JP5089936B2 - 発光イメージングの検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、任意の細胞を含む生きた対象中の発光シグナル成分をイメージングすることにより検出するための方法と組成物に関する。

組識内の因子を検出し定量するための従来の生体外方法は、疾患の進行をモニターする能力に限界がある。経験から推定できる場合もある。しかし個別的である場合が多く、数多くの生体外分析を行なう必要がある。

動物における疾患の進行を追跡する手段を持つことができ、しかも有害な影響を与えずに評価できるのが望ましい。本発明は、哺乳動物などの生体内の病原体とその他の発光用物体を検出し、追跡するための非侵襲的方法を提供することを目的とする。

本発明は、少なくとも細胞を含んでいる生物学的対象中の遺伝子の発現を検出するための方法であって、前記方法が、生物発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞を有する前記対象を、前記細胞による前記導入遺伝子の発現が前記細胞の画像による検出を許容する状況下に前記対象が維持される工程と、前記対象を、１以上の細胞から放出される光シグナルを画像化するに適した光学条件を有する光検出装置を用いて測定する工程と、測定された画像情報に基いて前記導入遺伝子の発現を解析する工程とを含むことを特徴とする発光イメージングの検出方法である。このような方法によって、画像に基づいて遺伝子の発現を検出し、追跡することを可能にする方法が提供される。

前記光シグナルが、生物発光タンパク質による発光シグナルの産物であり得る。また、前記光シグナルが、蛍光タンパク質による蛍光シグナルの産物であり得る。対象が不透明な組織を含む場合に、前記光シグナルを用いて、前記組織中に伝搬する光シグナルを前記組織の外部に放射される以前の部位で光検出装置を用いて測定する工程を含むようにすることができる。

光検出装置を用いて測定する工程は、光シグナルによる画像を構築することができるまで経時的に行うようにすることができる。前記光シグナルによる画像は、他の光学画像と重ね合わせる工程によって構築するようにしてもよい。

前記検出する工程は、選択した時間間隔で反復する工程をさらに含み、ここで前記反復する工程による検出結果は、前記対象中の前記導入遺伝子による発現の局在を経時的に追跡するために有効である。本発明は、さらに、前記対象に化合物を投与する工程、および前記化合物の投与後に前記対象からの光シグナルを測定する工程を含むようにしてもよい。

前記測定する工程を、増倍化電荷結合光検出素子を用いて行うようにできる。また、前記測定する工程を、冷却電荷結合光検出素子を用いて行うようにできる。

上記光検出装置の光学条件は、対物レンズを開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０３９以上において生物発光の検出を実施するのが好ましい。とくに、上記光学的条件が０．０７１以上であるのが検出および解析において好ましい。

本発明は、哺乳類対象内の生物適合体の局在を検出する非侵襲的方法を包含する。その生物適合体は分子であってもよいし、巨大分子、細胞、微生物（病原体を含む）、あるいは粒子などであってもよい。この方法では、対象に当前記発光用物体と発光成分の複合体を投与する。発光成分は通常、光を放射する分子または高分子（巨大分子）である。この成分は、化学反応の結果として発光することができる（例えば生物発光タンパク質）。発光成分の典型例は、ルシフェラーゼやエクオリンのような生物発光タンパク質および、黄色蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質である。

対象中で複合体が局在できた期間の後、対象を、充分な量の光シグナルを（その光検出装置で）測定して画像を構築するのに有効な期間、光検出装置の検出フィールド内に固定する。典型的な光検出装置は、画像処理装置に接続した増倍化電荷結合素子（ＩＣＣＤ）カメラである。「固定されていない」対象が動く時間スケールに比べて短い時間内に画像を構築できるのであれば、対象は実質的に「固定されている」ことになるので、撮影工程の間、特別な固定措置を必要とせず、光シグナルデータからの画像を構築できる。

撮像工程を選択した間隔で繰り返し、各間隔に対応する画像を構築することにより、上述の方法で、対象内の発光用物体の局在を経時的に追跡することができる。発光用物体上に標的成分を結合したり、複合させたり、あるいは組み込むことにより、数多くの特定の応用に、上述の方法を使用することができる。標的成分はその発光用物体固有の特性であってもよいし、あるいは標的成分を発光用物体に複合させたり、結合したりまたは組み込んでもよい。

さらに、発光成分と複合した病原体を発光用物体として使用すれば、この方法で、動物内の病原体による感染部位を検出し、局在化（位置決め）することも可能となる。

本発明は、哺乳類対象内の生体適合体のレベルを経時的に検出する非侵襲的方法を包含する。この方法は必ずしも発光用物体を画像の形で局在化するわけではなく、対象内での発光用物体のレベルの変化を経時的に検出するよう設計される。この方法は、発光用物体のレベルに対する治療用物質の効果を経時的にモニターするのに、とりわけ有用である。

本発明は、哺乳類対象における導入遺伝子の組込みを検出する非侵襲的方法をも包含する。この方法では、哺乳類細胞に導入遺伝子を組み込むのに有効な高知のべクター構築物を、対象に投与する。この構築物は、効果的な組込みに必要な要素に加えて、導入遺伝子（例えば治療用遺伝子）と、発光性タンパク質をコードする遺伝子とを、選択した活性化可能なプロモーターの制御下に含有する。その構築物が組み込みを達成しうる期間の後、そのプロモーターを活性化する。次に、対象を光検出装置の検出フィールド内に置き、光シグナルのレベルを測定または評価する。そのレベルがバックグラウンドを超える場合、その対象は当前記導入遺伝子を組込んでいると判断される。

本発明は、発光性タンパク質をコードする遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に含む構築物でトランスジェニックまたはキメラにした動物におけるプロモーター誘導事象の局在を検出する非侵襲的方法をも包含する。プロモーター誘導事象には、そのプロモーターを直接活性化する物質の投与、内因性プロモーター活性化因子の産生を刺激する物質の投与、内因性プロモーター活性化因子の産生をもたらすような熱ショックまたはストレスなどが挙げられる。この方法では、光検出装置を用いて、その媒質を透過した光子を検出し、その光子を経時的に積分し、積分したその信号に基づいて画像を作成する。他の側面において、本発明は、生物内の特定の部位で、選択した物質（例えば溶存酸素またはカルシウム）の濃度を測定する方法をも包含する。

本発明によれば、哺乳動物などの生体内の疾患に関連する発光用物体を画像化することにより検出し、追跡するための方法が提供される。

本発明において、不透明媒質とは「従来通りの」不透明な媒質を指し、必ずしも完全に不透明であるとは限らない。また、本発明における発光とは、化学反応または放射線の吸収により光を発生しうることをいう。発光成分の複合体化によって発光用物体に付与されることにより発光する。発光成分には、生物発光タンパク質、蛍光分子、蛍光タンパク質、光子を放出する酵素反応などの発光物質が含まれる。複合体化（共役）には、化学的カップリング、融合タンパク質の遺伝子操作、あるいは生物発光タンパク質を発現させる細胞、微生物または動物の形質転換が含まれうる。例えば、その発光用物体が撮像する哺乳類対象を構成する細胞である場合、その発光成分はその細胞に共役させた生物発光タンパク質または蛍光タンパク質であってよく、例えばトランスジェニック動物またはキメラ動物の作出によりその細胞内に導入されたべクター構築物からのプロモーター制御的発現の局在性によるものであり得る。

本発明は、哺乳類対象中の発光性複合体の非侵襲的撮像および／または検出に関する方法と組成物を包含する。この複合体は、生物適合体と発光成分とを含有する。生物適合体には、環状有機分子などの小分子；タンパク質などの高分子；ウイルス、細菌、酵母、カビなどの微生物；あらゆるタイプの病原体および病原性物質；ビーズやリポソームなどの粒子が含まれるが、これらに限らない。また、生物適合体は、撮像される哺乳類対象を構成する細胞の全部または一部であってもよい。

一般に、発光性複合体を様々な方法で対象に投与し、その対象内で局在させ、それを撮像する。撮像または対象からの光シグナルの測定は数十分間続くことがあるので、常にそうであるとは限らないが、通常は撮像工程中、対象を固定しておく。発光シグナル成分の撮像は、極めて低レベルの光（通常は単一光子）を検出し、画像の構築が可能になるまで光シグナルを積分できる光検出器の使用を必要とする。そのような高感度光検出器の例には、単一光子事象を増幅した後、検出系に固有の背景ノイズに対して単一光子を検出できる（例えば液体窒素で冷却された）カメラまたはカメラ群で、その事象を検出する装置がある。光シグナル画像を作成したら、通常は、放射された光子の発生源に関して準拠座標系を与えるため（すなわち対象に関して発光性複合体を局在化するため）に、それをその対象の”通常の”反射光画像に重ね合わせる。次に、そのような”合成”画像を分析することにより、対象内の標的の位置および／または量を決定する。

次に、上述した工程による各種の態様を詳細に記述する。

（１）発光成分
本発明の実施に有用な発光成分、発光分子または発光構築物は、その応用に応じて様々な形態のいずれをとってもよい。これらに共通する特徴は、それらが発光性であるということ、すなわちそれらが電子的励起状態から、より低いエネルギー状態（通常、基底状態）への遷移の結果として、原子または分子から紫外（ＵＶ）、可視および／または赤外（ＩＲ）領域の電磁放射線を放射するということである。発光成分の例には、蛍光分子、化学発光化合物、燐光化合物、生物発光化合物などの光冷光（フォトルミネセンス）分子がある。本発明の重要な側面は、非侵襲的に外部から検出できるように動物組識を貫通しうる光を生成する発光成分の選択である。光が動物組識（ほとんど水からなる）のような媒質を通過する能力は、主として、その光の強度と波長によって決まる。単位体積中の発光強度が強いほど、その光は検出しやすくなる。単位体積中に生成する光の強度は、後述する個々の発光成分のスペクトル特性と、単位体積中の当前記成分の濃度に依存する。したがって、通常、発光用物体内または発光用物体上に高濃度の発光成分を配置する共役法（例えばリポソームの高効率負荷や、細胞内での生物発光タンパク質の高レベル発現など）により、例えば各発光用物体に発光成分を一つだけ共役させる方法よりも深い組識層を通して検出することが容易な、より明るい発光性複合体を作成する。組識層越しの発光成分の検出性を支配する第２の因子は、放射光の波長である。ほとんどの組織は主に水から成るので、動物組識の吸収特性を近似するには水を使用することができる。水は長波長光（赤色領域の光）を短波長光より容易に透過させる。

（２）生物発光分子
生物発光分子は、光を放射するために放射エネルギーの入力を必要としない点で、蛍光分子とは異なる。むしろ生物発光分子は、ＡＴＰなどの化学エネルギーを利用して光を発生させる。蛍光成分に対する生物発光成分の利点は、そのシグナルに事実上バックグラウンドがないということである。検出される光は、外来の生物発光成分によって生成した光だけである。これに対して、蛍光分子を励起するために使用される光は、しばしば意図する標的以外の物質の蛍光をもたらす。これはバックグラウンドが生きている動物の内部環境のように複雑な場合に顕著である。

生物発光分子にはいくつかの種類が知られている。例えば、ルシフェラーゼ系（ｌｕｃ）を含有する代表的真核生物は、ホタル、コメツキムシであり、これらは緑色、黄緑色、黄色、橙色の光を放射する。中でも橙色は、他の短い波長の光よりも容易に組識を貫通する波長を持つので好都合である。ルシフェラーゼ酵素を発光させるには、基質ルシフェリンをルシフェラーゼ酵素に供給しなければならない。ルシフェラーゼ酵素がｌｕｘルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを含有するベクターの発現産物として導入される場合、ルシフェリンを供給する便利な方法もまた、本発明によって提供される。

（３）発光用物体
本発明は、上述のような発光成分、発光性構築物または発光分子を含むように修飾したまたは共役させた発光用物体を包含する。そのような共役体または修飾体を、発光シグナル成分、発光性複合体（ＬＥＣ）または単に複合体という。これらの発光用物体自体は、例えば分子、高分子、粒子、微生物または細胞などの形態をとることができる。発光成分を発光用物体に共役させる方法は、その成分と発光用物体の性質に依存する。ベクター構築物そのものも、本発明に応用できる高分子体となりうる。例えば、発光性分子をコードする遺伝子と治療用遺伝子とを、選択したプロモーター（すなわち当前記治療用遺伝子が標的とする細胞内で発現するプロモーター）の制御下に含有する真核発現ベクターを構築することができる。本発明の方法を用いてアッセイされるその発光性分子の発現は、その治療用遺伝子の発現位置と発現レベルを決定するために使用できる。その治療用遺伝子の発現が、処置される人または動物内で直接的な表現型を持たない場合に、この方法はとりわけ有用である。標識したウイルスを動物で使用することにより、感染を局在化し、感染の進行をモニターすることができ、また感染の蔓延を抑制するのに有効な薬物をスクリーニングすることもできる。

（４）粒子
ビーズ、リポソームなどを含む粒子は、本発明の実施に有用なもう１つの発光用物体を構成する。これらはサイズが大きいので、粒子には、例えば小分子などの場合よりも多数の発光成分を共役させることができる。これは、より短い露光時間で、またはより厚い組識層を通して検出することができる、より高濃度の光放射をもたらす。感染した細胞上のウイルスタンパク質は、感染した組識または器官の同定に使用できる。免疫系の細胞は、単一のまたは複数の細胞表面マーカーを用いて局在化することができる。真核細胞も本発明のある側面で発光用物体として有用である。所望の調節要素を含有する適当な発現ベクターが市販されている。それらのベクターを用いて、初代培養細胞、体細胞、リンパ細胞などを含む種々の真核細胞中で所望の発光性タンパク質を発現させうる構築物を作成することができる。これらの細胞は、一過性発現試験にも使用できるし、細胞系の場合は安定な形質転換体として選択することもできる。

（５）細胞
細胞は、原核、真核共に、本発明の実施に有用なもう１つの発光用物体を構成する。細胞にも粒子と同様に比較的高濃度の発光成分を負荷できるが、細胞には、例えば導入遺伝子構築物で細胞をトランスフェクションすることによって、発光成分を供給しうるという利点がある。また、標的成分もしくは細胞を対象内の所望の位置に導くのに有効な分子を発現させる細胞を選択することもできる。別法として、適当な標的成分を発現させるベクター構築物で細胞をトランスフェクションすることもできる。形質転換細胞における発光性タンパク質の発現は、選択された様々なプロモーター（ＣＭＶプロモーターやＳＶ４０プロモーターなど）を用いて調節することができる。

また、形質転換細胞が対象内に均一に分布し、ウイルスによる感染やサイトカインによる剌激を受けたときなど、一定の条件下でのみ発光性タンパク質が発現するように、形質転換細胞を投与してもよい。これらの剌激やその他の剌激に関係する因子に反応するプロモーターは、当技術分野で知られている。例えば恒常的に活性なプロモーターを用いて上述のように形質転換した腫瘍細胞系は、腫瘍の増殖と転移をモニターするために使用できる。形質転換した腫瘍細胞を動物に注射し、腫瘍塊を形成させ、増殖阻害剤候補または転移阻害剤候補で処置しながら、腫瘍の大きさと転移をモニターすることができる。腫瘍細胞は、様々な感染性因子または治療用化合物に感応する活性を持つ調節可能なプロモーターを含有する構築物で形質転換された細胞から作成することもできる。形質転換法は、原核細胞と真核細胞共に当技術分野で公知である。適当な調節因子と多重クローニング部位を持つベクターは広く市販されている。もう１つの側面として、本発明は、発光性タンパク質または発光性のタンパク質複合体をコードする導入遺伝子構築物を含有するトランスジェニック動物を包含する。この構築物は選択したプロモーターによって駆動され、例えば発光性タンパク質の機能的発現に必要な種々の補助タンパク質や、選択マーカー、エンハンサー要素などを含みうる。プロモーターの活性化は、発光性分子と補助タンパク質をコードする遺伝子の発現量を増大させる。プロモーターの活性化は、選択した生物適合体またはその一部とプロモーター要素の相互作用によって達成される。活性化がその動物の一部でのみ起こる場合は、その部分の細胞のみが発光性タンパク質を発現させる。別の側面として、ある種の疾患状態で発現するプロモーターを用いて、トランスジェニック動物内の患部を標識し、発光成分の発現を用いて、その疾患状態に対する処置の効果をモニターすることができる。組識特異性プロモーターと共に本発明の方法を使用することも可能である。これは、例えば動物における細胞（例えばニューロン）の発育中の追跡を可能にする。また、別の側面として、例えば発光成分を発現させる、注射された腫瘍細胞の局在は、その動物内のある部位にそれらの細胞が定着し、腫瘍塊を形成することで達成される。

（６）光検出装置
本発明の重要な側面は、哺乳動物内からの微弱な光を妥当な時間で（好ましくは約３０分以内に）撮像することができ、その装置からの信号を使って画像を構築できるほど充分に感度の高い光検出装置の選択である。極めて明るい発光成分を使用できる場合および／または撮像する対象または動物の表面近くに局在した発光性複合体を検出することが可能な場合は、暗視ゴーグルや、シリコン増倍管（ＳＩＴ）カメラ（例えば浜松ホトニクス）などの一般的高感度ビデオカメラを使用できる。しかし、より一般的には、もっと高感度な光検出法が必要である。本発明を実施する際に直面するような極めて低い光レベルでは、単位面積当たりの光子束があまりに低いので、撮影対象がもはや連続的でないように見える。その代わりに、それは時間的にも空間的にも互いに独立した個々の光子によって表される。モニターで見ると、そのような画像は、それぞれが検出された単一光子を表わす瞬く光の点のように見える。検出されたこれらの光子をデジタル画像処理装置で経時的に累積することにより、画像を獲得し、構築することができる。各画像点での信号に強度値を割り当てる従来のカメラとは対照的に、光子カウント撮像法では、信号の強度は意味を持たない。その目的は、単に信号（光子）の存在を検出し、その位置に関して信号の発生数を経時的に計数することである。

驚くべきことに、本発明において、対物レンズの開口数を従来の蛍光撮像用顕微鏡などで常識的に用いられる開口数に対して変更することにより、短い時間（例えば１分〜２０分）で生物発光のような微弱な発光成分による細胞画像を撮像できることが出願人により明らかになった。発明者らの独自の検討によれば、光検出装置の対物レンズを開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０３９以上において生物発光を容易に画像化できるに至った。さらに、検討を進めた結果、上記光学的条件（ＮＡ／β）の２乗が０．０７１以上である場合に、５分以内、場合によっては１分程度で視認可能で且つ解析可能な細胞画像を提供できることを突き止めた。

高感度光検出器には、光子が検出スクリーンに命中する前に光子を増幅する装置が含まれる。この種類には、マイクロチャネル増倍装置のような増倍装置を持つＣＣＤカメラが含まれる。マイクロチャネル増倍装置は通常、カメラの検出スクリーンに対して垂直かつ同延的なチャネルの金属アレイを含有する。マイクロチャネルアレイは撮像しようとする試料、対象または動物とカメラの間に設置される。このアレイのチャネルに侵入する光子の大半は、チャネルを抜け出す前にチャネルの側面と接触する。アレイを横切ってかけられた電圧は、各光子衝突から多くの電子を放出させる。このような衝突から生じた電子は、それらが発生したチャネルから放出され、カメラによって検出される。光子信号の増幅とは対照的に、光子検出器内のバックグラウンドノイズを減少させることによって感度を得る装置もある。ここでノイズは主として検出器アレイを冷却することによって低減される。
装置の典型例は、浜松ホトニクス社から入手できるＣ２４００シリーズである。

（７）画像処理装置
光検出装置によって生成した信号は、例えばモニターに表示したり、ビデオプリンターでプリントできる画像を構築するために、画像処理装置で処理する必要がある。そのような画像処理装置は、通常、上述の高感度光子計数カメラを含むシステムの一部として販売されており、例えばフォトメトリックス社や浜松ホトニクス社から入手できる。画像処理装置は通常、パーソナルコンピューターに接続される。パーソナルコンピューターは購入した撮像システムの一部として含まれている場合もある。画像をデジタルファイルの形式に処理することにより、様々な画像処理プログラムで操作したり、印刷することができる。

複数の検出器を対象の周囲に設置する方法や、走査型の検出器または検出器群などを含む他の方法を使用して、三次元画像を作成してもよい。動物または対象の全体が光検出装置の検出フィールド内にある必要はないということは理解される。例えば対象の特定の領域に局在することがわかっている発光性複合体を測定する場合、所望の情報を得るには、その領域とその周囲の充分な暗帯域からの光だけを測定すれば足りる。

（８）検出における対象の固定
対象の２次元または３次元画像を作成したい場合、光シグナルを測定している間は、対象を光検出装置の検出フィールド内に固定しておく場合がある。約２０ミリ秒未満で測定した光シグナルから画像を構築できるほどに信号が明るく、対象が特に動揺しない場合は、特別な固定措置は必要ない。これに対して、光シグナル測定に約２０ｍｓｅｃ以上を要し、対象が動揺している場合は、構築された画像に空間情報が保存されるように、その対象の動揺の程度に合わせて、光シグナル測定中、対象の不動を保証するための防止措置を考慮する必要がある。とくに、対象がマウスのような動物である場合は、その対象を例えば麻酔や機械的拘束具を用いて固定することができる。対象または動物から放射され光の総量のみを測定したい場合は、光シグナル測定期間が長くても、その対象を固定する必要はない。必要なことは、撮像の間、対象を光検出器の検出フィールドに閉じ込めておくことだけである。しかし、その測定中に対象を固定しておけば、検出される光子が通過する組識の厚さが動物間で均一化する。光シグナルを測定した（まだ固定されている）対象のグレースケール画像は、例えば微かな部屋光のなかで撮像室または撮像箱の扉を開放して、その反射した光子を測定することによって得ることができる。通常、発光シグナルの画像をグレースケール像に重ね合せることにより、対象に関する合成画像を作成する。また、選択した成分の分布および／または局在に対するある処置の効果を記録するために、発光性複合体の局在および／または発光性複合体からの信号を経時的に追跡したい場合は、光シグナルの測定または撮像を選択した時間間隔で反復することにより、一連の画像を構築することができる。間隔は数分程度の短いものであってもよいし、数日または数週間程度に長いものであってもよい。

（９）光シグナル画像の分析
本発明の方法および／または本発明の組成物を使用して作成した画像は、様々な方法で分析できる。それは、単純な視覚的検査、評価から、複雑なデジタル画像分析まで様々である。撮像すべき動物または対象は、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラに接続する。生物発光データは、外部照射の不在下に得る方がよい。露出設定は、例えば次の通りである：黒レベルは、例えば、カメラ／画像処理装置によって自動的に設定し、ゲインは増倍装置コントローラーで自動的に設定する。ここで、Ｆストップは適当な数値、例えば、２．８付近の値に設定する。マクロレンズを使用するのであれば、市販のレンズ製品であってもよい。

生物発光画像は、例えば、選択した時間（通常５分間）光子を積分することによって作成できる。データは、いずれの動物についても、１ピクセルあたり０〜３ビットの最低ビットレンジ設定で表わすことができる。生物発光シグナルの分解能を０〜３のビットレンジにできなかった他の発光用物体（すなわち２４ウェルプレート）の画像については、レンジを生物発光シグナルの局在化が可能な設定（通常１〜７）に増やするようにできる。選択した時間（例えば、５分間）の撮像で付加的な情報が得られなかった場合は、発光用物体をより短い時間で撮像するようにできる。外部撮像とは、動物の非侵襲的撮像を指す。内部撮像とは、動物の部分的切開（通常、腹壁切開）後の撮像を指す。内部撮像は、外部撮像で局在化した光シグナルの光源を確認するために、選択した動物で行なう。生物発光画像データは、検出された光子の強度を表わす擬似色発光画像として表わす。通常、青色（低強度）から赤色（高強度）までの６つの強度レベルを使用する。

以上の説明において、本発明では次に示すような生物発光の画像解析（またはイメージング分析）ならではの分析試薬を提供することができる。とくに、本発明の好適な実施の形態では、不透明な組織を含まない、単離された細胞もしくは細胞群を主に含んでいるような生物学的試料の任意な生物学的活性（酵素活性、免疫学的活性、分子生物学的活性、遺伝学的活性、内科的活性など）を分析するための方法、試薬、ならびに装置を提供する。ここに、単離された細胞もしくは細胞群は、主に光透過性が高い材質からなる収容容器（例えば、ウエル、シャーレ、マイクロスライド、マイクロフルイディクス用チップ）中で長期間保持するので、細胞内活性を損失を最小限にするか実質的に失活せずに撮像を行うための独特な試薬または試薬環境を提供する。

１．基質の長期使用に関する試薬とその取扱い
試料の細胞内活性を、例えば数時間から２４時間、２日から６日間、１週間から数週間、または数週間超というように長期間培養などの技術で継続させる際、発光をもたらすためには、次のような特徴をもった取扱いが重要である。次に述べる幾つかの方法および／または試薬は、単独でもよいが、複数の方法を組み合わせる方がよい場合があるので、本発明では限定しない。

（第1の取扱い方法） 現在市販または報告されている生物発光用試薬は、２４時間まで観察可能な基質があるが、それ以上、例えば、数週間だと、基質の継ぎ足しが必要となる。細胞または細胞群を配置している培地に対して定期的ないし、測定の開始に同期して基質を添加する方法が好ましい。複数回の添加を行うのに適している試薬キットとして、同じパッケージに同封される発光タンパクを含む発光性試薬を含む収容手段（容器または袋）と、発光性試薬に対応する量の基質溶液（または基質含有培養液）を複数回の使用に足りるように複数の分割されて収容している収容手段（容器または袋）とを具備するのが好ましい。

（第２の取扱い方法） 他の一面において、PH調整を長期に亘り実行する。そのために、例えば気体環境としての二酸化炭素ガスの濃度を一定量以上に保つ方法である。より詳細には、細胞が生き続けるに必要な最低量よりも高濃度なガスを存在させることができる。他方、充分大きな容量の気体環境を大気圧以上の蓄積容器（例えばガス用タンク）内に蓄積し、その容器から定期的ないし徐々に細胞（ないし細胞群）に向けて移動するように装置設計する。このような気体環境の局所的な移動は、細胞（ないし細胞群）の気体に対する代謝速度に応じた速度となるようにするのが好ましい。

（第３の取扱い方法および試薬） ＰＨを長時間一定に保証することが知られているＨＥＰＥＳを添加する。そのための方法には、上記気体環境の場合のように、細胞（ないし細胞群）が消費する固体、液体、気体の全てについての消費速度と関連したＨＥＰＥＳ濃度に応じてＨＥＰＥＳを供給することができる。ＨＥＰＥＳは、公知の除放性カプセルに封入して、有効数のカプセルを細胞（ないし細胞群）とともに液中ないし培地内に含ませておくことがさらに好ましい。有効量のＨＥＰＥＳ（またはＨＥＰＥＳと同等のＰＨ維持用化合物）を封入した徐放性カプセルを主に含んでいる溶液や培地は、本発明の目的を達成する有効な試薬となり得る。

（第４の取扱い方法、装置または試薬） 本発明の主旨によれば、細胞または細胞群の内部温度を致命的な変化が起きない程度に調節するための保温用装置および／または薬剤を提供することができる。

（第５の取扱い方法または試薬） 発光検出のバックグラウンドを長期に低くするための方法および／または試薬に関する。すなわち、生物発光（または化学発光）によるバックグラウンドの増加に関連する要素としての組織片、有色物（例えば発色性色素物質、とくにフェノールレッド色素））を除く方法であり、或いはこれら要素を予め充分に除去した培地または溶液を試薬として提供することができる。

（第６の取扱い方法または試薬） 細胞、特に細胞群に対して基質を流通させることは発光の安定性や測定精度にとって重要である。方法としては、基質の細胞膜透過を助ける処理（例えば、圧力ショック、電気的ショック）を連続的、断続的または細胞の老化に応じて実行することができる。試薬としては、細胞膜透過性を補助または促進する添加物（例えば、膜溶解物質としての界面活性剤、膜浸透圧変容物質としての塩類）を含有する基質または別途緩衝溶液を試薬として提供することができる。これらの方法および／または試薬は、長期の測定中に細胞中において活性の有る基質が不足しないように、新鮮な細胞外の基質に対して透過性が継続するか、或いは一時的に透過性が高まるように設定するのが好ましい。

（第７の取扱い方法） 均一な染色方法を達成する方法に関する。磁気ビーズをあらかじめ加えておき、数時間、または一日に一回攪拌する。通常は、収容する容器の底面上には細胞が貼り付いているため、上方から攪拌するのが好ましい。

（第８の取扱い方法または試薬） 長期観察を行う際に、同一の細胞（または細胞群）について多数回の発光反応を繰り返すことで生じる副産物による、光学的または化学的な阻害の影響を除去する方法や試薬に関する。すなわち、基質を継ぎ足すような取扱いに応じて発光反応に伴う反応副産物が蓄積していく。この発光反応に伴う副産物（ピロリン酸）などを除去するために、副産物排除用物質（例えば、沈殿作用を有する金属イオン）を加える。

（第９の取扱い方法または試薬） 発光成分としてのルシフェリンを再生させる方法または試薬に関する。ルシフェリンが発光後、オキシルシフェリンとなるが、これをルシフェリンに再生するための試薬をルシフェリンの老化または消耗に応じて細胞（または細胞群）に供給する方法が提供される。検出オキシルシフェリンがニトリル体2に変換された後、合成でも使われたように体内にあるシステインと反応し、ルシフェリンが再生することがホタルでは知られている。このような発光成分の活性低下を再生する再生物質を含んでいる基質、或いは別途の緩衝液を提供することも可能である。

（第１０の取扱い方法または試薬） 新規な試薬としてのカプセル封入型基質に関する。所定時間経過後または一定の時間間隔で溶出ないし液放出するようなカプセルに適当な基質（例えばルシフェリン）を封入しておき、基質を一定濃度を保つようにする。また、カプセルに封入されていない基質（例えばルシフェリン）と、カプセルに封入した同種の基質を同時に提供する方法、または混合した状態のカプセル含有溶液である試薬を提供することができる。また、徐放速度が異なる２以上のカプセルに同種の基質（例えばルシフェリン）を含有させた試薬を同時に細胞（ないし細胞群）と添加（または培地との接触）することにより、異なる放出時機に新鮮な基質が自動的に提供されるという利点を有する。

以上、特定の方法と態様に関して本発明を説明したが、本発明から逸脱することなく様々な変更や改変を施しうることは理解されるであろう。

Claims (9)

1. 少なくとも細胞を含んでいる生物学的対象（ヒト個体を除く）中の遺伝子の発現を検出するための発光イメージングの検出方法であって、
   生物発光タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞を有する前記生物学的対象を、導入された導入遺伝子の発現が前記細胞の画像による検出を許容する状況下に維持する工程と、
   開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗が０．０３９以上である対物レンズを有する光検出装置を用いて前記細胞の発光成分による画像を構築するとともに、前記発光成分からの発光シグナルを測定する工程と、
   前記発光成分による画像および測定された前記発光シグナルに基いて前記導入遺伝子の発現を解析する工程と、
   を含むことを特徴とする発光イメージングの検出方法。
2. 前記発光シグナルを測定する工程は、前記生物学的対象が不透明な組織を含む場合に、前記組織中に伝搬する発光シグナルを前記組織の外部に放射される以前の部位で測定することを特徴とする請求項１に記載の発光イメージングの検出方法。
3. 前記発光シグナルを測定する工程は、前記発光成分による画像を構築することができるまで経時的に行うことを特徴とする請求項１または２に記載の発光イメージングの検出方法。
4. 前記発光成分による画像を他の光学画像と重ね合わせる工程をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の発光イメージングの検出方法。
5. 選択した時間間隔で前記解析する工程を反復することにより、前記生物学的対象中の前記導入遺伝子による発現の局在を経時的に追跡することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の発光イメージングの検出方法。
6. 前記生物学的対象に化合物を投与する工程をさらに含み、
   前記発光シグナルを測定する工程は、前記化合物の投与後に前記発光成分からの発光シグナルを測定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の発光イメージングの検出方法。
7. 前記発光シグナルを測定する工程を、選択した時間間隔で反復することにより、前記生物学的対象中の前記導入遺伝子発現のレベルに対する前記化合物の効果を経時的に追跡することを特徴とする請求項６に記載の発光イメージングの検出方法。
8. 前記光検出装置は、電荷結合素子であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一つに記載の発光イメージングの検出方法。
9. 前記開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗が０．０７１以上であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一つに記載の発光イメージングの検出方法。