JP4839073B2 - 微弱光解析方法 - Google Patents
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Description
ここで、前記DNA構造物が、GPIアンカー型であるのが好ましい。また、前記DNA構造物が、細胞内へ基質溶液が侵入し難い成分である場合には、細胞内と細胞外に発現したレポーター分子の識別を可能にするので好ましい。また、前記のレポーター遺伝子が発光タンパク質であることにより、一定量の基質溶液との混合状態において、遺伝子の発現量に対応する光量を長期間安定に発生するので好ましい。また、前記のレポーター遺伝子が生ずるシグナルの強度を輝度値に変換することにより、正確な解析ができるので好ましい。また、前記のレポーター遺伝子が生ずるシグナルの光学イメージング像と細胞の明視野像を重ね合わせすることにより、発光した細胞を正確に同定できる点で好ましい。
一般に、顕微鏡観察における空間分解能εは、下記数式1で表される。
ε=0.61×λ÷NA ・・・(数式1)
(数式1において、λは光の波長であり、NAは開口数である。)
また、観察範囲の直径dは、下記数式2で表される。
d=D÷M ・・・(数式2)
(数式2において、Dは視野数であり、Mは倍率である。なお、視野数は一般に22から26である。)
従来、顕微鏡用対物レンズの焦点距離は国際規格で45mmとされていた。そして、最近では、焦点距離を60mmとする対物レンズが使われはじめている。この焦点距離を前提にしてNAが大きい、つまり空間分解能が高いレンズを設計すると作動距離(WD)は一般には0.5mm程度であり、また長WD設計のものでも8mm程度であった。このような対物レンズを用いた場合、観察範囲は0.5mm径程度である。
NA'=NA÷β ・・・(数式3)
(数式3において、NAは入射開口角(開口数)であり、NA'は射出開口角であり、βは投影倍率である。)
一般の対物レンズにおいて、NA'は高々0.04であり、NA'2は0.0016である。また、現在市販されている一般的な顕微鏡の対物レンズにおける像の明るさ(NA/β)2の値を調査したところ、0.0005から0.002の範囲であった。
技術分野
この態様は、本発明において、タンパク質の細胞外への分泌または、細胞表面への発現を解析する方法に関する。より具体的には、発光顕微鏡などを用いた解析法で、疎水性アミノ酸に富む配列から予測したシグナルペプチドや膜貫通ドメインをルシフェラーゼを用いた融合タンパク質コードする遺伝子をレポーターとし、細胞の表面に発現させルシフェラーゼ活性を検出する方法に関する。
ヒトを含め多細胞動物では、個体の構築・維持のための細胞間コミュニケーションや細胞外環境造成が必要である。そのために、細胞は莫大な種類のタンパク質を、小胞体-ゴルジ装置という細胞内小器官を介して細胞外に分泌する。例えばホルモンなどの分泌型水溶性タンパク質は細胞膜を通り抜けて細胞外に分泌されるし、膜タンパク質は細胞膜などの適切な膜に組み込まれる。分泌タンパク質は、N末端に「分泌シグナルペプチド」と呼ばれる配列を持っている。シグナルペプチドは、細胞質のリボソームで最初に翻訳されるや否や、これを認識する分子群によって、小胞体の膜のチャンネル(穴)に挿入され、続いて合成されるタンパク質本体部分を通過させつつ、自身は切断、破棄される。シグナルペプチドは、疎水性アミノ酸に富む配列であり、これを高確率で予測できるプログラムがある。
これら、シグナルペプチドを検出することで、(1) プロテオーム情報解析、ゲノム計画の進展により明らかになった、新規な遺伝子・タンパク質の機能推定、(2) バイオインフォマティクス・コンピュータを用いた大量の生物情報の処理、(3) ゲノム創薬、シグナルペプチドを用いた、リゾチームやホルモン剤などのタンパク質製剤の生産技術向上 といった用途の利用がある。
これらのシグナルペプチドの予測や機能は、最終的に細胞を用いて検証する。従来の方法として、ジーントラップ法は、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子を目的の細胞に導入し、染色体上で活性化されているプロモーターの下流に挿入された時のレポーター活性により内在性の遺伝子発現を同定するものである。例えば、レポーターは、β-balactosidase(β-gal)と(hygromycin (Hyg.) phosphotransferaseの融合遺伝子で、この遺伝子が翻訳されレポータータンパク質が合成され細胞内にとどまればβ-gal活性が発現してX-gal存在化に細胞質に青染される領域が出現するが、ER側に入るとその活性は失われる。レポータの上流に疎水性の膜貫通領域を組み込みβ-gal活性を指標にシグナル配列をコードする遺伝子を選択する。これらシグナル配列をターゲットとしたジーントラップ法により軟骨細胞に特異的な分泌型および膜表面タンパク質の同定が可能である(Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.92, pp.6592-6596)。しかしながら、シグナルペプチドが存在するとβ-balactosidase活性がなくなるため、フォールスポジティブが多くなりまた検出感度も良く無いといった問題点がある。
さらに、細胞表面への発現を観察するうえで、従来GFPなどに膜貫通ドメインを融合したタンパク質で観察する方法が試みられてきたが、細胞外へ発現したかの判断が困難である。また、フォールスポジティブが多いという問題がある。具体的にGFPのC末端にCD40の187アミノ酸からC末端までの膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をトランスフェクションした。この融合タンパク質を発現したHela細胞を4℃の環境で抗GFP抗体(sigma)と2次抗体として抗mouse-IgG-Cy3 (sigma)で免疫染色し、観察した。免疫染色でシグナルペプチドが無いのに細胞表面に発現している細胞が観察される(図2参照)。
1.従来技術では上記のように、シグナルペプチド検出に関連した従来の分析方法は何れも、 β-balactosidase活性を用いる方法では細胞1つずつのシグナルペプチドの有無を観察することが出来るが、小胞体内にターゲティングされているのは解るが細胞外へ放出されるかどうかは直接解らないし β-balactosidase活性を指標にしているため感度が低いといった問題点がある。また、細胞からGFPやルシフェリンの分泌された培養上清を測定する方法では、直接細胞を観察出来ず測定する培養液全体の情報しか解らず感度を上げるためには、培養上清を濃縮しなければならないといった問題点がある。
細胞個々の情報を高感度に観察することが可能なため、同一容器内で異なるシグナルペプチドや膜貫通ドメインかどうかを同時に解析出来、試料の必要量の低減、反応容器数の低減が可能で検査の簡便化出来る。
ウミシイタケのLuciferase遺伝子のN末にラットのneurotrophin-3 (NT-3)のシグナルペプチド部分- MSILFYVIFLAYLRGI- をつなげたもの(sig pep-Luci-GPI)とつなげないもの(Luci-GPI)にそれぞれC末端にヒトThy-1 のN末端から117(Ser)-161番(Leu)の部分をつなげた融合タンパク質を発現する遺伝子を構築した。
まず、トランスフェクション前日、35mmのカルチャーディシュに5x105 cells/mlの濃度で2ml(10% FBSを含むD-MEM培地)まき、5% CO2環境下37℃で培養した。翌日pDNA3.1発現ベクターにsig pep-Luci-GPIまたはLuci-GPI遺伝子を挿入したプラスミドをHela細胞にLipofectamine2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後24-48時間10% FBSを含むD-MEM培地で5% CO2環境下37℃で培養した。
<レポーター遺伝子>
本発明におけるレポーター遺伝子は、検出可能な蛍光を発するレポータータンパク質をコードする遺伝子を意味する。例えば、蛍もしくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼを挙げることができる。さらには、例えば、βガラクトシダーゼをコードする遺伝子、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を挙げることができる。
本発明におけるプロモーター領域としては、最初期遺伝子のプロモーターが挙げられる。
本発明で用いられる最初期遺伝子のプロモーターとしては、例えば、c-fosプロモーター領域が挙げられる。また、本発明で用いられるプロモーターとしては、前記プロモーターの任意の動物種の対応物も含まれる。ここでプロモーター領域とは、プロモーター活性を有するために必要な最小の塩基配列を含む任意の領域を意味する。例えば、該遺伝子の転写部位に対して上流500から2000塩基の領域の一部または全部を用いることができる。
下記に説明する発明において使用される「物質」とは、自然界に存在する天然の物質あるいは人工的に調製される任意の物質を意味する。具体的には、例えば、化学的に合成された任意の化合物を挙げることができる。該化合物の種類および分子量などについては特に限定されない。該物質がタンパク質、またはペプチドである場合には、生体組織や細胞から単離されるもの、および遺伝子組換えや化学的合成により調製されるものも含まれる。さらにまた、それらの化学修飾体も含まれる。
動物細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、目的のタンパク質をコードするDNA、終止コドンを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするDNA、エンハンサー配列、該タンパク質をコードする遺伝子の5'側および3'側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリA付加シグナル、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。
遺伝子を細胞へ導入する方法としては、塩化カルシウム法または塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。本発明で使用される遺伝子導入した細胞には一過性発現細胞あるいは安定発現細胞のいずれもが含まれる。
本発明は例えば、下記のように実施することが出来る。
細胞の定数(例えば、該物質を細胞に接触させる刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域(好ましくは、c-fos遺伝子のプロモーター領域)に発現可能に連結されたレポーター遺伝子(好ましくは蛍もしくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ)を前記の遺伝子導入方法を用いて細胞に導入する。得られた前記の遺伝子導入された細胞の定数(例えば、1〜1x109個、好ましくは1x103〜1x106個)を所望の細胞培養が可能な器具(例えば、シャーレ、多数のウェルを有するマルチプレートなど)を用いて所望の栄養培地(例えば、D-MEM培地など)中で培養する。この定数の細胞からなる試料を、あらかじめ細胞にとって最適な温度(例えば、25〜37℃、好ましくは35〜37℃)に保温し、試料の乾燥を防ぐため水を注入して保湿した発光顕微鏡の培養装置部に設置し、該発光顕微鏡の試料観察部にある対物レンズを通してデジタルカメラで発光イメージを記録する。前記の試料に、細胞に接触させて刺激を行なうための物質(例えば、化合物)を所望の濃度(例えば、1pM〜1M、好ましくは100nM〜1mM)で加えて、所望の時間間隔(例えば5分間〜5時間、好ましくは10分間〜1時間)で発光イメージを記録する。記録した画像を市販の画像解析ソフト(例えば、MetaMorph;ユニバーサルイメージング社製など)を用いて画像内の所望の領域における輝度値を取得する。さらに、発光イメージと同視野において明視野イメージを記録し、前記の画像解析ソフトを用いて発光イメージと明視野イメージを重ね合わせて、発光している細胞を同定する。
本発明における光学イメージングとは、レポーター遺伝子を導入した細胞において、レポーター遺伝子により発せられる検出可能なシグナルの存在、不在または強度をモニタリング、記録および分析するイメージング方法を意味する。光学イメージングを達成するためには、レポーター遺伝子により発せられるシグナルの強度が、シグナルを細胞の外部から分析することができるように、十分に高くなくてはならない。光学イメージングは自動化に容易に適用可能であることから、多数の遺伝子発現を同時にモニタリングするのに用いることができる。なお、イメージングした試料画像の任意の位置について、時系列に2次元または3次元に画像情報を処理する技術は、本出願人による特願2004−172156、特願2004−178254等を参照してもよい。蛍光観察と発光観察における時系列な画像取得の違いは、発光観察が励起光による光学的走査(レーザスキャン)を必要としない点で余計な光による影響が無い点にある。本発明で行うイメージング技術によれば、リアルタイムに発光画像を撮像できる。本発明の方法では特に、上述したような発光顕微鏡を使用することにより、発光画像による解析を実現することが可能となった。
疎水性アミノ酸に富む配列から予測したシグナルペプチドを検出する方法であって、N末から開始コドン、解析対象のシグナルペプチド、発光関連遺伝子、既知の膜貫通ドメイン、終止コドンの順でタンパク質をコードしているDNA構築物であって、DNA構築物を検査用細胞に遺伝子導入し、コードする遺伝子が転写・翻訳されタンパク分子が細胞外の表面にとどまる行程と、
細胞表面に発現したタンパク分子の発光活性を発光顕微鏡で検出する行程と、測定結果を解析する行程と、上記の反応を生じせしめる反応溶液及び反応容器と、これらの細胞を観察し解析し細胞の情報からシグナルペプチドを決定することの出来る方法を具備した方法。
付記項2
疎水性アミノ酸に富む配列から予測した膜貫通ドメインを検出する方法であって、N末から開始コドン、既知のシグナルペプチド、発光関連遺伝子、解析対象の膜貫通ドメイン、終止コドンの順でタンパク質をコードしているDNA構築物であって、DNA構築物を検査用細胞に遺伝子導入し、コードする遺伝子が転写・翻訳されタンパク分子が細胞外の表面にとどまる行程と、
細胞表面に発現したタンパク分子の発光活性を発光顕微鏡で検出する行程と、測定結果を解析する行程と、上記の反応を生じせしめる反応溶液及び反応容器と、これらの細胞を観察し解析し細胞の情報から膜貫通ドメインを決定することの出来る方法を具備した方法。
付記項3
上記1の方法において、少なくとも一つのシグナルペプチドの塩基配列が異なるDNA構築物が含まれたDNA構築物を同時に導入した細胞を同一容器に培養し、同一容器内で他種類の発光活性を同時に解析する方法。
付記項4
上記1の方法において、細胞表面への発現にGPIアンカー型を用いることで膜貫通ドメインによる擬陽性を開眼することをを可能にした検出法。
付記項5
上記1または2の方法において基質が細胞内へ入りづらい物を用いることで、細胞内と細胞外に発現したレポーター分子を識別することを可能とした検出法。
付記項6
上記方法におけるシグナルシーケンスまたは、膜貫通ドメインのスクリーニング法。
付記項7
上記方法における分泌量を検出する方法。
2:対物レンズ
3:集光レンズ
4:CCDカメラ
5:モニタ
6:ズームレンズ
Claims (12)
- N末端側から順に、解析対象のシグナルペプチド、発光タンパク質および既知の膜貫通ドメインが繋がった融合タンパク質を発現する細胞を含む試料を、撮像手段の撮像視野内に配置する工程と、
前記細胞において発現した前記発光タンパク質により生ずる発光シグナルを前記撮像手段により暗視野において光学イメージングするとともに、前記発光シグナルの量を定量的に決定する光学的処理工程とを備え、
前記光学イメージングが微弱光を画像解析可能な画像の取得であり、前記撮像手段が、開口数をNAとし投影倍率をβとしたときの(NA÷β)の2乗の値が0.01以上である対物レンズを備えることを特徴とする微弱光解析方法。 - 前記融合タンパク質が、GPIアンカー型であることを特徴とする請求項1に記載の微弱光解析方法。
- 前記発光シグナルは、前記発光タンパク質と細胞内へ侵入し難い基質との相互作用により生じ、これにより細胞内と細胞外に発現した前記発光タンパク質の識別を可能にすることを特徴とする請求項1または2に記載の微弱光解析方法。
- 前記試料に刺激用物質を接触させて刺激を行う工程をさらに含み、前記刺激に応答した細胞を前記光学的処理工程により光学的に処理することを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の微弱光解析方法。
- 前記発光シグナルの強度を輝度値に変換することを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載の微弱光解析方法。
- 前記光学イメージングにより取得される前記発光シグナルの画像と前記細胞の明視野像とを重ね合わせることを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の微弱光解析方法。
- 前記(NA÷β)の2乗の値が0.039以上であることを特徴とする請求項1から6のいずれか1項に記載の微弱光解析方法。
- 前記(NA÷β)の2乗の値が0.071以上であることを特徴とする請求項7に記載の微弱光解析方法。
- 前記光学イメージングを、高い開口数(NA)の対物レンズを用いて、短い時間間隔で実行することを特徴とする請求項7または8に記載の微弱光解析方法。
- 請求項1から9のいずれか1項に記載の方法を含むシグナルシーケンス方法。
- 請求項1から9のいずれか1項に記載の方法を含む膜貫通ドメインのスクリーニング方法。
- 請求項1から9のいずれか1項に記載の方法を含む分泌量を検出する方法。
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