JP5822054B1 - 画像処理装置、病理診断支援システム、画像処理プログラム及び画像処理方法 - Google Patents

Abstract

画像処理装置（２Ａ）は、組織切片における細胞の形態を表す明視野画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像とを入力する入力手段と、前記明視野画像から細胞の特定部位が抽出された細胞画像を生成する第１の生成手段と、前記蛍光画像から輝点領域が抽出された画像を生成し、輝点領域ごとに輝度プロファイルを作成し、蛍光輝点源となる蛍光粒子１個分の蛍光プロファイルに基づき、前記輝点領域における蛍光粒子が抽出された蛍光粒子画像を生成する第２の生成手段と、前記細胞画像と前記蛍光粒子画像とを重ね合わせる加算手段と、を有する。

Description

本発明は、画像処理装置、病理診断支援システム、画像処理プログラム及び画像処理方法に関する。

近年、抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効果的に設計するため、観察対象細胞上の生体物質（抗原）の定量が求められている。生体物質の存在を確認する方法として、生体物質認識部位が結合された蛍光物質と、生体物質認識部位に対応した生体物質の結合に基づく、組織分析方法が知られている。

特許文献１では、蛍光色素を用いて組織切片を染色し、蛍光の発光部分の面積と輝度レベルを求めることで、特定の細胞を識別し定量する方法が提案されている（第３ぺージ下段右側１３行目−第４ぺージ上段左側第８行目、第４ページ下段左側第１０−１４行目など参照）。
しかし、当該方法では、多数の生体物質が同一細胞上の特定の狭い領域に存在する場合には、発光部分が互いに重なり合い、輝度レベルから細胞上の生体物質の数やその細胞上における生体物質の位置情報まで正確に得ることはできない。
これに対し、特許文献２には、蛍光粒子を用いて組織切片を染色し、共焦点顕微鏡を用いて蛍光輝点を計測し、１細胞当たりの輝点数を算出する方法が開示されている（実施例１−２参照）。

特開昭６３−０６６４６５号公報 国際公開第２０１２−０２９３４２号公報

しかし、当該技術では、観察対象細胞上の生体物質の数を定量することはできるが、細胞上における生体物質の位置情報までは得ることができないし、共焦点顕微鏡を用いると、手間が大きく簡便性が低いという難点がある。
したがって、本発明の主な目的は、簡易な方法で観察対象細胞内での特定のタンパク質の発現（発現数とその発現位置）を正確に定量することができる画像処理装置を提供することにあり、併せて当該画像処理装置を利用する病理診断支援システム、画像処理プログラム及び画像処理方法を提供することにある。

上記課題を解決するため、本発明の第１の態様によれば、
組織切片における細胞の形態を表す明視野画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像とを入力する入力手段と、
前記明視野画像から細胞の特定部位が抽出された細胞画像を生成する第１の生成手段と、
前記蛍光画像から輝点領域が抽出された画像を生成し、輝点領域ごとに輝度プロファイルを作成し、蛍光輝点源となる蛍光粒子１個分の蛍光プロファイルに基づき、前記輝点領域における蛍光粒子が抽出された蛍光粒子画像を生成する第２の生成手段と、
前記細胞画像と前記蛍光粒子画像とを重ね合わせる加算手段と、
を有することを特徴とする画像処理装置が提供される。

本発明の第２の態様によれば、
前記画像処理装置と、
前記画像処理装置で使用される、前記明視野画像と前記蛍光画像とを取得する画像取得装置と、
を備えることを特徴とする病理診断支援システムが提供される。

本発明の第３の態様によれば、
コンピュータを、
組織切片における細胞の形態を表す明視野画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像とを入力する入力手段、
前記明視野画像から細胞の特定部位が抽出された細胞画像を生成する第１の生成手段、
前記蛍光画像から輝点領域が抽出された画像を生成し、輝点領域ごとに輝度プロファイルを作成し、蛍光輝点源となる蛍光粒子１個分の蛍光プロファイルに基づき、前記輝点領域における蛍光粒子が抽出された蛍光粒子画像を生成する第２の生成手段、
前記細胞画像と前記蛍光粒子画像とを重ね合わせる加算手段、
として機能させるための画像処理プログラムが提供される。

本発明の第４の態様によれば、
組織切片における細胞の形態を表す明視野画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像とを入力する入力工程と、
前記明視野画像から細胞の特定部位が抽出された細胞画像を生成する第１の生成工程と、
前記蛍光画像から輝点領域が抽出された画像を生成し、輝点領域ごとに輝度プロファイルを作成し、蛍光輝点源となる蛍光粒子１個分の蛍光プロファイルに基づき、前記輝点領域における蛍光粒子が抽出された蛍光粒子画像を生成する第２の生成工程と、
前記細胞画像と前記蛍光粒子画像とを重ね合わせる加算工程と、
を有することを特徴とする画像処理方法が提供される。

本発明によれば、簡易な方法で観察対象細胞内での特定のタンパク質の発現（発現数とその発現位置）を正確に定量することができる。

病理診断支援システムのシステム構成を示す図である。 図１の画像処理装置の機能的構成を示すブロック図である。 明視野画像の一例を示す図である。 蛍光画像の一例を示す図である。 図２の制御部により実行される画像解析処理を示すフローチャートである。 図５のステップＳ２の処理の詳細を示すフローチャートである。 明視野画像を示す図である。 細胞核が抽出された画像を示す図である。 図５のステップＳ４の処理の詳細を示すフローチャートである。 蛍光画像を示す図である。 輝点領域が抽出された画像を示す図である。 蛍光粒子が抽出された画像を示す図である。 輝度プロファイルの作成処理を概略的に説明するための図であって、蛍光画像から輝点領域が抽出された画像である。 輝度プロファイルの作成処理を概略的に説明するための図であって、一部の輝点領域が抽出された拡大画像である。 輝度プロファイルの作成処理を概略的に説明するための図であって、輝点領域に対応する蛍光画像である。 輝度プロファイルの作成処理を概略的に説明するための図であって、輝点領域に対応するマスク処理後の蛍光画像である。 Ｘ座標位置及びＹ座標位置における輝度の分布であって、当該輝度が２次元的に表現された輝度プロファイルを示す図である。 Ｘ座標位置及びＹ座標位置における輝度の分布であって、当該輝度が３次元的に表現された輝度プロファイルを示す図である。 蛍光粒子１個分の輝度プロファイル（基準プロファイル）を示す図である。 図１１Ａの当該輝度プロファイルから算出した結果（蛍光粒子の数とＸＹ平面上での座標位置）を示す図である。 輝度プロファイルを示す図であって、蛍光粒子が１個の場合を示す図である。 蛍光粒子の数／座標位置を示す図であって、蛍光粒子が１個の場合を示す図である。 輝度プロファイルを示す図であって、蛍光粒子が２個の場合を示す図である。 蛍光粒子の数／座標位置を示す図であって、蛍光粒子が２個の場合を示す図である。 輝度プロファイルを示す図であって、蛍光粒子が３個の場合を示す図である。 蛍光粒子の数／座標位置を示す図であって、蛍光粒子が３個の場合を示す図である。 輝度プロファイルを示す図であって、蛍光粒子が３個の場合を示す図である。 蛍光粒子の数／座標位置を示す図であって、蛍光粒子が３個の場合を示す図である。 細胞核が抽出された画像と蛍光粒子が抽出された画像とを重ね合わせた画像を示す図である。 細胞核上での蛍光粒子の分布を示す図である。 蛍光輝点が抽出された状態を示す模式図であって、１種の蛍光粒子を用いた場合を示す図である。 蛍光粒子が抽出された状態を示す模式図であって、１種の蛍光粒子を用いた場合を示す図である。 蛍光輝点が抽出された状態を示す模式図であって、２種の蛍光粒子を用いた場合を示す図である。 蛍光粒子が抽出された状態を示す模式図であって、２種の蛍光粒子を用いた場合を示す図である。 実施例１にかかるＫｉ６７タンパクの発現分布を示す図である。 実施例２にかかるＫｉ６７タンパク及びｐ５３タンパクの発現分布を示す図である。

以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。

＜病理診断支援システム１００の構成＞
図１に、本実施の形態における病理診断支援システム１００の全体構成例を示す。病理診断支援システム１００は、所定の染色試薬で染色された人体の組織切片の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。

図１に示すように、病理診断支援システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａ等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local Area Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。

顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織切片の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置２Ａに送信するものである。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆ等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。本実施の形態において、顕微鏡画像取得装置１Ａは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。

なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、例えば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織切片全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（例えば、特表２００２−５１４３１９号公報参照）等を用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織切片全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。

画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現分布を算出する。
図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５等を備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。

制御部２１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）等を備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。例えば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により画像解析処理（図５参照）を実行し、第１の生成手段、第２の生成手段、加算手段としての機能を実現する。

操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。

表示部２３は、例えば、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）やＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等のモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。本実施の形態において、表示部２３は、画像解析結果を出力するための出力手段として機能する。

通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、明視野画像と蛍光画像の入力手段として機能する。

記憶部２５は、例えばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。
その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーター等を備え、ＬＡＮ等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。

本実施の形態における画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された明視野画像（Ｈ染色画像、ＨＥ染色画像）及び蛍光画像を用いて解析を行うことが好ましい。
明視野画像は、Ｈ（ヘマトキシリン）染色試薬、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色試薬を用いて染色された組織切片を、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など（好塩基性の組織等）を染色する。エオジンは赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など（好酸性の組織等）を染色する。図３に、ＨＥ染色を行った組織切片を撮影した明視野画像の一例を示す。
蛍光画像は、特定の生体物質と特異的に結合及び／又は反応する生体物質認識部位が結合した蛍光物質を内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子と呼ぶ）を含む染色試薬を用いて染色された組織切片に対し、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光物質内包ナノ粒子を発光（蛍光）させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、組織切片における、生体物質認識部位に対応する特定の生体物質の発現を示すものである。図４に、蛍光画像の一例を示す。

＜蛍光画像の取得＞
ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬（蛍光物質内包ナノ粒子）、染色試薬による組織切片の染色方法等も含めて詳細に説明する。

〔蛍光物質〕
蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット（半導体粒子）を挙げることができる。２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜１１００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。

蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。

具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。

量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。

具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。

上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ₂、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ₂、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。

〔蛍光物質内包ナノ粒子〕
本実施の形態において蛍光物質内包ナノ粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。
ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ、メラミン等を挙げることができる。

本実施の形態で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子は、公知の方法により作製することが可能である。例えば、蛍光有機色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア ８巻 ２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光有機色素を用いることで種々の蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。

量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー ３３巻 ５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。

蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。

量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。

本実施の形態で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子の平均粒径は特に限定されないが、３０〜８００ｎｍ程度のものを用いることができる。また、粒径のばらつきを示す変動係数（＝（標準偏差／平均値）×１００％）は特に限定されないが、２０％以下のものを用いることが好ましい。平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。

〔生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子との結合〕
本実施の形態に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応する部位である。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質（ペプチド）および核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＲ抗体を蛍光物質内包ナノ粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。

生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。

また、生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＳＭ（ＰＥＧ）１２を用いることができる。

蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。

蛍光有機色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）社製）のような縮合剤を用いることもできる。

必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子ができる。

蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基もつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣ又はｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。

特定抗原を認識する抗体としては、M.アクチン,M.S.アクチン,S.M.アクチン,ACTH,Alk-1,α1-アンチキモトリプシン,α1-アンチトリプシン,AFP,bcl-2,bcl-6,β-カテニン,BCA 225,CA19-9,CA125,カルシトニン,カルレチニ,CD1a,CD3,CD4,CD5,CD8,CD10,CD15,CD20,CD21,CD23,CD30,CD31,CD34,CD43,CD45,CD45R,CD56,CD57,CD61,CD68,CD79a,"CD99, MIC2",CD138,クロモグラニン,c-KIT,c-MET,コラーゲン タイプIV,Cox-2,サイクリンD1,ケラチン,サイトケラチン（高分子量）,パンケラチン,パンケラチン,サイトケラチン 5/6,サイトケラチン 7,サイトケラチン 8,サイトケラチン8/18,サイトケラチン 14,サイトケラチン 19,サイトケラチン 20,CMV,E-カドヘリン,EGFR,ER,EMA,EBV,第VIII因子関連抗原,ファッシン,FSH,ガレクチン-3,ガストリン,GFAP,グルカゴン,グリコフォリン A,グランザイムB,hCG,hGH,ヘリコバクターピロリ,HBc 抗原,HBs 抗原,ヘパトサイト特異抗原,HER2,HSV -I,HSV -II,HHV-8,IgA,IgG,IgM,IGF-1R,インヒビン,インスリン,カッパ L鎖,Ki67,ラムダ L鎖,LH,リゾチーム,マクロファージ,メランA,MLH-1,MSH-2,ミエロパーオキシダーゼ,ミオゲニン,ミオグロビン,ミオシン,ニューロフィラメント,NSE,p27 (Kip1),p53,p53,P63,PAX 5,PLAP,ニューモシスティス カリニ,ポドプラニン（D2-40）,PGR,プロラクチン,PSA,前立腺酸性フォスファターゼ,Renal Cell Carcinoma,S100,ソマトスタチン,スペクトリン,シナプトフィジン,TAG-72,TdT,サイログロブリン,TSH,TTF-1,TRAcP,トリプターゼ,ビリン,ビメンチン,WT1,Zap-70が挙げられる。

〔染色方法〕
以下、組織切片の染色方法について述べる。以下に説明する染色方法は病理切片組織に限定せず、細胞染色にも適用可能である。
また、以下に説明する染色方法が適用できる切片の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。

１）脱パラフィン工程
キシレンを入れた容器に病理切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に病理切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に病理切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。

２）賦活化処理
公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０−１３０℃、時間は５−３０分で行うことができる。
次いで、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。

３）生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いた染色
生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子のＰＢＳ分散液を病理切片に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光物質内包ナノ粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子ＰＢＳ分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次病理切片に載せてもよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
蛍光物質内包ナノ粒子による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片を浸漬させ、未反応蛍光物質内包ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。カバーガラスを切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
なお、ＨＥ染色試薬を用いて染色を行う場合、カバーガラスによる封入前にＨＥ染色を行う。

〔蛍光画像の取得〕
染色した病理切片に対し顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、広視野の顕微鏡画像（蛍光画像）を取得する。顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
蛍光画像の視野は、３ｍｍ²以上であることが好ましく、３０ｍｍ²以上であることがさらに好ましく、３００ｍｍ²以上であることがさらに好ましい。

＜病理診断支援システム１００の動作（画像処理方法を含む。）＞
以下、病理診断支援システム１００において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。ここでは、特定のタンパク質（ここでは、乳癌組織におけるＫｉ６７タンパクとする。以下、特定タンパクと呼ぶ。）を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織切片を観察対象とする場合を例にとり説明するが、これに限定されるものではない。

まず、操作者は、ヘマトキシリン染色試薬と、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を蛍光標識材料とした染色試薬との、２種の染色試薬を用いて組織切片を染色する。
その後、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、（ａ１）〜（ａ５）の手順により明視野画像及び蛍光画像が取得される。
（ａ１）操作者は、ヘマトキシリン染色試薬と蛍光物質内包ナノ粒子を含む染色試薬とによりそれぞれ染色された組織切片をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置１Ａのスライド固定ステージに設置する。
（ａ２）明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
（ａ３）撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ４）ユニットを蛍光ユニットに変更する。
（ａ５）視野及び撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。

画像処理装置２Ａにおいては、明視野画像及び蛍光画像に基づき画像解析処理が実行される。
図５に、画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図５に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。

まず、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの明視野画像が入力されると（ステップＳ１）、明視野画像から細胞核の領域の抽出が行われる（ステップＳ２）。
図６に、ステップＳ２における処理の詳細フローを示す。ステップＳ２の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。

ステップＳ２においては、まず、明視野画像のモノクロ画像への変換が行われる（ステップＳ２０１）。図７Ａに、明視野画像の一例を示す。
次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理が施され、各画素の値が二値化される（ステップＳ２０２）。

次いで、ノイズ処理が行われる（ステップＳ２０３）。ノイズ処理は、具体的には、二値画像にクロージング処理が施されることにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からｎ×ｎ画素（ｎは２以上の整数）の範囲内にある画素に１つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からｎ×ｎ画素の範囲内にある画素に１つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。図７Ｂに、ノイズ処理後の画像の一例を示す。図７Ｂに示すように、ノイズ処理後には、細胞核が抽出された画像（細胞核画像）が生成される。

次いで、ノイズ処理後の画像にラベリング処理が施され、抽出された細胞核のそれぞれにラベルが付与される（ステップＳ２０４）。ラベリング処理とは、連結している画素に同じラベル（番号）を付与していくことで画像内のオブジェクトを識別する処理である。ラベリング処理により、ノイズ処理後の画像から各細胞核を識別してラベルを付与することができる。

一方、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの蛍光画像が入力されると（ステップＳ３）、蛍光画像から蛍光物質内包ナノ粒子（本実施形態では以下単に「蛍光粒子」という。）が抽出される（ステップＳ４）。
図８に、ステップＳ４における処理の詳細フローを示す。ステップＳ４の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。

ステップＳ４においては、まず、蛍光画像から蛍光輝点の波長に応じた色成分の抽出が行われる（ステップＳ４０１）。
図９Ａに、蛍光画像の一例を示す。
ステップＳ４０１では、たとえば、蛍光粒子の発光波長が５５０ｎｍである場合には、その波長成分を有する蛍光輝点のみが画像として抽出される。

次いで、抽出された画像に閾値処理が施され、二値化画像が生成され、輝点領域が抽出される（ステップＳ４０２）。
なお、閾値処理の前に細胞自家蛍光や他の不要信号成分等のノイズ除去処理が施されてもよく、ガウシアンフィルタ等のローパスフィルタや二次微分等のハイパスフィルタが好ましく用いられる。
図９Ｂに、輝点領域が抽出された画像の一例を示す。図９Ｂに示すように、かかる画像では蛍光輝点を中心とした輝点領域が抽出されている。

次いで、輝点領域が抽出された画像と蛍光画像とが重ね合わされ、輝点領域内の輝度信号情報がマップ化されることで輝度プロファイルが作成され（ステップＳ４０３）、その輝度プロファイルから各輝点領域における蛍光粒子の数と各蛍光粒子の位置とが算出される（ステップＳ４０４）。
「輝度プロファイル」とは、輝点領域が抽出された画像をマスクとして蛍光画像から抽出された画像とに基づき作成される輝度信号値の２次元分布情報であり、輝点領域における輝度信号値とその範囲（輝度分布の広がり）とを示すものである。
すなわち、図１０に示すように、蛍光画像から輝点領域が抽出された画像が生成されると（図１０Ａ）、輝点領域ごとに、輝点領域が抽出された画像（図１０Ｂ（図１０Ａ中の四角枠部分に対応している。））と、その輝点領域に対応する部位の蛍光画像（図１０Ｃ）とが重ね合わされ、輝点領域が抽出された画像をマスクとして、蛍光画像から輝点領域に対応する第２の蛍光画像が生成され（図１０Ｄ）、その第２の蛍光画像に基づき、Ｘ座標位置及びＹ座標位置における輝度の分布が作成され（図１０Ｅ）、これが輝度プロファイルとなる。
そして実際のところ、１つの輝点領域には１個または複数個の蛍光粒子が含まれ、かかる輝度プロファイルには蛍光粒子の数と各蛍光粒子の位置とに応じた輝度と範囲とが示される。当該輝度プロファイルから輝点領域における蛍光粒子の数と各蛍光粒子の位置とが算出される。
なお、輝度プロファイルは、図１０Ｅに示すように、Ｘ座標位置及びＹ座標位置における輝度が２次元的に表現されたものであってもよいし、図１０Ｆに示すように、Ｘ座標位置（横）及びＹ座標位置（縦）における輝度（高さ）が３次元的に表現されたものであってもよい。輝度プロファイルを図１０Ｆの３次元的に表現したほうが可視化され把握しやすいため、以後の説明では、図１０Ｆのような輝度プロファイルを用いて説明する。

本実施形態では、入力された当該蛍光画像と同一の画像取り込み条件で撮影された単独の蛍光粒子から、あらかじめ蛍光粒子１個分の輝度プロファイルが作成され、当該輝度プロファイルにおける蛍光粒子の数とその座標位置とが初期値（基準）として設定される。
図１１Ａに、蛍光粒子１個分の輝度プロファイルの一例を、図１１Ｂに、当該輝度プロファイルから算出した結果（蛍光粒子の数と各蛍光粒子のＸＹ平面上での座標位置）を、それぞれ示す。
かかる状況において、ステップＳ４０４では、既知の蛍光粒子１個分の輝度プロファイルを「基準プロファイル」として、輝点領域ごとに、基準プロファイルとその輝点領域の輝度プロファイルとを比較し、その輝点領域における蛍光粒子の数と各蛍光粒子の位置とが算出される。

たとえば、あらかじめ図１１Ａの基準プロファイルが作成され、図１１Ｂのような蛍光粒子の情報（数と座標位置）が設定されている状態において、図１２Ａ、図１２Ｃ、図１３Ａ、図１３Ｃの輝度プロファイルが作成されたと仮定する。
かかる場合、図１１Ａの基準プロファイルと、図１２Ａ、図１２Ｃ、図１３Ａ、図１３Ｃの輝度プロファイルとが比較され、基準プロファイル中の輝度（頂点の高さ）とその範囲（頂点付近の広がりや勾配）などに基づき、蛍光粒子の情報として数と座標位置とが算出される。
図１２Ａの例では、輝度プロファイル中の頂点の高さとその頂点付近の広がりや勾配が基準プロファイルのものと一致することから、図１２Ｂに示すように、蛍光粒子は個数が１個で単独で存在していることが判別される。
図１２Ｃの例では、輝度プロファイル中の頂点が高く、その頂点付近の勾配が急峻であることから、図１２Ｄに示すように、蛍光粒子は個数が２個で、各蛍光粒子が近接した位置に存在していることが判別される。
図１３Ａの例では、輝度プロファイル中の頂点が高く、その頂点付近に一定の広がりがあることから、図１３Ｂに示すように、蛍光粒子は個数が３個で、各蛍光粒子がほぼ等間隔で存在していることが判別される。
図１３Ｃの例では、輝度プロファイル中の頂点の数が２つであり、一方の頂点は高くて頂点付近に広がりがあり、他方の頂点は高さと頂点付近の広がりや勾配が基準プロファイルのものと一致することから、図１３Ｄに示すように、蛍光粒子は個数が３個で、そのうち２個の蛍光粒子は一定の間隔をあけて存在し、残り１個の蛍光粒子は離れた位置で単独で存在していることが判別される。
このように、蛍光粒子が複数個にわたる場合でも、基準プロファイルが作成され、蛍光粒子の数と座標位置とがあらかじめ設定されていれば、その輝点領域における蛍光粒子の数と各蛍光粒子の位置とを容易に判別することができる。
図９Ｃに、各輝点領域における蛍光粒子の数と各蛍光粒子の位置とが算出された画像であって、蛍光粒子が抽出された画像（蛍光粒子画像）を示す。

なお、蛍光粒子１個分の輝度プロファイルを基準プロファイルとして蛍光粒子の数と位置とを判別したが、あらかじめ複数個の蛍光粒子からなる輝度プロファイルを準備してこれを基準プロファイルとして蛍光粒子の数と位置とを判別してもよいし、複数個の蛍光粒子からなる輝度プロファイルそのものに対し２次元フーリエ変換等の処理を施して波形を分解し、蛍光粒子の数と位置とを判別してもよい。

次いで、蛍光粒子画像にラベリング処理が施され、抽出された蛍光粒子のそれぞれにラベルが付与される（ステップＳ４０５）。

ステップＳ２とステップＳ４との処理の終了後、図５の処理に戻り、細胞核画像（図７Ｂ参照）と蛍光粒子画像（図９Ｃ参照）との加算処理が行われ（ステップＳ５）、細胞核上における蛍光粒子の分布が表示される（ステップＳ６）。
図１４に、加算処理後の重複画像の一例を示す。
図１５に、細胞核上における蛍光粒子の分布の一例を示す。
図１４に示すように、細胞核画像と蛍光粒子画像とが加算されると、抽出された細胞核上に、抽出された蛍光粒子が重ね合わされる。その結果、図１４拡大部に示すように、各細胞核上には、輝点領域ごとに蛍光粒子が表示される。図１４拡大部の例では、図１２Ａの輝度プロファイルから算出した１個の蛍光粒子が「１」として、図１２Ｃの輝度プロファイルから算出した２個の蛍光粒子が「２」として、図１３Ａの輝度プロファイルから算出した３個の蛍光粒子が「３」として、図１３Ｃの輝度プロファイルから算出した３個の蛍光粒子が「４」として、それぞれ表示されている。
そして実際に図１４拡大部に対応する画像は、図１５に示すように、画像処理装置２Ａの表示部２３に表示され、観察対象細胞中の特定部位（細胞核）上での蛍光粒子の数や各蛍光粒子の位置とが分布として具体的に表示され把握される。細胞核上に重なる蛍光粒子の数や各蛍光粒子の位置（分布）は、癌の悪性度や進行度の指標となる特定タンパクの発現状況を示す。

以上の本実施形態によれば、図１６に示すように、ステップＳ１−Ｓ２の処理により細胞核３０が抽出され、ステップＳ３−Ｓ４（Ｓ４０１−Ｓ４０２）の処理により輝点領域４０が抽出され、その後、図１７に示すように、ステップＳ４０３−Ｓ４０４の処理により、細胞核３０上での蛍光粒子４２の分布が具体的に表示され把握されるようになっている。
そのため、簡易な方法で観察対象細胞内での特定タンパク質の発現（発現数とその発現位置）を正確に定量することができ、これまでの蛍光輝点画像からは解析することは困難であった、生体物質の定量及び観察対象細胞上の存在位置を正確に評価することが可能になった。生体物質の細胞上での存在位置は、特にがんの浸潤性や進行度等の悪性度に関連すると推定され、本実施形態によれば、がんの転移状況やがんの活性度を可視化することが可能になり、がんの予防や治療方針の決定に貢献できると考えられる。

なお、上記実施形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。

たとえば、上記実施形態では、特定タンパクの例として乳癌におけるＫｉ６７タンパクを挙げたが、これに限定されない。診断対象となる病変（がん）種に応じて、蛍光画像を取得する際の生体物質認識部位を異なるものとすれば、病変種に応じた特定タンパクの発現量を定量的に示す特徴量を医師に提供することが可能となる。

上記実施形態では、１種の特定タンパクのみを対象としたが、複数の特定タンパクに対し、発光波長が互いに異なる２種以上の蛍光粒子を用いてもよい。
かかる場合、ステップＳ４０１においてフィルターワーク等を用いてそれぞれの色成分を抽出し、その抽出した色成分（波長成分）ごとにステップ４０２−Ｓ４０５の処理を実行し、ステップＳ５において、細胞核画像と色成分ごと作成された蛍光粒子画像とを加算すればよい。その結果、ステップＳ６では、蛍光粒子の種類ごとに（特定タンパクごとに）蛍光粒子の分布が表示され、細胞核上における特定タンパクの発現状況と併せて、各特定タンパクの近接度をも表示することができる。
かかる処理によれば、図１８に示すように、ステップＳ１−Ｓ２の処理により細胞核３０が抽出され、ステップＳ３−Ｓ４（Ｓ４０１−Ｓ４０２）の処理により輝点領域５０、５２が抽出され、その後、図１９に示すように、ステップＳ４０３−Ｓ４０４の処理により、特定タンパクごとに蛍光粒子６０、６２の分布を表示させることができる。

また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、ＣＤ-ＲＯＭ等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ(搬送波)も適用される。

その他、病理診断支援システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。

（Ａ）染色試薬ａの作製
（Ａ−１）蛍光物質内包ナノ粒子（ナノ粒子１；赤色メラミン粒子）の作製
蛍光色素として赤色発光色素であるＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解させた。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた色素樹脂粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。
具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含むことから、プラス電荷となった。樹脂粒子の電荷の評価は、ＮＭＲやＩＲ等による樹脂成分分析と、ゼータ電位測定により行なった。
得られた色素結合ナノ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基が付いた蛍光色素内包ナノ粒子を得た。

一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌＳ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光色素内包ナノ粒子が有するマレイミド基に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
上記の末端にマレイミド基が付いた色素結合ナノ粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去して、最終的にストレプトアビジンが結合したＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ色素結合赤色メラミンナノ粒子（ナノ粒子１）を得た。
ナノ粒子１を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立（登録商標）社製Ｓ−８００型）で観察したところ、平均粒径は１５０ｎｍ、変動係数は１２％であった。

（Ａ−２）蛍光物質内包ナノ粒子への抗体の結合
下記工程（１）〜（１２）の方法により、蛍光物質内包ナノ粒子に対して抗体を結合させた。
工程（１）：１ｍｇのナノ粒子１を純水５ｍＬに分散させた。次いで、アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液（ＬＳ−３１５０、信越化学工業社製）１００μＬを添加し、室温で１２時間撹拌した。
工程（２）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（３）：エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
得られたアミノ基修飾したナノ粒子のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾されたことが確認できた。

工程（４）：工程（３）で得られたアミノ基修飾したナノ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて３ｎＭに調整した。
工程（５）：工程（４）で調整した溶液に、最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。
工程（６）：反応混合液を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（７）：ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用いて再分散させた。

工程（８）：抗Ｋｉ６７抗体１００μｇを１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
工程（９）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗Ｋｉ６７抗体溶液を得た。

工程（１０）：ナノ粒子１を出発原料として工程（７）で得られた粒子分散液と工程（９）で得られた還元化抗Ｋｉ６７抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
工程（１１）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
工程（１２）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用いて再分散させ、Ｋｉ６７抗体が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を得た。

ナノ粒子１を出発原料として得られた抗Ｋｉ６７抗体が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を「染色試薬ａ」とする。

（Ｂ）蛍光物質内包ナノ粒子を用いた組織染色
下記工程（１）〜（１０）の方法により、作製した染色試薬ａを用い、ヒト乳房組織切片を用いて免疫染色を行った。染色切片はコスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。

工程（１）：キシレンを入れた容器に病理切片を３０分浸漬させた。途中３回キシレンを交換した。
工程（２）：エタノールを入れた容器に病理切片を３０分浸漬させた。途中３回エタノールを交換した。
工程（３）：水を入れた容器に病理切片を３０分浸漬させた。途中３回水を交換した。
工程（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に病理切片を３０分浸漬させた。
工程（５）：１２１度で１０分オートクレーブ処理を行った。
工程（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を３０分浸漬させた。
工程（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織に載せて、１時間放置した。
工程（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗Ｋｉ６７抗体が結合された染色試薬ａを、組織切片に載せて３時間放置した。
工程（９）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片をそれぞれ３０分浸漬させた。
工程（１０）４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ヘマトキシリン染色を行った。
工程（１１）：Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ａｑｕａｔｅｘを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。

比較として、上記工程（８）において、組織を一次抗体である抗Ｋｉ６７モノクローナル抗体と反応させ、次いで二次抗体として０．８ｎｍ金コロイド標識２次抗体を用いて反応させた。続いて、銀増感試薬で金コロイドの粒子径を増幅し、金コロイドの可視化を行なった。得られた標本を、１％四酸化オスミウムで４℃１時間後固定し、エタノール上昇系列で脱水後、ｔ−ブチルアルコールで凍結乾燥（ＪＦＤ−３００，日本電子；東京）し、イオンスパッタＥ−１０１０（日立ハイテク；東京）でパラジウム蒸着を施し、日立走査型電子顕微鏡Ｓ−３０００Ｎで免疫ＳＥＭ観察を行なった。

（Ｃ）画像解析処理
染色試薬ａを用いて染色した組織切片について、顕微鏡画像（明視野画像及び蛍光画像）を取得した。
顕微鏡として、カールツアイス社製正立顕微鏡Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２を用い、対物レンズを２０倍に設定した。蛍光画像の取得にあたっては、５８０ｎｍの波長を有する励起光を照射して、組織切片から発せられる６１０ｎｍの波長を有する蛍光を結像し、顕微鏡設置カメラ（モノクロ）により顕微鏡画像（画像データ）を取得した。
なお、上記カメラは画素サイズ６．４μｍ×６．４μｍ、縦画素数１０４０個、横画素数１３８８個（撮像領域８．９ｍｍ×６．７ｍｍ）を有している。

得られた画像に図５の画像解析処理を実行し、輝度プロファイルに基づき、ナノ粒子１の数と位置とを算出したところ、図２０に示すように、細胞上にＫｉ６７タンパクの分布を表示することができた。その分布は、金コロイドを用いた免疫ＳＥＭ観察による発現位置と一致し、簡便な方法で生体物質の位置情報を得ることができた。

（Ａ）染色試薬ｂの作製
（Ａ−１）蛍光物質内包ナノ粒子（ナノ粒子２；緑色メラミン粒子）の作製
実施例１のナノ粒子１の作製において、蛍光色素として緑色発光色素であるｐｙｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６（Ｅｘｃｉｔｏｎ社製）１４．４ｍｇを水２２ｍに加えて溶解した以外は同様に、ｐｙｒｏｍｅｔｈｅｎｅ色素結合緑色メラミンナノ粒子（ナノ粒子２）を得た。
得られたナノ粒子２を走査型電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径は１８０ｎｍ、変動係数は１４％であった。

（Ａ−２）蛍光物質内包ナノ粒子への抗体の結合
実施例１の蛍光物質内包ナノ粒子への抗体の結合において、ナノ粒子１の代わりにナノ粒子２を用い、抗Ｋｉ６７抗体の代わりに抗ｐ５３抗体を用いた以外は同様にして、抗ｐ５３抗体が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を得た。
ナノ粒子２を出発原料として得られた抗ｐ５３抗体が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を「染色試薬ｂ」とする。

（Ｂ）蛍光物質内包ナノ粒子を用いた組織染色
実施例１の蛍光物質内包ナノ粒子を用いた組織染色の工程（８）において、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗Ｋｉ６７抗体が結合された染色試薬ａ及び、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ｐ５３抗体が結合された染色試薬ｂを組織切片に載せて３時間放置した以外は同様にして、組織染色を行った。

（Ｃ）画像解析処理
染色試薬ａ及び染色試薬ｂを用いて染色した組織切片について、実施例１に記載の顕微鏡により顕微鏡画像（明視野画像及び蛍光画像）を取得した。
なお、蛍光画像の取得にあたっては、５８０ｎｍの波長を有する励起光を照射し６１０ｎｍの波長を有する蛍光を結像して得られる蛍光画像データ、及び４９０ｎｍの波長を有する励起光を照射し５２０ｎｍの波長を有する蛍光を結像して得られる蛍光画像データの２枚の画像データを取得した。
得られたそれぞれの画像に図５の画像解析処理を実行し、輝度プロファイルに基づき、ナノ粒子１及びナノ粒子２の数と位置とをそれぞれ算出したところ、図２１に示すように、Ｋｉ６７タンパク及びｐ５３タンパクの２種の分布を細胞上に表示することができた。

本発明は病理診断のための画像処理技術に関し、特に簡易な方法で観察対象細胞内での特定のタンパク質の発現を正確に定量するのに好適に利用することができる。

１Ａ 顕微鏡画像取得装置
２Ａ 画像処理装置
３Ａ ケーブル
２１ 制御部
２２ 操作部
２３ 表示部
２４ 通信Ｉ／Ｆ
２５ 記憶部
２６ バス
３０ 細胞核
４０ 輝点領域
４２ 蛍光粒子
５０、５２ 輝点領域
６０、６２ 蛍光粒子
１００ 病理診断支援システム

Claims (5)

1. 組織切片における細胞の形態を表す明視野画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像とを入力する入力手段と、
   前記明視野画像から細胞の特定部位が抽出された細胞画像を生成する第１の生成手段と、
   前記蛍光画像から輝点領域が抽出された画像を生成し、輝点領域ごとに輝度プロファイルを作成し、蛍光輝点源となる蛍光粒子１個分の蛍光プロファイルに基づき、前記輝点領域における蛍光粒子が抽出された蛍光粒子画像を生成する第２の生成手段と、
   前記細胞画像と前記蛍光粒子画像とを重ね合わせる加算手段と、
   を有することを特徴とする画像処理装置。
2. 請求項１に記載の画像処理装置において、
   前記蛍光輝点源が、発光波長が互いに異なる２種以上の蛍光粒子とされ、
   前記第２の生成手段が、蛍光粒子の種類ごとに前記蛍光粒子画像を生成することを特徴とする画像処理装置。
3. 請求項１または２に記載の画像処理装置と、
   前記画像処理装置で使用される、前記明視野画像と前記蛍光画像とを取得する画像取得装置と、
   を備えることを特徴とする病理診断支援システム。
4. コンピュータを、
   組織切片における細胞の形態を表す明視野画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像とを入力する入力手段、
   前記明視野画像から細胞の特定部位が抽出された細胞画像を生成する第１の生成手段、
   前記蛍光画像から輝点領域が抽出された画像を生成し、輝点領域ごとに輝度プロファイルを作成し、蛍光輝点源となる蛍光粒子１個分の蛍光プロファイルに基づき、前記輝点領域における蛍光粒子が抽出された蛍光粒子画像を生成する第２の生成手段、
   前記細胞画像と前記蛍光粒子画像とを重ね合わせる加算手段、
   として機能させるための画像処理プログラム。
5. 組織切片における細胞の形態を表す明視野画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像とを入力する入力工程と、
   前記明視野画像から細胞の特定部位が抽出された細胞画像を生成する第１の生成工程と、
   前記蛍光画像から輝点領域が抽出された画像を生成し、輝点領域ごとに輝度プロファイルを作成し、蛍光輝点源となる蛍光粒子１個分の蛍光プロファイルに基づき、前記輝点領域における蛍光粒子が抽出された蛍光粒子画像を生成する第２の生成工程と、
   前記細胞画像と前記蛍光粒子画像とを重ね合わせる加算工程と、
   を有することを特徴とする画像処理方法。

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