内に含ませておくことがさらに好ましい。有効量の HEPES (または HEPESと同等の P H維持用化合物）を封入した徐放性カプセルを主に含んでいる溶液や培地は、本発明の目的を達成する有効な試薬となり得る。

[0220] (第 4の取扱い方法、装置または試薬）本発明の主旨によれば、細胞または細胞群の内部温度を致命的な変化が起きない程度に調節するための保温用装置および Z または薬剤を提供することができる。

[0221] (第 5の取扱い方法または試薬）発光検出のバックグラウンドを長期に低くするための方法および Zまたは試薬に関する。すなわち、生物発光 (または化学発光）によるバックグラウンドの増加に関連する要素としての組織片、有色物（例えば発色性色素物質、とくにフノールレッド色素））を除く方法であり、或いはこれら要素を予め充分に除去した培地または溶液を試薬として提供することができる。 [0222] (第 6の取扱い方法または試薬）細胞、特に細胞群に対して基質を流通させることは発光の安定性や測定精度にとって重要である。方法としては、基質の細胞膜透過を助ける処理 (例えば、圧力ショック、電気的ショック）を連続的、断続的または細胞の老化に応じて実行することができる。試薬としては、細胞膜透過性を補助または促進する添加物 (例えば、膜溶解物質としての界面活性剤、膜浸透圧変容物質としての塩類)を含有する基質または別途緩衝溶液を試薬として提供することができる。これらの方法および Zまたは試薬は、長期の測定中に細胞中にぉ、て活性の有る基質が不足しないように、新鮮な細胞外の基質に対して透過性が継続する力或いは一時的に透過性が高まるように設定するのが好ま U、。

[0223] (第 7の取扱い方法）均一な染色方法を達成する方法に関する。磁気ビーズをあら力じめ加えておき、数時間、または一日に一回攪拌する。通常は、収容する容器の底面上には細胞が貼り付、て、るため、上方力も攪拌するのが好ま、。

[0224] (第 8の取扱い方法または試薬）長期観察を行う際に、同一の細胞 (または細胞群）について多数回の発光反応を繰り返すことで生じる副産物による、光学的または化学的な阻害の影響を除去する方法や試薬に関する。すなわち、基質を継ぎ足すような取扱いに応じて発光反応に伴う反応副産物が蓄積していく。この発光反応に伴う副産物 (ピロリン酸)などを除去するために、副産物排除用物質 (例えば、沈殿作用を有する金属イオン)を加える。

[0225] (第 9の取扱い方法または試薬）発光成分としてのルシフヱリンを再生させる方法または試薬に関する。ルシフェリンが発光後、ォキシルシフェリンとなる力これをルシフエリンに再生するための試薬をルシフェリンの老化または消耗に応じて細胞 (または細胞群）に供給する方法が提供される。検出ォキシルシフリンが-トリル体 2に変換された後、合成でも使われたように体内にあるシスティンと反応し、ルシフヱリンが再生することがホタルでは知られて、る。このような発光成分の活性低下を再生する再生物質を含んでいる基質、或いは別途の緩衝液を提供することも可能である。基質としては、他にセレンテラジンも含まれる。

[0226] (第 10の取扱い方法または試薬）新規な試薬としてのカプセル封入型基質に関する。所定時間経過後または一定の時間間隔で溶出なヽし液放出するようなカプセルに適当な基質 (例えばルシフェリン)を封入しておき、基質を一定濃度を保つようにする。また、カプセルに封入されていない基質 (例えばルシフェリン）と、カプセルに封入した同種の基質を同時に提供する方法、または混合した状態のカプセル含有溶液である試薬を提供することができる。また、徐放速度が異なる 2以上のカプセルに同種の基質 (例えばルシフェリン)を含有させた試薬を同時に細胞 (な、し細胞群）と添カロ (または培地との接触)することにより、異なる放出時機に新鮮な基質が自動的に提供されるという利点を有する。こうすることによって、励起光照射時機と基質の放出時機を連携させることも可能となる。

実施例 1

[0227] ここでは、上述した実施の形態における所定部位発光量測定装置 100を用いて、図 10に示すプラスミドベクターを導入した複数の HeLa細胞を対象として、特定の He La細胞内のミトコンドリアからの発光量および ATP量を経時的に測定する。

[0228] まず、本実施例 1における実験プロトコルを説明する。

(1)蛍光タンパク質 (GFP)とミトコンドリア移行シグナルとルシフェラーゼとが繋がつた融合遺伝子を作製する。

(2)融合遺伝子が入ったプラスミドベクター（図 10参照）を HeLa細胞に導入する。

(3)上述した実施の形態における所定部位発光量測定装置 100 (具体的には、本装置を構成する倒立蛍光顕微鏡)を用いて、 GFPがミトコンドリアに局在しているか否かを判定することで、ルシフェラーゼがミトコンドリアに局在している力否かを確認する（図 11参照)。なお、図 11は、所定部位発光量測定装置 100を構成する蛍光画像撮像ユニット 108で撮像した、プラスミドベクターを導入した HeLa細胞の明視野像および蛍光像を示す図である。

(4) HeLa細胞にヒスタミンを投与し、 Ca²⁺を介したミトコンドリアの ATP量の変動を引き起こす。

(5)上述した実施の形態における所定部位発光量測定装置 100を用いて、ミトコンドリア力も発せられる発光を画像として経時的に取得する（図 12参照)。なお、図 12は、所定部位発光量測定装置 100を構成する発光画像撮像ユニット 106で撮像した、プラスミドベクターを導入した HeLa細胞の明視野像および発光像を示す図である。 (6)上述した実施の形態における所定部位発光量測定装置 100を用いて、明視野像、蛍光像および発光像を重ね合わせることで、測定する細胞を選定する。

(7)上述した実施の形態における所定部位発光量測定装置 100を用いて、選定した細胞または領域の発光強度を経時的に測定し（図 13参照）、 ATP量の変動をモニタする。なお、図 13は、所定部位発光量測定装置 100で測定した、特定した番号 1の HeLa細胞の発光強度の経時的変動を示す図である。

[0229] つぎに、実験結果について説明する。図 11に示すように、番号 1の HeLa細胞においては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入され且つミトコンドリアにルシフエラーゼが局在していることが確認でき、また、番号 2および番号 4の HeLa細胞においては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入されていないことが確認でき、さらに、番号 3の HeLa細胞においては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入されているがミトコンドリアにルシフェラーゼが局在していないことが確認できた。なお、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入され且つミトコンドリアにルシフェラーゼが局在していることが確認できた HeLa細胞は、番号 1の細胞のみであったので、測定対象の HeLa細胞は番号 1の HeLa細胞に特定された。また、図 12に示すように、番号 3 の HeLa細胞からの発光が最も強ぐついで番号 1の HeLa細胞からの発光が強く、ついで番号 2および番号 4の HeLa細胞からの発光は同等の強さであることが確認できた。そして、図 13に示すように、所定部位発光量測定装置 100を用いることにより、番号 1の HeLa細胞のミトコンドリアからの発光強度の経時変動をモニタすることができた。

実施例 2

[0230] ここでは、上述した実施の形態における図 16に示す所定部位発光量測定装置 10 0を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子と緑色蛍光タンパク (GFP)遺伝子とを導入した H eLa細胞を対象として、当該 HeLa細胞の発光観察および蛍光観察を行う。

[0231] まず、本実施例 2における実験プロトコルを説明する。

(1)ルシフェラーゼ遺伝子と緑色蛍光タンパク (GFP)遺伝子とを縦列して配置したベクター（EGFP— Luc、 Clonetech社製）をリポフエクチン法により HeLa細胞に導入する。 (2)ベクター導入力も約 24時間後、ベクターを導入した HeLa細胞を含む培養液 (D -MEM, GIBCO、 Invitrogen社製）にノレシフェリンを 500 μ Μ添加する。

(3)図 16に示す所定部位発光量測定装置 100のステージ 104に、培養液を入れた容器を設置し、所定部位発光量測定装置 100を用いて HeLa細胞の明視野画像、蛍光画像および発光画像を撮像する。なお、蛍光画像を撮像する場合には励起用分光フィルター 108gおよび発光 ·蛍光分光用フィルター 10¾を入れ、当該撮像における露出時間を 0. 7秒間とした。また、発光画像を撮像する場合には発光'蛍光分光用フィルター 10¾を外し、当該撮像における露出時間を 5分間とした。ここで、本実施例 2では、対物レンズ 108aとして、焦点距離 (f)が 9mmで開口数 (NA)が 0. 7 5であるォリンパス社製の" Uapo 20X"を用いた。また、結像レンズ 108eとして、焦点距離 (f)が 18mmで開口数 (NA)が 0. 25で "（NA÷ j8 )²"の値が 0. 035であるォリンパス社製の" LMPlanFL 10X"を用いた。また、光源 108cとして、ォリンパス社製のハロゲン光源" LG— PSs"を用いた。また、 CCDカメラ 108dとして、ォリンパス社製の" DP— 30BW"を用いた。また、励起用分光フィルター 108gとして、ォリンパス社製の" BP470— 490"を用いた。また、発光'蛍光分光用フィルター 108jとして、ォメガ（Omega)社製の" 510AF23"を用いた。

[0232] つぎに、観察結果について説明する。図 17は、ベクター（EGFP— Luc遺伝子）を導入した HeLa細胞の蛍光画像を示す図である。また、図 18は、ベクター（EGFP— Luc遺伝子）を導入した HeLa細胞の蛍光画像と明視野画像とを重ね合わせた画像を示す図である。また、図 19は、ベクター（EGFP— Luc遺伝子）を導入した HeLa細胞の発光画像を示す図である。図 17、図 18および図 19に示すように、所定部位発光量測定装置 100を用いて、遺伝子導入できた HeLa細胞を蛍光観察により特定することができ、さらに、当該特定した HeLa細胞を視野に入れてから発光画像の撮像を行うことができた。

実施例 3

[0233] ここでは、上述した実施の形態の発現量測定装置 1000を用いて、蛍光で細胞周期のステージの同定しながら発光で解析対象の遺伝子の発現量の測定 (解析対象の遺伝子のプロモーターアツセィ）を行う。 [0234] まず、細胞に導入するベクターを作製する。具体的には、細胞周期関連遺伝子プ口モーター導入ルシフェラーゼ (緑)発現ベクターを作製する。なお、用いる細胞は P C12である。つぎに、作製したベクターを細胞に導入する（トランスフエクシヨン)。つぎに、細胞の細胞膜を" PKH LinkerKits (赤） "（SIGMA社製)を用いて染色する。つぎに、発現量測定装置 1000を用いて、細胞周期のステージを同定しながら、解析対象遺伝子である細胞周期関連遺伝子のプロモータアツセィを行う。これにより、細胞周期と細胞の形態との関連を調べることができた。

実施例 4

[0235] ここでは、上述した実施の形態の発現量測定装置 1000を用いて、発光で細胞周期のステージの同定しながら蛍光で解析対象の遺伝子の発現量の測定および発現時期'当該遺伝子の局在の同定を行う。

[0236] まず、細胞に導入するベクターを作製する。具体的には、解析対象遺伝子プロモ一ターを導入した蛍光タンパク質ベクターを作製する。つぎに、 HaloTag (登録商標 )ベクター（プロメガ社製)を細胞に導入する。なお、用いる細胞は PC12である。つぎに、 HaloTag (登録商標）リガンド (プロメガ社製)を細胞に添加して、細胞に対してルシフェラーゼ標識を行う。つまり、 HaloTag (登録商標）（プロメガ社製）に対するリガンド結合により、細胞に対してルシフラーゼ標識を行う。つぎに、発現量測定装置 1 000を用いて、細胞周期のステージをモニタリングしながら、細胞周期に関わる可能性のある解析対象遺伝子の発現時期'局在の同定を行う。これにより、当該解析対象遺伝子と細胞周期との関連性の有無、および当該解析対象遺伝子の細胞周期マーカーとしての有用性を評価することができた。

産業上の利用可能性

[0237] 以上のように、本発明にかかる所定部位発光量測定方法、所定部位発光量測定装置および測定装置は、生きたサンプル内の所定の部位からの発光量を測定する場合に有用であり、また、本発明にかかる発現量測定方法は、生きた細胞に導入した解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に細胞周期のステージを同定する場合に有用であり、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。

Claims

請求の範囲

[1] 発光タンパク質をサンプル内の所定の部位に移行させる移行塩基配列と、当該発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と、を融合した融合遺伝子が導入された生きたサンプル力の発光量を測定することにより、前記所定の部位からの発光量を得る所定部位発光量測定方法であって、

前記融合遺伝子は、前記移行塩基配列および前記発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものであり、

当該融合遺伝子が導入されたサンプルの蛍光画像を撮る蛍光画像撮像ステップと前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かを判定する判定ステップと、

前記判定ステップの判定結果が局在すると判定された場合、サンプルからの発光量を測定する発光量測定ステップと、

を含むことを特徴とする所定部位発光量測定方法。

[2] 前記融合遺伝子が導入された生きたサンプルが撮像範囲中に複数存在する場合複数の前記サンプルの発光画像を撮る発光画像撮像ステップと、

前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像および前記発光画像撮像ステップで撮像した発光画像を重ね合わせることで、前記判定ステップの判定結果が局在すると判定されたサンプルの中カゝら測定対象のサンプルを選定する選定ステップと、をさらに含み、

前記蛍光画像撮像ステップは、複数の前記サンプルの蛍光画像を撮り、前記判定ステップは、前記蛍光画像に基づ!ヽて所定の部位に発光タンパク質が局在するカゝ否かをサンプルごとに判定し、

前記発光量測定ステップは、前記選定ステップで選定したサンプル力ゝらの発光量を測定すること、

を特徴とする請求項 1に記載の所定部位発光量測定方法。

[3] 前記蛍光画像撮像ステップ、前記判定ステップ、前記発光画像撮像ステップ、前記選定ステップ、前記発光量測定ステップを繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位力の発光量を経時的に得ること、

を特徴とする請求項 2に記載の所定部位発光量測定方法。

[4] 前記サンプル力の発光を発光色別に分離する発光分離ステップ、

をさらに含み、

前記サンプルに導入される融合遺伝子は、複数存在し、前記移行塩基配列で移行させる発光タンパク質の移行先の部位と、前記発光タンパク質から発せられる発光の発光色と、前記蛍光タンパク質力発せられる蛍光の蛍光色との組み合わせがそれぞれ異なるように予め作製され、

前記判定ステップは、前記蛍光画像に基づ!ヽて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを蛍光色ごとに判定し、

前記発光量測定ステップは、前記判定ステップの判定結果が局在すると判定された場合、前記発光分離ステップで分離した複数の発光のうち当該局在すると判定された部位力の発光を特定し、特定した発光の発光量を測定すること、

を特徴とする請求項 1に記載の所定部位発光量測定方法。

[5] 前記サンプルは、試料、組織、細胞、個体の、ずれか 1つであること、

を特徴とする請求項 1から 4のいずれか 1つに記載の所定部位発光量測定方法。

[6] 前記発光量測定ステップで測定した発光量に基づいて、前記選定ステップで選定したサンプル内の所定の部位における ATPを定量する ATP定量ステップ、

をさらに含み、

前記サンプルは細胞であり、前記所定の部位はミトコンドリアであり、前記移行塩基配列はミトコンドリア移行シグナルであり、前記発光タンパク質はルシフェラーゼであり、前記蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質であり、

前記蛍光画像撮像ステップ、前記判定ステップ、前記発光画像撮像ステップ、前記選定ステップ、前記発光量測定ステップにカ卩えてさらに前記 ATP定量ステップを繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位からの ATPを経時的に定量すること、を特徴とする請求項 3に記載の所定部位発光量測定方法。

[7] 発光タンパク質をサンプル内の所定の部位に移行させる移行塩基配列と、当該発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と、を融合した融合遺伝子が導入された生きたサンプル力の発光量を測定することにより、前記所定の部位からの発光量を得る所定部位発光量測定装置であって、

前記移行塩基配列および前記発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合した融合遺伝子を用い、

当該融合遺伝子が導入されたサンプルの蛍光画像を撮る蛍光画像撮像手段と、前記蛍光画像撮像手段で撮像した蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在する力否かを判定する判定手段と、

前記判定手段の判定結果が局在すると判定された場合、サンプルからの発光量を測定する発光量測定手段と、

を備えたことを特徴とする所定部位発光量測定装置。

[8] 発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞を対象として、細胞から発せられた発光の発光強度を測定する発光測定ステップと、細胞から発せられた蛍光の蛍光強度を測定する蛍光測定ステップと、前記発光測定ステップで測定した発光強度または前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を測定する発現量測定ステップと、を含む発現量測定方法であって、前記細胞は、前記発光関連遺伝子、前記蛍光関連遺伝子および前記解析対象の遺伝子に加えてさらに、細胞周期の所定のステージで発現する細胞周期関連遺伝子を導入したものであり、

前記発現量測定ステップで発光強度を用いる場合には前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定し、前記発現量測定ステップで蛍光強度を用いる場合には前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定することで、細胞周期のステージを同定するステージ同定ステップ、

をさらに含むことを特徴とする発現量測定方法。

[9] 前記細胞が撮像範囲中に複数存在する場合、

複数の細胞の蛍光画像を撮像する蛍光画像撮像ステップと、前記複数の細胞の発光画像を撮像する発光画像撮像ステップと、をさらに含み、

前記発光測定ステップは、前記発光画像撮像ステップで撮像した発光画像に基づ

V、て、各細胞から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、

前記蛍光測定ステップは、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づ

V、て、各細胞から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定し、

前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度または前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定し、

前記ステージ同定ステップは、前記発現量測定ステップで発光強度を用いる場合には前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞ごとに判定し、前記発現量測定ステップで蛍光強度を用いる場合には前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞ごとに同定すること、

を特徴とする請求項 8に記載の発現量測定方法。

[10] 前記ステージ同定ステップでステージが同定された細胞の中力測定対象の細胞を選択する選択ステップ、

をさらに含み、

前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度または前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づ、て、前記選択ステップで選択した細胞に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定すること、

を特徴とする請求項 9に記載の発現量測定方法。

[11] 前記発光画像撮像ステップ、前記蛍光画像撮像ステップ、前記発光測定ステップ、前記蛍光測定ステップ、前記ステージ同定ステップ、前記選択ステップ、前記発現量測定ステップを繰り返し実行することで、前記選択ステップで選択した細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら前記解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定すること、を特徴とする請求項 10に記載の発現量測定方法。

[12] 前記発現量測定ステップは、前記選択ステップで選択した細胞を対象として、前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づ!ヽて前記解析対象の遺伝子の細胞内における発現部位を同定すること、

を特徴とする請求項 11に記載の発現量測定方法。

[13] 発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞を対象として、細胞力発せられた発光の発光強度を測定する発光測定ステップと、前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づ!ヽて前記解析対象の遺伝子の発現量を測定する発現量測定ステップと、を含む発現量測定方法であって、前記細胞は、その所定の部位を蛍光物質で染色したものであり、

当該細胞の蛍光画像を撮像する蛍光画像撮像ステップと、

前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づいて細胞の形状が変化した力否かを判定することで、細胞周期のステージを同定するステージ同定ステップとをさらに含むことを特徴とする発現量測定方法。

[14] 前記細胞が撮像範囲中に複数存在する場合、

複数の細胞の発光画像を撮像する発光画像撮像ステップ、

をさらに含み、

前記蛍光画像撮像ステップは、前記複数の細胞の蛍光画像を撮像し、前記発光測定ステップは、前記発光画像撮像ステップで撮像した発光画像に基づ V、て、各細胞から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、

前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づ、て前記解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定し、

前記ステージ同定ステップは、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づ、て細胞の形状が変化したか否力を細胞ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞ごとに同定すること、

を特徴とする請求項 13に記載の発現量測定方法。

[15] 前記ステージ同定ステップでステージが同定された細胞の中力測定対象の細胞を選択する選択ステップ、

をさらに含み、

前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づ、て、前記選択ステップで選択した細胞に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定すること、

を特徴とする請求項 14に記載の発現量測定方法。

[16] 前記発光画像撮像ステップ、前記蛍光画像撮像ステップ、前記発光測定ステップ、前記ステージ同定ステップ、前記選択ステップ、前記発現量測定ステップを繰り返し実行することで、前記選択ステップで選択した細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら前記解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定すること、を特徴とする請求項 15に記載の発現量測定方法。

[17] 微弱光を発する発光標識および励起されて蛍光を発する蛍光標識が付与されて保持手段に保持される標本の標本像を結像する結像光学系と、該標本像を撮像する撮像手段とを備える測定装置において、

前記結像光学系は、

前記発光標識からの微弱光を前記標本像としての微弱光標本像を結像する微弱光結像光学系と、

前記蛍光標識からの蛍光を前記標本像としての蛍光標本像を結像する蛍光結像光学系と、

を備え、

前記撮像手段は、前記微弱光標本像と前記蛍光標本像とを撮像することを特徴とする測定装置。

[18] 前記蛍光結像光学系は、前記標本を照明する照明手段を備えることを特徴とする請求項 17に記載の測定装置。

[19] 前記撮像手段によって撮像された微弱光標本像の像特性をもとに、該微弱光標本像の撮像と前記蛍光標本像の撮像とを切り換える制御を行う撮像切換制御手段を備えたことを特徴とする請求項 17に記載の測定装置。

[20] 前記像特性は、前記微弱光標本像の像強度であり、

前記撮像切換制御手段は、前記像強度が所定のしきい値より大きい場合、前記微弱光標本像の撮像カゝら前記蛍光標本像の撮像に切り換えることを特徴とする請求項 19に記載の測定装置。

[21] 前記像強度は、前記微弱光標本像の全体または部分の像強度であって、所定時点から現時点までの累積の像強度または現時点の像強度であることを特徴とする請求項 20に記載の測定装置。

[22] 前記蛍光結像光学系は、

前記蛍光標識の各点からの蛍光を略平行光束に変換する蛍光対物レンズと、前記蛍光対物レンズによって略平行光束に変換された蛍光を集光して前記蛍光標本像を結像する蛍光結像レンズと、

前記蛍光標識を励起する励起光を選択的に透過させる励起光透過フィルター、前記蛍光標識からの蛍光を選択的に透過させる蛍光透過フィルターおよび前記励起光を反射し前記蛍光を透過させるダイクロイツクミラーを有し、前記蛍光対物レンズと前記蛍光結像レンズとの間に配置される蛍光ユニットと、

前記励起光を発する励起光源を有し、該励起光源力の励起光を前記ダイクロイツクミラーによって反射させ前記標本に照射させる励起光照射手段と、

を備えたことを特徴とする請求項 19〜21のいずれか一つに記載の測定装置。

[23] 前記微弱光結像光学系は、

前記発光標識の各点からの微弱光を略平行光束に変換する微弱光対物レンズと、前記微弱光対物レンズによって略平行光束に変換された微弱光を集光して前記微弱光標本像を結像する微弱光結像レンズと、

を備えたことを特徴とする請求項 22に記載の測定装置。

[24] 前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記標本に対して互いに反対側に配置され、

前記励起光照射手段は、前記標本に対して励起光を未照射にする未照射手段を有し、

前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記未照射手段に励起光を未照射にさせ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記励起光照射手段に励起光を照射させる制御を行うことを特徴とする請求項 22または 23に記載の測定装置。

[25] 前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野を相対的に平行移動させる視野移動手段を備えることを特徴とする請求項 24に記載の測定装置。

[26] 前記保持手段は、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野内に前記標本を移動させる標本移動手段を有することを特徴とする請求項 24または

25に記載の測定装置。

[27] 前記微弱光対物レンズおよび前記蛍光対物レンズは、同一の対物レンズであり、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記対物レンズを共用することを特徴とする請求項 23に記載の測定装置。

[28] 前記対物レンズと前記蛍光ユニットとの間の瞳空間に挿脱可能に配置され、該瞳空間に配置された場合、前記対物レンズからの微弱光を前記微弱光結像レンズに向けて反射させるミラーを備え、

前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記ミラーを瞳空間に配置するとともに前記未照射手段に励起光を未照射にさせ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記ミラーを瞳空間に未配置にするとともに前記励起光照射手段に励起光を照射させる制御を行うことを特徴とする請求項 27に記載の測定装置。

[29] 前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記標本に対して同じ側に配置され、

前記保持手段は、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野内に前記標本を移動させる標本移動手段を有し、

前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記標本移動手段によって前記標本を前記微弱光結像光学系の視野内に移動させ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記標本移動手段によって前記標本を前記蛍光結像光学系の視野内に移動させる制御を行うことを特徴とする請求項

22または 23に記載の測定装置。

[30] 前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野が前記標本を含むように前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系を移動させる光学系移動手段を備え、

前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記標本に対して同じ側に配置され、

前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記微弱光結像光学系の視野が前記標本を含むように前記光学系移動手段によって該微弱光結像光学系を移動させ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記蛍光結像光学系の視野が前記標本を含むように前記光学系移動手段によって該蛍光結像光学系を移動させる制御を行うことを特徴とする請求項 22または 23に記載の測定装置。

[31] 前記光学系移動手段は、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野の略中心点を結ぶ線分の中点を通り前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各光軸に略平行な回転軸を有し、該回転軸を中心に前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系を回転移動させることを特徴とする請求項 30 に記載の測定装置。

[32] 前記撮像手段は、

前記微弱光標本像を撮像する微弱光撮像手段と、

前記蛍光標本像を撮像する蛍光撮像手段と、

を備えることを特徴とする請求項 17および請求項 19〜29のいずれか一つに記載の測定装置。

[33] 前記撮像手段は、

前記微弱光標本像を撮像する微弱光撮像手段と、

前記蛍光標本像を撮像する蛍光撮像手段と、

を備え、

前記光学系移動手段は、前記微弱光結像光学系および前記微弱光撮像手段と、前記蛍光結像光学系および前記蛍光撮像手段と、をそれぞれ一体に移動させることを特徴とする請求項 30または 31に記載の測定装置。

[34] 前記微弱光標本像および前記蛍光標本像は、それぞれ前記微弱光結像レンズおよび前記蛍光結像レンズによって略同じ位置に結像され、

前記撮像手段は、前記微弱光標本像および前記蛍光標本像が結像される位置に略一致して固定されることを特徴とする請求項 30または 31に記載の測定装置。

[35] 前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の少なくとも一方に対応し、前記標本に対して透過照明を行う照明手段を備えることを特徴とする請求項 27〜31の

V、ずれか一つに記載の測定装置。

[36] 前記透過照明は、明視野観察用照明、暗視野観察用照明、微分干渉観察用照明および位相差観察用照明の少なくとも 1つであることを特徴とする請求項 35に記載の測定装置。

[37] 前記微弱光結像光学系は、該微弱光結像光学系の標本側の開口数を NAoとし、前記微弱光標本像を結像する倍率を 13として、 (NAo/ 18 )²によって演算される値が 0. 01以上であることを特徴とする請求項 17および請求項 19〜35のいずれか一つに記載の測定装置。