JP6931870B2 - 細胞の再プログラム化を検出するための方法及び装置 - Google Patents
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Description
本願に記載された本発明の対象の大半は、発明者のYuan-Hsiang Chang、Hideo Yokota、Kuniya Abe及びMing-Dar Tsaiによって、“Detection and Localization of Mouse Induced Pluripotent Stem Cell Formation using Time-Lapse Fluorescence Microscopy Images.”というタイトルの論文において公開された。当該論文は、2016年8月16日から2016年8月20日までに開催されたIEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC)の2016年第38回年次国際会議中に開示され、2016年10月18日にIEEE Xploreによってオンラインで公開された。従って、当該公開又は開示は、本願の出願日前の6か月以内に、本発明の発明主体の全てのメンバーによって行われ、及び/又は、本発明の発明者である全てのメンバーによって行われた。
本開示のいくつかの実施形態によれば、当該方法は、以下の(a)〜(d)の工程を含む。(a)グレースケール変換、及びアンシャープマスキングを、上記蛍光顕微鏡画像に適用し、強調画像を取得する工程、(b)上記強調画像を2値画像に変換する工程、(c)上記2値画像において、細胞に対して細胞様楕円境界を特定する工程であって、各細胞様楕円境界が、孤立細胞、又は細胞群を示す工程、並びに(d)各孤立細胞又は各細胞群をランダムな色で標識化し、着色された複数のコンポーネントを取得する工程であって、各着色コンポーネントが、再プログラム化を受けている1つ以上の細胞、又は再プログラム化された1つ以上の細胞を示す、工程。
Gx及びGyは、それぞれ、x方向及びy方向における上記画像階調を示している工程、及び、
(e−2)式4に従って、各ピクセルの上記滑らかさσ(x,y)を決定する工程であって、
添付図面に関連して、以下に与えられた詳細な説明は、本実施例の説明として意図されるが、本実施例が構成される唯一の形態、又は本実施例が利用される唯一の形態だけを示すことは意図していない。当該説明は、当該実施例の機能を示し、当該実施例を構成し、処理するための工程の手順を示す。しかし、同一の機能及び手順、又は同等の機能及び手順が、異なる実施例によって達成されてもよい。
上記を考慮して、本開示の第1の態様は、1つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するための方法を規定する。
Gx及びGyは、それぞれ、x方向及びy方向における画像階調度を示す。次に、各ピクセルの曖昧さ(滑らかさ)σ(x,y)は、式4に従った、局所領域における画像階調度の標準偏差として定義される。
(1)IPS細胞形成
胚線維芽細胞は、ドキシサイクリン誘導性Oct4、Sox2、Klf4及びc−Mycを宿すマウス系の13.5dpcの胚に由来する。10%ウシ胎児血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の3cmシャーレ中で、1×104個の胚線維芽細胞を播種し、37℃で一晩、培養した。10%ES細胞用ウシ胎児血清(ES-certified FBS)、1%非必須アミノ酸、0.1%b−メルカプトエタノール、1000μg/mlのLIF、50μg/mlのアスコルビン酸、3μMのCHIR99021を含有するGMEMであるES培地で、培地を交換した。2μg/mlのドキシサイクリンを培地に添加し、導入遺伝子の発現を誘導した。ドキシサイクリンを添加した日を0日目とした。
この研究では、Leica Microsystem AF 6000LX (DFC360FX-442880310)を使用して、生きた細胞の経時的な画像を取得した。顕微鏡の設定を下記の表1に要約した。2つのチャンネル(チャンネル1及び2)で、顕微鏡画像を同時に取得した。経時的な蛍光顕微鏡画像を8時間おきに18日間撮った。
この実施例では、図2Bからの蛍光画像を、上述のように、画像処理工程S101及び細胞検出工程S103によって処理し、結果を、図3に示した。図3において、パネル(a)は、元の画像である。パネル(b)は、画像処理工程S101後の結果を示す。当該工程では、蛍光を発する孤立細胞が、アンシャープマスキングによりはっきりと強調されている。パネル(c)は、細胞検出工程S103後の結果を示す。当該工程では、ランダムな色を、検出された蛍光を発する細胞又は細胞群に割り当てる。また、パネル(d)は、明視野コントラスト技術によって得られた画像を示す。
この実施例では、上述の画像処理工程S101、細胞検出工程S103及びクラスター特定工程S105によって、2つの連続的な蛍光画像を処理し、図4に結果を示した。図4において、パネル(a)及び(b)は、それぞれ、元の画像、及び対応する明視野コントラスト画像を示し、パネル(c)及び(d)は、パネル(a)の画像において工程S101から工程S103までを行ったあとの結果を示すが、パネル(c)及び(d)は、階調度の標準偏差が異なる。
この実施形態では、実施形態1のシステムの例示的な実施が記載されている。
本開示の第3の態様は、ディープラーニングによるiPS検出のための方法及び装置を規定する。本実施形態3は、実施形態1及び2で既に説明した方法、システム及び装置、並びに、下記で説明する方法及び装置を含む。
分類1:孤立細胞で周囲にゲル状物質を伴っている
分類2:増殖しているがクラスターを形成していない細胞
分類3:iPSクラスターの形成
分類4:別のタイプの細胞クラスター
分類5:別のタイプの細胞クラスター
図6は、上記の各分類に対する例示的な画像である。
本実施形態に記載された構成に基づいて、トレーニング段階において、クリップ部201は、最終的なテスト画像であるIWP-2コロニー1以外の、コントロール、DMSO及びIWP-2の画像セットから、トレーニング画像をクリップした。ROIのサイズを、256×256ピクセルに固定した。他のサイズ(32×32、64×64、128×128)と比較して、256×256ピクセルのサイズは、特に、臨界的特徴(critical feature)に関して有効であった。
この実施形態は、ディープラーニングによるiPS検出のための方法及び装置の別の例を提供する。本実施形態の一態様は、第3の実施形態の変形を含む。本実施形態の別の態様は、第3の実施形態の補足を含む。
クラス1:周囲にゲル状の物体を伴った細胞
クラス2:群がらないいくつかの細胞
クラス3:粗いパターンで群がるいくつかの細胞
クラス4:精細なパターンで群がるいくつかの細胞
クラス5:iPS
図23は、上記の分類基準(クラス0から5)に従った例示的な分類領域を示す。
本実施形態に記載された構成に基づいた例示的な結果は、図28及び29に示される。この実施例では、我々は下記のiPSデータ及び構成も使用した。
1枚の画像(2560×1920ピクセル)は、たった1つのコロニーを含む。4日目、7日目、8日目、9日目、10日目及び11日目に撮影された同一のコロニーの6つの画像は、1セットの、時系列に沿った画像を構成する。
この実施形態は、トレーニング画像及びテスト画像についてのより詳細な説明を提供する。本実施形態の一態様は、第3の実施形態の変形と、第4の実施形態の変形とを含む。本実施形態の別の態様は、第3の実施形態の補足と、第4の実施形態の補足とを含む。
Claims (16)
- 1つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するための方法であって、
(a)グレースケール変換、及びアンシャープマスキングを、上記蛍光顕微鏡画像に適用し、強調画像を取得する工程と、
(b)上記強調画像を2値画像に変換する工程と、
(c)上記2値画像において、細胞に対して細胞様楕円境界を特定する工程であって、各細胞様楕円境界が、孤立細胞、又は細胞群を示す工程と、
(d)各孤立細胞又は各細胞群をランダムな色で標識化し、着色された複数のコンポーネントを取得する工程であって、各着色コンポーネントが、再プログラム化を受けている1つ以上の細胞、又は再プログラム化された1つ以上の細胞を示す、工程と、を含む、方法。 - 上記ガウジアンフィルタのフィルタサイズは、上記細胞の直径である、請求項2に記載の方法。
- (e)上記着色コンポーネントの各ピクセルの滑らかさを、ピクセルの局所領域と比較し、下記(e−1)及び(e−2):
(e−1)式3に従って、各ピクセルの画像階調度M(x,y)を決定する工程であって、
Gx及びGyは、それぞれ、x方向及びy方向における上記画像階調を示している工程、及び、
(e−2)式4に従って、各ピクセルの上記滑らかさσ(x,y)を決定する工程であって、
によって評価する工程、並びに、
(f)式5の基準を満たす曖昧な領域Rの存在を決定する工程、
上記曖昧な領域は、細胞クラスターを示している、請求項1に記載の方法。 - (e)上記着色コンポーネントの各ピクセルの滑らかさを、ピクセルの局所領域と比較し、下記(e−1)及び(e−2):
(e−1)式3に従って、各ピクセルの画像階調度M(x,y)を決定する工程であって、
Gx及びGyは、それぞれ、x方向及びy方向における上記画像階調を示している工程、及び、
(e−2)式4に従って、各ピクセルの上記滑らかさσ(x,y)を決定する工程であって、
によって評価する工程、並びに、
(f)式5の基準を満たす曖昧な領域Rの存在を決定する工程、
上記方法は、上記1つ以上の細胞の一連の蛍光顕微鏡画像に対して、工程(a)から工程(f)を実行し、上記細胞の再プログラム化の開始を特定することを含む、請求項1に記載の方法。 - 1つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するための方法を実行するための、コンピュータが読み取り可能な命令が符号化された、有形のコンピュータ可読記憶媒体であって、
上記方法は、
(a)グレースケール変換、及びアンシャープマスキングを、上記蛍光顕微鏡画像に適用し、強調画像を取得する工程と、
(b)上記強調画像を2値画像に変換する工程と、
(c)上記2値画像において、細胞に対して細胞様楕円境界を特定する工程であって、各細胞様楕円境界が、孤立細胞、又は細胞群を示す、工程と、
(d)各孤立細胞又は各細胞群をランダムな色で標識化し、着色された複数のコンポーネントを取得する工程であって、各着色コンポーネントが、再プログラム化を受けている1つ以上の細胞、又は再プログラム化された1つ以上の細胞を示す、工程と、を含む、有形のコンピュータ可読記憶媒体。 - 上記ガウジアンフィルタのフィルタサイズは、上記細胞の直径である、請求項8に記載の有形のコンピュータ可読記憶媒体。
- 上記方法は、
(e)上記着色コンポーネントの各ピクセルの滑らかさを、ピクセルの局所領域と比較し、下記(e−1)及び(e−2):
(e−1)式3に従って、各ピクセルの画像階調度M(x,y)を決定する工程であって、
Gx及びGyは、それぞれ、x方向及びy方向における上記画像階調を示している工程、及び、
(e−2)式4に従って、各ピクセルの上記滑らかさσ(x,y)を決定する工程であって、
によって評価する工程、並びに、
(f)式5の基準を満たす曖昧な領域Rの存在を決定する工程、
上記曖昧な領域は、細胞クラスターを示している、請求項7に記載の有形のコンピュータ可読記憶媒体。 - 1つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像から、再プログラム化を受けている細胞、及び再プログラム化された細胞を特定するためのシステムであって、
1つ以上の細胞の蛍光顕微鏡画像を取得するように構成された装置と、
制御ユニットであって、プロセッサ、及び複数の命令を保存するためのメモリを備え、上記複数の命令は、上記プロセッサによって実行された場合、
(a)グレースケール変換、及びアンシャープマスキングを、上記蛍光顕微鏡画像に適用し、強調画像を取得する工程と、
(b)上記強調画像を2値画像に変換する工程と、
(c)上記2値画像において、細胞に対して細胞様楕円境界を特定する工程であって、各細胞様楕円境界が、孤立細胞、又は細胞群を示す、工程と、
(d)各孤立細胞又は各細胞群をランダムな色で標識化し、着色された複数のコンポーネントを取得する工程であって、各着色コンポーネントが、再プログラム化を受けている1つ以上の細胞、又は再プログラム化された1つ以上の細胞を示す、工程と、を含む方法を上記プロセッサに実行させる、制御ユニットと、を備えている、システム。 - 上記ガウジアンフィルタのフィルタサイズは、上記細胞の直径である、請求項13に記載のシステム。
- 上記方法は、
(e)上記着色コンポーネントの各ピクセルの滑らかさを、ピクセルの局所領域と比較し、下記(e−1)及び(e−2):
(e−1)式3に従って、各ピクセルの画像階調度M(x,y)を決定する工程であって、
Gx及びGyは、それぞれ、x方向及びy方向における上記画像階調を示している工程、及び、
(e−2)式4に従って、各ピクセルの上記滑らかさσ(x,y)を決定する工程であって、
(f)式5の基準を満たす曖昧な領域Rの存在を決定する工程、
上記曖昧な領域は、細胞クラスターを示している、請求項12に記載のシステム。
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