JP4767582B2 - 発現量定量方法および発現量定量装置 - Google Patents
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Description
(工程1)1つのプラスミドベクターの中に、SV40のような恒常的に働いているプロモーターを用いて、所定の色(例えば緑や赤など)の発光を発するルシフェラーゼを発現するルシフェラーゼ遺伝子を融合することで、当該ルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現できるようにする。
(工程2)当該プラスミドベクターに、目的の遺伝子のプロモーターと、前記所定の色とは異なる色の発光を発するルシフェラーゼを発現するルシフェラーゼ遺伝子と、をさらに融合する。
(1)本実施例で用いるプラスミドベクターを、(a)SV40プロモーター、(b)発光強度を補正するためのルシフェラーゼ遺伝子であるCBG99遺伝子(プロメガ株式会社製、発光色:緑)、(c)目的遺伝子であるHSP70Bのプロモーター、(d)CBG99遺伝子と発光色が異なるルシフェラーゼ遺伝子であるCBR遺伝子(プロメガ株式会社製、発光色:赤)、を融合して作製する。具体的には、本実施例で用いるプラスミドベクターを、図4に示すように、補正コントロール用のCBG99遺伝子をSV40プロモーターの下流に融合し、CBR遺伝子をHSP70Bのプロモーターと共に(繋げて)さらに融合して作製する。
(2)作製したプラスミドベクターをHeLa細胞に導入する(トランスフェクション)。
(3)HeLa細胞を35mmガラス底シャーレで一晩培養し、翌日、培養液に1MHEPESおよび発光基質を加えた後、熱ショック刺激(43℃、CO2:5%、60分)を与える。
(4)上述した実施の形態における発現量定量装置100を用いて、各HeLa細胞における2つのルシフェラーゼ(CBG99およびCBR)の発光強度をそれぞれ、熱ショック刺激後30分おきに経時的に測定する。具体的には、発現量定量装置100において、経時的に撮像した発光画像から、HeLa細胞ごとに、CBG99およびCBRからの発光の発光強度を数値化する。なお、当該測定は室温で行い、対物レンズは20倍の(油浸)ものを用い、発光画像の撮像において露出時間は5分であった。
102 サンプル
104 容器(シャーレ)
106 ステージ
108 対物レンズ
109 結像レンズ
110 フィルター
112 CCDカメラ
114 情報通信端末
114a 制御部
114a1 発光画像撮像指示部
114a2 発光画像取得部
114a3 選定部
114a4 補正部
114a5 定量部
114b クロック発生部
114c 記憶部
114d 通信インターフェース部
114e 入出力インターフェース部
114f 入力部
114g 出力部
Claims (5)
- 発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子および前記発光タンパク質が発する発光の色とは異なる色の発光を発する異色発光タンパク質を発現する異色発光関連遺伝子が導入された複数のサンプルを対象として、各サンプルから発せられた発光の発光強度に基づいて前記発光関連遺伝子の発現量をそれぞれ定量する発現量定量方法であって、
開口数(NA)および倍率(β)で表される(NA/β)2の値が0.02以上である対物レンズを用いて、撮像範囲中に前記複数のサンプルを含む発光画像を撮像する発光画像撮像ステップと、
前記発光画像撮像ステップで撮像した各発光画像に基づいて、サンプルから発せられた発光タンパク質の発光強度および異色発光タンパク質の発光強度をサンプルごとに測定する測定ステップと、
前記測定ステップで測定した各発光タンパク質の発光強度を、前記複数のサンプルのうち1つの前記異色発光タンパク質の発光強度を基準として算出した他のサンプルの前記異色発光タンパク質の発光強度との比、または前記発光タンパク質の発光強度と前記異色発光タンパク質の発光強度との比に基づいてそれぞれ補正する補正ステップと、
前記補正ステップで補正した発光タンパク質の発光強度に基づいて前記発光関連遺伝子の発現量を定量する定量ステップと、
を含み、
前記発光画像撮像ステップ、前記測定ステップ、前記補正ステップ、前記定量ステップを繰り返し実行することで、前記発光関連遺伝子の発現量を経時的に定量することを特徴とする発現量定量方法。 - 前記発光関連遺伝子及び前記異色発光関連遺伝子は、基質要求性が同じルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれ含み、1つのベクターによって導入されることを特徴とする請求項1に記載の発現量定量方法。
- 前記発光画像撮像ステップで得られた前記発光画像を、該発光画像を撮像した時刻と対応付けて記憶する記憶ステップをさらに含むことを特徴とする請求項1または2に記載の発現量定量方法。
- 前記サンプルは、組織または細胞であることを特徴とする請求項1から3のいずれか1つに記載の発現量定量方法。
- 発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子および前記発光タンパク質が発する発光の色とは異なる色の発光を発する異色発光タンパク質を発現する異色発光関連遺伝子が導入された複数のサンプルを対象として、各サンプルから発せられた発光の発光強度に基づいて前記発光関連遺伝子の発現量をそれぞれ定量する発現量定量装置であって、
開口数(NA)および倍率(β)で表される(NA/β)2の値が0.02以上である対物レンズを用いて、撮像範囲中に前記複数のサンプルを含む発光画像を経時的に撮像する撮像部と、
前記撮像部が撮像した各発光画像に基づいて、サンプルから発せられた発光タンパク質の発光強度および異色発光タンパク質の発光強度をサンプルごとに測定する測定部と、
前記測定部が測定した各発光タンパク質の発光強度を、前記複数のサンプルのうち1つの前記異色発光タンパク質の発光強度を基準として算出した他のサンプルの前記異色発光タンパク質の発光強度との比、または前記発光タンパク質の発光強度と前記異色発光タンパク質の発光強度との比に基づいてそれぞれ補正する補正部と、
前記補正部が補正した発光タンパク質の発光強度に基づいて前記発光関連遺伝子の発現量を定量する定量部と、
を備えたことを特徴とする発現量定量装置。
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